KR101546366B1

KR101546366B1 - 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법

Info

Publication number: KR101546366B1
Application number: KR1020150036289A
Authority: KR
Inventors: 류현미; 박소연; 이다은; 임지혜
Original assignee: 의료법인 제일의료재단
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2015-08-25

Abstract

본 발명은 태아 특이적 후성학적 마커 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 태아 특이적 후성학적 마커 X3을 이용한 임신부 혈액 중 태아 DNA의 검출 및 다운증후군 태아의 비침습적 산전 검사 방법을 제공한다.

Description

태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법{Composition for detecing fetal epigenetic markers and detecting method thereof}

본 발명은 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커를 검출하기 위한용 조성물 및 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 염색체 21번 내 존재하는 태아 특이적인 후성학적 마커와 다운증후군 태아 검출을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

임신부의 혈액 내에 존재하는 태아 DNA는 태아 유래 조직인 태반에서 기원하며, 임신 중 일어나는 태반세포(trophoblast)의 자발적인 세포 사멸 과정을 통한 고사 시에 발생하여 임신부의 혈액 내로 방출된다고 알려져 있다(Prenat Diagn 2007;27:415-8, Am J Pathol 2006;169:400-4).

태아 DNA가 임신부의 혈액 중에 존재한다는 사실은 남자 태아(male fetus)를 임신한 임신부의 혈액에서 Y 염색체의 특이적인 DNA를 검출함으로써 최초로 보고되어(Lancet 1997; 350:485-487), 임신 관련 질환과 태아의 유전 질환에 관한 비침습적 산전 검사의 새로운 재원으로 연구되고 있다.

기존 임신부의 혈액에 존재하는 태아 DNA의 검출은 임신부 여성에는 존재하지 않는 남아 유래의 Y 염색체 내 특이적인 DNA 서열을 이용하여 이루어졌다. 하지만 이 경우 태아가 여아인 경우 적용할 수 없는 제한점을 가지고 있다. 따라서 태아의 성별에 관계없이 임신부 혈액에 존재하는 태아 DNA를 보다 정확하게 측정하기 위해 조직의 발생단계와 종류에 따라 특이적인 양상을 나타내는 DNA 메틸화와 같은 유전자의 후성학적 특성 (epigenetic characteristics)이 주목을 받고 있다.

최근 임신부의 DNA와 태아의 DNA 사이의 후성학적 차이 (epigenetic difference)를 이용한 태아 DNA 확인자(identifier)를 찾으려는 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 PDE9A, SERPINB5, RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, PYCARD 등은 태아의 성별과 무관하게 존재하며 임신부의 혈액과 태반에서 메틸화 수준이 달라지므로 임신부의 혈액 내에 순환 태아 DNA가 존재하는지를 확인하는데 사용되고 있다. PDE9A 및 SERPINB5는 임신부의 혈액세포 중에는 주로 메틸화 상태로 존재하며 태반에서는 주로 비메틸화 상태로 존재한다고 보고되었다(Biol Reprod. 82(4):745-50, 2010). 반면, RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, 및 PYCARD는 임신부의 혈액세포 중에는 비메틸화 상태, 태반에서는 메틸화 상태로 존재한다고 알려져 있다(미국등록특허 제7754428호).

한편, 현재 시행되는 산전 선별 검사의 주된 목적은 21번 염색체가 정상인보다 1개 더 많은 3개 존재하여 나타나는 염색체 질환인 다운증후군의 검출이다. 다운증후군은 정신 지체, 신체 기형, 전신 기능 이상, 성장 장애 등 신체 전반에 걸쳐 이상을 나타내며, 신생아 800명당 1명의 높은 발생빈도를 보이는 질환이다.

현재 다운증후군의 산전 검사는 태아 목 투명대 초음파 검사법(nuchal translucency ultrasound scan of the fetus)과 혈청 표지 물질(pregnancy-associated plasma protein A, human chorionic gonadotrophin, alpha fetoprotein, unconjugated estriol, 및 inhibin-A)의 조합 검사법을 병행하고 있다. 그러나, 이러한 방법에 의한 검출 정확성은 5%의 위양성율 하에서 대략 84%인 것으로 보고되고 있다(Obstet Gynecol. 2006;107:167-173, N Engl J Med. 2005;353:2001-11). 또한, 이러한 조합 검사법은 임신 제1삼분기 검사 결과를 공개하지 않음으로 인해 임신 제2삼분기까지 환자가 검사 결과를 기다리게 한다는 점과 두 단계의 검사를 모두 거쳐야 하는 환자 순응도의 문제를 가진다. 또한, 의료 비용 측면에서도 두 단계에 걸친 여러 번의 검사 시행이라는 단점을 지닌다. 일반적으로 다운증후군 태아의 정확한 검사는 양수천자(amniocentesis)나 융모생검(chorionic villus sampling)을 통한 염색체 분석을 실시하여 이루어지고 있으나, 이러한 양수천자나 융모생검은 침습적 방법으로서 대략 1% 유산율의 위험성을 지니고 있다. 이러한 침습적 검사 방법의 위험성과 와 선별 방법의 낮은 정확성으로 인하여, 기존 선별 방법을 대체하기 위해 임신 제1삼분기에 다운증후군 태아에 대한 정확성이 높은 비침습적 검사 기술의 개발이 여전히 요구되고 있다.

현재까지 염색체 21번에 존재하는 임신부의 DNA와 태아의 DNA 사이의 후성학적 차이를 보이는 다양한 태아 DNA 확인자들이 보고되었다(Clin Chem 2008;54:500-11, Clin Chem 2010;56:90-8, Am J Pathol. 2009 May;174(5):1609-18). 하지만 보고된 태아 DNA 확인자는 비침습적인 태아 DNA의 검출을 위해 임신부의 혈액 세포와 태반 조직 사이의 조직 특이적인 후성학적 특성에 기반하여 동정되었으므로 질환 특이적인 후성학적 특성이 고려되지 않아 질환의 검출을 위한 마커로서의 이용에는 한계가 있다. 따라서, 임신부의 혈액 중 태아 DNA의 검출을 포함한 비침습적 산전 검사에 보다 효과적으로 이용될 수 있는 마커에 대한 요구가 여전히 존재한다.

본 발명자들은 비침습적 산전 검사에 이용될 수 있는 태아 조직에 특이적인 후성학적 특징을 갖는 마커를 발굴하기 위한 연구를 수행하여 21번 염색체에 존재하는 서열번호 1의 마커 X3이 태아 DNA와 임신부 DNA를 구별하여, 다운증후군과 같은 염색체 이상을 갖는 태아의 구별에 이용될 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 21번 염색체에 존재하는 조직 특이적인 후성학적 특징을 보이는 새로운 태아 특이적인 후성학적 마커를 개발하여 임신부 혈액 내 태아 DNA 검출을 위한 신뢰할 수 있는 태아 특이적 DNA 마커를 발굴하고 이를 통해 태아 다운증후군의 검출에 있어 효과적인 새로운 태아 특이적 DNA 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 태아 특이적 후성학적 마커를 이용하여 비침습적으로 임신부 혈액 중 태아 DNA의 존재 여부를 확인하고 정량함으로써, 산전 검사에 필요한 정보를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커를 검출하기 위한 조성물을 제공한다.

태아 DNA와 임신부 DNA는 메틸화 상태가 상이할 수 있으며, 그에 의해 태아 DNA와 임신부 DNA의 구별이 가능하다는 것이 알려져 있다. DNA의 메틸화는 후성학적 현상으로, 본 발명에 따른 태아 특이적 후성학적 마커 X3은 임신부 DNA와 비교하여 상이한 메틸화 상태를 가지므로, 그 메틸화 상태에 의해 태아 DNA를 임신부 DNA로부터 구별할 수 있다. 태아 특이적 후성학적 마커 X3은 21번 염색체에 존재하며, 임신부 DNA에서는 완전한 비메틸화 상태이나, 태아 DNA에서는 완전한 메틸화 또는 과메틸화 상태이며, 카피수 변이(Copy Number Variant, CNV)를 갖지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "태아 특이적 후성학적 마커"는 메틸화와 같은 후성학적 특징에 의해 태아 유래 DNA를 임신부 유래 DNA로부터 특이적으로 구별하기 위해 이용될 수 있는, 염색체 상의 특정 부위를 의미한다. 태아 특이적 후성학적 마커는 비침습적 산전 검사에 유용하게 이용될 수 있다. 태아 특이적 후성학적 마커를 이용하여 임신부 혈액 중 태아 DNA를 검출하고 그의 존재 여부를 판단하는 것은 물론, 임신부 혈장 내 존재량을 측정하는 것에 의해 태아의 염색체 이상을 검사할 수 있다.

본 발명에서 태아 특이적 후성학적 마커 X3은 21번 염색체 상의 43483783번에서 43483949번까지의 영역(Genbank accession no. AP001745; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)이고, 서열번호 1으로 표시된다.

태아 특이적 후성학적 마커 X3의 CpG 부위는 태아 DNA에서는 완전한 메틸화 또는 과메틸화 상태이고, 임신부 DNA에서는 완전한 비메틸화 상태이므로, 메틸화 여부에 의해 태아 및 임신부 유래의 DNA를 구별할 수 있고, 메틸화된 DNA의 양적 평가를 통해 태아 다운증후군을 검사할 수 있다. 또한, 이들 마커는 비침습적 산전 검사에서 태아 DNA의 존재에 대한 양성 대조군으로 이용될 수 있다.

따라서, 상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출을 위한 조성물은 태아 DNA의 검출 또는 다운증후군 태아의 진단을 위하여 사용될 수 있다. 또한, 임신부 혈액으로부터 태아 DNA를 검출하는 경우, 임신부 혈액의 세포 유리 DNA(cell-free DNA)를 대상으로 세포 유리 태아 DNA의 존재 여부를 검출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태는 임신부 혈액 중 태아 DNA를 검출하는 방법으로서, 임신부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계, 분리된 메틸화된 DNA에 대해 태아 특이적 후성학적 마커 X3(서열번호 1)의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 마커는 실시간 중합효소연쇄 반응을 포함한 중합효소연쇄 반응에서 태아 DNA의 존재 여부를 검출하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 태아 DNA의 존재 여부를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 수행 전에 메틸화된 DNA를 비메틸화된 DNA로부터 화학적 변형 없이 물리적으로 분리하는 단계를 수행할 수 있다.

메틸화된 DNA를 비메틸화된 DNA로부터 물리적으로 분리하는 단계는 DNA 자체를 화학적으로 변형시키거나 절단하지 않고, 메틸화 여부에 의해 분리하는 것을 의미한다. 메틸화된 DNA의 물리적 분리는 메틸화 특이적 항체를 이용한 면역침전이나 메틸화 부위를 인식하는 메틸-CpG 결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain capture, MBD)을 이용하여 이루어질 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커를 증폭하기 위한 제제는 상기 마커의 메틸화 수준을 측정하기 위한 것일 수 있다. 그 예로, 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 메틸화를 검출하기 위해 설계된 프라이머일 수 있다.당업계에 공지된 사실에 기초하여 통상의 기술자는 상기 마커 X3의 증폭을 가져올 수 있는 적절한 프라이머를 용이하게 설계할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 마커 X3의 검출을 위한 프로브를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 사실에 기초하여 통상의 기술자는 상기 마커 X3의 검출을 가져올 수 있는 프로브 서열을 적절히 설계할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 마커 X3의 증폭을 위한 서열번호 2와 3으로 이루어진 프라이머쌍, 및 마커 X3의 검출을 위한 서열번호 4의 프로브를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 위한 완충액, dNTP 혼합물, 및 DNA 중합효소를 더 포함한다.

실시간 중합효소연쇄반응은 표적 핵산의 증폭과 측정을 동시에 진행한다. 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 산물로부터 발생하는 신호, 예를 들면, 형광의 강도를 실시간으로 측정하므로, 전통적인 중합효소연쇄반응에 비해 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있다. 또한, 증폭 산물의 분석을 위한 전기영동이나 서열결정과 같은 추가적인 단계를 필요로 하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용하기 위한 프로브는 5' 말단에는 형광물질이 부착되고, 3' 말단에는 소광물질이 부착되어 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 소광물질은 6-TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX(carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브의 3'-말단에 MGB(minor groove binder)가 부착될 수 있다. MGB는 형성된 이중쇄의 안정성을 증가시켜 분석의 정확도에 기여한다.

본 발명의 일 구체예에서, 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 통상적인 조건에서 수행되거나, 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응의 진행 중 어닐링 및 연장 단계에서 형광물질이 부착된 프로브로부터의 형광을 측정한다. 본 발명의 또 다른 양태는 상기 조성물을 포함하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 키트를 제공한다.

상기 키트는 태아 DNA 검출용 키트 또는 다운증후군 태아 진단용 키트로서 사용될 수 있다.

또한, 상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 검출을 위한 적절한 시약, 용기 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 마커 X3를 이용하여 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출 방법을 제공한다. 상기 방법은 임신부 혈액 중 태아 DNA를 검출하는 방법으로 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 방법은 임신부 혈액에서 상기 마커 X3의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출 방법일 수 있으며, 보다 구체적으로

임신부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계, 및

분리된 메틸화 DNA에 대해 태아 특이적 후성학적 마커 X3(서열번호 1)의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

태아 특이적 후성학적 마커 X3은 태아 DNA, 즉, 태반으로부터 유래된 DNA에서는 완전한 메틸화 또는 과메틸화 상태이나, 임신부의 혈액 세포 DNA에서는 비메틸화 상태이다. 따라서, 임신부 혈액 시료 중 메틸화된 태아 DNA를 비메틸화된 임신부 DNA로부터 물리적으로 분리하고 그로부터 마커 X3에 의해 태아 DNA의 존재 여부를 확인할 수 있다. 또한, 마커 X3의 임신부 혈장 내 존재량은 다운증후군 태아의 산전 검사에 필요한 정보로 활용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 임신부 혈액에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계는 메틸화 DNA 특이적 면역 침강 또는 MBD에 의해 수행된다.

메틸화된 DNA를 비메틸화된 DNA로부터 물리적으로 분리하는 단계는 메틸화 DNA 특이적 항체를 이용하여 메틸화 DNA를 항체에 결합시킨 후 침강된 항체 복합체로부터 메틸화 DNA를 방출시키거나 또는 MBD 단백질과 추출된 DNA를 혼성화 후, 메틸화 DNA를 방출시키는 것에 의해 수행된다. 메틸화된 DNA를 화학적으로 변형시키거나 절단하지 않으면서 물리적으로 비메틸화된 DNA로부터 분리하고, 이로부터 태아 특이적 후성학적 마커의 존재를 검출하거나 또는 그 양을 측정한다.

또한, 상기 메틸화된 DNA는 메틸화된 세포 유리 DNA일 수 있으며, 이 경우 상기 방법은 임신부의 혈액으로부터 세포 유리 DNA를 수득하는 단계; 및 수득된 세포 유리 DNA로부터 메틸화된 세포 유리 DNA를 분리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 X3의 증폭을 위한 서열번호 2와 3으로 이루어진 프라이머쌍, 마커 X3의 검출을 위한 서열번호 4의 프로브를 이용하여 수행할 수 있다.

시료 중에 존재하는 X3의 존재량은 시료 중 해당 마커의 카피수와 같은 다양한 정량적 단위로 표현될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 마커 X3을 이용하는 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은 임신부 혈액에서 상기 마커 X3의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법일 수 있으며, 보다 구체적으로 분리된 임신부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계; 및 분리된 메틸화된 DNA에 대해 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 물리적 분리 및 마커의 존재 여부 검출에 대해서는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 임신부 혈액 중 태아 DNA를 검출하는 방법은 분리된 메틸화 DNA 중 태아 특이적 후성학적 마커 X3의 존재량을 측정하는 단계, 및 다른 정상 이배수체의 염색체에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커의 존재량과 상기 측정된 마커의 존재량을 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 다른 정상 이배수체의 염색체에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커는 21번 염색체를 제외한 정상 염색체 수를 갖는 나머지 염색체에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커로서, 기준 마커로도 명명된다.

구체적으로, 상기 방법은 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량을 기준 마커의 존재량과 비교하여 21번 염색체에 존재하는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 비율적 증가를 확인하여 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보를 제공하는 방법일 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 비율적 증가는, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적인 후성학적 메틸화 마커의 혈액 내 존재량; 및 상기 기준 마커의 혈액 내 존재량의 비율값에 근거하여 분석하는 것으로, 상기 비율값은 하기의 식에 의하여 계산될 수 있다.

식: 메틸화된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 임신부 혈액 내 존재량 / 메틸화된 기준 마커의 임신부 혈액 내 존재량

본 명세서에서 사용된 용어 정상적인 이배수체로 존재하는 다른 염색체의 태아 특이적인 후성학적 마커, 즉 기준 마커는 RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, 및 PYCARD와 같이 임신부 혈액에서는 비메틸화 상태, 태반에서는 메틸화 상태로 존재하는 마커들로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 기준마커는 RASSF1A로서, 이는 3번 염색체상의 50378097에서 50378227번까지의 영역(Genbank accession no. NM_007182.4; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)에 해당하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 50378097에서 50378227번까지의 영역의 서열에 대해서는 서열번호 12에 나타내었다.

다른 정상 이배수체의 염색체에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커에 대한 상기 측정된 X3의 비율은 다운증후군 태아의 산전 검사에 필요한 정보를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 방법은 검출된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량을 표준화된 기준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 표준화된 기준은 정상 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 상기 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량 또는 다운증후군 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 상기 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이 경우, 상기 방법은 검출된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량, 즉 상기 마커의 메틸화 정도가 정상 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 상기 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량, 즉 상기 마커의 메틸화 정도에 비하여 높으면 다운증후군 태아를 가진 것으로 판정할 수 있다. 또한, 다운증후군 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 상기 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량, 즉 상기 마커의 메틸화 정도와 동등한 경우, 다운증후군 태아를 가진 것으로 판정할 수 있다.

이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 비침습적으로 임신부산모 혈액 시료 중 태아 DNA의 존재 여부를 검출하고, 다운증후군의 산전 검사에 필요한 정보를 수득할 수 있다.

도 1은 태아 특이적 후성학적 마커 X3(8개의 CpG 부위)의 비술피트 서열결정 데이터를 보여준다. 선택된 마커는 모두 태아 유래의 태반 조직에서는 과메틸화 또는 완전한 메틸화를 보였으나, 임신부 유래의 말초 혈액에서는 완전한 비메틸화를 보였다.
도 2는 각각 임신부 혈액 시료에 대해 수행된 태아 특이적 후성학적 마커 X3(서열번호 1)에 대한 qPCR의 결과를 보여준다.
도 3은 태아 특이적 후성학적 마커 X3과 정상 이배수체의 염색체 3번에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커인 RASSF1A의 실시간 qPCR 결과를 보여준다. 도면 중 Ratio는 X3의 임신부 혈액 내 존재량/RASSF1A의 임신부 혈액 중 존재량의 비율로 계산된 비율 값을 의미한다.
도 4는 태아 특이적 후성학적 마커 X3과 RASSF1A의 다중 실시간 qPCR로부터 수득된 ROC 곡선의 분석 결과를 보여준다. 도면 중 Ratio는 X3의 임신부 혈액 내 존재량/RASSF1A의 임신부 혈액 중 존재량의 비율로 계산된 비율값을 의미한다.

실시예 1. 태아 특이적 후성학적 마커의 스크리닝

21번 염색체를 대상으로 임신부 혈액 중 태아 DNA를 검출하기 위해 이용될 수 있는 태아 특이적 후성학적 마커를 스크리닝하였다. 임신부와 태아에서 각각 상이한 메틸화 양상을 보이는 마커를 선별하여 태아 특이적 후성학적 마커로서의 적용 가능성을 확인하였다.

(1) 대상

2011년 3월부터 12월 사이에 제일병원에 내원한, 정상 태아 또는 다운증후군 태아를 가진 임신 여성과 임신하지 않은 정상 여성을 대상으로 모집하였다. 제일병원 윤리위원회로부터 본 연구에 대한 허가(#CGH-IRB-2011-85)를 얻었다.

(2) 시료 처리

비임신 정상 여성과 임신부의 말초 혈액은 EDTA를 함유한 튜브에 채취하고, 1,600 g에서 10분 동안 원심분리하고 수득된 말초 혈액 세포 부분을 2,500 g에서 10분 동안 재원심분리한 후, 잔류 혈장을 제거하여 말초 혈액 세포를 수득하였다. 임신부의 말초혈액 시료는 임신 제1삼분기에 융모막 융모 샘플링 시술 직전에 채취했고, 모든 태반 시료는 융모막 융모 샘플링에서 수득하였다. 각각 QIAamp Blood Kit (Qiagen) 및 QIAamp Tissue Kit (Qiagen)를 이용하여, 말초 혈액 세포 및 태반 조직으로부터 DNA를 추출하였다.

(3) 어레이 혼성화(Array Hybridization)

21번 염색체의 타일링 올리고뉴클레오티드 어레이(tiling oligonucleotide array)를 위해, 정상 비임신 여성 (n=2)으로부터의 전혈 시료, 정상 태아를 임신한 여성(n=5)의 전혈 시료, 정상 태아의 태반 시료 (n=4), 및 다운증후군 태아의 태반 시료 (n=5)를 이용하였다.

태반 조직 및 혈액 세포로부터 추출된 각 DNA 시료를 초음파 처리(sonication)한 후, 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 특이적으로 인식하는 MBD(Invitrogen, MethylMiner^TM Methylated DNA enrichment kit)를 사용하여 메틸화된 DNA만 선택적으로 결합시키고, 결합된 MBD-DNA를 특이적으로 결합할 수 있는 마그네틱비드를 이용하여 메틸화된 DNA만 선택적으로 추출하여 마이크로어레이에 적용하였다. MBD를 통해 수득된 산물을 전체 유전체를 증폭할 수 있는 Whole Genome Amplification Kit(Sigma)를 사용하여 증폭하고, 각각의 증폭된 DNA는 Genomic DNA Enzymatic Labeling Kit (Agilent)를 이용하여 표지하고, 21번 염색체에 대해 특이적으로 맞춤화된 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 어레이 플랫폼은 21번 염색체에 특이적인 고-해상도 타일링 올리고뉴클레오티드 어레이를 위해 제작된 것이었다(Agilent technologies, Design_ID038569). 이 어레이는 60 bp 당 1개의 중간 프로브 밀도(median probe density)로 21번 염색체 전체를 포괄하는 40만개의 50량체 또는 60량체(60-mer) 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 표지화, 혼성화, 및 혼성화-후 세척 절차를 포함한, 마이크로어레이 프로토콜이 제조사에 의해 제안되었으며, http://www.agilent.com에서 확인할 수 있다.

요약하면, Cyanine 5-dUTP로 표지된 MBD-DNA 와 Cyanine 3-dUTP로 표지된 총 인풋 DNA를 Amicon 필터(Millipore)를 이용하여 세척하였다. 그 후, 제조사의 설명서에 따라, 회전하는 SureHyb 챔버에서 67℃에서 40시간 동안 Methylation Hybridization Kit (Agilent)를 이용하여, 상기 마이크로어레이로의 경쟁적 혼성화를 진행시켰다. 그 후, 세척된 슬라이드를 High-Resolution C Scanner (Agilent)를 이용하여 스캔하고, Feature Extraction 소프트웨어(Agilent Technologies)를 이용하여 형광을 평가하였다. 수득된 형광 수치를 이용하여 Intensity Lowess 정규화를 통해 값을 보정하고, 보정된 값들은 BATMAN(Bayesian tool for methylation analysis) 알고리즘을 통하여 메틸화 여부를 평가하였다. BATMAN 알고리즘에 따라 평가된 값에서 로그값이 1 이상이며, BATMAN 콜(call)이 1인 값들을 메틸화된 것으로 평가하였다.

(4) 타일링 올리고뉴클레오티드 어레이의 데이터 분석

백그라운드 보정을 이용하여 두 개의 신호 값을 정규화시키고, Agilent Genomic Workbench 소프트웨어 (Agilent)를 이용하여, 신호 비(MBD/인풋), 신호 로그 비 [log₂(MBD/input)], P[X], 및 P를 수득하였다. log₂ 값은 log₂ 스케일로 변환된, 각 프로브에 대한 Cy5:Cy3 형광 비(MBD에 의해 회수된 메틸화 DNA:총 인풋 DNA)이고, 각 좌(locus)에서 메틸화 DNA 양의 상대적 척도를 나타낸다. 본 발명자들은 미가공 데이터(raw data)에 중앙값 및 Lowess 정규화를 적용하고, 불량(low-quality) 데이터 포인트를 제거하기 위해 가외치 프로브(outlier probe)를 필터링하였다. MBD 어레이 분석에서 binding call을 수득하기 위해 이용되는 P[X] 및 P 값은 X 값이 시료의 전체 지놈의 X 값의 가우스 분포로부터 벗어날 확률로 정의하였다. 이때, 프로브에 대한 X 값은 분포의 대칭에 대해 보정된 MBD 신호와 인풋 신호 간의 차이를 의미한다. 프로브에 대한 값은 인접 프로브(해당 프로브의 1 kb 내에 있는 프로브)의 신호를 고려하여, 평균 X로 계산하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 완전한 메틸화를 정규화 log₂ 값 > 1로 정의하고, 완전한 비메틸화를 정규화 log₂ 값 = 0으로 정의하였다.

타일링 올리고뉴클레오티드 어레이 분석에서 혈액과 태반 조직에서 차등적으로 메틸화된 영역을 확인하여 태아 특이적 후성학적 마커의 후보를 선택하였다. 질환의 유무에 관계없이, 태반 시료(n=9)에서 1보다 큰 정규화된 log₂ 값으로 정의된 완전한 메틸화 및 혈액 시료(n=7)에서는 0인 정규화된 log2 값로 정의된 완전한 비메틸화에 근거하여 마커를 선택하였다. 하기 표 1은 그 결과를 보여준다.

태아 유래 태반 시료에서 완전한 메틸화를 나타내고, 임신의 유무에 관계없이, 모든 혈액 시료에서 완전한 비메틸화를 나타내는 것으로 확인된 Index 243805로 표시된 프로브에 의해 동정된 영역을 태아 특이적 마커 X3으로 명명하였다.

(5) 표적 영역 내 카피수 변이(Copy Number Variation)?확인

태아 특이적 후성학적 마커 X3의 DNA 서열을 DGV(Database of Genomic Variants)(http://projects.tcag.ca/variation/) 검색에 의해 카피수 변이(copy number variant, CNV)의 존재 여부에 대해 확인하였다. 하기의 표 2는 CNV가 없는 것으로 최종적으로 확인된 영역을 나타낸다. 붉은 색 서열은 마이크로어레이에 의해 선정된 프로브 서열을 나타내며, 밑줄친 영역은 선택된 프로브의 주변 프로브 서열이다.

(6) 비술피트 직접 서열결정 (Bisulfite direct sequencing)

타일링 올리고뉴클레오티드 어레이 분석에 의해 선별된 마커에 대해 비술피트 직접 서열결정을 이용하여 어레이 분석 데이터의 정확성을 확인하였다. DNA 시료 (1 ㎍)를 제조사의 설명서에 따라 EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)를 이용하여 비술피트-전환시켰다. 비술피트-전환 DNA를 메틸화 CpG 부위 및 비메틸화 CpG 부위의 구별을 위한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같았다:

Index ID: 243805:

정방향 프라이머: 5'-TGTTAGGATAGGAGTAGTGG-3' (서열번호: 10)

역방향 프라이머: 5'-CCCACAAACGCTAAACATCTC-3' (서열번호: 11)

PCR 반응 용액은 20 ㎕의 총 반응 부피당 10 ng 지놈 DNA, 10 pM 프라이머, 0.25 mM dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 1 X 완충액, 및 0.25 U Taq 폴리머라아제를 포함하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분 동안의 예비변성, 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서의 40초로 이루어진 사이클 35회, 및 72℃에서 10분의 최종 연장을 포함하였다. PCR 증폭 후에, 제조사의 설명서에 따라 PCR 정제 키트 (Bioneer)를 이용하여 PCR 산물을 정제하고, PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 서열을 결정하였다. 서열결정 산물은 PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 분석하고, Genescan 소프트웨어 버전 3.7 (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 전기영동도 기록(electropherogram trace)을 해석하였다. Genotyper 소프트웨어 버전 3.7 (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 상응하는 유전형을 배치하였다. 도 1은 마커 X3에 대한 비술피트 서열결정 데이터를 보여준다. 선별된 태아 특이적 후성학적 마커 X3은 서열번호 1로 확인되었다. 마커 X3은 모두 태아 유래의 태반 조직에서는 과메틸화 또는 완전한 메틸화를 보였으나, 임신부 유래의 말초 혈액에서는 완전한 비메틸화를 보였다.

실시예 2. 태아 DNA 의 검출

실시예 1에서 선별된 태아 특이적 후성학적 마커 X3을 이용하여 임신부 혈액으로부터 수득된 시료에서 태아 DNA의 검출을 수행하였다.

(1) 임신부 혈장으로부터 세포-유리 DNA 단리

임신부(n=6)로부터 말초 혈액을 EDTA 튜브에 수집하였다. 채취 직후, 임신부 말초 혈액 시료를 4℃에서 1,600 g로 10분 동안 원심분리하였다. 혈장 부분을 16,000g로 10분 동안 재원심분리하여 임신부 DNA의 추가적인 방출을 최소화하고, 검사할 때까지 -80℃ 초저온 냉동고(deep freezer) 보관하였다. 제조사의 설명서에 따라, QIAamp DSP Virus Kit (Qiagen)를 이용하여 1.5 mL 임신부 혈장으로부터 세포-유리 DNA를 단리하였다. 각 DNA 시료를 30 ㎕의 멸균 DNase-불포함 물로 용해시키고, 후속 맹검 분석(blinded analysis)을 위해 표시하였다.

(2) 메틸화 DNA의 농축(Enrichment)

MethylMiner^TM 메틸화 DNA 추출 키트 (Invitrogen)를 이용하여, 임신부 혈장으로부터 추출된 세포-유리 DNA로부터 메틸화 DNA를 추출하였다. MBD-비오틴 단백질(3.5 ㎍)을 10 ㎕ Dynabeads M-280 Streptavidin에 결합(coupling)시킨 후, MBD-자성 비드 컨쥬게이트를 3회 세척하고 1 부피(volume)의 1X Bind/Wash 완충액에 재현탁시켰다. 회전 믹서 상에서 30 ㎕의 추출된 순환 DNA를 MBD-자성 비드에 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 포획(capture) 반응을 수행하였다. 그 후, 비드를 1X Bind/Wash 완충액으로 3회 세척하고, 결합된 메틸화 DNA를 용리 완충액 중 증가되는 NaCl 농도 [450 mM, 600 mM, 1,000 mM, and 2,000 mM NaCl]를 이용하여 메틸화 DNA를 단계적으로 추출하였다. 추출된 메틸화 DNA는 DNA 농축기 (Zymo research corp.)를 이용하여 농축시키고, 30 ㎕의 최종 부피로 용해시켰다. 키트에 포함된 대조군 DNA(메틸화 DNA 및 비메틸화 DNA)를 이용하여 메틸화 DNA의 추출을 확인하였다.

(3) 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)

임신부 혈장 중 태아 특이적 후성학적 마커의 검출 가능성을 확인하기 위해 qPCR을 수행하였다. qPCR 은 ABI 7500 system (ABI)을 이용하여 수행하였다. 2X Master Mix II (Kogene biotech) 10 ㎕ 및 MBD에 의해 포획된 메틸화 혈장 DNA 5 ㎕를 이용하여 20 ㎕ 부피로 반응액을 준비하였다. 프라이머 및 가수분해 프로브(hydrolysis probe)는 각각 200 nmol/L 및 100 nmol/L의 최종 농도로 사용하였다. 프라이머, 가수분해 프로브, 및 표적 영역의 앰플리콘의 서열이 하기 표 3에 표시된다. 초기 PCR 반응 조건은 50℃에서의 2분 및 95℃에서의 10분, 및 뒤이은 95℃에서의 15초 및 60℃에서의 1분으로 이루어진 사이클 50회였다. 앰플리콘의 연속 희석에 의해 각 분석에 대한 보정 곡선(calibration curver)을 작성하였다. 모든 시료는 3회 증폭시키고 최종 결과는 평균을 반영하였다. 농축 계수(factor concentration)는 카피/mL로 표현하고, 전술된 바와 같이, 데이터를 카피수로 전환시키기 위해, 6.6 pg의 표준 계수(standard factor)를 사용하였다(Am J Hum Genet 1998; 62:768-75).

마커	서열
X3	서열번호 5: 앰플리콘 5'-GGTGCACGCAAGGAGCTATCGTGAACATTGCTCCCAACTGGCCGCTTGCTTGTCCCCCGGCTCCCCTTGGCCCCAGTGGCGGCTTTGCCTGAATTAGAGGGCGTGAGAGCCACCTGTGTCTCAGCACTGCAATTAAAGCAGGAAGCCCTTTCGGAAGCAGCCGTGTGCACCA-3'
X3	서열번호 2: 정방향 프라이머 5'-GGT GCA CGC AAG GAG CTA TCG -3' 서열번호 3: 역방향 프라이머 5'-TGG TGC ACA CGG CTG CTT CCG -3' 서열번호 4: 가수분해 프로브 5'-(Cy5)TGC TCC CAA CTG GCC GCT TGC TTG T(BHQ2)-3'

도 2는 태아 특이적 후성학적 마커 X3이 qPCR에 의해 임신부 혈장 중에 존재하는 태아 DNA를 효과적으로 검출할 수 있음을 보여준다.

실시예 3. 태아 특이적 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 태아 검사의 정확성 확인

다운증후군 태아와 정상 태아를 임신한 임신부 혈액으로부터 수득된 시료에서 실시예 1에서 선별된 태아 특이적 후성학적 마커 X3을 이용하여 다운증후군 태아의 검사 정확성을 확인하였다. 21번 염색체의 수적 증가에 의한 다운증후군 태아를 X3과 같은 21번 염색체에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커를 이용하여 정확히 검출하기 위해, 2개의 정상 염색체 수를 갖는 다른 염색체의 태아 특이적 후성학적 마커와의 양적 비교가 필요하다. 이를 통해 21번 염색체에 존재하는 태아 특이적인 후성학적 마커의 비율적 증가를 확인함으로써 태아 다운증후군의 검사가 가능하다. 따라서 본 실시예서는 3번 염색체상의 50378097에서 50378227번까지의 영역(Genbank accession no. NM_007182.4; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)에 해당하는 태아 특이적 메틸화 마커인 RASSF1A를 기준(reference) 마커로 이용하였다. RASSF1A는 임신부 유래 DNA에서는 비메틸화 상태이고, 태반 유래 DNA에서는 메틸화 상태로 존재하는 태아 특이적인 메틸화 마커이며(미국특허 제7754428호), 임신부 혈액 내 태아 DNA를 이용한 단일 유전자 질환의 검사에 관한 영국 RAPID (Reliable Accurate Prenatal non-Invasive Diagnosis) 연구 프로젝트에서 임신부 혈액 내 태아 DNA의 존재 유무를 확인하는 후성학적 마커로서 RASSF1A의 이용을 권고하고 있다.

(1) 임신부 혈장으로부터 세포-유리 DNA의 추출

다운증후군 태아를 임신한 임신부 참가자(n=17)와 정상 태아를 임신한 임신부 참가자(n=52)로부터의 말초 혈액을 EDTA 튜브에 수집하고, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 임신부 혈장으로부터 세포-유리 DNA를 추출하였다.

(2) 메틸화 DNA의 농축(Enrichment)

실시예 2에서와 동일한 방법으로, MethylMiner^TM 메틸화 DNA 키트 (Invitrogen)를 이용하여, 세포-유리 DNA로부터 메틸화 DNA를 추출하고, DNA 농축기 (Zymo research corp.)를 이용하여 메틸화 DNA를 농축하였다.

(3) 다중 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(multiplex qPCR)

태아 특이적 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 검사의 정확성을 확인하기 위해 다중 qPCR 을 수행하였다. 2X Master Mix II (Geneslabs) 10 ㎕ 및 MBD에 의해 포획된 메틸화 세포-유리 DNA 10 ㎕를 이용하여 20 ㎕ 부피로 반응액을 준비하였다. 프라이머 및 가수분해 프로브는 100 nmol/L의 최종 농도로 사용하였다. 프라이머, 가수분해 프로브, 및 표적 영역의 앰플리콘의 서열은 하기 표 4에 표시된다.

초기 PCR 반응 조건은 37℃에서의 10분 및 95℃에서의 5분, 및 뒤이은 95℃에서의 15초, 63℃에서의 30초, 72℃에서의 1분으로 이루어진 사이클 50회였다. 앰플리콘의 연속 희석에 의해 각 분석에 대한 보정 곡선을 작성하였다. 각 시료를 3회 증폭시켰고, 최종 결과는 평균을 반영하였다. 농축 계수는 카피/mL로 표현하고, 전술된 바와 같이, 데이터를 카피수로 전환시키기 위해, 6.6 pg의 표준 계수(standard factor)를 사용하였다(Am J Hum Genet 1998; 62:768-75).

마커	서열
X3	서열번호 5: 앰플리콘 5'-GGTGCACGCAAGGAGCTATCGTGAACATTGCTCCCAACTGGCCGCTTGCTTGTCCCCCGGCTCCCCTTGGCCCCAGTGGCGGCTTTGCCTGAATTAGAGGGCGTGAGAGCCACCTGTGTCTCAGCACTGCAATTAAAGCAGGAAGCCCTTTCGGAAGCAGCCGTGTGCACCA-3'
X3	서열번호 2: 정방향 프라이머 5'-GGT GCA CGC AAG GAG CTA TCG -3' 서열번호 3: 역방향 프라이머 5'-TGG TGC ACA CGG CTG CTT CCG -3' 서열번호 4: 가수분해 프로브 5'-(Cy5)TGC TCC CAA CTG GCC GCT TGC TTG T(BHQ2)-3'
RASSF1A	서열번호 6: 앰플리콘 5'-GAGCCTGAGCTCATTGAGCTGCGGGAGCTGGCACCCGCTGGGCGCGCTGGGAAGGGCCGCACCCGGCTGGAGCGTGCCAACGCGCTGCGCATCGCGCGGGGCACCGCGTGCAACCCCACACGGCAGCTGGT-3'
RASSF1A	서열번호 7: 정방향 프라이머 5'-GAG CCT GAG CTC ATT GAG CTG-3' 서열번호 8: 역방향 프라이머 5'-ACC AGC TGC CGT GTG G-3' 서열번호 9: 가수분해 프로브 5'-(HEX) ACC CGG CTG GAG CGT GCC AAC GC (BHQ1)-3'

(4) 통계 분석

실험군(Trisomy21)은 다운증후군 태아를 임신한 임신부로 구성되었고, 대조군(Normal)은 정상 태아를 임신한 임신부로 구성되었다. X3과 기준 마커로 사용된 RASSF1A의 임신부 혈액 내 존재량과 비율값은 평균으로 표현되었으며, Mann-Whitney U test를 이용하여 실험군과 대조군 간의 유의성을 분석하였다.

태아 다운증후군 검출의 정확도는 X3의 임신부 혈액 내 존재량과 비율값에 근거하여 분석하고, 태아의 핵형 분석 결과를 참조하여 결정하였다. 여기서 비율값은 (X3의 임신부 혈액 내 존재량/기준 마커의 임신부 혈액 내 존재량)으로 계산되었다.

검사 정확성 평가에 있어 민감도, 특이도, 양성 예측치, 음성 예측치는EpiMax Table Calculator(http://www.healthstrategy.com/epiperl/epiperl.ht

m)를 이용하여 계산하였다.

전체적인 검사 방법의 정확도는 ROC 곡선의 아래 면적(the area under the ROC curve, AUC)를 가지고 평가하였다. ROC 곡선의 아래 면적을 이용한 전체적인 검사 정확도는 마커의 임신부 혈액 내 존재량과 기준 마커와의 비율에 대해서 산출하였다.

통계적 분석은 Statistical Package for Social Sciences 10.0(SPSS Inc.)을 사용하였고, 통계적 유의성은 모든 검사에서 P<0.05로 설정하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 기준 마커로 사용된 RASSF1A의 임신부 혈액 내의 양은 대조군(Normal)과 실험군(Trisomy21)에서 다르지 않았다 (P>0.05). 그러나, X3의 임신부 혈액 내 존재량과 비율값은 실험군(Trisomy21)에서 대조군(Normal)에 비해 유의성 있는 차이를 보이며 증가되었다 (P<0.001).

X3의 존재량 절단치 314 카피/mL에서 X3의 민감도, 특이도, 양성 예측치, 음성 예측치 및 AUC를 비교하였다. 70.6% 민감도, 76.9% 특이도, 50.0% 양성 예측치, 88.9% 음성 예측치, 0.749 AUC (95% 신뢰구간: 0.607-0.891)를 보였다. X3 비율값의 절단치는 1.5이었으며, 76.5% 민감도, 92.3% 특이도, 76.5% 양성 예측치, 92.3% 음성 예측치, 0.871 AUC (95% 신뢰구간: 0751-0.991)를 보였다.

각 ROC 곡선 분석 결과는 도 4에 도시된다. 결과적으로 태아 특이적 후성학적 마커인 X3과 기준 마커인 RASSF1A에 대한 다중 qPCR 결과는 태아 특이적 후성학적 마커 X3이 임신부 혈장 중에 존재하는 태아 DNA의 검출을 통해 다운증후군 태아 여부를 판별하기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

<110> CHEIL GENERAL HOSPITAL & WOMEN'S HEALTHCARE CENTER, et al. <120> Composition for detecing fetal epigenetic markers and detecting method thereof <130> KPN14411 <160> 12 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 167 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctggtgcacg caaggagcta tcgtgaacat tgctcccaac tggccgcttg cttgtccccc 60 ggctcccctt ggccccagtg gcggctttgc ctgaattaga gggcgtgaga gccacctgtg 120 tctcagcact gcaattaaag caggaagccc tttcggaagc agccgtg 167 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for marker X3 <400> 2 ggtgcacgca aggagctatc g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for marker X3 <400> 3 tggtgcacac ggctgcttcc g 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for marker X3 <400> 4 tgctcccaac tggccgcttg cttgt 25 <210> 5 <211> 172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of marker X3 <400> 5 ggtgcacgca aggagctatc gtgaacattg ctcccaactg gccgcttgct tgtcccccgg 60 ctccccttgg ccccagtggc ggctttgcct gaattagagg gcgtgagagc cacctgtgtc 120 tcagcactgc aattaaagca ggaagccctt tcggaagcag ccgtgtgcac ca 172 <210> 6 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of marker RASSF1A <400> 6 gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg ggcgcgctgg gaagggccgc 60 acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg gcaccgcgtg caaccccaca 120 cggcagctgg t 131 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RASSF1A <400> 7 gagcctgagc tcattgagct g 21 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RASSF1A <400> 8 accagctgcc gtgtgg 16 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for RASSF1A <400> 9 acccggctgg agcgtgccaa cgc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for X3 <400> 10 tgttaggata ggagtagtgg 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for X3 <400> 11 cccacaaacg ctaaacatct c 21 <210> 12 <211> 131 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg ggcgcgctgg gaagggccgc 60 acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg gcaccgcgtg caaccccaca 120 cggcagctgg t 131

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커인 X3를 검출하기 위한 조성물로서, 상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커는 임신부 DNA에서는 비메틸화 상태이고 태아 DNA에서는 메틸화 상태로 존재하는 태아 특이적인 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물은 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 상기 메틸화 마커를 검출하기 위한 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 완충액, dNTP, 및 DNA 중합효소를 더 포함하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 임신부 혈액 중 태아 DNA(fetal DNA)의 검출에 사용되는 것인, 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 다운증후군 태아 진단에 사용되는 것인, 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 키트.
분리된 임신부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계; 및
분리된 메틸화된 DNA에 대해 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커인 X3의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
제7항에 있어서,
상기 임신부 혈액에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계는 메틸화 DNA 특이적 면역 침전 또는 메틸화 부위를 인식하는 메틸-CpG 결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain capture, MBD)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
제7항에 있어서,
상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
제9항에 있어서,
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 상기 메틸화 마커의 증폭을 위한 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 상기 메틸화 마커 검출을 위한 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
제7항에 있어서,
상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계는 분리된 메틸화된 DNA에 대해 상기 메틸화 마커의 존재량을 측정하는 단계로서, 상기 메틸화 마커의 존재량은 임신부 혈액 시료 중에 존재하는 마커의 카피수를 정량적으로 측정함으로써 얻는 것인, 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
제7항에 있어서,
상기 검출방법은 임신부 혈액 중 태아 DNA(fetal DNA)의 존재를 확인하기 위한 것인, 임신부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
분리된 임신부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계; 및
분리된 메틸화된 DNA에 대해 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법.
제13항에 있어서,
상기 방법은 상기 검출된 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량을 표준화된 기준과 비교하는 단계를 더 포함하는 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법으로서, 상기 표준화된 기준은 정상 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 상기 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량 또는 다운증후군 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 상기 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량인 것을 특징으로 하는 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법.
제13항에 있어서,
상기 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공방법은 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 존재량을 기준 마커의 존재량과 비교하여 21번 염색체에 존재하는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 메틸화 마커의 비율적 증가에 대한 정보를 제공하는 것으로서, 상기 기준 마커는 21번 염색체를 제외한 정상 염색체 수를 갖는 나머지 염색체에 태아 특이적으로 메틸화되어 존재하는 후성학적 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는, 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법.
제15항에 있어서,
상기 기준 마커는 3번 염색체상의 50378097에서 50378227번까지의 영역(Genbank accession no. NM_007182.4; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)에 해당하는 RASSF1A인 검출방법으로서, 상기 기준 마커로 사용된 RASSF1A는 임신부 DNA에서는 비메틸화상태이고, 태아 DNA에서는 메틸화상태로 존재하는 태아 특이적 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법.
제16항에 있어서,
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 비율적 증가는, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적인 후성학적 메틸화 마커의 혈액 내 존재량; 및 상기 기준 마커인 RASSF1A의 혈액 내 존재량의 비율값에 근거하여 분석하되, 상기 비율값은 하기의 식에 의하여 계산되는 것을 특징으로 하는 다운증후군 태아의 진단에 대한 정보의 제공 방법.
식: 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 임신부 혈액 내 존재량 / RASSF1A의 임신부 혈액 내 존재량