TW201408778A

TW201408778A - 一種癌症篩檢的方法ｉｉｉ

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Publication number: TW201408778A
Application number: TW101131472A
Authority: TW
Inventors: Hung-Cheng Lai
Original assignee: Nat Defense Medical Ct
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-03-01

Abstract

一種癌症篩檢的方法，包含下列步驟：(1)提供一受測檢體；(2)檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；(3)根據至少一個目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有癌症或癌症前病變；甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)或變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)等。

Description

一種癌症篩檢的方法III

本發明係關於一種癌症篩檢的方法，特別是指一種以甲基化DNA作為生物標記的癌症篩檢的方法。

子宮頸癌是全球及台灣女性主要的死因之一，根據2002年世界衛生組織(WHO)的統計，子宮頸癌為全球女性癌症死因的第二位，僅次於乳癌；定期接受子宮頸癌篩檢是預防子宮頸癌的最佳方法，習用子宮頸癌篩檢的方式主要有兩種，一是最常見的子宮頸抹片檢查(Pap smear)，另一則為人類乳突病毒檢驗(HPV testing)；子宮頸抹片檢查是取出子宮頸部之分泌物，以顯微鏡觀察其中脫落之上皮細胞中，是否有癌病變產生，以早期偵測子宮頸癌；而HPV檢驗則是以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,RT-PCR)或Hybrid Capture的方式檢查樣本中是否存在有人類乳突病毒(human papilloma virus,HPV)病毒的存在。

然而，由於子宮頸抹片檢查(Pap smear)需要靠醫師取樣、檢驗師/病理醫師判讀抹片，除了容易產生高偽陰性率(High false negative rate)而延遲癌前病變的診斷與治療之外，再者，所需的人力素質與成本太高，這對許多發展中的國家來說，有推廣上的困難；另一方面，人類乳突病毒檢驗(HPV testing)雖具有高敏感度，但卻容易造成高偽陽性率(High false positive rate)，不僅讓病患白白擔心，也會浪費許多醫療資源在偽陽性患者的追蹤檢查上；因此，如何提高子宮頸癌檢驗方法的準確性及方便性，是推廣子宮頸癌檢驗的重要課題之一。

基因的缺失(genomic deletions)被認為是腫瘤形成的重要因素，長久以來，我們都習慣了基因組中的編碼是仰賴ATCG四個鹼基排列的觀念，Knudson早在1975年即提出雙重受創理論(two-hit theory)，指出一些同源腫瘤抑制基因伴隨的突變或缺失可能造成或易造成癌症的發生；然而，其他影響表現型(phenotype)的訊息可能存於被修飾過的鹼基5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)中，5-甲基胞嘧啶被發現存在於哺乳類動物細胞內的迴文序列5’-CpG-3’中，在哺乳類動物細胞內除了一些被稱為“CpG島”(CpG islands,CGIs)的區域之外，大多數的CpG雙核苷酸對都被甲基化，CpG島是指在大約1000個鹼基對(1Kb)的區域內含有大量的GC-以及CpG-，通常位於基因的附近，且在廣泛表現的基因之啟動子附近被發現。胞嘧啶的甲基化發生在DNA合成後，自一甲基捐贈者s-腺核苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine,SAM)將一甲基經酵素轉移到胞嘧啶第5個碳的位置上，該酵素反應係由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)執行，DNMT1是哺乳類動物主要的甲基轉移酶，係負責將半甲基化位置複製後修復(post-replicative restoration)為全甲基化，被稱為維持甲基化(maintenance methylation)；反之，DNMT3A及DNMT3B則被認為主要負責甲基化新的位置，進行一種稱為重新甲基化(de novo methylation)的步驟。

CpG雙核苷酸對甲基化的遺失(loss of methylation)，意即一般的低度甲基化，是癌細胞內的第一個超遺傳異常(epigenetic abnormality)；然而，在過去幾年內的研究卻顯示，特定位置(例如：一些腫瘤抑制基因)的高度甲基化(site-specific hypermethylation)與其功能的喪失有關，這可能會在癌症生成時提供選擇優勢(selective advantages)；在啟動子區域上CpG島的高度甲基化，可以藉由組蛋白修飾(histone modification)伴隨接續而來的基因默化現象(gene silencing)，來引起染色質改造(chromatin remodeling)；除了染色體缺失及基因突變之外，經由啟動子的高度甲基化所造成腫瘤抑制基因的超遺傳默化現象(epigenetic silencing)也常見於人類癌症中。

最近的流行病學研究顯示，血清葉酸鹽(serum folate)的濃度(一種甲基的主要來源)與HPV的感染和清除有關聯；在甲基週期(methyl cycle)的代謝作用中，酵素的基因多型性(genetic polymorphisms)也曾被報導與子宮頸上皮內病變的發展有關；如同超基因演化的觀念一般，DNA甲基化與子宮頸癌間關聯的研究也同樣盛行，子宮頸癌的DNA甲基化研究日與遽增，顯示使用甲基化作為子宮頸癌篩檢的可能性；由於遺傳與環境交互作用的特性，腫瘤抑制基因甲基化程度因不同的基因及不同的族群而異，不同的疾病也會有不同的甲基化表現型(methylator phenotypes)；然而，子宮頸癌的甲基化表現型以及其與HPV基因型的關聯仍未知，而子宮頸癌中有何特定的基因會被甲基化，以及需要多少基因方可達到臨床應用的需求，這些問題仍是未來需要被確認的議題。

由此可見，上述習用子宮頸癌篩檢方法仍有諸多缺失，實非一良善之設計者，而亟待加以改良。

本案發明人鑑於上述習用子宮頸癌篩檢方法所衍生的各項缺點，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件癌症篩檢的方法。

本案發明人先前已於台灣(TW Pat.Pub.No.200831900、TW Pat.Pub.No.201038739)、中國(CN Appl.No.200810094659.2、CN Appl.No.200910135501.X)、馬來西亞(UI20085354)及美國(US Pat.Pub.No.20080311570、US Pat.Pub.No.20110045465)提出相關專利申請(下稱前案)，本案係為前案之延伸，本案發明人發現新穎的癌症篩檢生物指標及其篩檢之方法。

本發明之目的即在於提供一種子宮頸癌篩檢的方法，以作為第一線子宮頸癌的篩檢(cancer screen)。

本發明之次一目的係在於提供一種子宮頸癌篩檢的方法，該方法除了可作為第一線子宮頸癌的篩檢之外，亦可作為第二線子宮頸癌的篩檢，輔助人類乳突病毒檢驗(HPV testing)或不確定的抹片結果，以達到更準確之子宮頸癌篩檢效果。

本發明之另一目的係在於提供一種癌症篩檢的方法，該方法除可應用在子宮頸癌的檢測上，亦可應用於其他癌症(如：卵巢癌、肝癌、大腸癌、乳癌、口腔癌、子宮內膜癌及惡性肉瘤)的檢測，以輔助異常檢體之判斷。

可達成上述發明目的之一種癌症篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為癌症有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據該目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有癌症或癌前病變，或作為治療預後的指標。

其中該受測檢體為子宮頸抹片、卵巢癌組織、腹水、血液、尿液、糞便、痰、口腔黏膜細胞、胃液、膽汁、子宮頸上皮細胞、或手術後之癌症組織等。

其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法包含但不限於甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)或變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)等。

其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列。

其中該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列。

其中該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列。

其中該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列。

其中該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列。

其中該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列。

其中該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列。

其中該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列。

其中該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。

其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測。

其中該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測。

其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。

此外，前述篩檢指標及篩檢方法進一步可用於子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、大腸癌、乳癌、口腔癌、子宮內膜癌及惡性肉瘤的篩檢。

術語「受測檢體」係指離體之受測樣本，該樣本包括前述之子宮頸抹片、腹水、血液、尿液、糞便、痰、口腔黏膜細胞、胃液、膽汁、子宮頸上皮細胞、或手術後之癌症組織等離體之檢體樣本。本發明之癌症篩檢方法係用於檢測該些離體樣本中目標基因甲基化的狀態，以作為各類癌症的篩檢指標。本發明所提供之癌症篩檢方法及其篩檢指標，可供檢測研究人員於實驗室中進行檢測。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

實施例一材料與方法一、材料

試驗材料包含一系列完整的子宮頸病變樣本，包括：鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)、腺癌(adenocarcinoma,AC)，以及正常子宮頸樣本。所有的子宮頸樣本(SCC+AC,n=20；normal,n=20)、卵巢樣本(cancer of ovary,n=19；normal,n=14)、大腸樣本(Ca of colon,n=18；normal,n=18)、肝組織樣本(HCC,n=18；normal,n=18)、口腔樣本(oral Ca,n=20；normal,n=19)、子宮內膜癌樣本(endometrial Ca,n=20；normal,n=20)、乳房組織樣本(cancer of breast,n=17；normal, n=17)、惡性肉瘤樣本(sarcoma,n=18；normal,n=16)均取自台北三軍總醫院，各樣本的基因組DNA(genomic DNA)以QIAamp DNA套組(QIAGEN)抽取，再以Millipore公司出產之DNA修飾套組(CpGenome^TM DNA Modification Kit,Millipore,Temecula,CA)進行亞硫酸鹽修飾作用，並用以比對分析全基因組中DNA甲基化的情形。

二、藉由全基因體甲基化晶片(Illuminea Infinium HumanMethylation27 BeadChip)進行DNA甲基化分析

分別自癌組織樣本與正常組織樣本萃取DNA，把萃取的DNA進行亞硫酸鹽修飾作用(Bisulfite modification)後並調整成同一濃度(ng/μl)，分別將濃度相同的癌組織樣本DNA或正常組織細胞樣本DNA各自混合成兩組待測樣品，於Infinium HumanMethylation27甲基化晶片(Illumina,San Diego,CA)分析全基因的甲基化程度，實驗步驟依原廠操作手冊進行，以Illumina晶片掃瞄機(Bead Array reader)及GenomeStudio 軟體(Illumina)分析晶片上各基因的甲基化程度。

Infinium HumanMethylation27甲基化晶片含括14,475個基因，可檢測這些基因共27,578個CpG位點的甲基化程度。CpG位點甲基化程度的分析則是以「β值」(β values)的數值來呈現，每個CpG位點的β值介於0與1之間，0代表無甲基化；而1則代表100%甲基化。

三、亞硫酸鹽修飾作用(Bisulfite modification)、甲基化特異性定量聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)以及焦磷酸定序(pyrosequencing)

使用Millipore公司出產之DNA修飾套組(CpGenome^TM DNA Modification Kit,Millipore,Temecula,CA)進行亞硫酸鹽修飾作用：取1μg樣本的基因組DNA(genomic DNA)，以亞硫酸鈉對基因組DNA進行化學修飾，在單鏈DNA中，所有非甲基化的胞嘧啶都會發生脫氨基作用而轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不被修飾，仍保持5-甲基胞嘧啶的狀態；最後，將反應後的樣本DNA溶於70μl 55℃的TE緩衝液(TE buffer)中，以進行甲基化特異性定量PCR(qMSP)。

另取人類周圍血(peripheral blood)的正常DNA進行亞硫酸鹽修飾作用，以作為具有非甲基化啟動子序列的對照組。

取1μg經過亞硫酸鹽修飾作用後的樣本基因組DNA，以及對照組DNA，以qMSP引子與探針進行甲基化特異性定量PCR分析，該qMSP引子和探針為可專一辨認甲基化基因序列，各目標基因的qMSP引子和探針序列如表一所示；甲基化特異性定量PCR反應物的總體積為20μl，包含1μl已修飾過的模版DNA、每一引子各250 nM、螢光探針225nM以及2X FastStart Universal Probe Master(Rox)(Roche)；將混合好的反應物置於ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System儀器，在95℃進行最初解離(denature)10分鐘，接著以95℃解離(denature)15秒、60℃黏合(annealing)與合成1分鐘為循環，解離、黏合、合成步驟共重複45個循環，以SDS 2.3軟體進行甲基化定量數據分析，設定軟體threshold=0.128與baseline介於3至15間。將內部對照基因COL2A與甲基化特異性基因的定量數據依甲基化索引(Methylation Index,Meth-Index)公式：100,00×2 ^{^}([(COL2A of Ct)-(Gene of Ct)]) 計算樣品中目標基因的甲基化程度。

使用焦磷酸定序分析目標基因片段的目的為精確定量目標基因CpG位點甲基化程度的百分比。進行焦磷酸定序之前，需先使用PyroMark Assay Design 2.0軟體(QIAGEN)設計生物素(biotin)標記的引子，使用PCR反應擴增涵蓋目標基因CpG位點的基因片段，再以焦磷酸定序檢測目標基因CpG位點的甲基化百分比。首先將已經過亞硫酸鹽修飾的子宮頸抹片細胞或組織樣本DNA加入含有生物素(biotin)標記的引子對及PyroMark PCR套組(QIAGEN)的PCR反應溶液，經PCR 反應擴增目標片段後，以2.0%瓊脂膠體確認PCR擴增片段是否正確，經PyroMark Q24 Vacuum Workstation(QIAGEN)進行DNA樣品的純化與變性，加入定序引子後於PyroMark Q24 System(QIAGEN)進行焦磷酸定序與甲基化分析。

實施例二甲基化目標基因之篩選

藉由Infinium HumanMethylation27K甲基化晶片進行篩選14,475基因，(1)選擇較高甲基化比率分數(β值>0.4與<0.4)、結合Gene Expression資料庫(GEO7803)、以及基因豐富性分析(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)篩選出92個基因；(2)癌細胞株(cancer cell line)經5-AZC與TSA處理樣本，以QRT-PCR分析這92個基因，確認基因表現會受甲基化的影響，剩下61個基因；(3)混合待測樣本由MSP分析這61個基因中DNA甲基化，剩下26個基因；(4)癌症試紙樣本由MSP分析這26個基因中DNA甲基化，剩下21個基因；(5)癌症組織由MSP分析這21個基因中DNA甲基化，剩下16個基因；(6)癌症試紙樣本由Q-MSP分析這16個基因中DNA甲基化，剩下 14個基因；由焦磷酸定序來確認基因甲基化狀態，最後篩選出九個目標基因於癌細胞可能具有高度甲基化現象，分別為ADRA1D(SEQ ID No：1)、AJAP1(SEQ ID No：2)、HS3ST2(SEQ ID No：3)、MAGI2(SEQ ID No：4)、POU4F2(SEQ ID No：5)、POU4F3(SEQ ID No：6)、PTGDR(SEQ ID No：7)、SOX17(SEQ ID No：8)以及SYT9(SEQ ID No：9)，其詳細資料如表三所示；由表三可知，這九個基因除了HS3ST2已知與大腸癌、乳癌等可能有關，POU4F2及SOX17已知乳癌及肝癌有關外，目前很少有研究顯示該些基因與子宮頸癌或其他癌症之間的關連。

實施例三子宮頸癌樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該九個目標基因在子宮頸鱗狀細胞癌樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於正常子宮頸樣本(SCCN)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為0.34、0.18、0.19、2.58、7.62、0.77、0.16、0.17以及0.31)；於子宮頸癌的樣本(SCC T)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為911.37、1558.97、1088.65、713.92、535.01、1552.71、305.84、248.29以及551.84)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.0001，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖一(A)、圖二(A)、圖三(A)、圖四(A)、圖五(A)、圖六(A)、圖七(A)、圖八(A)以及圖九(A)所示。

實施例四卵巢腫瘤樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該七個目標基因在卵巢腫瘤樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於良性卵巢腫瘤樣本(ovary N)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3以及PTGDR甲基化的程度(中位數分別為4.25、5.19、0.00、10.91、2.06、3.60以及1.57)；於惡性卵巢腫瘤的樣本(ovary T)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3以及PTGDR甲基化的程度(中位數分別為13.62、10.76、114.38、33.08、4.28、21.97以及28.40)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.05，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖一(B)、圖二(B)、圖三(B)、圖四(B)、圖五(B)、圖六(B)以及圖七(B)所示。

實施例五肝癌樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該五個目標基因在肝癌樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於正常肝臟組織樣本(HCC N)中ADRA1D、POU4F2、PTGDR、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為35.29、6.25、49.30、20.15以及19.70)；於肝癌的樣本(HCC T)中ADRA1D、POU4F2、PTGDR、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為202.10、53.73、275.76、111.25以及154.65)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.0001，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖一(C)、圖五(C)、圖七(C)、圖八(B)以及圖九(B)所示。

實施例六大腸癌樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該八個目標基因在大腸癌樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於正常大腸組織樣本(colon N)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為59.21、228.97、292.95、123.44、591.64、249.72、80.12以及52.63)；於大腸癌的樣本(colon T)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、 POU4F2、POU4F3、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為83.47、2312.91、2301.12、799.41、1615.48、1058.53、751.06以及601.65)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.05，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖一(D)、圖二(C)、圖三(C)、圖四(C)、圖五(D)、圖六(C)、圖八(C)以及圖九(C)所示。

實施例七乳癌樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該九個目標基因在乳癌樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於正常乳房組織樣本(breast Ca N)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為11.78、22.28、112.81、24.55、30.23、31.29、43.64、12.02以及5.53)；於乳癌的樣本(breast Ca T)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為57.19、260.96、281.64、193.70、77.06、310.34、341.97、77.05以及25.24)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.01，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖一(E)、圖二(D)、圖三(D)、圖四(D)、圖五(E)、圖六(D)、圖七(D)、圖八(D)以及圖九(D)所示。

實施例八口腔癌樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該七個目標基因在口腔癌樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於正常口腔組織樣本(oral Ca N)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、PTGDR以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為10.25、0.0065、115.98、0.00、30.23、10.47以及0.00)；於口腔癌的樣本(oral Ca T)中ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、PTGDR以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為26.44、0.0107、381.49、54.59、77.06、32.78以及10.85)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.05，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖一(F)、圖二(E)、圖三(E)、圖四(E)、圖五(F)、圖七(E)以及圖九(E)所示。

實施例九子宮內膜癌樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該七個目標基因在子宮內膜癌樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於正常子宮內膜組織樣本(Em N)中AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為0.00、0.00、0.00、16.42、0.31、0.00以及0.63)；於子宮內膜癌的樣本(Em T)中AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR以及SYT9甲基化的程度(中位數分別為535.78、1456.23、504.15、248.83、89.86、148.19以及0.43)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.05，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖二(F)、圖三(F)、圖四(F)、圖五(G)、圖六(E)、圖七(F)以及圖九(F)所示。

實施例十惡性肉瘤樣本內目標基因的甲基化分析

以甲基化特異性PCR(MSP)分析該二個目標基因在惡性肉瘤樣本中的甲基化狀態，結果顯示，於良性肉瘤樣本(sar N)中MAGI2以及POU4F3甲基化的程度(中位數分別為0.00以及0.31)；於惡性肉瘤樣本(sar T)中MAGI2以及POU4F3甲基化的程度(中位數分別為5.20以及89.86)。這兩組數據經過Mann-Whitney test分析後，各組間都達到P<0.05，其差異在統計學上是具有顯著差異的。以上如圖四(G)以及圖六(F)所示。

本發明所提供之癌症篩檢的方法，與前述習用技術相互比較時，更具有下列之優點：

1.本發明所提供之癌症篩檢的方法係以離體之檢體中特定基因的甲基化程度作為癌症有無的篩檢指標，與習用子宮頸抹片及人類乳突病毒檢驗(HPV testing)方法比較，本發明之癌症篩檢方法的敏感性及專一性均較前述兩者高。

2.本發明所提供之癌症篩檢的方法除可應用在子宮頸癌的檢測上，亦可應用於其他癌症(如：卵巢癌、肝癌、大腸癌、乳癌、口腔癌、子宮內膜癌及惡性肉瘤)的檢測，以輔助異常檢體之判斷。上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，例如：受測者檢體中各目標基因甲基化程度的判斷方式等變化之等效性實施例，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案所提供之癌症篩檢的方法確屬創新，並能較習用子宮頸癌篩檢方法增進上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

圖一為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因ADRA1D，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)肝、(D)大腸、(E)乳房以及(F)口腔組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖二為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因AJAP1，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)大腸、(D)乳房、(E)口腔以及(F)子宮內膜組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖三為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因HS3ST2，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)大腸、(D)乳房、(E)口腔以及(F)子宮內膜組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖四為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因MAGI2，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)大腸、(D)乳房、(E)口腔、(F)子宮內膜以及(G)惡性肉瘤組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖五為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因POU4F2，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)肝、(D)大腸、(E)乳房、(F)口腔以及(G)子宮內膜組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖六為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因POU4F3，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)大腸、(D)乳房、(E)子宮內膜以及(F)惡性肉瘤組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖七為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因PTGDR，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)卵巢腫瘤、(C)肝、(D)乳房、(E)口腔以及(F)子宮內膜組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖八為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因SOX17，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)肝、(C)大腸以及(D)乳房組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

圖九為本發明癌症篩檢方法所使用之目標基因SYT9，在各類正常與罹癌之(A)子宮頸、(B)肝、(C)大腸、(D)乳房、(E)口腔以及(F)子宮內膜組織樣本中，進行亞硫酸鹽定序(BS)分析甲基化程度之結果。

<110> 國防醫學院

<120> 一種癌症篩檢的方法III

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<212> DNA

<213> 人屬智慧種(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 人屬智慧種(Homo sapiens)

<400> 1

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<212> DNA

<213> 人屬智慧種(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 人屬智慧種(Homo sapiens)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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Claims

一種癌症篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為癌症有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據該目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有癌症或癌前病變，或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該受測檢體為子宮頸抹片、腹水、血液、尿液、糞便、痰、口腔黏膜細胞、胃液、膽汁、子宮頸上皮細胞、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種子宮頸癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為子宮頸癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、 AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有子宮頸癌或子宮頸癌前病變，或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第6項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該受測檢體為子宮頸抹片、血液、尿液、子宮頸上皮細胞、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第6項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該受測檢體為異常之子宮頸抹片。
如申請專利範圍第6項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該受測檢體為人類乳突病毒檢驗(HPV testing)呈陽性(positive)之子宮頸細胞檢體。
如申請專利範圍第6項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第6項所述之子宮頸癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第6項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種卵巢癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為卵巢癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有卵巢癌或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第13項所述之卵巢癌篩檢的方法，其中該受測檢體為卵巢癌組織、腹水、血液、尿液、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第13項所述之卵巢癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第13項所述之卵巢癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第13項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種肝癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為肝癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有肝癌或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第18項所述之肝癌篩檢的方法，其中該受測檢體為肝組織、糞便、胃液、膽汁、腹水、血液、尿液、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第18項所述之肝癌篩檢的方法，該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應 (methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第18項所述之肝癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第18項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種大腸癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為大腸癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有大腸癌或大腸癌前病變，或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第23項所述之大腸癌篩檢的方法，其中該受測檢體為大腸組織、腹水、血液、尿液、糞便、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第23項所述之大腸癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第23項所述之大腸癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1 係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第23項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種乳癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為乳癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有乳癌或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第28項所述之乳癌篩檢的方法，其中該受測檢體為血液、尿液、乳汁、乳房分泌物、囊腫、穿刺及切片檢體、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第28項所述之乳癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第28項所述之乳癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第28項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種口腔癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為口腔癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有口腔癌或口腔癌前病變，或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第33項所述之口腔癌篩檢的方法，其中該受測檢體為血液、口腔漱洗細胞、痰、口腔黏膜細胞、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第33項所述之口腔癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第33項所述之口腔癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第33項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種子宮內膜癌篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為子宮內膜癌有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有子宮內膜癌或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第38項所述之子宮內膜癌篩檢的方法，其中該受測檢體為血液、尿液、陰道沖洗物、經血、內膜刮取組織、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第38項所述之子宮內膜癌篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第38項所述之子宮內膜癌篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第38項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。
一種惡性肉瘤篩檢的方法，係檢測受測檢體細胞中目標基因甲基化的狀態，以作為惡性肉瘤有無的篩檢指標，該方法包含下列步驟：步驟1 提供一受測檢體；步驟2 檢測該受測檢體之基因組DNA中至少一個目標基因的CpG序列甲基化狀態，該目標基因係選自至少一個由ADRA1D、AJAP1、HS3ST2、MAGI2、POU4F2、POU4F3、PTGDR、SOX17以及SYT9所組成；以及步驟3 根據目標基因甲基化狀態的有無，判斷該檢體是否具有惡性肉瘤或作為治療預後的指標。
如申請專利範圍第43項所述之惡性肉瘤篩檢的方法，其中該受測檢體為血液、尿液、手術後之癌症組織等離體樣本。
如申請專利範圍第43項所述之惡性肉瘤篩檢的方法，其中該目標基因的CpG序列甲基化狀態檢測方法為甲基化特異性聚合酶連鎖反應(methylation-specific PCR,MSP)、定量甲基化特異性聚合酶連鎖反應(quantitative methylation-specific PCR,QMSP)、亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing,BS)、微陣列(microarrays)、質譜儀分析(mass spectrometer)、變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)或焦磷酸定序(pyrosequencing)。
如申請專利範圍第43項所述之惡性肉瘤篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D係具有如SEQ ID No：1所示之核苷酸序列，該目標基因AJAP1係具有如SEQ ID No：2所示之核苷酸序列，該目標基因HS3ST2係具有如SEQ ID No：3所示之核苷酸序列，該目標基因MAGI2係具有如SEQ ID No：4所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F2係具有如SEQ ID No：5所示之核苷酸序列，該目標基因POU4F3係具有如SEQ ID No：6所示之核苷酸序列，該目標基因PTGDR係具有如SEQ ID No：7所示之核苷酸序列，該目標基因SOX17係具有如SEQ ID No：8所示之核苷酸序列，該目標基因SYT9係具有如SEQ ID No：9所示之核苷酸序列。
如申請專利範圍第43項所述之癌症篩檢的方法，其中該目標基因ADRA1D甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：10-11所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因AJAP1甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：12-13所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因HS3ST2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：14-15所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因MAGI2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：16-17所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F2甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：18-19所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因POU4F3甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：20-21所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因PTGDR甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：22-23所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SOX17甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：24-25所示之核苷酸序列所偵測，該目標基因SYT9甲基化的狀態係由引子對如SEQ ID No：26-27所示之核苷酸序列所偵測；其中該引子包含至少有80%的序列同一性、互補性或至少連續十個核苷酸相同之序列。