JP5851400B2 - 大腸腫瘍の検出方法 - Google Patents
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Description
本願は、2010年6月16日に日本国に出願された特願2010−137460号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
(1) マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、
(A)被験者から採取した糞便中に含まれるRNAを抽出する工程と、
(B)前記工程(A)において得られたRNA中のマーカー遺伝子由来RNAの量を測定する工程と、
(C)前記工程(B)において測定されたマーカー遺伝子由来RNAの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較し、測定されたマーカー遺伝子由来RNA量が予め設定された閾値よりも多い場合に陽性と判断する工程と、
を有し、
前記マーカー遺伝子がCKB(Creatine kinase B)遺伝子、COX−2(Cyclooxygenase−2)遺伝子及びMMP−7遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。
(2) 前記マーカー遺伝子として、さらに、Snail遺伝子、MMP−1遺伝子、及びB2M(β2ミクログロブリン)遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子を用いることを特徴とする前記(1)記載の大腸腫瘍の検出方法。
(3) 大腸腺腫又は大腸早期癌を検出することを特徴とする前記(1)又は(2)に記載の大腸腫瘍の検出方法。
(4) 前記被験者が、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがあり、
前記被験者から経時的に採取された糞便に対して、それぞれ、前記工程(A)〜(C)を行い、当該被験者の大腸腫瘍の再発可能性をモニタリングするためになされることを特徴とする前記(1)又は(2)に記載の大腸腫瘍の検出方法。
(5) 糞便中に含まれるRNAを抽出するための機器又は薬剤と、
CKB(Creatine kinase B)遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
COX−2(Cyclooxygenase−2)遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、及び
MMP−7遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
を含むことを特徴とする糞便を用いて大腸腫瘍を検出するためのキット。
(6) さらに、Snail遺伝子、MMP−1遺伝子、及びB2M(β2ミクログロブリン)遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方を含むことを特徴とする前記(5)記載のキット。
0期:癌が粘膜内に留まっている状態。
I期:癌が大腸壁内に留まっている状態。
II期:癌が大腸壁の固有筋層を超えており、壁外にまで及んでいる状態。
III期:癌がリンパ節に転移している状態。
IV期:癌が遠方の臓器やリンパ節にまで転移している状態。
本発明者らが既に明らかにしているように、糞便中のCOX−2遺伝子由来RNA量は、大腸癌を検出するために非常に有効なバイオマーカーである(特許文献1〜4参照。)。しかしながら、COX−2遺伝子のみをバイオマーカーとした場合には、COX−2陰性の大腸癌を検出することができない。そこで、本発明者らは、COX−2陰性の大腸癌を検出可能なマーカー遺伝子をCOX−2遺伝子と併用することにより、集団検診等でより感度よく大腸腫瘍を検出し得ると考え、そのような新規なマーカー遺伝子の探索を行った。
本発明の大腸腫瘍の検出方法は、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、CKB遺伝子を用いることを特徴とする。糞便中のCKB遺伝子由来RNAの量は、大腸腫瘍罹患者において、非罹患者よりも多くなる傾向がある。このため、糞便中のCKB遺伝子由来RNAの量を指標として、大腸腫瘍の罹患の有無を検出することができる。すなわち本発明は、大腸腫瘍の罹患の有無を調べるために、大腸腫瘍の遺伝子マーカーとして、CKB遺伝子を用いて、糞便中の大腸腫瘍の遺伝子マーカー由来RNAを検出する方法とも言える。
(A)被験者から採取した糞便中に含まれるRNAを抽出する工程と、
(B)前記工程(A)において得られたRNA中のマーカー遺伝子由来RNAの量を測定する工程と、
(C)前記工程(B)において測定されたマーカー遺伝子由来RNAの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較する工程。
以下、工程ごとに説明する。
その他、ヒトをはじめとする動物から排泄された糞便を採取するための採便棒や採取容器等も、本発明のキットに含ませることができる。
<糞便サンプル>
大腸小腺腫(腫瘍の大きさが5〜9mm)患者10名、大腸進行腺腫(腫瘍の大きさが10mm以上)患者が24名、大腸癌患者111名(早期癌25名、進行癌86名)、上部消化管癌患者12名(胃腫瘍患者10名、食道癌患者2名)、及び健常者113名から、糞便を提供していただいた。各患者は、内視鏡的・組織学的に確定診断がなされた患者である。本実施例においては、大腸に腫瘍性病変(但し、5mm未満の腺腫性ポリープや過形成ポリープは含まない)や、明らかな炎症性変化が認められず、出血性病変、全身性疾患、及び進行性の癌のない人を健常者とした。また、大腸癌患者111名のうち、病期0期が11名、病期I期が24名、病期II期が37名、病期III期が25名、病期IV期が14名であった。なお、これらの患者及び健常者には、事前に口頭又は書面にてインフォームドコンセントを得た。
検体(糞便サンプル)は、内視鏡検査又は生検から2〜4週間後であって、手術又は内視鏡的切除の前に採取された。採取された糞便サンプルは、まず4℃で保存された後、保存開始後24時間以内に−80℃に移し、RNA抽出処理を行うまで保存した。
滅菌済みの5mLチューブに、約0.5gの凍結した糞便サンプルと、3mLのIsogen(ニッポンジーン社製)を加えた後、ホモジナイザーで混合して、均一化させた。得られたスラリーを、滅菌済み1.5mLチューブに約0.7mLずつ分注した後、12,000×gで5分間、4℃で遠心し、その上清を新しい滅菌済み1.5mLチューブに分注した。各チューブに0.3mLのIsogenと0.3mLのクロロホルムをそれぞれ加え、チューブを30秒間激しくボルテックスにかけて撹拌した後、12,000×gで15分間、4℃で遠心した。得られた水相を、チューブ上面からコンタミネーションを生じないように注意して回収し、新しい1.5mLチューブに移した。等量の70%エタノール溶液を加えた後、チューブを30秒間激しくボルテックスにかけて攪拌した。得られた混合液から、RNeasy mini kit(QIAGEN社製)を用いてRNAを抽出・精製した。精製されたRNAは、NanoDrop 1000(NanoDrop Wilmington社製)を用いて定量した。以後の解析に用いるまで、RNAは−80℃にて保存した。
精製されたRNAとランダムヘキサマーと逆転写酵素M−MLV(RNaseH−;タカラバイオ社製)とを用いて、最終容量が20μLの反応液中で、使用説明書に従ってcDNAを合成した。
合成されたcDNAを鋳型として、定量的リアルタイムPCRを行うことにより、当該cDNA中のCKB遺伝子、COX−2遺伝子、MMP−7遺伝子、Snail遺伝子、MMP−1遺伝子、及びB2M遺伝子に対して、糞便中の各遺伝子由来RNAから合成されたcDNAの量を定量した。これらのマーカー遺伝子を検出するためのTaqMan(登録商標)プライマー・プローブセットは、アプライドバイオシステムズ社より市販されているものを、それぞれ用いた。なお、これらのセットに含まれているプローブは、5’端側に蛍光物質FAMがラベルされており、3’端側には消光物質がラベルされているレポータープローブである。具体的には、1μLのcDNA溶液と、1μLの20×TaqMan primers and probe mixture(アプライドバイオシステムズ社製)とに滅菌済み精製水を加えて最終容量を20μLに調製したものを、PCR反応溶液とした。遺伝子ごとにそれぞれ調製したPCR溶液を、95℃で20秒間処理した後、95℃で3秒間、62℃で30秒間を60サイクルの反応条件で、7500 Fast Real−Time PCR systems(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、リアルタイムに蛍光強度を測定しながら核酸増幅(PCR)した。コピー数を計算する対照試料(標準物質)として、各遺伝子のcDNAが入ったプラスミドを使用し、同時に増幅した。
測定の結果得られたマーカー遺伝子由来RNA量(コピー数)に対する統計学的処理は、Mann Whitney′s U testにより行った。また、全ての統計学的処理は、両側検定で行い、P値<0.05を統計上有意であるとした。
なお、マーカー遺伝子由来RNAの大部分が当該遺伝子由来のmRNAであることから、以下、mRNAと記載する。
マーカー遺伝子由来RNA量の測定に用いたものと同一の糞便に対して、免疫学的便潜血検査(MPA)法(1回)を行い、潜血の有無を検出した。免疫学的便潜血検査は、市販の便潜血キット「マグストリーム(登録商標)HemSp−N」(磁性粒子凝集反応薬)(富士レビオ社製、製品番号:214794)を用いて、添付のプロトコールに従って行った。
各マーカー遺伝子のmRNAのコピー数を表1に示す。表1中、上段の数値は平均値であり、下段はレンジである。また、「Other Cancer」は上部消化管癌患者の結果を示す。この結果、糞便中のCKBのmRNA量は、COX−2等の公知の大腸癌マーカーと同様に、大腸癌、及び大腸進行腺腫の大腸腫瘍罹患者群において、健常者群よりも有意に多いことが分かった。すなわち、これらの結果から、適当な閾値を設定することにより、糞便中のCKB遺伝子由来RNA量を指標として大腸腫瘍を検出し得ることが明らかである。特に、CKBのmRNA量は、COX−2等よりも大腸進行腺腫患者群におけるコピー数が、健常者群よりも有意に多かったことから、大腸進行腺腫をより高い感度で検出可能であるといえる。
各マーカー遺伝子の大腸腫瘍罹患者と非罹患者を識別するための閾値(カットオフ値)を設定するために、健常者群、大腸癌群、及び大腸進行腺腫群における各マーカー遺伝子のコピー数を解析した。
表2に、健常者群における、各マーカー遺伝子のコピー数の平均値、標準偏差(SD)、中央値、95パーセンタイル値、及び97.5パーセンタイル値を示す。また、表3及び表4に、大腸癌群及び大腸進行腺腫群における、各マーカー遺伝子のコピー数の平均値、標準偏差(SD)、中央値、及び25パーセンタイル値を示す。これらの結果から、CKB遺伝子のカットオフ値を1450、COX−2遺伝子のカットオフ値を58、MMP−7遺伝子のカットオフ値を5、Snail遺伝子のカットオフ値を9、MMP−1遺伝子のカットオフ値を37、B2M遺伝子のカットオフ値を21000と設定した。
上記で設定したカットオフ値を用いて各サンプルの陽性・陰性を判断し、大腸癌検出の感度及び特異度を算出し、免疫学的便潜血検査(IFOBT(single))の結果と比較した。算出結果を表5に示す。この結果、COX−2遺伝子は、感度・特異度共に免疫学的便潜血検査よりも良好であったが、CKB遺伝子は、特異度は免疫学的便潜血検査と同等であったものの、感度は免疫学的便潜血検査よりも低かった。表5中、「95%CI」は95%信頼区間(%)である。なお、以降の全てのサンプルの感度及び特異度に対するP値の算出は、χ2検定(chi−square test、カイ二乗検定)により行った。また、全ての統計学的処理は、両側検定で行い、P値<0.05を統計上有意であるとした。
各マーカー遺伝子の大腸腫瘍検出用マーカーとしての性能を調べるため、ROC(Receiver Operating Characteristic)解析を行った。ROC解析は、PASW statistics ver.18(IBM製)を用いて作図した。解析結果を表6及び図1に示す。図1は、縦軸を感度、横軸を(1−特異度)として、ROC曲線を引いた。
CKB遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の大腸癌検出の感度及び特異度を算出し、比較した。算出結果を表7及び8に示す。
上記で設定したカットオフ値を用いて各サンプルの陽性・陰性を判断し、病期ごとの大腸腫瘍検出の感度及び特異度を算出し、免疫学的便潜血検査(IFOBT(single))の結果と比較した。算出結果を表9に示す。表9中、「0_Ca」〜「IV_Ca」は、それぞれ、大腸癌の病期0期〜IV期を示す。この結果、CKB遺伝子は、0期の大腸癌を免疫学的便潜血検査よりも高い感度で検出し得ることがわかった。
CKB遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の病期ごとの大腸腫瘍検出の感度を算出し、比較した。算出結果を表10に示す。この結果、CKB遺伝子にその他の遺伝子、特にCOX−2遺伝子やMMP−7遺伝子を組み合わせることにより、単独では感度が低かった大腸腫瘍の検出感度を高められることが明らかとなった。中でも、CKB遺伝子とCOX−2遺伝子に、更にMMP−7遺伝子、Snail遺伝子、MMP−1遺伝子、又はB2M遺伝子を組み合わせて用いることにより、非常に高い感度で大腸進行腺腫や0期やI期の癌を検出し得ることが分かった。特に、適切なカットオフ値を設定することにより、大腸進行腺腫を50%以上という非常に高い感度で検出し得ることもわかった。
CKB遺伝子とその他のマーカー遺伝子を組み合わせた場合の累積病期の大腸腫瘍検出の感度を算出し、免疫学的便潜血検査(IFOBT(single))の結果と比較した。算出結果を表11に示す。表11中、「Ad〜0_Ca」〜「Ad〜IV_Ca」は、それぞれ、大腸進行腺腫から大腸癌の各病期までの累積病期を示す。表11では、比較対象として、COX−2遺伝子単独で用いた場合と、COX−2遺伝子とMMP−1遺伝子を組み合わせた場合も示している。これらの結果からも、CKB遺伝子に他のマーカー遺伝子を組み合わせて用いることにより、高感度で大腸腫瘍を検出し得ること、さらにCOX−2遺伝子を組み合わせて用いることにより、特にCOX−2遺伝子とMMP−7遺伝子を組み合わせて用いることにより、非常に高い感度で大腸腫瘍を検出し得ることが明らかである。
Claims (6)
- マーカー遺伝子を用いて、大腸腫瘍を検出する方法であって、
(A)被験者から採取した糞便中に含まれるRNAを抽出する工程と、
(B)前記工程(A)において得られたRNA中のマーカー遺伝子由来RNAの量を測定する工程と、
(C)前記工程(B)において測定されたマーカー遺伝子由来RNAの量と、マーカー遺伝子の種類ごとに予め設定された閾値とを比較し、測定されたマーカー遺伝子由来RNA量が予め設定された閾値よりも多い場合に陽性と判断する工程と、
を有し、
前記マーカー遺伝子がCKB(Creatine kinase B)遺伝子、COX−2(Cyclooxygenase−2)遺伝子及びMMP−7遺伝子であることを特徴とする大腸腫瘍の検出方法。 - 前記マーカー遺伝子として、さらに、Snail遺伝子、MMP−1遺伝子、及びB2M(β2ミクログロブリン)遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子を用いることを特徴とする請求項1記載の大腸腫瘍の検出方法。
- 大腸腺腫又は大腸早期癌を検出することを特徴とする請求項1又は2に記載の大腸腫瘍の検出方法。
- 前記被験者が、大腸腫瘍に罹患していると診断されたことがあり、
前記被験者から経時的に採取された糞便に対して、それぞれ、前記工程(A)〜(C)を行い、当該被験者の大腸腫瘍の再発可能性をモニタリングするためになされることを特徴とする請求項1又は2に記載の大腸腫瘍の検出方法。 - 糞便中に含まれるRNAを抽出するための機器又は薬剤と、
CKB(Creatine kinase B)遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
COX−2(Cyclooxygenase−2)遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、及び
MMP−7遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方と、
を含むことを特徴とする糞便を用いて大腸腫瘍を検出するためのキット。 - さらに、Snail遺伝子、MMP−1遺伝子、及びB2M(β2ミクログロブリン)遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子由来RNAを検出するためのプローブ又はプライマーの少なくともいずれか一方を含むことを特徴とする請求項5記載のキット。
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