JP2015177745A

JP2015177745A - 肺癌の検査方法

Info

Publication number: JP2015177745A
Application number: JP2014055322A
Authority: JP
Inventors: 近藤　豊; Yutaka Kondo; 豊近藤; 恵子新城; Keiko Shinjo; 馬場　嘉信; Yoshinobu Baba; 嘉信馬場
Original assignee: Aichi Prefecture
Current assignee: Aichi Prefecture
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2015-10-08

Abstract

【課題】ＤＮＡメチル化測定に基づいた肺癌の検査方法を提供する。
【解決手段】被験者の生物学的サンプルからＤＮＡを回収すること、該ＤＮＡについてＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定し、メチル化陽性であるとき肺癌であると評価することを含む、肺癌のインビトロ検査方法、並びに、ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、７種の遺伝子のＤＮＡメチル化異常を検出することを利用する肺癌の検査方法に関する。
本発明はまた、上記７種の遺伝子のＤＮＡメチル化の測定をＩＣＯＮプローブを用いて行う方法に関する。

肺癌は、日本人における癌死亡の第１の原因を占める難治性癌である。分子標的治療薬の登場に個別化医療が進んでいるが、治療成績の向上のためには早期診断及び早期治療が欠かせない。

近年、肺癌の検出のために特定の遺伝子のＤＮＡメチル化の検出を利用する方法が提案されている。そのような遺伝子として例えば、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子、ＰＥＮＫ遺伝子、ＨＯＸＡ１１遺伝子及びＳＦＲＰ２遺伝子などが知られている。

ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子については、ヒトの癌においてＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子のプロモーター部位の高メチル化が癌に関与すること（特許文献１及び２）、ＣｐＧアイランドがＤＮＡメチル化されたＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子を検出することによる癌の診断方法が知られている（特許文献３及び４）。

ＰＥＮＫ遺伝子については、肺腺癌においてＰＥＮＫプロモーターのＤＮＡメチル化が異なるパターンを示すことが知られている（特許文献５）。

ＨＯＸＡ１１遺伝子については、肺腺癌においてＤＮＡメチル化されている遺伝子の１つとして知られている（特許文献６）。

ＳＥＲＰ２遺伝子については、該遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧを検出するためのプライマー（特許文献７及び８）、並びに、サンプルにおいて癌を検出するための遺伝子としてＤＮＡメチル化されたＳＥＲＰ２が知られている（特許文献９及び１０）。

しかしながら、これらの遺伝子のＤＮＡメチル化の検出だけでは癌特異的な異常ＤＮＡメチル化を見出すことができない症例もあり、さらなる癌検査精度の向上が望まれている。また、これと併せて、侵襲性のかなり低い血液サンプルについて癌由来の微量ＤＮＡの異常ＤＮＡメチル化を検出する手法があれば、肺癌などの癌の簡便かつ早期の診断に役立つはずである。

特表２００８−０６７７１６号公報米国特許出願公開第２０１２／１２２０８８号米国特許出願公開第２００６／２１０９９０号米国特許出願公開第２０１０／１４３８９９号国際公開第ＷＯ２００７／０５０７７号米国特許出願公開第２００８／２３３１０１号再表２００８−１４９８５５号公報再表２０１１−２４９９９号公報国際公開第ＷＯ２００８／０８４２１９号米国特許出願公開第２００９／１５５７８６号

本発明の目的は、肺癌の検査に有用な遺伝子のＤＮＡメチル化マーカーを見出すことである。
本発明の別の目的は、上記のＤＮＡメチル化マーカーについてメチル化の有無を測定する肺癌の検査方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、血液中の癌由来の微量ＤＮＡのメチル化異常を検出可能とする新規のＤＮＡメチル化測定方法を提供することである。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、上記の目的を達成するために有用な７種の遺伝子を見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の特徴を包含する。

（１）被験者の生物学的サンプルからＤＮＡを回収すること、該ＤＮＡについてＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定し、メチル化陽性であるとき肺癌であると評価することを含む、肺癌のインビトロ検査方法。
（２）ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定することをさらに含む、上記（１）に記載の方法。
（３）生物学的サンプルが、喀痰、血液、胸水、尿、便又は肺組織である、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）測定を、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、パイロシークエンス法、定量的ＭＳＰ法、デジタルＰＣＲによるＭＳＰ法、バオサルファイトシークエンス法、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法又はＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定法によって行う、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）肺癌が肺腺癌である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。

（６）ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子と、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子がともにメチル化陽性であるとき肺癌であると評価する、上記（２）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）生物学的サンプルが血液であり、該血液からＤＮＡを回収することを含む、上記（６）に記載の方法。
（８）ＤＮＡのメチル化を、デジタルＰＣＲによるＭＳＰ法、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法又はＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定法により行う、上記（６）又は（７）に記載の方法。

（９）被験者の生物学的サンプルからのＤＮＡを、該ＤＮＡの塩基配列中のメチル化シトシンに結合する蛍光Ｉ標識ＩＣＯＮプローブと、該ＤＮＡのメチル化部位と非メチル化部位との両方に結合する蛍光ＩＩ標識コントロールプローブとを反応させる工程、並びに、各プローブ由来の蛍光の数を測定してメチル化レベルを決定する工程を含む、ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定方法。
（１０）蛍光ＩがＦＡＭ蛍光であり、蛍光ＩＩがＡｌｅｘａ６４７蛍光である、上記（９）に記載の方法。
（１１）癌が肺癌である、上記（１０）に記載の方法。
（１２）肺癌が肺腺癌である、上記（１１）に記載の方法。
（１３）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法におけるＤＮＡのメチル化の測定のために使用する、上記（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。

本発明により、肺癌、とりわけ肺腺癌の検出を特定の７種の遺伝子のＤＮＡメチル化異常を検出又は測定することによって可能となった。この７種の遺伝子のうち４種の遺伝子は肺癌のＤＮＡメチル化マーカーとして知られていたが、他の３種の遺伝子をＤＮＡメチル化マーカーとして組み合わせることによって、肺癌の検出精度を向上させることができるという格別の作用効果を提供する。また、上記７種の遺伝子をＤＮＡメチル化マーカーとしてＤＮＡのメチル化異常を検出又は測定するためのＩＣＯＮプローブを使用する方法は早期癌の検出を可能にする。

この図は、蛍光ラベルされたＩＣＯＮプローブ（ビピリジン化合物）を用いたＤＮＡメチル化検出法によるＤＮＡメチル化レベル（縦軸）と、人工的に作製したメチル化ＤＮＡの予測メチル化率（横軸）との相関を示すグラフである。ここで、１００％メチル化ＤＮＡはＳＳＳＩ処理により作製し、０％メチル化ＤＮＡはＧｅｎｏｍｉｐｈｉ処理により作製し、０％〜１００％メチル化率の希釈系列を調製した。この実験では、ＬＩＮＥ１遺伝子（■）とＰＥＮＫ遺伝子（●）を例示した。

本発明をさらに具体的に説明する。

１．肺癌の検査のための遺伝子のＤＮＡメチル化マーカーと方法
本発明は、第１の態様において、肺癌のインビトロ検査方法を提供する。該方法は、被験者の生物学的サンプルからＤＮＡを回収すること、該ＤＮＡについてＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定し、メチル化陽性であるとき肺癌であると評価することを含む。

ＧＦＲＡ１遺伝子、ＫＣＮＪ３遺伝子及びＯＳＡＰ遺伝子は、これまで肺癌の検査用マーカーになりうることを示す報告はなく、今回初めて肺癌のメチル化マーカーとしての有用性が明らかになった。

ＧＦＲＡ１（ＧＤＮＦｆａｍｉｌｙｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ１）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７７、ＨＧＮＣＩＤ：４２４３である。

ＫＣＮＪ３（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｉｎｗａｒｄｌｙ−ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙＪ，ｍｅｍｂｅｒ３）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２２３９、ＨＧＮＣＩＤ：６２６４である。

ＯＳＡＰ（ｏｖａｒｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子＝ＭＧＡＲＰ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ−ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２６２３、ＨＧＮＣＩＤ：２９９６９である。

後述の実施例によれば、上記３遺伝子中メチル化が１遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合、感度７４．７％、特異度９１．１％、偽陽性８．９％、偽陰性２５．３％であった。また、３遺伝子中メチル化が２遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合、感度４７．４％、特異度１００％、偽陽性０％、偽陰性５２．６％であった。

ここで、特異度は、肺腺癌陰性の人の数のうち真に陰性として判定される人の数の割合を指すが、３遺伝子中メチル化が１遺伝子以上のとき、２遺伝子以上のとき、それぞれ９１．１％、１００％となり、上記の３遺伝子は、肺腺癌陰性とする判定に高い特異性を有する。

本発明の好適な実施形態によれば、上記の３遺伝子（ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ）のメチル化の測定に加えて、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定することをさらに含めることができる。

後述の実施例によれば、上記の３遺伝子中メチル化が１遺伝子以上と４遺伝子中メチル化が１遺伝子以上を含む、すなわち７遺伝子中メチル化が２遺伝子以上を使用して肺腺癌を診断する場合、感度８０．０％、特異度９７．８％、偽陽性２．２％、偽陰性２０．０％であった。

ここで、感度は、肺腺癌陽性の人の数のうち真に陽性として判定される人の数の割合を指すが、上記の場合、感度が８０．０％であり、また、特異度が９７．８％であり、上記の３遺伝子と上記の４遺伝子を組み合わせることによる肺腺癌の陰性及び陽性の精度は高まる。

重要なことは、上記の４遺伝子のみで肺癌と判定できなかった１４症例が、これらの４遺伝子と上記３遺伝子を組み合わせることによって複数の遺伝子（すなわち２遺伝子以上）で陽性として判定可能であったことから、判定精度が向上する。

４遺伝子の配列情報は、以下のとおり、ＧｅｎＢａｎｋやＨＧＣＮから入手可能である。

ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２Ａ）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００７７、ＨＧＮＣＩＤ：１７８７である。

ＨＯＸＡ１１（ｈｏｍｅｏｂｏｘＡ１１）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５５２３、ＨＧＮＣＩＤ：５１０１である。

ＰＥＮＫ（ｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６２１１、ＨＧＮＣＩＤ：８８３１である。

ＳＦＲＰ２（ｓｅｃｒｅｔｅｄｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２）遺伝子の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３０１３、ＨＧＮＣＩＤ：１０７７７である。

生物学的サンプルは、非限定的に、喀痰、血液、胸水、尿、便、肺組織などである。このうち、血液は、癌由来のＤＮＡが微量のためＤＮＡメチル化異常を検出することが難しいが、本発明の方法を使用することによって上記のＤＮＡメチル化異常を検出できるようになった。

各サンプルから、フェノール／クロロホルム法などの一般的な手法によってＤＮＡを抽出することができる。ＤＮＡ抽出キットが市販されているので、そのようなキットを使用すると便利である。

本発明の方法では、上記遺伝子のメチル化を検出する。遺伝子上の好ましいメチル化部位は、該遺伝子のエクソン領域、イントロン領域、５'非翻訳領域、３'非翻訳領域、又はプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域であり、この領域の塩基配列の異常なメチル化が検出または測定される。「ＣｐＧ領域」は、ＣＧ配列に富む領域であり、例えば約２０〜３５％またはそれ以上のＣ＋Ｇの塩基を含む領域である。

本明細書における「異常なメチル化」、「メチル化異常」などの用語は、上記７種の遺伝子について、肺腺癌などの肺癌に罹患した患者の上記遺伝子の特定領域に、正常人には実質的に認められないメチル化が存在する場合に使用される。

ＤＮＡメチル化測定は、市販のキット等を用いてＤＮＡをバイサルファイト変換したのち、非限定的に、例えばメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、パイロシークエンス法、定量的ＭＳＰ法、デジタルＰＣＲによるＭＳＰ法、バオサルファイトシークエンス法、又は次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法によって行うことができる。また、バイサルファイト変換を必要としない新規の手法である、ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定法によってもＤＮＡメチル化を測定することができる。これらの手法については後述の実施例等でも説明されている。

例えば、一般的に使用されているメチル化特異的ＰＣＲ法（Ｊ．Ｇ．Ｈｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９６，９３：９８２１−９８２６；Ｃ．Ａ．Ｅａｄｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０００，２８：Ｅ３２；Ｋ．Ｒａｎｄｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２００２，２７：１１４−１２０；Ｄ．Ｔ．Ａｋｅｙｅｔａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２００２，８０：３７６−３８４）によってＤＮＡメチル化を検出することができる。また、メチル化のレベルは、例えばパイロシークエンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法（Ｓ．Ｃｏｌｅｌｌａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２００３，３５：１４６−１５０；Ｊ．Ｔｏｓｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２００３，３５：１５２−１５６）によって測定可能である。

メチル化特異的ＰＣＲ法（ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ；ＭＳＰ）は、重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理したＤＮＡを鋳型にし、ＰＣＲを行うことによってメチル化の有無を調べる方法である。重亜硫酸ナトリウムは、ＤＮＡ上のシトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシン（ＣｐＧのシトシン残基の５'位のメチル化）ではこの変換反応が起こらない。

ＰＣＲ用プライマーとして、メチル化されている場合に増幅されるメチル化特異的プライマーセットと、メチル化されていない場合に増幅される非メチル化特異的プライマーセットの２種類が使用される。具体的には、これらのプライマーは、ＣｐＧ領域の遺伝子配列を基準にして選択し、例えばＤＮＡ自動合成機を使用することによって作製することができる。

ＰＣＲによる増幅後に、この２種類のプライマーセットからの増幅産物の比を比較することによってメチル化の有無を決定する。すなわち、メチル化特異的プライマーによる増幅産物が、試験検体で検出された時、問題の遺伝子がメチル化されていると判定する。このプライマーは、元の配列に近い配列を増幅し検出する際に有効である。一方、非メチル化特異的プライマーは、重亜硫酸ナトリウムの処理で変化した配列を検出する際に有効である。さらにまた、試験検体の重亜硫酸ナトリウムで処理後のＤＮＡの質的評価としてメチル化の有無に関わらずＰＣＲ増幅が行われる例えばＬＩＮＥ１プライマー（特開２０１０−２７９３１１号公報）を用いるときには、（メチル化特異的プライマーによる増幅産物）対（ＬＩＮＥ１プライマーによる増幅産物）の比によりメチル化ＤＮＡの量的診断も可能となる。

パイロシークエンス法、定量的メチル化ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）法、デジタルＰＣＲ法、又は次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法で使用可能なプライマーセットの非限定的な例は、以下のとおりである。これらのプライマーセットは、肺癌検査用キットとしても使用も可能である。

（パイロシークエンス法の場合）
ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子：配列番号１〜３
ＧＦＲＡ１遺伝子：配列番号４〜６
ＨＯＸＡ１１遺伝子：配列番号７〜９
ＯＳＡＰ遺伝子：配列番号１０〜１２
ＰＥＮＫ遺伝子：配列番号１３〜１５
ＳＦＲＰ２遺伝子：配列番号１６〜１８
ＫＣＮＪ３遺伝子：配列番号１９〜２１

（定量的メチル化ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）法及びデジタルＰＣＲ法の場合）
ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子：配列番号２２及び２３（メチル化特異的プラーマー）、配列番号２５及び２６（非メチル化特異的プライマー）
ＧＦＲＡ１遺伝子：配列番号２８及び２９（メチル化特異的プラーマー）、配列番号３０及び３１（非メチル化特異的プライマー）
ＨＯＸＡ１１遺伝子：配列番号３２及び３３（メチル化特異的プラーマー）、配列番号３４及び３５（非メチル化特異的プライマー）
ＯＳＡＰ遺伝子：配列番号３６及び３７（メチル化特異的プラーマー）、配列番号３９及び４０（非メチル化特異的プライマー）
ＰＥＮＫ遺伝子：配列番号４２及び４３（メチル化特異的プラーマー）、配列番号４４及び４５（非メチル化特異的プライマー）
ＳＦＲＰ２遺伝子：配列番号４６及び４７（メチル化特異的プラーマー）、配列番号４９及び５０（非メチル化特異的プライマー）
ＫＣＮＪ３遺伝子：配列番号５２及び５３（メチル化特異的プラーマー）、配列番号５４及び５５（非メチル化特異的プライマー）
（次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法の場合）
ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子：配列番号５６及び５７
ＧＦＲＡ１遺伝子：配列番号５８及び５９
ＨＯＸＡ１１遺伝子：配列番号６０及び６１
ＯＳＡＰ遺伝子：配列番号６２及び６３
ＰＥＮＫ遺伝子：配列番号６４及び６５
ＳＦＲＰ２遺伝子：配列番号６６及び６７
ＫＣＮＪ３遺伝子：配列番号６８及び６９

本発明において、肺癌は、非小細胞肺癌であり、これには、腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌が含まれる。好ましい肺癌は、肺腺癌である。肺腺癌は、肺癌のなかで約５０％以上を占め、肺の末梢にできやすく、遠隔転移しやすいという性質を有している。

本発明の好適な実施形態によれば、本発明の方法は、ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子と、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子がともにメチル化陽性であるとき肺癌、好ましくは非小細胞肺がん、より好ましくは肺腺癌、であると評価することを含む。

メチル化は、肺癌、より好ましくは肺腺癌、に特異的な異常メチル化であることが好ましい。３遺伝子群から１遺伝子以上と４遺伝子群から１遺伝子以上の、合せて２遺伝子以上のメチル化陽性を検出又は測定することによって肺癌であると評価する（又は、そのような評価を補助若しくは支援する）確度が高まる。

本発明の方法ではさらに、生物学的サンプルとして被験者の血液を使用することができる。血液中の癌由来のＤＮＡは微量であるため、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法、デジタルＰＣＲ法、ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定法（下記参照）などの高感度ＤＮＡメチル化検出法を使用する必要がある。上記と同様に７種の遺伝子のＤＮＡメチル化を測定可能とするプライマーやプローブを組み合わせて用いることによってメチル化検出を行うことができる。

２．ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定方法
本発明はさらに、被験者の生物学的サンプルからのＤＮＡを、該ＤＮＡの塩基配列中のメチル化シトシンに結合する蛍光Ｉ標識ＩＣＯＮプローブと、該ＤＮＡのメチル化部位と非メチル化部位との両方に結合する蛍光ＩＩ標識コントロールプローブとを反応させる工程、並びに、各プローブ由来の蛍光の数を測定してメチル化レベルを決定する工程を含む、ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定方法を提供する。

ＩＣＯＮプローブは、東京大学の岡本晃光博士らによって開発された、特定のＤＮＡ配列内の１つのメチル化シトシンに結合するプローブ（ビピリジン化合物）である（Ｋ．ＴａｉｎａｋａａｎｄＡ．Ｏｋａｍｏｔｏ，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍ２０１１Ｄｅｃ；Ｃｈａｐｔｅｒ８：Ｕｎｉｔ８．７．１−１７）。このプローブをＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）で蛍光ラベル（緑）し、コントロールプローブをＡｌｅｘａ６４７（赤）でラベルする場合、この２種類のプローブをＤＮＡに反応すると、非メチル化ＤＮＡはコントロールプローブのみに結合するため赤色の蛍光として観察され、一方、メチル化ＤＮＡは、ＩＣＯＮプローブとコントロールプローブが結合するため黄色の蛍光として観察される。このとき、蛍光は、高感度の蛍光顕微鏡で観察することができる。また、メチル化レベルは、（黄色蛍光の数）÷（黄色蛍光の数＋赤色蛍光の数）×１００（％）で算出できる。このようにして算出されたＤＮＡメチル化レベルは、人工的に作成したメチル化ＤＮＡの予測メチル化率と高い相関を示す（図１）。

上記の蛍光Ｉと蛍光ＩＩの組み合わせの例には、ＦＡＭとＡｌｅｘａ６４７の組み合わせ、Ａｌｅｘａ４８８とＣｙ５の組み合わせなどがある。
上記の方法で使用可能なプローブを以下に例示する。これらのプローブのセットは、肺癌検査用キットとしても使用も可能である。

ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６遺伝子：配列番号７０（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号７１（コントロールプローブ）
ＧＦＲＡ１遺伝子：配列番号７２（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号７３（コントロールプローブ）
ＨＯＸＡ１１遺伝子：配列番号７４（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号７５（コントロールプローブ）
ＯＳＡＰ遺伝子：配列番号７６（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号７７（コントロールプローブ）
ＰＥＮＫ遺伝子：配列番号７８（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号７９（コントロールプローブ）
ＳＦＲＰ２遺伝子：配列番号８０（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号８１（コントロールプローブ）
ＫＣＮＪ３遺伝子：配列番号８２（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号８３（コントロールプローブ）
ＬＩＮＥ１遺伝子：配列番号８４（ＩＣＯＮプローブ）、配列番号８５（コントロールプローブ）

本発明の方法は、バイサルファイト変換を必要とせず、また、血液中の癌由来の微量ＤＮＡのメチル化異常を検出する方法としても使用することができる。この方法は、簡便であり、かつ、微量ＤＮＡをロスすることなく分析に使用できる。検出においては、蛍光顕微鏡の他に、マイクロアレイ、スキャナーによる蛍光検出などが可能であると考えられる。
本発明の方法は、被験者における肺癌、より好ましくは肺腺癌、の検査や、上記１節に記載の方法でのＤＮＡメチル化検出などに使用できる。

上記の１節及び２節に記載された特定のプラーマーセット及びプライマーセットは、肺癌（好ましくは非小肺癌、より好ましくは肺腺癌）の検査用キットとして使用できる。キットには、他に、使用説明書、ＤＮＡ抽出キット、ＰＣＲ測定キットなどを包含させることができる。

以下の実施例によって本願発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、その実施例に制限されないものとする。

（実施例１）
＜種々のＤＮＡメチル化検出法による肺腺癌の検出＞
［Ｉ］実験手順
（１）ＤＮＡ抽出
腫瘍組織及び正常肺組織ＤＮＡについて、肺腺癌患者の手術検体から得られた腫瘍組織もしくは正常肺組織からＤＮＡを抽出した。方法はフェノール／クロロホルムを用いた一般的手法である。

また、血液中ＤＮＡについて、肺腺癌患者の手術時に末梢血約５ｍｌをＥＤＴＡ−Ｎａスピッツに採取し、フィコールを用いて血漿のみを分離し、−８０℃に保存した。血液中のＤＮＡはキアゲン社のＱＩＡｍｐＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄキットを用いて抽出した。

上記の肺腺癌患者は、愛知県がんセンターにて手術を受けた患者であり、該患者に対しインホームドコンセントにより研究へのサンプル提供が要請された。

（２）バイサルファイト変換
組織由来ＤＮＡ及び血液由来ＤＮＡはキアゲン社のＥｐｉＴｅｃｔＰｌｕｓＤＮＡＢｉｓｕｌｆｉｔｅキットを用いてバイサルファイト変換を行った。ＤＮＡは５００ｎｇから２μｇを使用し、最終２５μｌで溶出した。バイサルファイト変換を行ったうえでメチル化アッセイ（パイロシークエンス法、定量的メチル化ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）法、デジタルＰＣＲ法、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス）を行った。

（３）パイロシークエンス法
バイサルファイト変換後のサンプルをＰＣＲで目的遺伝子領域を増幅する。ＰＣＲはＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８６７０ｍＭ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１６６ｍＭ，ＭｇＣｌ_２６７ｍＭ， βメルカプトエタノール１００ｍＭ）、プライマー０５．ｐｍｏｌ、ＭｇＣｌ_２３ｍＭ、ｄＮＴＰ１．２５ｍＭ、ポリメラーゼ（ＴａｋａｒａｒＴａｑ）１Ｕを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９５℃ ３０秒、アニーリング温度３０秒、７２℃ ３０秒で５０サイクル行った。各遺伝子のアニーリング温度は、ＨＯＸＡ１１５５℃，ＯＳＡＰ５７．５℃，ＳＦＲＰ２５６℃，ＧＦＲＡ１５２．５℃である。

得られたＰＣＲ産物を用いてパイロシークエンスによりメチル化率を解析した。ＰＣＲ産物はビオチンを利用して選別し、シークエンスプライマーをアニールさせることでシークエンスを行った。

測定に使用したプライマーは、７種の遺伝子について以下のものを使用した。Ｆｗｄは、フォワード（正方向）プライマーを表し、Ｒｅｖは、リバース（逆方向）プライマーを表し、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒは、パイロシークエンサーでアニールさせるプライマーを表す。

（CDKN2A/p16）
Fwd: GGTTGTTTTYGGTTGGTGTTTT（配列番号１）
Rev: Biotin-ACCCTATCCCTCAAATCCTCTAAAA（配列番号2）
Sequence primer： TTTTTGTTTGGAAAGAT（配列番号3）
（GFRA1）
Fwd: GYGGGYGAGTTTAGGAGGGAGTT（配列番号4）
Rev: GGGACACCGCTGATCGTTTAAAAAAACCCTCRACCTACTCCTATT（配列番号5）
Sequence primer： TAGGAGGGAGTTGGAG（配列番号6）
（HOXA11）
Fwd: TTTTTTGTTAAGGATGGGGATAGA（配列番号7）
Rev: GGGACACCGCTGATCGTTTAAACCACCCTCATCAAAATCCATTAT（配列番号8）
Sequence primer： AGTGGAGAATTATGTTAAGT（配列番号9）
（OSAP）
Fwd: GGGACACCGCTGATCGTTTAGGAGGATGGTGAGGATTATAAAGG（配列番号10）
Rev: AACTACCCTTCCACAAAAAAACT（配列番号11）
Sequence primer： AAAAAAACTAAAAACCTAAC（配列番号12）
（PENK）
Fwd: GGAAAAGAGTYGGGTGTTTTAGG（配列番号13）
Rev: GGGACACCHCTGATCGTTTACCCRACCRACAACTTTTAAAT（配列番号14）
Sequence primer： GGGTGTTTTAGGTAGT（配列番号15）
（SFRP2）
Fwd: GGGACACCGCTGATCGTTTAGGTTTATTTT（配列番号16）
Rev: CCRAAATTCRAACTTATCCC（配列番号17）
Sequence primer： CCCRCTCTCTTCRCTAAATA（配列番号18）
（KCNJ3）
Fwd: GGGATTTTGGTTAAAAGATAGGA（配列番号19）
Rev: GGGACACCGCTGATCGTTTAAATCCCAACCCACCTACCAA（配列番号20）
Sequence primer： TTAAAAGATAGGAGATAGGT（配列番号21）

（４）定量的メチル化ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）法
バイサルファイト変換後のサンプルをメチル化配列特異的プライマー、メチル化に関係ない領域のコントロールプライマーを用いてＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法でリアルタイムＰＣＲを行った。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ、プライマー０５．ｐｍｏｌを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、サンプルと同時に０％メチル化および１００％メチル化サンプルをコントロールとしてＰＣＲを行い、サイクル数を比較することでメチル化率を計算した。

測定に使用したプライマーは、７種の遺伝子について以下のものを使用した。Ｍは、メチル化を示し、ＵＭは、非メチル化を示す。Ｍ−ｐｒｏｂｅ（ＦＡＭ）は、メチル化特異的プローブを表し、ＵＭ−ｐｒｏｂｅ（ＶＩＣ）は、非メチル化特異的プローブを表す。

（CDKN2A/p16）
M-Fwd: TTGGTAGTTAGGAAGGTTGTATCGC（配列番号22）
M-Rev: TCCCTACTCCCAACCGCG（配列番号23）
M-probe(FAM): ACGTTTTTGTTGGTAGGCGG（配列番号24）
UM-Fwd: GGTAGTTAGGAAGGTTGTATTGT（配列番号25）
UM-Rev: TCCCTACTCCCAACCACA（配列番号26）
UM-probe(VIC): TATGTTTTTGTTGGTAGGTGG（配列番号27）
（GFRA1）
M-Fwd: TCGAGTCGAGGGTTTTGTTC（配列番号28）
M-Rev: CTCCTTCCCTTTCCGAACTC（配列番号29）
UM-Fwd: GGTGGGAATAGGAGTAGGTT（配列番号30）
UM-Rev: AATTTCCAAACAAAACCCTCAA（配列番号31）
（HOXA11）
M-Fwd: TTAAGGACGGGGATAGATTTTTAC（配列番号32）
M-Rev: CTCCGCGATAACCGAACTTA（配列番号33）
UM-Fwd: TTAAGGATGGGGATAGATTTTTAT（配列番号34）
UM-Rev: CCTTAAACTCTCCACAATAACCAAA（配列番号35）
（OSAP）
M-Fwd: GGATGAAGGTCGACGTGTTTTTTTC（配列番号36）
M-Rev: CAACGACAACGCCAAAATCT（配列番号37）
M-probe(FAM): TTCGGGCGGGGCGT（配列番号38）
UM-Fwd: GGGTTGGATGAAGGTTGATG（配列番号39）
UM-Rev: CCCTCAACAACAACACCAAAA（配列番号40）
UM-probe(VIC): TTTGGGTGGGGTGTTGT（配列番号41）
（PENK）
M-Fwd: AATTTTGTTTTGGGTCGCGGAC（配列番号42）
M-Rev: CTCGCGATTCCCGAAATAAC（配列番号43）
UM-Fwd: TTGTGGATGTTTAGGAAAAGAGTT（配列番号44）
UM-Rev: ACCCTCCCAACCAACAACTT（配列番号45）
（SFRP2）
M-Fwd: GTTTCGTTCGCGTTGTTTTTTC（配列番号46）
M-Rev: ACCCGCTCTCTTCGCTAAAT（配列番号47）
M-probe(FAM): TTTTTCGGGGTTTCGAGTCG（配列番号48）
UM-Fwd: TGTTTTGTTTGTGTTGTTTTTTT（配列番号49）
UM-Rev: CCCAAACCCACTCTCTTCAC（配列番号50）
UM-probe(VIC): TTTTGGGGTTTTGAGTTGTA（配列番号51）
（KCNJ3）
M-Fwd: GGTTTTTGGAGTTCGGAATTC（配列番号52）
M-Rev: CCCGCCCAAAAACATATCTA（配列番号53）
UM-Fwd: GGGGGTGTTGTATTAGTGTTTG（配列番号54）
UM-Rev:CCAACCCACCTACCAACTCA（配列番号55）

（５）デジタルＰＣＲ法
バイサルファイト変換後のサンプルをメチル化配列特異的プライマー（Ｍ）、非メチル化配列特異的プライマー（ＵＭ）を用いてＴａｑＭａｎ法を用いたドロップレットＰＣＲを行う。反応後のドロップレットをＱＸ１００ＤｒｏｐｌｅｔＲｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）により蛍光をカウントしサンプル中のコピー数を算出する。Ｍプライマーでのカウント数とＵＭプライマーでのカウント数とを合わせて計算することにより、サンプルのメチル化率を算出した。
測定に使用したプライマーは、上記のｑＭＳＰと同じプライマーである。

（６）次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法
バイサルファイト変換後のサンプルを用いてＰＣＲを行い、目的遺伝子領域を増幅する。ＰＣＲバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８６７０ｍＭ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１６６ｍＭ，ＭｇＣｌ_２６７ｍＭ， βメルカプトエタノール１００ｍＭ）、プライマー０５．ｐｍｏｌ、ＭｇＣｌ_２３ｍＭ、ｄＮＴＰ１．２５ｍＭ、ポリメラーゼ（ＴａｋａｒａｒＴａｑ）１Ｕを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９５℃ ３０秒、アニーリング温度３０秒、７２℃ ３０秒で５０サイクル行った。アニーリング温度はＨＯＸＡ１１５７．５℃，ＯＳＡＰ６０℃，ＳＦＲＰ２５０℃，ＧＦＲＡ１５２．５℃，ＫＣＮＪ３５７．５℃，ＰＥＮＫ５７．５℃，ｐ１６６４℃から６０℃に段階的に下げる、の各温度である。得られた産物はキアゲン社ＱＩＡｑｉｃｋＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにて精製した。精製産物はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社のＮＥＢｎｅｘｔＤＮＡｌｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＭａｓｔｅｒＭｉｘＳｅｔｆｏｒＩｌｌｕｍｉｎａを用いて次世代シークエンス用にライブラリーを作成した。次世代シークエンスはイルミナ社ＭｉＳＥＱを用いて行った。
測定に使用したプライマーは、７種の遺伝子について以下のものを使用した。

（CDKN2A/p16）
Fwd: GTATYGYGGAGGAAGGAAA（配列番号56）
Rev: AACTCCTCCCCACCTACCC（配列番号57）
（GFRA1）
Fwd: GGYGAGTTTAGGAGGGAGTT（配列番号58）
Rev: CRTATTCCRAAACCAAATTTCT（配列番号59）
（HOXA11）
Fwd: TTTTGTTAAGGATGGGGATAGATT（配列番号60）
Rev: AACCACRCTCATCAAAATCC（配列番号61）
（OSAP）
Fwd: AGATGGGTTAGGGGAGGATG（配列番号62）
Rev: AAACRCAAACTACCCTTCCA（配列番号63）
（PENK）
Fwd: GGAAAAGAGTYGGGTGTTTTAGG（配列番号64）
Rev: CCCRACCRACAACTTTTAAAT（配列番号65）
（SFRP2）
Fwd: AAYGGTTTATTTTGTTTTTT（配列番号66）
Rev: RCCCGCTCTCTTCRCTAAAT（配列番号67）
（KCNJ3）
Fwd: GGYGGATAGGTTTTTGGAGT（配列番号68）
Rev: AATCTCCCRCCCCCTAAA（配列番号69）

［ＩＩ］肺腺癌の検出に有効な遺伝子のスクリーニング
肺腺癌と診断された４１人の患者の臨床検体（肺癌組織及び正常肺組織）からＤＮＡを抽出した後、制限酵素のイソシゾマー性質を利用したＭＣＡ（methylated CpG island amplification）法を用いて、メチル化しているＤＮＡ断片を増幅したうえで回収し、マイクロアレイ（アジレント社、Ｇ4497Ａ）で解析した。高頻度でメチル化している遺伝子を選択し、別のメチル化検出法（パイロシークエンス法及び定量的ＭＳＰ法）によってメチル化レベルの検証を行い、正常組織ではメチル化が検出されず、肺腺癌組織でのみDNAメチル化を示す７種の遺伝子、すなわちＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２遺伝子を最終的に選択した。７遺伝子のうち、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４種の遺伝子はメチル化マーカーとして肺癌の検出において知られている（上記「背景技術」参照）が、ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰの３種の遺伝子については肺癌のメチル化マーカーとなりうることが今回初めて見出された。
上記の７遺伝子の配列情報については、以下のとおりＧｅｎＢａｎｋ等から入手可能である。

CDKN2A/p16 (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)
RefSeq: NM_000077
HGNC ID: 1787
GFRA1(GDNF family receptor alpha 1)
RefSeq: NM_145793
HGNC ID: 4243
HOXA11 (homeobox A11)
RefSeq: NM_005523
HGNC ID: 5101
OSAP (ovary-specific acidic protein) = MGARP(mitochondrial-localized glutamic acid-rich protein)
RefSeq: NM_032623
HGNC ID: 29969
PENK (proenkephalin)
RefSeq: NM_006211
HGNC ID: 8831
SFRP2 (secreted frizzled-related protein 2)
RefSeq: NM_003013
HGNC ID: 10777
KCNJ3 (potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member3)
RefSeq: NM_002239
HGNC ID: 6264

以下で説明するように、上記４遺伝子、上記３遺伝子、或いはそれらの組み合わせによって、ＤＮＡメチル化しているものを陽性とした場合、肺腺癌を高い特異度で検出可能であった。

［ＩＩＩ］７遺伝子のメチル化と肺腺癌の検出との関係
上で選択された７種の遺伝子のメチル化マーカーについて、肺腺癌患者からの肺組織臨床サンプル（腫瘍組織９５検体、正常組織４５検体）を用いてＤＮＡメチル化検出法にてメチル化の有無を測定した。メチル化されている場合陽性とし、メチル化されていない場合陰性とした。上記の７遺伝子、４遺伝子又は３遺伝子について、それぞれの遺伝子群のなかで何個の遺伝子がメチル化されているかを調べ、例えば１遺伝子以上の場合又は２遺伝子以上の場合を肺腺癌と判定すると仮定し、測定結果から感度、特異度、偽陽性、及び偽陰性を決定した。

感度は、（真陽性の数）÷（真陽性の数＋偽陰性の数）で表される。
特異度は、（真陰性の数）÷（真陰性の数＋偽陽性の数）で表される。
偽陽性は、（真陽性の数）÷（真陽性の数＋偽陽性の数）で表される。
偽陰性は、（真陰性の数）÷（真陰性の数＋偽陰性の数）で表される。

（１）３遺伝子（ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ）中メチル化が１遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合
結果を表１に示した。

表において、「１以上」は、メチル化が１遺伝子以上の症例数が７１であることを示し、「１未満」は、メチル化が０の症例数が２４であることを示す。
感度７４．７％、特異度９１．１％、偽陽性８．９％、偽陰性２５．３％であった。

（２）３遺伝子（ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ）中メチル化が２遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合
結果を表２に示した。

表において、「２以上」は、メチル化が２遺伝子以上の症例数が４５であることを示し、「２未満」は、メチル化が１遺伝子又は０の症例数が５０であることを示す。
感度４７．４％、特異度１００％、偽陽性０％、偽陰性５２．６％であった。

（３）４遺伝子（ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１、ＳＦＲＰ２）中メチル化が１遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合
結果を表３に示した。

表において、「１以上」は、メチル化が１遺伝子以上の症例数が８５であることを示し、「１未満」は、メチル化が０の症例数が１０であることを示す。
感度８９．５％、特異度８８．９％、偽陽性１１．１％、偽陰性１０．５％であった。

（４）４遺伝子（ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１、ＳＦＲＰ２）中メチル化が２遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合
結果を表４に示した。

表において、「２以上」は、メチル化が２遺伝子以上の症例数が６６であることを示し、「２未満」は、メチル化が１遺伝子又は０の症例数が２９であることを示す。
感度６９．５％、特異度１００％、偽陽性０％、偽陰性３０．５％であった。

（５）７遺伝子（ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１、ＳＦＲＰ２）中メチル化が１遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合
結果を表５に示した。

表において、「１以上」は、メチル化が１遺伝子以上の症例数が８６であることを示し、「１未満」は、メチル化が０の症例数が９であることを示す。
感度９０．５％、特異度８２．２％、偽陽性１７．８％、偽陰性９．５％であった。

（６）７遺伝子（ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１、ＳＦＲＰ２）中メチル化が２遺伝子以上であるときを肺腺癌とする場合
結果を表６に示した。

表において、「２以上」は、メチル化が２遺伝子以上の症例数が７６であることを示し、「２未満」は、メチル化が１遺伝子又は０の症例数が１９であることを示す。
感度８０．０％、特異度９７．８％、偽陽性２．２％、偽陰性２０．０％であった。

（７）３遺伝子（ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３、ＯＳＡＰ）から１遺伝子以上と４遺伝子（ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１、ＳＦＲＰ２）から１遺伝子以上を含む２遺伝子以上を使用して肺腺癌を診断する場合
結果を表７に示した。

（実施例２）
＜ＩＣＯＮプローブ反応を利用する高感度ＤＮＡメチル化測定＞
ＩＣＯＮプローブはジーンデザイン社製のものを使用した。メチル化ＤＮＡに結合するメチル化プローブにはＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）蛍光（緑）を、コントロールプローブにはＡｌｅｘ６４７蛍光（赤）を付加している。ゲノムＤＮＡ５００ｎｇを９５℃５分加熱し１本鎖にしたのち、バッファー（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｏｓｍａｔｅ５ｍＭ，Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ１００ｍＭ，Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．７５０ｍＭ，ＥＤＴＡ０．５ｍＭ，ＮａＣｌ１Ｍ）とプローブ０．００２ｐｍｏｌとを加え０℃で１５分反応させる。反応後はキアゲン社のＱＩＡｑｉｃｋＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いて精製し、最終３０μｌで溶出した。

観察用ガラス（松浪２４×６０ｍｍカバーガラス）は１ＮＮａＯＨで４０分で洗浄後、超純水にて洗浄し乾燥したものを使用した。

サンプルはガラス上に滴下したのち、カバーガラス（松浪５×５ｍｍカバーガラス）をかぶせたのちに顕微鏡（オリンパス、高感度全反射蛍光イメージングシステム）で観察した。

細胞株由来のＤＮＡをＳｓｓＩメチラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）処理して作成した１００％メチル化サンプルと、ゲノムＤＮＡ増幅試薬（ＧＥＩｌｌｕｓｔｒａＧｅｎｏｍｉＰｈｉＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）を用いてＤＮＡ増幅して作成した０％メチル化サンプルとを混合し、０，１，１０，２５，５０，７５，９０，９９，１００％の各メチル化率のサンプルを作成した。このサンプルを用いてＩＣＯＮプローブ反応を行い、上記の顕微鏡で観察した。

ＩＣＯＮプローブ配列としては、以下のものを使用した。Ｂはビピリジンを表わし、ＦＡＭ及びＡｌｅｘａ６４７は、蛍光ラベルを表す。Ｍｅｔｈｙｐｒｏｂｅは、メチル化特異的プローブを表し、ＵｎＭｅｔｈｙｐｒｏｂｅは、非メチル化特異的プローブを表す。なお、各配列番号について配列表に示された配列は、塩基配列のみを示し、該配列にはビピリジンや蛍光プローブは示されていない。

（CDKN2A/p16）
Methyprobe: FAM-GTCCCTCAAATCCTCTGGAGGGACCGCBGTATCTTTCCAGGCAAGGGGAC（配列番号70）
UnMethyprobe: BGCGAGTGCTCGGAGGAGGTGCTATTAACTCCGAGCACTTAGCGAATGTG-Alexa647（配列番号71）
（GFRA1）
Methyprobe: FAM-CGGCCTGCTCCTGTTCCCGCCBCTCCGCAGCTCCAGCTCCCTCCTAAGCT（配列番号72）
UnMethyprobe: BTAGATGCGGTAATCTTCGAGAGCTCGAAGGGCCGAGTTGGGCCAGGACG-Alexa647（配列番号73）
（HOXA11）
Methyprobe: FAM-TGGGCTACCTTGGGCTCTCCBCAGTAGCCGAGCTTAACATGATTCTCCAC（配列番号74）
UnMethyprobe: BGCTGCCTCTTTGAAGCGGATCCGTGAAGTAGAAATTTGGAGACGTAAGC（配列番号75）
（OSAP）
Methyprobe: FAM-CTGAGAGCCTGGCAGCGCCCCBCCCGGAGGAGGCACGTCGACCTTCATCC（配列番号76）
UnMethyprobe: BGTCTTGGAGACCGCCCTGCGGAGATACATCGCGCCCGCTGTCCGCCGCG-Alexa647（配列番号77）
（PENK）
Methyprobe: FAM-CGGTTCCCGGGATGGCGCGGTCGCCCCCAACGCBAGGCTGCCTGGGGCAC（配列番号78）
UnMethyprobe: BGGGCAAGATTCCGGAGAGAACGCCGCAGACCAGGGGCGAGAGAGCGGGA-Alexa647（配列番号79）
（SFRP2）
Methyprobe: FAM-TCTCTTCGCTGGGTGCGACTCBGGGCCCCGAAAAGCTGGCAGCCGGCGGC（配列番号80）
UnMethyprobe: BTTGCTGCGCTTGTAGGAGAAGTCGGGCTGGCCAAAGAGGAAGAGCCCGC-Alexa647（配列番号81）
（KCNJ3）
Methyprobe: FAM- GGGACCGCTCCCCGCACCCCCBGCGCACCTGTCTCCTATCTTTTAGCCAA（配列番号82）
UnMethyprobe: BTTAATGAGTTGACAAGCGAGTCCCAACCCACCTGCCAACTCGCTGGCTG-Alexa647（配列番号83）
（LINE1）
Methyprobe: FAM- TTTTCAGACCGGCTTAAGAAACGGCGCACCACBAGACTATATCCCACACC（配列番号84）
UnMethyprobe: BGAGGGTCCTACGCCCACGGAATCTCGCTGATTGCTAGCACAGCAGTCTG-Alexa647（配列番号85）

蛍光顕微鏡では、非メチル化ＤＮＡはコントロールプローブのみ結合しているため赤色で観察されるが、一方、メチル化ＤＮＡはＩＣＯＮプローブとコントロールプローブが結合するため黄色で観察される。メチル化レベルは、[（黄色の数）÷（黄色の数＋赤色の数）］×１００（％）となる。

様々なメチル化レベルになるように調整したＤＮＡ（０〜１００％メチル化）にプローブを反応させたところ、予想されるメチル化レベルと実際に観察した蛍光の数は高い相関を示した（図１）。ここで、１００％メチル化ＤＮＡはＳＳＳＩ処理により作製し、０％メチル化ＤＮＡはＧｅｎｏｍｉｐｈｉ処理により作製し、０％〜１００％メチル化率の希釈系列を調製した。ＬＩＮＥ１は、遺伝子全体のＤＮＡメチル化レベルを反映する遺伝子である。ＰＥＮＫ遺伝子について、その遺伝子のメチル化レベルを測定した。

肺腺癌が疑われる被験者からのサンプルについて上記７種の遺伝子のＤＮＡメチル化を測定することによって肺腺癌を検出することが可能になった。本発明の方法では、血液中の癌由来の微量ＤＮＡの異常ＤＮＡのメチル化の検出も可能となる。

配列番号１〜６９：プライマー
配列番号７０〜８５：プローブ

Claims

被験者の生物学的サンプルからＤＮＡを回収すること、該ＤＮＡについてＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定し、メチル化陽性であるとき肺癌であると評価することを含む、肺癌のインビトロ検査方法。
ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子のメチル化を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
生物学的サンプルが、喀痰、血液、胸水、尿、便又は肺組織である、請求項１又は２に記載の方法。
測定を、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、パイロシークエンス法、定量的ＭＳＰ法、デジタルＰＣＲによるＭＳＰ法、バオサルファイトシークエンス法、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法又はＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定法によって行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
肺癌が肺腺癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
ＧＦＲＡ１、ＫＣＮＪ３及びＯＳＡＰの３つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子と、ｐ１６、ＰＥＮＫ、ＨＯＸＡ１１及びＳＦＲＰ２の４つの遺伝子のうち１つ以上の遺伝子がともにメチル化陽性であるとき肺癌であると評価する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
生物学的サンプルが血液であり、該血液からＤＮＡを回収することを含む、請求項６に記載の方法。
ＤＮＡのメチル化を、デジタルＰＣＲによるＭＳＰ法、次世代シークエンサーを用いたバイサルファイトシークエンス法又はＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定法により行う、請求項６又は７に記載の方法。
被験者の生物学的サンプルからのＤＮＡを、該ＤＮＡの塩基配列中のメチル化シトシンに結合する蛍光Ｉ標識ＩＣＯＮプローブと、該ＤＮＡのメチル化部位と非メチル化部位との両方に結合する蛍光ＩＩ標識コントロールプローブとを反応させる工程、並びに、各プローブ由来の蛍光の数を測定してメチル化レベルを決定する工程を含む、ＩＣＯＮプローブを用いたＤＮＡメチル化測定方法。
蛍光ＩがＦＡＭ蛍光であり、蛍光ＩＩがＡｌｅｘａ６４７蛍光である、請求項９に記載の方法。
癌が肺癌である、請求項１０に記載の方法。
肺癌が肺腺癌である、請求項１１に記載の方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法におけるＤＮＡのメチル化の測定のために使用する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。