WO2011158667A1 - 大腸腫瘍の検出方法 - Google Patents

大腸腫瘍の検出方法 Download PDF

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colorectal
rna
marker
detecting
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繁 金岡
吉田　賢一
寧 濱屋
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国立大学法人浜松医科大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting colorectal tumors, particularly advanced adenomas and early cancers, using a marker gene. More specifically, the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of a colorectal tumor in a subject from which stool is collected, using the amount of marker gene-derived RNA contained in stool as an index.
  • This application claims the priority based on Japanese Patent Application No. 2010-137460 for which it applied to Japan on June 16, 2010, and uses the content here.
  • the only non-invasive method that can be used at present is a stool test for examining the presence or absence of occult blood, that is, a stool occult blood test, which is widely used as a standard method for mass screening of colorectal cancer.
  • a stool occult blood test which is widely used as a standard method for mass screening of colorectal cancer.
  • the fecal occult blood test has low sensitivity and specificity (sensitivity 30 to 90%, specificity 70 to 98%) because hemoglobin appears in the stool is not specific to the tumor. There is a disadvantage that there are not a few false positives.
  • a method for non-invasively detecting colorectal cancer there is a method using an ingredient contained in feces as an index. Since the stool contains cells that have detached from the cancer tissue, the composition of the stool is thought to reflect gastrointestinal lesions. Therefore, a cancer-affected person is distinguished from a healthy person using a gene that is not so expressed in normal tissue but highly expressed in cancer tissue as a biomarker and the amount of mRNA of the gene in stool as an index. Thus, by using stool as a specimen, there is no invasiveness and the test burden on the subject can be drastically improved.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 methods using DNA such as detection of K-ras, p-53, APC gene mutation and microsatellite instability in feces have been reported (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 4).
  • a method for detecting mRNA such as protein kinase C (PKC) in stool for example, see Non-patent Documents 5 to 7
  • a method for examining the expression of CD44 variant in the stool cell fraction for example, non-patent document) Reference 8
  • a method for detecting the presence or absence of methylation of genomic DNA contained in feces for example, see Non-Patent Document 9 have been developed.
  • PLC protein kinase C
  • the expression level of these genes is as follows. In many cases, the gene expression shows almost the same behavior as the gene expression level. Therefore, even when these gene markers are used in combination, it is difficult to improve the detection sensitivity of COX-2 negative colon cancer.
  • the COX-2 gene, the MMP-7 gene, and the Snail gene tend to increase in the amount of expression in stool depending on the degree of progression of cancer, so the sensitivity of early cancer detection is lower than that of advanced cancer There is also a problem.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a colorectal tumor, particularly advanced adenoma or early cancer with high sensitivity, using as an index a component contained in feces.
  • RNA from stool provided by a person suffering from colorectal tumor, and analyzed RNA derived from a human gene contained in this RNA. It was found that the amount of CKB (creatine kinase B) gene-derived RNA contained in stool is higher in those suffering from colorectal tumors than in those not suffering from colorectal tumors (those who do not have a particular disease in the large intestine). Was completed.
  • CKB tine kinase B
  • the present invention has the following configuration.
  • a method of detecting a colon tumor using a marker gene (A) extracting RNA contained in feces collected from a subject; (B) a step of measuring the amount of marker gene-derived RNA in the RNA obtained in the step (A); (C) comparing the amount of the marker gene-derived RNA measured in the step (B) with a preset threshold value for each type of marker gene;
  • COX-2 Cyclooxygenase-2 gene
  • MMP-7 Microx metalloproteinase-7 gene
  • Snail gene MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) gene
  • B2M ⁇ 2 microglobulin
  • the marker gene further comprises one or more genes selected from the group consisting of MMP-7 gene, Snail gene, MMP-1 gene, and B2M gene For detecting colorectal tumors.
  • the subject has been diagnosed as having a colorectal tumor
  • the stool collected from the subject over time is subjected to the steps (A) to (C), respectively, to monitor the possibility of recurrence of the colorectal tumor in the subject.
  • the method for detecting a colorectal tumor according to any one of (5).
  • a gene marker for colorectal tumor comprising a CKB (creatine kinase B) gene.
  • a device or drug for extracting RNA contained in feces At least one of a probe and a primer for detecting RNA derived from CKB (Createtine kinase B) gene
  • a kit for detecting a colorectal tumor using stool comprising:
  • the colorectal tumor may be a tumor that occurs in the large intestine regardless of benign or malignant, and includes both colorectal adenoma and colorectal cancer.
  • Colorectal cancer is generally classified into clinical stage 0 to IV. In the present invention and the present specification, each stage refers to the following state. Stage 0: Cancer remains in the mucous membrane. Stage I: A condition in which cancer remains in the large intestine wall. Stage II: A condition in which the cancer exceeds the intrinsic muscle layer of the large intestine wall and extends beyond the wall. Stage III: Cancer has spread to lymph nodes. Stage IV: Cancer has spread to distant organs and lymph nodes.
  • “Early cancer” and “advanced cancer” are defined by the depth of the wall. Early cancer refers to cancer in which the advanced part of the cancer is confined to the intramucosa or submucosa of the large intestine wall and does not exceed this, and refers to part of stage 0 and stage I of the clinical stage. Advanced cancer is a cancer where the advanced part of the cancer goes beyond the submucosa and reaches deeper than the intrinsic muscle layer, and refers to part of stage I, stage II, stage III and stage IV among clinical stages. These are defined in the 7th edition of the Colorectal Cancer Handling Code (Colon Cancer Society, Kanbara Publishing, 2006).
  • Colorectal adenomas are also divided into small adenomas and advanced adenomas according to the size and the degree of atypia. Some colorectal adenomas are difficult to distinguish from early colon cancer, particularly mucosal cancer (stage 0 cancer). In particular, advanced adenomas having a size exceeding 10 mm are considered to be suitable for cancer as tumors that may develop into submucosal cancer (stage I cancer) in the future, similar to mucosal cancer. Therefore, in primary screening such as mass screening, it is important to detect colorectal adenomas, particularly advanced adenomas, as in the case of early colorectal cancer.
  • marker gene-derived RNA means RNA transcribed from the full length or a part of the genomic DNA of the marker gene, and may be mRNA of the gene, It may be a part (fragment).
  • non-affected person means a person who does not suffer from a colorectal tumor, and includes not only a healthy person but also a person suffering from a disease other than a colorectal tumor.
  • COX-2 gene-derived RNA in stool is a very effective biomarker for detecting colorectal cancer (see Patent Documents 1 to 4).
  • COX-2 negative colon cancer cannot be detected when only the COX-2 gene is used as a biomarker. Therefore, the present inventors believe that by using a marker gene capable of detecting COX-2 negative colorectal cancer in combination with the COX-2 gene, a colorectal tumor can be detected more sensitively by mass screening or the like. A novel marker gene was searched.
  • each gene was performed by an Agilent Expression Array analysis using a GeneChip (registered trademark) array (subjected to Takara Bio Inc. Dragon Genomics Center).
  • the amount of COX-2 gene-derived RNA in stool was 25.3 times higher in healthy COX-2 positive colorectal cancer patients, whereas in COX-2 negative colorectal cancer patients It was only 1.4 times that of healthy people.
  • the amount of RNA derived from each gene of the MMP-7 gene and MMP-1 gene is large in COX-2 strong positive colorectal cancer patients, and the COX-2 negative colorectal cancer patients are healthy as in the COX-2 gene. It was clearly not higher than.
  • the colorectal tumor detection method of the present invention is characterized by using a CKB gene as a gene marker for colorectal tumors.
  • the amount of CKB gene-derived RNA in stool tends to be greater in those with colorectal tumors than in non-affecteds. Therefore, the presence or absence of colorectal tumor can be detected using the amount of CKB gene-derived RNA in stool as an index. That is, the present invention can be said to be a method for detecting RNA derived from a gene marker for colon tumor in stool using CKB gene as a gene marker for colon tumor in order to examine the presence or absence of colon tumor.
  • a marker gene other than the CKB gene may be used in combination as a gene marker for the colorectal tumor.
  • the other marker gene combined with the CKB gene is not particularly limited as long as the gene-derived RNA amount in the stool is significantly different between the colon tumor affected group and the non-affected group.
  • one or more genes selected from the group consisting of COX-2 gene, MMP-7 gene, Snail gene, MMP-1 gene, and B2M gene are used as the marker gene used in combination with the CKB gene. It is preferable.
  • RNA derived from the gene in the stool is non-indicated in COX-2 negative colorectal cancer patients (the amount of COX-2 gene-derived RNA is approximately the same as that of non-affected persons). Since the gene was higher than that of the affected person, it was found that it can be used as a genetic marker for colorectal tumors. Therefore, in the method for detecting a colorectal tumor of the present invention, it is particularly preferable to use a combination of CKB gene and COX-2 gene as a marker gene for colorectal tumor. By using a combination of the CKB gene and the COX-2 gene, the detection sensitivity of colorectal adenoma and early cancer can be further improved.
  • the detection sensitivity of colorectal adenoma can be improved as compared with the case of using a combination of 1 gene or a combination of CKB gene, COX-2 gene and B2M gene.
  • colon cancer can be detected with very high accuracy and high sensitivity by using a combination of four genes, CKB gene, COX-2 gene, MMP-7 gene, and B2M gene.
  • the colorectal tumor detection method of the present invention comprises the following steps (A) to (C).
  • RNA contained in feces collected from a subject is extracted.
  • the extracted RNA may be purified by a conventional method.
  • the method for extracting and purifying RNA from stool is not particularly limited, and any method known in the art may be used, and a commercially available purification kit or the like may be used.
  • the method for measuring the amount or concentration of RNA is not particularly limited, and any method known in the art such as an absorbance measurement method may be used.
  • the preservation solution added to the stool examples include, for example, a stool sample preparation solution containing a water-soluble alcohol or the like as an active ingredient (see, for example, International Publication No. 2010-024251 pamphlet). It is preferable that it is a solution which can preserve
  • RNA extracted in step (A) may be used as it is in step (B) or may be used in step (B) after storage for a certain period.
  • RNA may be stored by any method as long as it can be stored while suppressing degradation of RNA.
  • RNA may be stored after lyophilization or in a solution in purified water. May be saved.
  • step (B) the amount of RNA derived from the marker gene in the RNA obtained in step (A) is measured.
  • the method for measuring the amount of the marker gene-derived RNA in the step (B) is not particularly limited, and from among known methods generally used for measuring the amount of nucleic acid having a specific base sequence, It can be selected as appropriate.
  • it may be detected by a hybridization method using a probe that can hybridize with a marker gene-derived RNA, or by a method using a nucleic acid amplification reaction using a primer and a polymerase that can hybridize with a marker gene-derived RNA. May be.
  • a hybridization method using a probe that can hybridize with a marker gene-derived RNA
  • a method using a nucleic acid amplification reaction using a primer and a polymerase that can hybridize with a marker gene-derived RNA May be.
  • commercially available detection kits can also be used.
  • RNA derived from a marker gene can also be amplified by a NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method in which RNA is directly amplified from RNA.
  • the amplification product of the marker gene-derived RNA can be quantified by a technique known in the art. For example, the amplification product can be quantitatively measured by appropriately separating the amplified product by gel or capillary electrophoresis as appropriate and then detecting it.
  • various sensitization methods such as the Invader (registered trademark) method can be used to detect the marker gene-derived RNA.
  • the sensitization method should be used for either directly detecting the marker gene-derived RNA present in the RNA obtained in step (A) or for detecting after amplification by a nucleic acid amplification reaction. Can do.
  • the amount of each marker gene-derived RNA may be measured individually or simultaneously.
  • amplification products may be obtained by performing PCR separately for each gene type using cDNA obtained by reverse transcription reaction from all or part of the RNA obtained in step (A) as a template. By performing PCR or the like, amplification products of a plurality of genes may be obtained in one reaction.
  • step (C) the amount of RNA derived from the marker gene measured in step (B) is compared with a threshold set in advance for each type of marker gene.
  • the threshold value is a threshold value for discriminating between a group suffering from colorectal cancer or advanced adenoma and a non-affected group.
  • the threshold value used in step (C) is appropriately set by those skilled in the art by considering the type of marker gene-derived RNA amount measurement method in step (B) and performing necessary preliminary tests. can do.
  • stool collected from a group (non-affected group) that is known not to suffer from colorectal disease from the results of other examination methods such as endoscopy, and affected by colorectal cancer or colorectal advanced adenoma The amount of marker gene-derived RNA is determined for feces collected from a known group (affected group) using the same measurement method as in step (B), and the measured values of both groups are compared.
  • a threshold value for identifying both groups can be set as appropriate.
  • the desired detection accuracy can be taken into account when setting the threshold value.
  • the probability that the amount of the RNA derived from the marker gene is less than the threshold is within a desired range (for example, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 2.5). % Or less, more preferably 1% or less, particularly preferably 0%).
  • RNA derived from the marker gene in stool is a desired value (for example, 90% ile, preferably 95% ile, more preferably 97.5% ile, still more preferably 99% ile, particularly preferably in the percentile of non-affected persons. Can be set to be 100% ile).
  • the significance probability (P value) that the amount of RNA derived from the marker gene in stool collected from the subject is less than the threshold is a desired value (for example, 10%, preferably 5%, more preferably 1%, still more preferably).
  • CKB-derived RNA amount the amount of CKB gene-derived RNA measured in step (B)
  • the threshold If there is less, it is determined that the subject is CKB negative.
  • the amount of CKB-derived RNA tends to be higher in the colon tumor affected group than in the non-affected group. For this reason, the subject from whom the detection result of being CKB positive was obtained has a high possibility of having a colorectal tumor. For this reason, a definitive diagnosis can be performed by using the method for detecting a colorectal tumor of the present invention for primary screening such as mass screening and performing endoscopy or the like on a subject determined to be CKB positive.
  • the detection result obtained by the method for detecting a colorectal tumor of the present invention is useful as information for diagnosis of a colorectal tumor. That is, the method for detecting a colorectal tumor of the present invention can provide information for diagnosing a colorectal tumor.
  • the colorectal tumor detection method of the present invention can be used for monitoring the recurrence possibility of a colorectal tumor.
  • stool is collected over time from a subject who has been diagnosed as having a colorectal tumor.
  • the above steps (A) to (C) are performed on each collected stool.
  • the obtained measurement value is set in advance.
  • the stool is higher than the threshold value, it can be determined that the subject has a high possibility of recurrence of the colorectal tumor at the time when the stool is collected.
  • the threshold value can also be set so as to be preferably 5% or less.
  • the threshold value can be set in accordance with the desired sensitivity and specificity.
  • each marker gene is compared with a threshold value to determine whether it is positive or negative.
  • a subject who is positive for at least one marker gene is likely to have a colorectal tumor.
  • another marker gene is often negative. For this reason, the sensitivity of colorectal tumor detection can be improved by using multiple types of marker genes in combination.
  • the method for detecting a colorectal tumor of the present invention can be carried out more easily by using a kit equipped with reagents and equipment used in the steps (A) and (B).
  • the kit includes a device or drug for extracting RNA contained in stool, and at least one of a probe or primer for detecting CKB gene-derived RNA, and uses stool. Used to detect colorectal tumors.
  • RNA contained in stool As an apparatus or drug for extracting RNA contained in stool, for example, it is used for homogenizing collected stool and preparing a suspension in which nucleic acid is extracted from cells contained in the stool. And a reagent for recovering and purifying RNA from the obtained suspension.
  • the suspension solution can be appropriately selected from solutions generally used for recovering nucleic acids from stool. Specific examples of the suspension solution include a phenol solution and a chloroform solution.
  • the suspension solution preferably contains an RNase inhibitor such as guanidine thiocyanate, a surfactant, or a chelating agent.
  • the reagent for recovering and purifying RNA from the suspension include inorganic solutions such as ethanol solution and silica.
  • CKB gene-derived RNA As a probe or primer for detecting CKB gene-derived RNA, CKB gene-derived RNA or an oligonucleotide that can specifically hybridize with a part of cDNA obtained from the RNA can be used.
  • the oligonucleotide capable of hybridizing with CKB gene-derived RNA or the like may be designed and produced by any method known in the art.
  • detection of CKB gene-derived RNA is performed by synthesizing cDNA by reverse transcription using RNA extracted from feces as a template, and then using the obtained cDNA as a template and a primer for detecting CKB gene-derived RNA.
  • the nucleic acid amplification reaction such as, and the method of detecting the obtained amplification product, reverse transcriptase, random primers, nucleotides, buffers, etc. used for reverse transcription reaction, polymerase used for PCR, labeled nucleotide, Unlabeled nucleotides, buffers, PCR devices and the like may be included in the kit of the present invention.
  • a stool collection rod, a collection container, and the like for collecting stool excreted from animals such as humans can also be included in the kit of the present invention.
  • Example 1 ⁇ Stool sample> 10 patients with colorectal adenoma (tumor size 5-9mm), 24 patients with advanced colorectal adenoma (tumor size 10mm or more), 111 patients with colorectal cancer (25 early cancer, 86 advanced cancer) Feces were provided by 12 upper gastrointestinal cancer patients (10 stomach tumor patients and 2 esophageal cancer patients) and 113 healthy subjects. Each patient is a patient who has been diagnosed endoscopically and histologically.
  • neoplastic lesions in the large intestine (but not including adenomatous polyps and hyperplastic polyps less than 5 mm), no obvious inflammatory changes, hemorrhagic lesions, systemic diseases, and progression Persons without sexual cancer were considered healthy.
  • stage 0 is 11; stage I is 24; stage II is 37; stage III is 25; stage IV is 14 there were.
  • informed consent was obtained in advance orally or in writing for these patients and healthy individuals.
  • Specimens were collected 2-4 weeks after endoscopy or biopsy and prior to surgery or endoscopic resection. The collected stool sample was first stored at 4 ° C., then transferred to ⁇ 80 ° C. within 24 hours after the start of storage, and stored until RNA extraction treatment was performed.
  • ⁇ RNA extraction and purification from stool samples > About 0.5 g of frozen stool sample and 3 mL of Isogen (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) were added to a sterilized 5 mL tube, and then mixed with a homogenizer for homogenization. The obtained slurry was dispensed into a sterilized 1.5 mL tube at approximately 0.7 mL each, and then centrifuged at 12,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was transferred to a new sterilized 1.5 mL tube. Dispensed.
  • RNA, random hexamer, and reverse transcriptase M-MLV RNaseH ⁇ ; manufactured by Takara Bio Inc.
  • cDNA was synthesized in a reaction solution with a final volume of 20 ⁇ L according to the instruction manual.
  • stool can be obtained for CKB gene, COX-2 gene, MMP-7 gene, Snail gene, MMP-1 gene, and B2M gene in the cDNA.
  • the amount of cDNA synthesized from each gene-derived RNA was quantified.
  • the TaqMan (registered trademark) primer / probe set for detecting these marker genes was commercially available from Applied Biosystems.
  • the probes included in these sets are reporter probes in which a fluorescent substance FAM is labeled on the 5 ′ end side and a quenching substance is labeled on the 3 ′ end side.
  • FAM fluorescent substance labeled on the 5 ′ end side
  • quenching substance is labeled on the 3 ′ end side.
  • 1 ⁇ L of a cDNA solution and 1 ⁇ L of 20 ⁇ TaqMan primers and probe mixture were added with sterilized purified water to a final volume of 20 ⁇ L. did.
  • Each PCR solution prepared for each gene was treated at 95 ° C.
  • mRNA mRNA derived from the gene
  • IFOBT immunological fecal occult blood test
  • Table 1 shows the copy number of mRNA of each marker gene.
  • the upper value is the average value
  • the lower value is the range.
  • “Other Cancer” indicates the results of patients with upper gastrointestinal cancer.
  • the amount of CKB mRNA in stool is significantly higher in the group of colon cancer patients with colorectal cancer and colorectal advanced adenoma than in the normal group, as with known colorectal cancer markers such as COX-2. I understood. That is, it is clear from these results that a colon tumor can be detected by setting an appropriate threshold value using the amount of CKB gene-derived RNA in feces as an index.
  • the amount of CKB mRNA in the group of patients with advanced colorectal adenoma was significantly higher than that of COX-2 and the like in the group of patients with advanced colorectal adenoma, so it can be said that advanced colorectal adenoma can be detected with higher sensitivity. .
  • ⁇ Cutoff value setting> In order to set a threshold (cutoff value) for distinguishing between those with and without colorectal tumor for each marker gene, the number of copies of each marker gene in the group of healthy subjects, colorectal cancer and advanced colorectal adenomas Analyzed.
  • Table 2 shows the average value, standard deviation (SD), median value, 95th percentile value, and 97.5th percentile value of the copy number of each marker gene in the healthy subject group.
  • Tables 3 and 4 show the average value, standard deviation (SD), median value, and 25th percentile value of the copy number of each marker gene in the colorectal cancer group and the colorectal advanced adenoma group.
  • the cutoff value of the CKB gene is 1450
  • the cutoff value of the COX-2 gene is 58
  • the cutoff value of the MMP-7 gene is 5
  • the cutoff value of the Snail gene is 9
  • the cutoff value of the MMP-1 gene The cut-off value was set to 37
  • the cut-off value for the B2M gene was set to 21000.
  • the amount of RNA derived from the CKB gene is the area of the region under the curve, as in the amount of RNA derived from the COX-2 gene, the amount of RNA derived from the MMP-7 gene, the amount of RNA derived from the B2M gene, and the immunological fecal occult blood test.
  • the combination of the CKB gene and the COX-2 gene had the best sensitivity.
  • the combination of the CKB gene and the COX-2 gene is more sensitive than the combination of the MMP-1 gene and the COX-2 gene, although the CKB gene alone has a lower detection sensitivity than the MMP-1 gene. It was good.
  • colon cancer can be detected with very high sensitivity by using a combination of -7 genes.
  • the sensitivity and specificity of colorectal cancer detection in the case of combining 4 genes of CKB gene, COX-2 gene, MMP-7 gene and B2M gene, and the sensitivity of colorectal tumor detection in the cumulative stage are calculated, and COX -2 gene only, COX-2 gene and MMP-7 gene in combination, COX-2 gene and B2M gene in combination, COX-2 gene and CKB gene When used in combination, and compared with the results of immunological fecal occult blood test (IFOBT (single)).
  • IFOBT immunological fecal occult blood test
  • colorectal tumor detection method of the present invention it is possible to accurately examine the presence or absence of colorectal tumors, particularly colorectal advanced adenomas and stage 0 and stage I cancers.

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Abstract

本発明は、糞便に含まれる成分を指標として、大腸腫瘍、特に進行腺腫や早期癌を検出する方法を提供することを課題とする。 マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、（Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、（Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、（Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する工程と、を有し、前記マーカー遺伝子がＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。

Description

大腸腫瘍の検出方法
　本発明は、マーカー遺伝子を用いた大腸腫瘍、特に進行腺腫や早期癌の検出方法に関する。より具体的には、糞便に含まれているマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を指標として、当該糞便が採取された被験者の大腸腫瘍への罹患の有無を検出する方法に関する。
　本願は、２０１０年６月１６日に日本国に出願された特願２０１０－１３７４６０号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第１番目に多い癌である（２００５年度癌死統計）。また、２０２０年の癌罹患者推計では、男性は第二位、女性は第一位になると推計されている。そこで、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が強く求められている。大腸癌は他の癌に比べて、早期に発見され適切な治療が行われた場合の５年生存率が非常に高いため、大腸癌の集団検診（ｍａｓｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、最も効果的な方法の一つである。
　大腸癌の確定診断のためには、一般的に、大腸内を直接視認できる内視鏡検査が行われており、さらに必要に応じて、患部の生検検査も行われている。しかしながら、これらの方法は侵襲的であり、かつ、高度な専門技術を要するため、集団検診のような一次スクリーニングには不適当である。
　集団検診のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。しかしながら、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度３０～９０％、特異度７０～９８％）、偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。
　非侵襲的に大腸癌を検出する方法として、糞便に含まれる成分を指標とする方法がある。糞便中には癌組織から剥離してきた細胞が含まれていることから、糞便の組成は消化管病変を反映し得ると考えられる。そこで、正常組織ではあまり発現せず、癌組織では高発現する遺伝子をバイオマーカーとし、糞便中の当該遺伝子のｍＲＮＡ量を指標として、癌罹患者と健常者とを区別している。このように、検体として糞便を用いることにより、侵襲性がなく、被験者の検査負担を飛躍的に改善することができる。
　例えば、糞便中のＫ－ｒａｓ、ｐ－５３、ＡＰＣ遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等のＤＮＡを用いた方法が報告されている（例えば、非特許文献１～４参照。）。また、糞便中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）等のｍＲＮＡを検出する方法や（例えば、非特許文献５～７参照。）、糞便の細胞画分のＣＤ４４バリアントの発現を調べる方法（例えば、非特許文献８参照。）、糞便中に含まれているゲノムＤＮＡのメチル化の有無を検出する方法（例えば、非特許文献９参照）等も開発されている。
　このように、糞便中の含有量を指標として大腸癌を検出し得るバイオマーカーとして利用可能な遺伝子が多く報告されている。しかしながら、これらのバイオマーカーを用いた場合の感度は便潜血法とほぼ同程度かそれよりも低い、という問題がある。特に、集団検診においては、早期癌や癌化の可能性の高い進行腺腫といった、内視鏡的又は手術的切除によって治癒が可能な腫瘍を検出することが重要であるが、上記いずれのバイオマーカーでも、早期癌や進行腺腫の検出感度が便潜血法よりも劣っている。このため、糞便を検体として早期癌等を感度よく検出する方法の開発が強く望まれている。
　便潜血法よりも感度よく大腸癌を検出する方法として、本発明者らにより、糞便中のＣＯＸ－２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２）遺伝子の発現量を指標とする方法が開示されている（例えば、特許文献１～４参照。）。ＣＯＸ－２遺伝子は、大腸癌の遺伝子マーカーとして非常に優れているものの、ＣＯＸ－２遺伝子の発現量が増大しない大腸癌（ＣＯＸ－２陰性大腸癌）もあり、このようなケースを検出することができない。特許文献３には、ＭＭＰ－７（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７）遺伝子やＳｎａｉｌ遺伝子等の、ＣＯＸ－２遺伝子と併用可能な遺伝子マーカーも開示されているものの、これらの遺伝子の発現量は、ＣＯＸ－２遺伝子の発現量とほぼ同様の挙動を示す場合が多く、このため、これらの遺伝子マーカーを併用した場合でも、ＣＯＸ－２陰性大腸癌の検出感度を向上させることは困難である。また、ＣＯＸ－２遺伝子、ＭＭＰ－７遺伝子、及びＳｎａｉｌ遺伝子は、癌の進行度に依存して糞便中の発現量が増大する傾向があるため、進行癌に比べて早期癌の検出感度が低いという問題もある。
　一方、大腸癌において、ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）及びｈｎＲＮＰ　Ｆ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆ）の発現量と細胞内局在が変化することが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。ＣＫＢについては、その他にも、子宮癌において発現量が増大し、血清中のＣＫＢ含有量が、子宮癌マーカーとして使用可能であることも報告されている（例えば、非特許文献１１参照。）。しかしながら、糞便中のＣＫＢ含有量の大腸癌マーカーとしての利用可能性については、現在までに全く報告されていない。発現量が癌化に依存して増減するタンパク質をコードする遺伝子が、必ず臨床上有用なバイオマーカーとして利用できるとは限らないことは、当業者であれば当然理解できる。
特許第４１３４０４７号公報 特許第４２０６４２５号公報 国際公開第２００７／０１８２５７号パンフレット 国際公開第２００８／０９３５３０号パンフレット
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　本発明は、糞便に含まれる成分を指標として、大腸腫瘍、特に進行腺腫や早期癌を高感度に検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、大腸腫瘍罹患者より提供された糞便からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡ中に含まれているヒト遺伝子由来のＲＮＡを解析したところ、大腸腫瘍罹患者では、大腸腫瘍非罹患者（大腸に特段の疾患のない者）よりも、糞便中に含まれているＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子由来ＲＮＡの量が多いことを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は下記の構成をとる。
（１）　マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、
（Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する工程と、
を有し、
前記マーカー遺伝子がＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。
（２）　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＣＯＸ－２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２）遺伝子、ＭＭＰ－７（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７）遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）遺伝子、及びＢ２Ｍ（β２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることを特徴とする前記（１）記載の大腸腫瘍の検出方法。
（３）　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＣＯＸ－２遺伝子を用いることを特徴とする前記（１）記載の大腸腫瘍の検出方法。
（４）　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＭＭＰ－７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１遺伝子、及びＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることを特徴とする前記（３）記載の大腸腫瘍の検出方法。
（５）　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＭＭＰ－７遺伝子を用いることを特徴とする前記（１）記載の大腸腫瘍の検出方法。
（６）　大腸腺種又は大腸早期癌を検出することを特徴とする前記（３）～（５）のいずれか１つに記載の大腸腫瘍の検出方法。
（７）　前記被験者が、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがあり、
　前記被験者から経時的に採取された糞便に対して、それぞれ、前記工程（Ａ）～（Ｃ）を行い、当該被験者の大腸腫瘍の再発可能性をモニタリングするためになされることを特徴とする前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の大腸腫瘍の検出方法。
（８）　ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子からなることを特徴とする大腸腫瘍の遺伝子マーカー。
（９）　糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤と、
ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
を含むことを特徴とする糞便を用いて大腸腫瘍を検出するためのキット。
　本発明の大腸腫瘍の検出方法を用いることにより、被験者から採取された糞便を検体として、当該被験者が大腸腫瘍に罹患しているか否かを判断するために有用な情報を提供することができる。
実施例１において得られた、糞便中の各マーカー遺伝子由来ＲＮＡ量を、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして用いた場合のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析の結果を示した図である。
　本発明及び本願明細書において、大腸腫瘍は、良性・悪性に拘わらず、大腸に発生する腫瘍であればよく、大腸腺腫と大腸癌の双方が含まれる。
　大腸癌の進行度は、治療方法を決定する上で重要な要因である。大腸癌は、一般的に臨床病期０～ＩＶ期に分類される。本発明及び本願明細書において、各病期は、それぞれ、以下の状態を指す。
０期：癌が粘膜内に留まっている状態。
Ｉ期：癌が大腸壁内に留まっている状態。
ＩＩ期：癌が大腸壁の固有筋層を超えており、壁外にまで及んでいる状態。
ＩＩＩ期：癌がリンパ節に転移している状態。
ＩＶ期：癌が遠方の臓器やリンパ節にまで転移している状態。
　大腸早期癌（ｅａｒｌｙ　ｃａｎｃｅｒ）、進行癌（ａｄｖａｎｃｅｄ　ｃａｎｃｅｒ）とは、壁深達度により規定されている。早期癌とは、癌の先進部が大腸壁の粘膜内又は粘膜下層に限局し、これを超えていないものであり、臨床病期のうち０期とＩ期の一部を指す。進行癌とは、癌の先進部が粘膜下層を超え固有筋層以深に届くものであり、臨床病期のうちＩ期の一部、ＩＩ期、ＩＩＩ期とＩＶ期を指す。これらは大腸癌取り扱い規約第７版（大腸癌研究会、金原出版、２００６年）に定義されている。
　大腸腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）も、大きさや異型度に応じて、小腺腫と進行腺腫（ａｄｖａｎｃｅｄ　ａｄｅｎｏｍａ）とに分けられる。大腸腺腫の中には、大腸早期癌、特に粘膜癌（０期癌）との鑑別が難しいものがある。中でも１０ｍｍを超える大きさの進行腺腫は、粘膜癌と同様に、将来的に粘膜下層癌（Ｉ期癌）に進展する可能性のある腫瘍として、癌に順ずるものとしている。よって、集団検診等の一次スクリーニングでは、大腸早期癌と同様に、大腸腺腫、特に進行腺腫を検出することが重要である。
　また、本発明及び本願明細書において、「マーカー遺伝子由来ＲＮＡ」とは、マーカー遺伝子のゲノムＤＮＡの全長又は一部分から転写されたＲＮＡを意味し、当該遺伝子のｍＲＮＡであってもよく、当該ｍＲＮＡの一部分（フラグメント）であってもよい。
　本発明及び本願明細書において、「非罹患者」とは、大腸腫瘍に罹患していない者を意味し、健常者のみならず、大腸腫瘍以外の疾患に罹患している者も含む。
＜ＣＫＢ遺伝子＞
　本発明者らが既に明らかにしているように、糞便中のＣＯＸ－２遺伝子由来ＲＮＡ量は、大腸癌を検出するために非常に有効なバイオマーカーである（特許文献１～４参照。）。しかしながら、ＣＯＸ－２遺伝子のみをバイオマーカーとした場合には、ＣＯＸ－２陰性の大腸癌を検出することができない。そこで、本発明者らは、ＣＯＸ－２陰性の大腸癌を検出可能なマーカー遺伝子をＣＯＸ－２遺伝子と併用することにより、集団検診等でより感度よく大腸腫瘍を検出し得ると考え、そのような新規なマーカー遺伝子の探索を行った。
　具体的には、内視鏡検査等により大腸癌を発症していると確定診断がなされた患者であって、糞便中のＣＯＸ－２遺伝子由来ＲＮＡの量が、健常者よりも非常に多い患者（ＣＯＸ－２強陽性大腸癌罹患者）と、ＣＯＸ－２遺伝子由来ＲＮＡの量が、非罹患者と同程度しかない患者（ＣＯＸ－２陰性大腸癌罹患者）とからそれぞれ採取された糞便からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、これを用いて各遺伝子の発現解析を行った。コントロールとして、健常者から採取された糞便に対しても同様に行った。なお、これらの患者及び健常者には、事前に口頭又は書面にてインフォームドコンセントを得た。また、採取された糞便の保存、ＲＮＡ抽出は、後記実施例１に記載の方法と同様にして行った。
　各遺伝子の発現解析は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ(登録商標)アレイを用いたＡｇｉｌｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｒｒａｙ解析により行った（タカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターに外注。）。この結果、糞便中のＣＯＸ－２遺伝子由来ＲＮＡの量は、ＣＯＸ－２強陽性大腸癌罹患者では健常者の２５．３倍であったのに対して、ＣＯＸ－２陰性大腸癌罹患者では健常者の１．４倍でしかなかった。また、ＭＭＰ－７遺伝子及びＭＭＰ－１遺伝子の各遺伝子由来ＲＮＡ量は、ＣＯＸ－２遺伝子と同様に、ＣＯＸ－２強陽性大腸癌罹患者において多く、ＣＯＸ－２陰性大腸癌罹患者では健常者に比し明らかに高くはなかった。一方で、ＣＫＢ遺伝子は、ＣＯＸ－２陰性大腸癌罹患者において、健常者よりも糞便中の発現量が２８．８倍も上昇していることが分かった。これらの結果から、大腸腫瘍罹患者では、非罹患者よりも、糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡが多い傾向があること、ＣＫＢ遺伝子を大腸腫瘍のマーカー遺伝子として用いることにより、ＣＯＸ－２陽性の大腸腫瘍のみならず、ＣＯＸ－２陰性の大腸腫瘍をも検出可能であることが明らかとなった。
＜大腸腫瘍の検出方法＞
　本発明の大腸腫瘍の検出方法は、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、ＣＫＢ遺伝子を用いることを特徴とする。糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの量は、大腸腫瘍罹患者において、非罹患者よりも多くなる傾向がある。このため、糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの量を指標として、大腸腫瘍の罹患の有無を検出することができる。すなわち本発明は、大腸腫瘍の罹患の有無を調べるために、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、ＣＫＢ遺伝子を用いて、糞便中の大腸腫瘍の遺伝子マーカー由来ＲＮＡを検出する方法とも言える。
　本発明の大腸腫瘍の検出方法においては、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、ＣＫＢ遺伝子以外の他のマーカー遺伝子を組み合わせて用いてもよい。２種類以上の遺伝子を組み合わせて用いることにより、大腸腫瘍をより精度よく検出することができる。ＣＫＢ遺伝子と組み合わせる他のマーカー遺伝子は、糞便中の当該遺伝子由来ＲＮＡ量が、大腸腫瘍罹患者群と非罹患者群とで有意に差がある遺伝子であれば、特に限定されるものではない。
　本発明においては、ＣＫＢ遺伝子と組み合わせて用いるマーカー遺伝子として、ＣＯＸ－２遺伝子、ＭＭＰ－７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１遺伝子、及びＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることが好ましい。
　ＣＫＢ遺伝子は、糞便中の当該遺伝子由来ＲＮＡの量が、ＣＯＸ－２陰性大腸癌罹患者（ＣＯＸ－２遺伝子由来ＲＮＡの量が、非罹患者と同程度しかない大腸癌罹患者）において、非罹患者よりも高い遺伝子であったことから、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして利用できることが見出された。よって、本発明の大腸腫瘍の検出方法においては、大腸腫瘍のマーカー遺伝子として、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とを組み合わせて用いることが特に好ましい。ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とを組み合わせて用いることにより、大腸腺腫や早期癌の検出感度をより向上させることができる。
　本発明において用いられる大腸腫瘍のマーカー遺伝子の組み合わせとしては、具体的には、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＳｎａｉｌ遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－１遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との組み合わせ、及びＣＫＢ遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子の組み合わせ等が挙げられる。
　例えば、３遺伝子を組み合わせて用いることにより、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子の組み合わせにより、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＳｎａｉｌ遺伝子の組み合わせ、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－１遺伝子の組み合わせ、又はＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の組み合わせを用いた場合よりも、特に大腸腺腫の検出感度を改善し得る。また、特に、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との４遺伝子を組み合わせて用いることにより、大腸腫瘍を非常に高精度かつ高感度に検出することができる。
　本発明の大腸腫瘍の検出方法は、具体的には、下記の工程（Ａ）～（Ｃ）を有する。
（Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する工程。
　以下、工程ごとに説明する。
　まず、工程（Ａ）として、被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する。本工程においては、抽出したＲＮＡを常法により精製してもよい。糞便からのＲＮＡの抽出・精製方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよく、市販されている精製キット等を利用することもできる。なお、次の工程に移る前に、予め、工程（Ａ）において得られたＲＮＡの量や濃度を測定してもよい。ＲＮＡの量や濃度の測定方法は、特に限定されるものではなく、吸光度測定法等の当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。
　工程（Ａ）においてＲＮＡ抽出に供される糞便は、ヒト由来のものであれば特に限定されるものではなく、例えば、定期健診や診断等のために採取された検体等を用いることができる。また、排泄直後のものであってもよく、採取後一定期間保存されたものであってもよい。糞便の保存方法は特に限定されず、臨床検査等で糞便に対してなされる保存方法のいずれであってもよい。例えば、凍結保存や冷蔵保存された糞便をＲＮＡ抽出に用いてもよく、各種保存液に浸漬・懸濁させた状態で保存されたものを用いてもよい。糞便に添加される保存液としては、例えば、水溶性アルコール類等を有効成分とする糞便試料調製用溶液（例えば、国際公開第２０１０－０２４２５１号パンフレット参照。）等の、糞便中のＲＮＡの損傷を抑制して保存し得る溶液であることが好ましい。
　工程（Ａ）において抽出されたＲＮＡは、そのまま工程（Ｂ）へ用いられてもよく、一定期間保存後に工程（Ｂ）へ用いられてもよい。ＲＮＡの保存は、ＲＮＡの分解を抑制して保存し得る方法であれば、いずれの方法で行ってもよく、例えば、凍結乾燥後に保存してもよく、精製水に溶解させた溶液の状態で保存してもよい。
　次に、工程（Ｂ）として、工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する。工程（Ｂ）におけるマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量の測定方法は、特に限定されるものではなく、一般的に特定の塩基配列を有する核酸の量を測定する場合に用いられる公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。
　なお、本発明及び本願明細書において、ＲＮＡの量を測定するとは、厳密な定量を意味するものではなく、半定量的なものであってもよく、所定の閾値等との定量的な比較が可能な程度に測定できるものであってもよい。例えば、当該技術分野において公知の手法によりマーカー遺伝子由来ＲＮＡを検出し、得られた検出結果から、濃度既知の対照試料の検出結果から作成された検量線に基づき算出することができる。マーカー遺伝子由来ＲＮＡの検出方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、マーカー遺伝子由来ＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出してもよく、マーカー遺伝子由来ＲＮＡとハイブリダイズし得るプライマーとポリメラーゼとを用いた核酸増幅反応を利用した方法により検出してもよい。その他、市販されている検出用キット等を利用することもできる。
　工程（Ｂ）における測定は、工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中に存在するマーカー遺伝子由来ＲＮＡを直接定量的に検出してもよく、当該ＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡを核酸増幅反応により増幅させた後に定量的に検出してもよい。例えば、マーカー遺伝子由来ＲＮＡに隣接してハイブリダイズする２本のプローブを用い、ハイブリダイゼーション後にリガーゼ反応により結合させ、得られた結合体を定量的に検出する方法や、標識したプローブを用いたノザンブロッティング法を行い、ハイブリダイゼーションにより会合体を形成したプローブの量を、標識を指標として定量的に検出する方法等により、マーカー遺伝子由来ＲＮＡを直接検出することができる。
　マーカー遺伝子由来ＲＮＡの量は微量であるため、核酸増幅反応を利用した方法により測定することもできる。例えば、工程（Ａ）において得られたＲＮＡの全量又は一部に対して、逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅をすることにより、マーカー遺伝子由来ＲＮＡを検出し、その量を測定することができる。ｃＤＮＡを鋳型とした核酸増幅法としては、通常ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が行われるが、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）法を用いることもできる。また、当該核酸増幅として、リアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲを行うことにより、マーカー遺伝子由来ＲＮＡの検出と同時にその定量を簡便に行うことができる。その他、ＲＮＡからダイレクトにＲＮＡを増幅させるＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によっても、マーカー遺伝子由来ＲＮＡを増幅させることができる。マーカー遺伝子由来ＲＮＡの増幅産物は、当該技術分野において公知の手法により定量することができる。例えば、その増幅産物を適宜、ゲルやキャピラリー電気泳動等で特異的に分離した後、それを検出することにより定量的に測定することができる。
　また、マーカー遺伝子由来ＲＮＡの検出には、インベーダー（登録商標）法等の各種増感法を利用することもできる。増感法は、工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中に存在するマーカー遺伝子由来ＲＮＡを、直接検出する場合と、核酸増幅反応により増幅させた後に検出する場合のいずれの場合にも利用することができる。
　マーカー遺伝子として、ＣＫＢ遺伝子とその他の遺伝子を組み合わせて用いる場合、それぞれのマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を個別に測定してもよく、同時に測定してもよい。例えば、工程（Ａ）において得られたＲＮＡの全量又は一部から逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型とし、遺伝子の種類ごとに別個にＰＣＲを行って増幅産物を得てもよく、マルチプレックスＰＣＲ等を行うことにより、複数の遺伝子の増幅産物を１つの反応で得てもよい。
　工程（Ｂ）の後、工程（Ｃ）として、工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する。当該閾値は、大腸癌又は進行腺腫罹患者群と、非罹患者群とを識別するための閾値である。測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が予め設定された閾値よりも多い場合に陽性とし、当該閾値よりも少ない場合に陰性とする。
　工程（Ｃ）において用いられる閾値は、当業者であれば、工程（Ｂ）におけるマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、内視鏡検査等の他の検査方法の結果から、大腸疾患に罹患していないことが分かっている集団（非罹患者群）から採取された糞便と、大腸癌若しくは大腸進行腺腫に罹患していることが分かっている集団（罹患者群）から採取された糞便とに対して、工程（Ｂ）と同じ測定方法によりマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量を求め、両集団の測定値を比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。
　閾値の設定に際しては、所望の検出精度を考慮することもできる。非罹患者群と罹患者群の両群について、糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の分布が明らかにされている場合には、例えば、大腸癌又は大腸進行腺腫の罹患者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値未満となる確率（すなわち、非罹患者であると判断される確率）が所望の範囲内（例えば、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２．５％以下、さらに好ましくは１％以下、特に好ましくは０％）となるように、閾値を設定することができる。
　また、非罹患者群についてのみ、糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の分布が明らかにされている場合には、例えば、被験者が非罹患者であると仮定した場合に、当該被験者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が、非罹患者のパーセンタイルで所望の値（例えば、９０％ｉｌｅ、好ましくは９５％ｉｌｅ、より好ましくは９７．５％ｉｌｅ、さらに好ましくは９９％ｉｌｅ、特に好ましくは１００％ｉｌｅ）となるように、閾値を設定することができる。また、当該被験者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値未満である有意確率（Ｐ値）が所望の値（例えば、１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、さらに好ましくは０．１％）となるように、閾値を設定することができる。なお、Ｐ値は両側確率であってもよく、片側確率であってもよい。罹患者群についてのみ、糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の分布が明らかにされている場合にも、同様にして閾値を設定することができる。なお、Ｐ値は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ′ｓ Ｕ ｔｅｓｔ等の統計学的手法により求めることができる。
　具体的には、工程（Ｂ）において測定されたＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの量（以下、ＣＫＢ由来ＲＮＡ量）が、予め設定された閾値よりも多い場合に、前記被験者はＣＫＢ陽性であり、当該閾値よりも少ない場合には、前記被験者はＣＫＢ陰性である、と判断する。ＣＫＢ由来ＲＮＡ量は、大腸腫瘍罹患者群において、非罹患者群よりも高くなる傾向がある。このため、ＣＫＢ陽性であるという検出結果が得られた被験者は、大腸腫瘍に罹患している可能性が高い。このため、本発明の大腸腫瘍の検出方法を集団検診等の一次スクリーニングに用い、ＣＫＢ陽性と判断された被験者に対して内視鏡検査等を行うことにより、確定診断を行うことができる。このように、本発明の大腸腫瘍の検出方法により得られた検出結果は、大腸腫瘍の診断のための情報として有用である。つまり、本発明の大腸腫瘍の検出方法により、大腸腫瘍の診断のための情報を提供することができる。
　このように、糞便中のＣＫＢ由来ＲＮＡ量は、大腸腫瘍の発症の有無に依存しており、大腸腫瘍が発症している被験者群のほうが、大腸腫瘍を発症していない被験者群よりも高くなる傾向がある。このため、本発明の大腸腫瘍の検出方法は、大腸腫瘍の再発可能性のモニタリングに利用することができる。具体的には、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがある被験者から、経時的に糞便を採取する。採取された各糞便に対して、それぞれ上記工程（Ａ）～（Ｃ）を行う。例えば、外科的処理等により、既に発症していた大腸腫瘍の病変部を切除した被験者から、経時的に糞便中のＣＫＢ由来ＲＮＡ量を測定した場合には、得られた測定値が予め設定された閾値よりも高くなった場合に、当該糞便が採取された時点において、当該被験者では大腸腫瘍が再発した可能性が高い、と判断できる。
　本発明の大腸腫瘍の検出方法における感度や特異度は、設定される閾値により適宜調整することができる。例えば、十分に高い感度を得たい場合、すなわち大腸腫瘍の罹患があることを検出しようとする場合には、閾値は、大腸腫瘍の罹患者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値未満となる確率（すなわち、非罹患者であると判断される確率）が１％以下、特に好ましくは０％となるように設定することが好ましい。一方、健康診断等の一次スクリーニングに用いる場合には、多少感度が犠牲になるとしても、特異度が高いことが好ましい。このため、例えば、健常者から採取された糞便中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量が閾値を越える確率（すなわち、罹患者であると判断される確率）が十分に小さくなるように、例えば１０％以下、好ましくは５％以下となるように閾値を設定することもできる。このように、本発明の大腸腫瘍の検出方法においては、所望の感度・特異度に合わせて、閾値を設定することができる。
　マーカー遺伝子として、ＣＫＢ遺伝子とその他の遺伝子を組み合わせて用いた場合には、マーカー遺伝子ごとに、それぞれ閾値と比較し、陽性か陰性かを判断する。少なくとも１のマーカー遺伝子が陽性である被験者は、大腸腫瘍に罹患している可能性が高い。大腸腫瘍のタイプによっては、複数の大腸腫瘍マーカーのうち、あるマーカー遺伝子が陽性であったとしても、別のマーカー遺伝子は陰性となる場合も多い。このため、マーカー遺伝子を複数種類組み合わせて用いることにより、大腸腫瘍検出の感度を向上させることができる。
　また、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）において用いられる試薬や機器等を備えるキットを用いることにより、本発明の大腸腫瘍の検出方法をより簡便に実施することができる。当該キットは、具体的には、糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤と、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、を含み、糞便を用いて大腸腫瘍を検出するために用いられる。
　糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤としては、例えば、採取された糞便を均質化し、当該糞便に含まれていた細胞から核酸を抽出させた懸濁物を調製するために用いられる懸濁用溶液、得られた懸濁物からＲＮＡを回収・精製するための試薬等が挙げられる。当該懸濁用溶液としては、糞便から核酸を回収する際に一般的に用いられる溶液の中から適宜選択して用いることができる。当該懸濁用溶液としては、具体的には、フェノール溶液、クロロホルム溶液等が挙げられる。また、当該懸濁用溶液は、チオシアン酸グアニジン、界面活性剤、キレート剤等のＲＮＡ分解酵素阻害剤を含んでいることが好ましい。懸濁物からＲＮＡを回収・精製するための試薬等としては、例えば、エタノール溶液、シリカ等の無機担体等が挙げられる。
　また、工程（Ａ）は、市販されている核酸精製キット等を利用することができるため、市販されている核酸精製キットと、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーとを組み合わせたものを、本発明のキットとすることもできる。
　ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーとしては、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ、又は当該ＲＮＡから得られたｃＤＮＡの一部と特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを用いることができる。なお、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ等とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知のいずれの手法で設計・作製されてもよい。
　例えば、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡの検出を、糞便から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプライマーを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出する方法により行われる場合には、逆転写反応に用いる逆転写酵素、ランダムプライマー、ヌクレオチド、バッファー等や、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、バッファー、ＰＣＲ装置等を、本発明のキットに含ませてもよい。
　その他、ヒトをはじめとする動物から排泄された糞便を採取するための採便棒や採取容器等も、本発明のキットに含ませることができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
＜糞便サンプル＞
　大腸小腺腫（腫瘍の大きさが５～９ｍｍ）患者１０名、大腸進行腺腫（腫瘍の大きさが１０ｍｍ以上）患者が２４名、大腸癌患者１１１名（早期癌２５名、進行癌８６名）、上部消化管癌患者１２名（胃腫瘍患者１０名、食道癌患者２名）、及び健常者１１３名から、糞便を提供していただいた。各患者は、内視鏡的・組織学的に確定診断がなされた患者である。本実施例においては、大腸に腫瘍性病変（但し、５ｍｍ未満の腺腫性ポリープや過形成ポリープは含まない）や、明らかな炎症性変化が認められず、出血性病変、全身性疾患、及び進行性の癌のない人を健常者とした。また、大腸癌患者１１１名のうち、病期０期が１１名、病期Ｉ期が２４名、病期ＩＩ期が３７名、病期ＩＩＩ期が２５名、病期ＩＶ期が１４名であった。なお、これらの患者及び健常者には、事前に口頭又は書面にてインフォームドコンセントを得た。
　検体（糞便サンプル）は、内視鏡検査又は生検から２～４週間後であって、手術又は内視鏡的切除の前に採取された。採取された糞便サンプルは、まず４℃で保存された後、保存開始後２４時間以内に－８０℃に移し、ＲＮＡ抽出処理を行うまで保存した。
＜糞便サンプルからのＲＮＡ抽出・精製＞
　滅菌済みの５ｍＬチューブに、約０．５ｇの凍結した糞便サンプルと、３ｍＬのＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を加えた後、ホモジナイザーで混合して、均一化させた。得られたスラリーを、滅菌済み１．５ｍＬチューブに約０．７ｍＬずつ分注した後、１２，０００×ｇで５分間、４℃で遠心し、その上清を新しい滅菌済み１．５ｍＬチューブに分注した。各チューブに０．３ｍＬのＩｓｏｇｅｎと０．３ｍＬのクロロホルムをそれぞれ加え、チューブを３０秒間激しくボルテックスにかけて撹拌した後、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心した。得られた水相を、チューブ上面からコンタミネーションを生じないように注意して回収し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。等量の７０％エタノール溶液を加えた後、チューブを３０秒間激しくボルテックスにかけて攪拌した。得られた混合液から、ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出・精製した。精製されたＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ　１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ社製）を用いて定量した。以後の解析に用いるまで、ＲＮＡは－８０℃にて保存した。
＜マーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の測定＞
　精製されたＲＮＡとランダムヘキサマーと逆転写酵素Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ－；タカラバイオ社製）とを用いて、最終容量が２０μＬの反応液中で、使用説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。
　合成されたｃＤＮＡを鋳型として、定量的リアルタイムＰＣＲを行うことにより、当該ｃＤＮＡ中のＣＫＢ遺伝子、ＣＯＸ－２遺伝子、ＭＭＰ－７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１遺伝子、及びＢ２Ｍ遺伝子に対して、糞便中の各遺伝子由来ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡの量を定量した。これらのマーカー遺伝子を検出するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー・プローブセットは、アプライドバイオシステムズ社より市販されているものを、それぞれ用いた。なお、これらのセットに含まれているプローブは、５’端側に蛍光物質ＦＡＭがラベルされており、３’端側には消光物質がラベルされているレポータープローブである。具体的には、１μＬのｃＤＮＡ溶液と、１μＬの２０×ＴａｑＭａｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｂｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ（アプライドバイオシステムズ社製）とに滅菌済み精製水を加えて最終容量を２０μＬに調製したものを、ＰＣＲ反応溶液とした。遺伝子ごとにそれぞれ調製したＰＣＲ溶液を、９５℃で２０秒間処理した後、９５℃で３秒間、６２℃で３０秒間を６０サイクルの反応条件で、７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、リアルタイムに蛍光強度を測定しながら核酸増幅（ＰＣＲ）した。コピー数を計算する対照試料（標準物質）として、各遺伝子のｃＤＮＡが入ったプラスミドを使用し、同時に増幅した。　
　測定の結果得られたマーカー遺伝子由来ＲＮＡ量（コピー数）に対する統計学的処理は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ′ｓ Ｕ ｔｅｓｔにより行った。また、全ての統計学的処理は、両側検定で行い、Ｐ値＜０．０５を統計上有意であるとした。
　なお、マーカー遺伝子由来ＲＮＡの大部分が当該遺伝子由来のｍＲＮＡであることから、以下、ｍＲＮＡと記載する。
＜免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））＞
　マーカー遺伝子由来ＲＮＡ量の測定に用いたものと同一の糞便に対して、免疫学的便潜血検査（ＭＰＡ）法（１回）を行い、潜血の有無を検出した。免疫学的便潜血検査は、市販の便潜血キット「マグストリーム（登録商標）ＨｅｍＳｐ－Ｎ」（磁性粒子凝集反応薬）（富士レビオ社製、製品番号：２１４７９４）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。
＜各マーカー遺伝子のｍＲＮＡ量の測定結果＞
　各マーカー遺伝子のｍＲＮＡのコピー数を表１に示す。表１中、上段の数値は平均値であり、下段はレンジである。また、「Ｏｔｈｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ」は上部消化管癌患者の結果を示す。この結果、糞便中のＣＫＢのｍＲＮＡ量は、ＣＯＸ－２等の公知の大腸癌マーカーと同様に、大腸癌、及び大腸進行腺腫の大腸腫瘍罹患者群において、健常者群よりも有意に多いことが分かった。すなわち、これらの結果から、適当な閾値を設定することにより、糞便中のＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ量を指標として大腸腫瘍を検出し得ることが明らかである。特に、ＣＫＢのｍＲＮＡ量は、ＣＯＸ－２等よりも大腸進行腺腫患者群におけるコピー数が、健常者群よりも有意に多かったことから、大腸進行腺腫をより高い感度で検出可能であるといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜カットオフ値の設定＞
　各マーカー遺伝子の大腸腫瘍罹患者と非罹患者を識別するための閾値（カットオフ値）を設定するために、健常者群、大腸癌群、及び大腸進行腺腫群における各マーカー遺伝子のコピー数を解析した。
　表２に、健常者群における、各マーカー遺伝子のコピー数の平均値、標準偏差（ＳＤ）、中央値、９５パーセンタイル値、及び９７．５パーセンタイル値を示す。また、表３及び表４に、大腸癌群及び大腸進行腺腫群における、各マーカー遺伝子のコピー数の平均値、標準偏差（ＳＤ）、中央値、及び２５パーセンタイル値を示す。これらの結果から、ＣＫＢ遺伝子のカットオフ値を１４５０、ＣＯＸ－２遺伝子のカットオフ値を５８、ＭＭＰ－７遺伝子のカットオフ値を５、Ｓｎａｉｌ遺伝子のカットオフ値を９、ＭＭＰ－１遺伝子のカットオフ値を３７、Ｂ２Ｍ遺伝子のカットオフ値を２１０００と設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜各マーカー遺伝子の大腸癌検出の感度及び特異度＞
　上記で設定したカットオフ値を用いて各サンプルの陽性・陰性を判断し、大腸癌検出の感度及び特異度を算出し、免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表５に示す。この結果、ＣＯＸ－２遺伝子は、感度・特異度共に免疫学的便潜血検査よりも良好であったが、ＣＫＢ遺伝子は、特異度は免疫学的便潜血検査と同等であったものの、感度は免疫学的便潜血検査よりも低かった。表５中、「９５％ＣＩ」は９５％信頼区間（％）である。なお、以降の全てのサンプルの感度及び特異度に対するＰ値の算出は、χ２検定（ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ　ｔｅｓｔ、カイ二乗検定）により行った。また、全ての統計学的処理は、両側検定で行い、Ｐ値＜０．０５を統計上有意であるとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜各マーカー遺伝子のＲＯＣ解析＞
　各マーカー遺伝子の大腸腫瘍検出用マーカーとしての性能を調べるため、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析を行った。ＲＯＣ解析は、ＰＡＳＷ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｖｅｒ．１８（ＩＢＭ製）を用いて作図した。解析結果を表６及び図１に示す。図１は、縦軸を感度、横軸を(１－特異度)として、ＲＯＣ曲線を引いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 この結果、ＣＫＢ遺伝子由来ＲＮＡ量は、ＣＯＸ－２遺伝子由来ＲＮＡ量、ＭＭＰ－７遺伝子由来ＲＮＡ量、Ｂ２Ｍ遺伝子由来ＲＮＡ量、及び免疫学的便潜血検査と同様に、曲線の下の領域の面積が０．５以上であり、大腸腫瘍を検出するためのマーカーとして、良好であることがわかった。
＜複数マーカー遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度＞
　ＣＫＢ遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度を算出し、比較した。算出結果を表７及び８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　この結果、２種類のマーカー遺伝子を併用する場合には、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子の組み合わせが最も感度が良好であった。特に、単独では、ＣＫＢ遺伝子はＭＭＰ－１遺伝子よりも検出感度が低かったにも関わらず、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子の組み合わせは、ＭＭＰ－１遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子の組み合わせよりも感度が良好であった。
＜各マーカー遺伝子の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度＞
　上記で設定したカットオフ値を用いて各サンプルの陽性・陰性を判断し、病期ごとの大腸腫瘍検出の感度及び特異度を算出し、免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表９に示す。表９中、「０＿Ｃａ」～「ＩＶ＿Ｃａ」は、それぞれ、大腸癌の病期０期～ＩＶ期を示す。この結果、ＣＫＢ遺伝子は、０期の大腸癌を免疫学的便潜血検査よりも高い感度で検出し得ることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
＜複数マーカー遺伝子を組み合わせた場合の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度＞
　ＣＫＢ遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度を算出し、比較した。算出結果を表１０に示す。この結果、ＣＫＢ遺伝子にその他の遺伝子、特にＣＯＸ－２遺伝子やＭＭＰ－７遺伝子を組み合わせることにより、単独では感度が低かった大腸腫瘍の検出感度を高められることが明らかとなった。中でも、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子に、更にＭＭＰ－７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１遺伝子、又はＢ２Ｍ遺伝子を組み合わせて用いることにより、非常に高い感度で大腸進行腺腫や０期やＩ期の癌を検出し得ることが分かった。特に、適切なカットオフ値を設定することにより、大腸進行腺腫を５０％以上という非常に高い感度で検出し得ることもわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
＜複数マーカー遺伝子を組み合わせた場合の累積病期の大腸腫瘍検出の感度＞
　ＣＫＢ遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の累積病期の大腸腫瘍検出の感度を算出し、免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表１１に示す。表１１中、「Ａｄ～０＿Ｃａ」～「Ａｄ～ＩＶ＿Ｃａ」は、それぞれ、大腸進行腺腫から大腸癌の各病期までの累積病期を示す。表１１では、比較対象として、ＣＯＸ－２遺伝子単独で用いた場合と、ＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－１遺伝子を組み合わせた場合も示している。これらの結果からも、ＣＫＢ遺伝子に他のマーカー遺伝子を組み合わせて用いることにより、高感度で大腸腫瘍を検出し得ること、さらにＣＯＸ－２遺伝子を組み合わせて用いることにより、特にＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子を組み合わせて用いることにより、非常に高い感度で大腸腫瘍を検出し得ることが明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　さらに、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子との４遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度、並びに累積病期の大腸腫瘍検出の感度を算出し、ＣＯＸ－２遺伝子のみを用いた場合、ＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子とを組み合わせて用いた場合、ＣＯＸ－２遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子とを組み合わせて用いた場合、ＣＯＸ－２遺伝子とＣＫＢ遺伝子とを組み合わせて用いた場合と、及び免疫学的便潜血検査（ＩＦＯＢＴ（ｓｉｎｇｌｅ））の結果と比較した。算出結果を表１２及び１３に示す。この結果、ＣＫＢ遺伝子とＣＯＸ－２遺伝子とＭＭＰ－７遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子とを組み合わせて用いた場合が、最も高感度であった。特に、これらの４遺伝子を組み合わせた場合の感度は、有意確率（Ｐ値）が０．００１以下と非常に小さく、高い精度が要求される臨床検査においても十分に有用であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明の大腸腫瘍の検出方法を用いることにより、大腸腫瘍、特に大腸進行腺腫や０期とＩ期の癌の罹患の有無を精度よく検査することができるため、本発明の大腸腫瘍の検出方法は、糞便試料を用いた臨床検査等の分野、特に高い信頼性と安全性が要求される臨床検査等の分野において利用が可能である。

Claims (9)

  1. 　マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、
    （Ａ）被験者から採取した糞便中に含まれるＲＮＡを抽出する工程と、
    （Ｂ）前記工程（Ａ）において得られたＲＮＡ中のマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量を測定する工程と、
    （Ｃ）前記工程（Ｂ）において測定されたマーカー遺伝子由来ＲＮＡの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する工程と、
    を有し、
    前記マーカー遺伝子がＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。
  2. 　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＣＯＸ－２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２）遺伝子、ＭＭＰ－７（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７）遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１（Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１）遺伝子、及びＢ２Ｍ（β２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることを特徴とする請求項１記載の大腸腫瘍の検出方法。
  3. 　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＣＯＸ－２遺伝子を用いることを特徴とする請求項１記載の大腸腫瘍の検出方法。
  4. 　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＭＭＰ－７遺伝子、Ｓｎａｉｌ遺伝子、ＭＭＰ－１遺伝子、及びＢ２Ｍ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子を用いることを特徴とする請求項３記載の大腸腫瘍の検出方法。
  5. 　前記マーカー遺伝子として、さらに、ＭＭＰ－７遺伝子を用いることを特徴とする請求項１記載の大腸腫瘍の検出方法。
  6. 　大腸腺種又は大腸早期癌を検出することを特徴とする請求項３～５のいずれか一項に記載の大腸腫瘍の検出方法。
  7. 　前記被験者が、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがあり、
    　前記被験者から経時的に採取された糞便に対して、それぞれ、前記工程（Ａ）～（Ｃ）を行い、当該被験者の大腸腫瘍の再発可能性をモニタリングするためになされることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の大腸腫瘍の検出方法。
  8. 　ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子からなることを特徴とする大腸腫瘍の遺伝子マーカー。
  9. 　糞便中に含まれるＲＮＡを抽出するための機器又は薬剤と、
    ＣＫＢ（Ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ）遺伝子由来ＲＮＡを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
    を含むことを特徴とする糞便を用いて大腸腫瘍を検出するためのキット。
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