JP6877704B2 - 膵臓癌の検出のための方法及びキット - Google Patents
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Description
本発明の別の目的は、上記方法に使用するための膵臓癌を検出若しくは検出支援(或いは、検査、又は判定支援)するためのキットを提供することである。
したがって、本発明は、以下の特徴を含む。
(2)前記遺伝子のうち少なくとも2種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を測定することを含む、上記(1)に記載の方法。
(3)HOXA1遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化を測定する、上記(1)又は(2)に記載の方法。
(4)PCDH10遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化をさらに測定する、上記(3)に記載の方法。
(5)CCND2遺伝子及び/又はBMP3遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化を測定することをさらに含む、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)生物学的検体が、血液、血漿、血清、唾液、尿、膵液、糞便、腹水又は膵臓組織である、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)上記遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化をパイロシークエンス法、メチル化特異的PCR法、定量的メチル化特異的PCR法、高感度DNAメチル化検出法、又はそれらの組み合わせによって測定する、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(9)CCND2遺伝子及び/又はBMP3遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を検出するための試薬をさらに含む、上記(8)に記載のキット。
(10)試薬が、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4、BMP3、C13orf18及びCCND2遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化領域を特異的に増幅するためのプライマーである、上記(8)又は(9)に記載のキット。
(11)試薬が、バイサルファイト試薬及びPCR反応試薬をさらに含む、上記(8)〜(10)のいずれかに記載のキット。
本発明は、第1の態様において、被験体の生物学的検体において、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A、SPSB4及びC13orf18遺伝子からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を測定し、該少なくとも1種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドがDNAメチル化されている場合、被験体は膵臓癌を発症していると決定することを含む、該被験体の膵臓癌の発症をインビトロで検出若しくは検出支援する方法を提供する。
[配列番号1](配列中、下線部はプライマーを示し、陰影部はSeqプライマーを示す。また、太字ATGは開始コドンを示す。)
[配列番号2](配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字AGCはプローブを示す。)
[配列番号3](配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字CAGは転写開始点を示す。)
[配列番号4](配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字GCTは転写開始点を示す。)
[配列番号5](配列中、下線部はプライマーを示す。また、太字GGCGは転写開始点を示す。)
[配列番号6](配列中、下線部はプライマーを示し、陰影部はSeqプライマーを示す。)
[配列番号7](配列中、下線部はプライマーを示す。)
[配列番号8](配列中、下線部はプライマーを示し、陰影部はProbeを示す。)
上記の生物学的検体を、体液の場合、例えばフィルター濾過、遠心分離などの分離手段にかけて固形分を除いたのち、或いは、糞便の場合、精製水を加えて、同様に分離手段にかけて固形分を除いたのち、或いは、組織の場合、精製水を加えてホモゲナイズし、同様に分離手段にかけて固形分を除いたのち、上清をフェノール/クロロホルム法などの公知の手法によるか又は市販キットを用いてゲノムDNAを抽出する。
(a) パイロシークエンス法
ポリメラーゼ塩基伸長反応によるルシフェラーゼ発光反応を検出することで塩基配列を解読する方法であり、伸長反応の際に生成されるピロリン酸と発光強度が完全に比例関係にあるため高精度な定量解析を行うことができる。この原理により、バイサルファイト処理を行ったDNAのCpGサイトのT%/C%を解読してDNAメチル化比率を決定する(Alliance Biosystems)。
DNAをバイサルファイト処理することによってDNA中のメチル化されていないシトシン(非メチル化シトシン)はウラシルに変換される。一方、メチル化シトシンはバイサルファイト処理で変換されない。それゆえ、このような処理によってメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別できるので、PCR増幅したのち、塩基配列を決定するとか、制限酵素処理などの手法によってDNAメチル化を解析することができる(特表2002-535998号公報)。
PCR増幅は、PCRバッファー中、dNTP mixture、プライマー、DNA、耐熱性DNAポリメラーゼの存在下で行う。耐熱性DNAポリメラーゼは、TaKaRa Taq HS(タカラバイオ)などの市販の酵素を使用できる。PCR条件として、例えば95〜98℃、5〜60秒の変性反応、50〜55℃、30〜60秒のアニーリング反応、及び72℃、20秒〜60秒の伸長反応を1サイクルとし、これを30〜40サイクル行うことができる。
DNAをバイサルファイト変換し、このDNAを鋳型にして、メチル化DNAを特異的に増幅するプライマーと、非メチル化DNAを特異的に増幅するプライマーを用いて別々にPCRを行い、PCR産物の有無によりDNAメチル化の有無を判定する(特表2002-535998号公報)。
MSP法は、methylation specific PCR技術であり、Na bisulfiteで処理したDNAを、目的遺伝子内部のメチル化領域及び非メチル化領域に特異的な予想配列のプライマーを用いてPCR増幅することを基本としている(上記(c))。
複数の蛍光団(fluorophore)を使用することによってリアルタイム定量MSPを行うことが可能であり、この場合メチル化領域特異的プライマーと非メチル化領域特異的プライマーを使用する(T. Swift-Scanlan et al., BioTechniques 2006, 40: 210-219)。
バイサルファイト処理後にメチル化DNAと非メチル化DNAに共通のプライマーを用いて目的のDNAをPCR増幅後、メチル化DNAと非メチル化DNAで配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理し、断片をエタノール沈殿して濃縮し、電気泳動でメチル化DNAと非メチル化DNAを識別できる。PCR増幅は、バイサルファイトシークエンス法と同様に行うことができる(Z. Xiong and P.W. Laird, Nucleic Acids Res. 25(1): 2532-2534, 1997)。
HOXA1-PY-F: TTTTATGGAGGAAGTGAGAAAGT(配列番号9)
HOXA1-PY-RU: GGGACACCGCTGATCGTTTATCCAAAAAAAAATTCATTCTTACA(配列番号10)
HOXA1-PY-Seq: AAGTGAGAAAGTTGGTATAG(配列番号11)
SPSB4のプライマーセットを以下に例示する。
SPSB4-MSP-MF: GGCGTTTGAGCGTTAATTTC(配列番号12)
SPSB4-MSP-MR: CGCAAATACCGACTCTCTCC(配列番号13)
ADMTS2のプライマーセットを以下に例示する。
ADMTS2-MSP-MF: TTTCGGGGTGTTTTTGTTTC(配列番号14)
ADMTS2-MSP-MR: TAACCCGACGCATCTTAACG(配列番号15)
ADMTS2-MSP-probe: CGAGTTCGGTATCGCGGCGAC(配列番号16)
C13orf18のプライマーセットを以下に例示する。
C13orf18-MSP-MF: GGTATTTGGGGTTGGGAAGT(配列番号17)
C13orf18-MSP-MR: TCCTAAAAATCCCGCCCTAC(配列番号18)
C13orf18-MSP-Probe: TTTGAAAGCGTCGTTGCGTTTCGC(配列番号19)
CCND2のプライマーセットを以下に例示する。
CCND2-MSP-MF: TATTTCGGGCGGTTTGTTAG(配列番号20)
CCND2-MSP-MR: CTCTTCGAACGCCGTAAAAC(配列番号21)
CCND2-MSP-Probe: CGGTTTTAGACGTTGTATCGCGTCG(配列番号22)
PCDH10のプライマーセットを以下に例示する。
PCDH10-MSP-MF: TTGGGGATTGGGAATTTTTC(配列番号23)
PCDH10-MSP-MR: ACAACCGAACGAAACGAAAC(配列番号24)
SEMA5Aのプライマーセットを以下に例示する。
SEMA5A-MSP-MF: GGTTTCGTAGTTTTAGGTTAGTCGC(配列番号25)
SEMA5A-MSP-MR: GAAATAAACGACACTAACCGAACCG(配列番号26)
BMP3のプライマーセットを以下に例示する。
BMP3-PY-F: AGTTGTTTTAATTTTTGGAAAAGG(配列番号27)
BMP3-PY-RU: GGGACACCGCTGATCGTTTAAAATCTATCTATACCTTCCCTCCTC(配列番号28)
BMP3-PY-Seq: TAATTTTTGGAAAAGGTAA(配列番号29)
ADAMTS2遺伝子について、TGTTTTAGAGTATAGAGATAGGGGGAT(配列番号31)及びAACCACCCCAAAAACACAAC(配列番号32)である。
PCDH10遺伝子について、TTTTAAAGGAAAAAGAATGTTAGTATTATT(配列番号33)及びAAAAATTCCCAATCCCCAAC(配列番号34)である。
SEMA5A遺伝子について、GGGGTGGGTTTAGGTTGTTT(配列番号35)及びCTAACCRAACCRCCCCTAC(配列番号36)である。
SPSB4遺伝子について、TGGTTTTTAGGGATGAGTTTAGTTAGA(配列番号37)及びCCCTCCCCTAAAACTAAATACTTTTATAC(配列番号38)である。
BMP3遺伝子について、GGAGAGATTGGTTGAGGATTTTATAG(配列番号39)及びCCTTTTCCAAAAATTAAAACAACTAC(配列番号40)である。
C13orf18遺伝子について、GTGAAGTAGTTAGTAGAGGTTAGAGAGAGA(配列番号41)及びATACCCCCAACAACAATATTTAACA(配列番号42)である。
CCND2遺伝子について、TTTTTTGTATATATTTTGTAGGGGG(配列番号43)及びCATACCCAAAAATAAAAATCATATCC(配列番号44)である。
DNAをバイサルファイト変換し、このDNAを鋳型にして、標的遺伝子領域のPCR増幅を行う。得られたサンプルを精製後、ライブラリー作成とサンプルIDがわかるようにIDを付加したのち、次世代シークエンサーでシークエンスを行う。得られたデータをバイサルファイト変換後のリファレンスシークエンスにマッピングし、メチル化Cと非メチル化Cを算出しDNAメチル化率を計算する。
DNAをバイサルファイト変換し、このDNAを鋳型にして、メチル化DNAを特異的に増幅するプライマー、プローブセットと、非メチル化DNAを特異的に増幅するプライマー、プローブセットを用いてPCRを行う。それぞれのPCR反応で得られる蛍光をデジタルPCR法で検出することでメチル化DNAと非メチル化DNAのコピー数を算出する。デジタルPCRは通常のリアルタイムPCRよりも検出感度が高く、0.01%の感度を持つと報告されている。
本発明はさらに第2の態様において、膵臓癌の発症又は罹患を検査するためのキットを提供する。
使用説明書には、DNAメチル化検査のためのプロトコールなどが記載されうる。
愛知県がんセンター中央病院消化器内科(名古屋、愛知)において、内視鏡下生検(EUS-FNA)で得られたサンプルでKRAS変異を有するステージIII及びステージVIの症例38例を用いてIllumina Infinium HumanMethylation 450(イルミナ)による網羅的DNAメチル化解析を行った。膵臓癌では90%以上の症例でKRAS変異を有することが報告されているため、KRAS変異陽性(Mt)のサンプルを用いた。
膵臓癌患者からの膵臓癌組織(FNA)と血液(血清)を検体としてDNAを回収し、パイロシークエンス法を用いてHOXA1遺伝子のCpGアイランドのDNAメチル化を測定した。標的配列は、配列番号1の塩基配列中のtcaCGcCGggcttCGcaggaccaggtcac(配列番号45)の配列である。大文字の「C」を含む部分についてメチル化を評価する。
測定手順は次のとおりであった。
Claims (7)
- 被験体の生物学的検体において、HOXA1、PCDH10、SEMA5A、ADAMTS2及びSPSB4遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を測定し、該HOXA1遺伝子のプロモーターCpGアイランド、及びその他の遺伝子のうち少なくとも1種の遺伝子のプロモーターCpGアイランドがDNAメチル化されている場合、被験体は膵臓癌を発症していると決定することを含む、該被験体の膵臓癌の発症をインビトロで検出若しくは検出支援する方法。
- 生物学的検体が、血液、血漿、血清、唾液、尿、膵液、糞便、腹水又は膵臓組織である、請求項1に記載の方法。
- 上記遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化を、パイロシークエンス法、メチル化特異的PCR法、定量的メチル化特異的PCR法、高感度DNAメチル化検出法、次世代シークエンサーを用いるバイサルファイトシークエンス法、又はそれらの組み合わせによって測定する、請求項1又は2に記載の方法。
- HOXA1、PCDH10、SEMA5A、ADAMTS2及びSPSB4遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化の有無を検出するための試薬を含む、膵臓癌検査用キット。
- 試薬が、HOXA1、ADAMTS2、PCDH10、SEMA5A及びSPSB4遺伝子のプロモーターCpGアイランドのDNAメチル化領域を特異的に増幅するためのプライマーである、請求項4に記載のキット。
- 試薬が、バイサルファイト試薬及びPCR反応試薬をさらに含む、請求項4又は5に記載のキット。
- 検査が、被験体の血液、血漿又は血清を用いて行われる、請求項4〜6のいずれか1項に記載のキット。
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