CN114231631B - 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用 - Google Patents

血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114231631B
CN114231631B CN202111540330.6A CN202111540330A CN114231631B CN 114231631 B CN114231631 B CN 114231631B CN 202111540330 A CN202111540330 A CN 202111540330A CN 114231631 B CN114231631 B CN 114231631B
Authority
CN
China
Prior art keywords
circ
hsa
gastric cancer
plasma
screening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111540330.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114231631A (zh
Inventor
邵永富
叶国良
郭俊明
陆佳敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital Of Ningbo University
Original Assignee
First Affiliated Hospital Of Ningbo University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital Of Ningbo University filed Critical First Affiliated Hospital Of Ningbo University
Priority to CN202111540330.6A priority Critical patent/CN114231631B/zh
Publication of CN114231631A publication Critical patent/CN114231631A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114231631B publication Critical patent/CN114231631B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了血浆中hsa‑circ‑0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于筛查胃癌产品中的应用，hsa‑circ‑0086720序列全长714个核苷酸，基因定位于人9号染色体33953282～33996331区域，hsa‑circ‑0086720的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明涉及一种血浆中的hsa‑circ‑0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于筛查胃癌产品中的应用，其通过验证hsa‑circ‑0086720在不同分期胃癌组织内均显著低表达鉴定出hsa‑circ‑0086720具有极好的胃癌相关性，通过检测和比较早期胃癌患者和健康人循环血浆hsa‑circ‑0086720水平的差异，发现hsa‑circ‑0086720水平在早期胃癌患者循环血浆中已显著升高。本发明发现并证明了hsa‑circ‑0086720是一种可以用于早期胃癌筛查和胃癌患者术后疾病评估的环状RNA分子。本发明所提供的新型hsa‑circ‑0086720标志物对进一步提高当前胃癌诊治水平具有一定意义。

Description

血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的 应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用，更具体涉及胃癌组织和血浆中特异性hsa-circ-0086720分子标志物的发现、鉴定、检测及其应用。
背景技术
环状RNA(circular RNA,circRNA)分子是指一类以5'末端和3'末端反向共价键结合的内源性环状RNA分子。近年研究显示circRNA是一类具有重要生物学功能的新型RNA分子，它可以在转录前、转录、转录后多个水平参与基因表达调控。不仅如此，circRNA序列高度保守，性质稳定，不易被核酸外切酶降解，并且具有明显的组织、时序和疾病相对特异性，所以circRNA具备成为临床疾病精准诊断分子标志物的潜质。
胃癌是世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率在所有恶性肿瘤中居第4位，死亡率排第2位。中国每年新发胃癌患者高达40万，居世界首位；死亡人数30万，占全球因胃癌死亡人数一半。早期胃癌(early gastric cancer)局限于黏膜和黏膜下层，临床多无症状。目前我国早期胃癌的平均诊断率不足10％，80％以上患者出现症状而就诊时已处于胃癌中晚期，错失手术根治机会，致使患者5年存活率仅为25％左右。早期胃癌如能及时手术切除，其5年生存率可达90％以上。因此，提高胃癌防治水平的关键仍在于早期发现。然而，目前临床上即使是最先进的物理检测手段(如：CT、核磁共振等)发现肿瘤的极限直径仅为1cm，而常用肿瘤标志物的灵敏度和特异度亦不够理想，如癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)筛查早期胃癌的灵敏度仅为4.3％。因此，开发新型肿瘤标志物尤其是针对早期胃癌筛查的分子标志物具有重要意义。
发明内容
本发明涉及一种血浆中的hsa-circ-0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于筛查胃癌产品中的应用。
环状RNA分子hsa-circ-0086720序列全长714个核苷酸，定位于人9号染色体33953282～33996331区域，由UBAP2基因转录后经剪切首尾连接形成。其核苷酸序列如SEQID No.1所示。
本发明涉及一种血浆中的hsa-circ-0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于筛查胃癌产品中的应用，hsa-circ-0086720的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
可选地，所述产品能够通过检测血浆中hsa-circ-0086720的水平来辅助诊断或筛查患者是否患有胃癌。
可选地，检测血浆中hsa-circ-0086720水平的所述产品包括：通过实时定量PCR、逆转录PCR、原位杂交、基因测序、试剂盒或基因芯片检测的hsa-circ-0086720水平以诊断胃癌的产品。
可选地，所述基因芯片至少包括与hsa-circ-0086720核酸序列杂交的探针。
可选地，检测血浆中hsa-circ-0086720水平的所述产品为实时荧光定量检测试剂，所述实时荧光定量检测试剂包括特异性扩增hsa-circ-0086720的引物：
正向引物5’-ACTGCCGTCAACTCCTGTTC-3’；
反向引物5’-TGTCTGAATTCCCTTCCAGCAA-3’。
可选地，所述试剂的PCR特异扩增检测片段为5’-TCCTCAGAGCCTGCTTATGGAAGTGACAGGGAAAAATCAGGATGAATGCATAGTGGCCCTACATGATTGTAATGGAGATGTGAACAAAGCTATCAATATA-3’。
本发明中，在前期研究中利用circRNA芯片检测并比较胃癌组织与癌旁组织circRNA表达谱差异，发现环状RNA hsa-circ-0086720在胃癌组织中显著低表达。
本发明自主设计了用于人胃黏膜组织和循环血浆hsa-circ-0086720检测的特异性PCR反向引物(divergent primer)，该引物上游序列为5’-ACTGCCGTCAACTCCTGTTC-3’，下游序列为5’-TGTCTGAATTCCCTTCCAGCAA-3’。PCR特异扩增检测片段为5’-TCCTCAGAGCCTGCTTATGGAAGTGACAGGGAAAAATCAGGATGAATGCATAGTGGCCCTACATGATTGTAATGGAGATGTGAACAAAGCTATCAATATA-3’。通过对该引物PCR产物测序，验证了引物扩增的特异性。
可选地，所述试剂为实时荧光定量检测试剂盒，所述实时荧光定量检测试剂盒中含有内参基因GAPDH特异性PCR引物：
正向引物：5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；
反向引物：5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’。
可选地，hsa-circ-0086720表达在胃癌患者癌组织中下调；癌组织低表达hsa-circ-0086720预测胃癌患者预后相对良好。
本发明涉及一种血浆中的hsa-circ-0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于术后胃癌评估产品中的应用。
血浆中的hsa-circ-0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于术后胃癌评估产品中的应用，hsa-circ-0086720的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
可选地，检测血浆中hsa-circ-0086720的表达水平的所述产品包括：
通过实时定量PCR、逆转录PCR、原位杂交、基因测序、试剂盒或基因芯片检测的hsa-circ-0086720表达水平以诊断胃癌的产品。
可选地，所述基因芯片至少包括与hsa-circ-0086720核酸序列杂交的探针。
可选地，用于术后胃癌评估的所述产品为实时荧光定量检测试剂，所述实时荧光定量检测试剂包括特异性扩增hsa-circ-0086720的引物：
正向引物5’-ACTGCCGTCAACTCCTGTTC-3’；
反向引物5’-TGTCTGAATTCCCTTCCAGCAA-3’。
可选地，所述试剂的PCR特异扩增检测片段为5’-TCCTCAGAGCCTGCTTATGGAAGTGACAGGGAAAAATCAGGATGAATGCATAGTGGCCCTACATGATTGTAATGGAGATGTGAACAAAGCTATCAATATA-3’。
可选地，所述试剂为实时荧光定量检测试剂盒，所述实时荧光定量检测试剂盒中含有内参基因GAPDH特异性PCR引物：
正向引物：5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；
反向引物：5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’。
本发明借助大样本胃癌组织和循环血浆RNA提取与目标RNA的定量RT-PCR检测方法，发现hsa-circ-0086720在82.3％胃癌患者癌组织中显著低表达。进一步对胃黏膜内癌和癌旁组织检测发现，hsa-circ-0086720同样在胃黏膜内癌组织中显著低表达。通过验证hsa-circ-0086720在不同分期胃癌组织内均显著低表达鉴定出hsa-circ-0086720具有极好的胃癌相关性。不仅如此，通过检测和比较早期胃癌患者(黏膜内癌)和健康人循环血浆hsa-circ-0086720水平的差异，发现hsa-circ-0086720水平在早期胃癌(黏膜内癌)患者循环血浆中已显著升高。
本发明通过构建受试者工作特征ROC曲线发现胃癌组织hsa-circ-0086720具有良好的敏感性与特异性。胃癌组织hsa-circ-0086720的ROC曲线下面积为0.670(95％CI,0.594-0.746)，敏感性和特异性分别为41.67％和86.64％。早期胃癌循环血浆hsa-circ-0086720的ROC曲线下面积为0.771(95％CI,0.663-0.879)。当其截断值为3.77，敏感性和特异性分别为67.4％和87.2％，其远远超过血浆CAE水平。
结合肿瘤临床病理因素，本发明发现胃癌组织中hsa-circ-0086720的表达水平与Borrmann分型、肿瘤神经侵袭密切相关。Kaplan-Meier生存分析显示胃癌组织hsa-circ-0086720的表达水平与患者术后总生存率和无病生存率相关。Cox单因素分析提示胃癌组织hsa-circ-0086720表达水平是影响胃癌患者术后总生存期和无病生存期长短的独立危险因素。在此基础上，进一步通过联合胃癌组织hsa-circ-0086720表达水平与患者年龄、淋巴结转移、神经侵袭、CEA表达这些临床病理因素，构建nomogram生存预测模型，应用该模型能较好地预测胃癌患者术后3-5年总生存率和无病生存状态概率。
本发明通过上述研究，系统解决了组织和循环血浆hsa-circ-0086720的特异性检测问题，发现并证明了hsa-circ-0086720是一种可以用于早期胃癌筛查和胃癌患者术后疾病评估的环状RNA分子。本发明为早期胃癌的筛查提供了新的分子标志物，对进一步提高当前胃癌诊治水平具有一定意义。
附图说明
图1为验证引物扩增特异性的circRNA hsa-circ-0086720的PCR产物测序图；
图2为实施例中两个组织标本中circRNA hsa-circ-0086720的扩增曲线图；
图3为实施例中两个组织标本中circRNA hsa-circ-0086720的解链曲线图；
图4为实施例中两个血浆标本中circRNA hsa-circ-0086720的扩增曲线图；
图5为实施例中两个血浆标本中circRNA hsa-circ-0086720的解链曲线图；
图6为实施例中荧光定量RT-PCR验证胃癌组织异常表达的circRNA，其中circRNAhsa-circ-0086720在胃癌组织内显著低表达；
图7为实施例中circRNA hsa-circ-0086720在早期胃癌(黏膜内癌)组织中显著低表达；
图8为实施例中组织高表达和低表达circRNA hsa-circ-0086720患者生存分析；
图9为实施例中circRNA hsa-circ-0086720的nomogram生存预测模型；
图10为实施例中circRNA hsa-circ-0086720在早期胃癌(黏膜内癌)循环血浆中水平显著升高；
图11为实施例中circRNA hsa-circ-0086720的ROC曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供的循环血浆hsa-circ-0086720早期胃癌筛查分子标志物是一种新筛选的环状RNA标志物，可用于早期胃癌患者筛查和胃癌患者术后疾病评估。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
具体的该hsa-circ-0086720标志物的筛选：
本发明在前期研究中利用circRNA芯片检测并比较胃癌组织与癌旁组织circRNA表达谱差异，发现环状RNAhsa-circ-0086720在胃癌组织中显著低表达。
所以筛选的环状RNAhsa-circ-0086720标志物的验证
(一)样本的采集与处理
对胃癌患者进行外科手术治疗，切除病变组织。在胃癌病灶和远离病灶部位3cm外分别切取黄豆样大小组织1块，用手术刀切成厚度不超过0.5cm的组织小块，浸泡入1mL RNAfixer非液氮型样品RNA保存液(北京百泰克)中，放入-80℃超低温冰箱中备用。对早期胃癌(黏膜内癌)患者行内镜粘膜下剥离术(Endoscopic submucosal dissection，ESD)，术后用活检钳收集胃癌病灶和癌旁组织各1块，非液氮型样品RNA保存液中-80℃超低温冰箱中保存备用。对于血浆采集，采用碘伏消毒后，无菌注射器采集上肢外周静脉血3mL，转移到EDTA抗凝管后，室温下3000rpm离心10min使血液分层，将上层淡黄色血浆层转移到2mL无RNase离心管中，放入到-80℃超低温冰箱中保存备用。
(二)特异性PCR反向引物设计与合成
本发明自主设计了用于人胃黏膜组织和循环血浆hsa-circ-0086720检测的特异性PCR反向引物，该引物上游序列为5’-ACTGCCGTCAACTCCTGTTC-3’，下游序列为5’-TGTCTGAATTCCCTTCCAGCAA-3’。PCR特异扩增检测片段为5’-TCCTCAGAGCCTGCTTATGGAAGTGACAGGGAAAAATCAGGATGAATGCATAGTGGCCCTACATGATTGTAATGGAGATGTGAACAAAGCTATCAATATA-3’。结合图1所示，通过对该引物PCR产物测序，验证了引物扩增的特异性。
(三)总RNA提取与hsa-circ-0086720的RCR检测
1.将标本从-80℃超低温冰箱中取出，室温解冻。
2.组织块用滤纸吸干后，多位点剪取50mg组织，置于2mL无RNase离心管中，加入Trizol试剂(美国Invitrogen)1mL，用手持式匀浆器充分匀浆至无可见固体后，室温静置10min。对于血浆样本，取血浆300μL转移到2mL无RNase离心管中，加入Trizol LS(美国Invitrogen)试剂900μL，旋涡震荡10s，室温静置5min。
3.三氯甲烷提取：加入0.2mL三氯甲烷，漩涡振荡10秒，室温静置5分钟后12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新无RNase离心管中。
4.异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，混匀，4℃条件下静置20分钟后12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀。
5.75％乙醇洗涤：加入质量分数为75％乙醇1mL，该乙醇经过-20度预冷，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清，再用75％乙醇重复洗涤一次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清。
6.干燥RNA：再次4℃下12000rpm离心1分钟，用100μL移液器缓慢吸除残余液体后，见一针尖大小半透明白色RNA沉淀，室温条件下干燥1分钟，加10μL无RNase水溶解，反复吹打，得到RNA提取液。
7.RNA逆转录：在0.5mL离心管中加入9.5μL RNA提取液、1μLRandom Primers、1μLPCR Nucleotide Mix、2μL MgCl2、1μL Reverse Transcriptase、4μL Reaction Buffer和0.5μL Ribonuclease Inhibitor；然后在25℃保温5分钟，42℃1小时，再在70℃保温15分钟，加入80μL无RNase水，就得到cDNA溶液。
8.PCR检测：对上步的cDNA溶液进行荧光定量PCR(仪器购于美国Stratagene公司)，扩增的引物为hsa-circ-0086720特异性扩增上下游引物：上游序序列为5’-ACTGCCGTCAACTCCTGTTC-3’,下游序列为5’-TGTCTGAATTCCCTTCCAGCAA-3’。其具体操作如下：
在薄壁透明荧光定量PCR反应管中分别加入hsa-circ-0086720特异性扩增上下游引物各1μL，12.5μLqPCR MasterMix(美国Promega)，5.5μL无RNase水和5μL cDNA；PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性15秒，55℃退火30秒，70℃延伸30秒，共45个循环；解链曲线分析：95℃1分钟，55℃30秒；然后缓慢升温至95℃，升温速率为0.2℃/秒。
最后得到如附图2(组织)和图4(血浆)所示的hsa-circ-0086720扩增曲线和如附图3(组织)和图5(血浆)所示的hsa-circ-0086720解链曲线，从扩增曲线可以得到所检测标本的Ct值，从解链曲线中可以了解到该曲线为较窄的单一峰，可以看出每个标本的hsa-circ-0086720均被特异性扩增，没有引物二聚体和杂带的干扰。通过hsa-circ-0086720的PCR产物测序，验证了引物扩增的特异性(图1)。
(四)hsa-circ-0086720表达水平的计算
与hsa-circ-0086720检测方法基本相同，所不同的只是将扩增的上下游引物由GAPDH特异性扩增上下游引物代替hsa-circ-0086720，检测得到样本中GAPDH表达水平的扩增曲线和解链曲线。样本cDNA的CtGAPDH值≤30，RNA即cDNA质量合格。所用的GAPDH特异性扩增上下游引物序列为：上游序列为5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；下游序列为5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’。
利用同一标本中hsa-circ-0086720和GAPDH的Ct值，就可根据公式ΔCt＝CtcircRNA-CtGAPDH计算出该hsa-circ-0086720的Ct值，根据Ct值的大小就可判断该hsa-circ-0086720的相对表达水平；Ct值小者，其对应circRNA的表达水平高；而Ct值大者，其对应circRNA的表达水平低。
(五)hsa-circ-0086720在胃癌组织、循环血浆中的变化规律及其临床应用
借助上述qRT-PCR技术，大样本验证hsa-circ-0086720在胃癌组织及其配对癌旁组织中表达情况，结合图6所示，结果表明hsa-circ-0086720在82.3％胃癌患者癌组织中显著低表达。在此基础上，结合图7所示，进一步对胃黏膜内癌和癌旁组织检测发现，hsa-circ-0086720也在胃黏膜内癌组织中显著低表达。
结合肿瘤临床病理因素，本发明发现胃癌组织中hsa-circ-0086720的表达水平与Borrmann分型、神经侵袭密切相关。结合图8所示，Kaplan-Meier生存分析显示胃癌组织hsa-circ-0086720的表达水平与患者术后总生存率和无病生存率相关。Cox单因素分析提示胃癌组织hsa-circ-0086720表达水平是影响胃癌患者术后总生存期和无病生存期长短的独立危险因素。
进一步通过联合胃癌组织hsa-circ-0086720表达水平与患者年龄、淋巴结转移、神经侵袭、CEA表达这些临床病理因素，构建nomogram生存预测模型，该模型能较好地预测胃癌患者术后3-5年总生存率(图9A)和无病生存状态(图9B)。
不仅如此，通过检测和比较早期胃癌患者(黏膜内癌)和健康人循环血浆hsa-circ-0086720水平的差异，结合图10所示，发现hsa-circ-0086720水平在早期胃癌患者循环血浆中即有显著升高。通过构建受试者工作特征(ROC)曲线，发现胃癌组织hsa-circ-0086720具有良好的敏感性与特异性。结合图11A所示，胃癌组织hsa-circ-0086720的ROC曲线下面积为0.670(95％CI,0.594-0.746)，敏感性和特异性分别为41.67％和86.64％。结合图11B所示，而早期胃癌循环血浆hsa-circ-0086720的ROC曲线下面积为0.771(95％CI,0.663–0.879)，当其截断值为3.77，敏感性和特异性分别为67.4％和87.2％，远远超过血浆CAE水平。
本发明通过上述研究，系统解决了组织和循环血浆hsa-circ-0086720的特异性检测问题，发现并证明了hsa-circ-0086720是一种可以用于早期胃癌筛查和胃癌患者术后疾病评估的环状RNA分子，并且可通过qRT-PCR方法实现批量定量检测。本发明为早期胃癌的筛查提供了新的分子标志物，对进一步提高当前胃癌诊治水平具有一定的意义。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波大学医学院附属医院
<120> 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用
<130> 2021.12.15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttatggaag tgacagggaa aaatcaggat gaatgcatag tggccctaca tgattgtaat 60
ggagatgtga acaaagctat caatatattg ctggaaggga attcagacac aacttcatgg 120
gagactgtag ggtgtaagaa aaagaatttt gcaaaagaaa attcagaaaa caaagagaat 180
agagagaaga aaagcgagaa agaatcgagt cgtggacgtg gaaacaacaa ccggaaagga 240
agaggcggca atcgtggcag agaatttaga ggtgaagaaa atggaattga ttgcaatcaa 300
gtggacaaac cttcagatcg tggcaagcga gcccggggta gaggatttgg acgtggcaga 360
gggagagggg caggaaggtt ctcaacccaa ggcatgggga catttaatcc tgcagactat 420
tcagattcta catctacaga tgtgtgtggg acaaagctag tagtttggga agctgctcag 480
aatggtgcag atgagggaac tgaactggca tcaaatactc acaacatagc tcaggatctg 540
tcaaacaaaa gttcttatgg actcaaaggg gcttggaaga attctgtgga agagtggaca 600
acagaagact ggactgaaga tctttctgaa acaaaggtct tcactgcctc atctgctcca 660
gcagagaatc acatcttacc tgggcaaagc attgatctgg tagccttgct ccagaagcct 720
gttcctcaca gtcaagcctc agaagccaac tcctttgaaa cttcccaaca gcagggcttt 780
ggccaagccc ttgtcttcac aaattcgcaa cacaacaatc agatggcacc agggactggc 840
agctccactg ccgtcaactc ctgttctcct cagagcctg 879

Claims (6)

1.血浆中的hsa-circ-0086720作为胃癌诊断标志物在制备用于筛查早期胃癌黏膜内癌产品中的应用，hsa-circ-0086720的核酸序列如SEQ ID No.1所示，其特征在于：检测血浆中hsa-circ-0086720水平的所述产品为实时荧光定量检测试剂，所述实时荧光定量检测试剂包括特异性扩增hsa-circ-0086720的引物，该引物背靠背设计、跨接点：
正向引物5’-ACTGCCGTCAACTCCTGTTC-3’；
反向引物5’-TGTCTGAATTCCCTTCCAGCAA-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品能够通过检测血浆中hsa-circ-0086720的水平来辅助诊断或筛查患者是否患有早期胃癌黏膜内癌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：检测血浆中hsa-circ-0086720水平的所述产品包括：通过实时定量PCR、原位杂交、基因测序、试剂盒或基因芯片检测的hsa-circ-0086720水平以诊断或筛查早期胃癌黏膜内癌的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因芯片至少包括与hsa-circ-0086720核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂的PCR特异扩增检测片段包括5’-TCCTCAGAGCCTGCTTATGGAAGTGACAGGGAAAAATCAGGATGAATGCATAGTGGCCCTACATGATTGTAATGGAGATGTGAACAAAGCTATCAATATA-3’。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述试剂为实时荧光定量检测试剂盒，所述实时荧光定量检测试剂盒中含有内参基因GAPDH特异性PCR引物：
正向引物：5’- ACCCACTCCTCCACCTTTGAC -3’；
反向引物：5’- TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT -3’。
CN202111540330.6A 2021-12-16 2021-12-16 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用 Active CN114231631B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111540330.6A CN114231631B (zh) 2021-12-16 2021-12-16 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111540330.6A CN114231631B (zh) 2021-12-16 2021-12-16 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114231631A CN114231631A (zh) 2022-03-25
CN114231631B true CN114231631B (zh) 2023-07-21

Family

ID=80756789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111540330.6A Active CN114231631B (zh) 2021-12-16 2021-12-16 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114231631B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116162705B (zh) * 2022-11-10 2024-03-12 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种胃癌诊断产品和诊断模型
CN116377062B (zh) * 2022-12-07 2024-03-29 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 检测环状RNA hsa_circ_0033144的试剂在制备诊断胃癌产品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114231631A (zh) 2022-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107177669B (zh) 一种胃癌分子标志物hsa_circ_0006633及其应用
CN114231631B (zh) 血浆hsa-circ-0086720作为胃癌诊断和术后评估标志物的应用
CN102947468B (zh) 大肠肿瘤的检测方法
CN106755344B (zh) 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用
JP5209272B2 (ja) 肝臓癌関連遺伝子、及び肝臓癌リスクの判定方法
CN115537466A (zh) 一种检测胃癌的miRNA标志物组合及试剂盒
JP2015522277A (ja) 前立腺癌の診断方法と診断用物質
JP2006526390A (ja) 正常細胞およびがん細胞における遺伝子発現を検出する方法
CN106636343B (zh) 一种检测口腔癌的标志物及其试剂盒
JP2020068673A (ja) 口腔癌判定装置、口腔癌判定方法、プログラム及び口腔癌判定キット
CN108588227A (zh) 用于结直肠癌诊断的引物及探针、试剂盒及基因检测方法
US20040259101A1 (en) Methods for disease screening
WO2020135422A1 (zh) 健康风险评估方法
KR102108299B1 (ko) 위암의 림프절 전이를 예측하기 위한 마이크로rna 마커
JP2013542733A (ja) 結腸直腸癌のスクリーニング方法
RU2647470C2 (ru) Способ диагностики метастазов рака толстой кишки
EP2247754A1 (en) Colon cancer associated transcript 1 (ccat1) as a cancer marker
CN114875155A (zh) 一组基因突变及其在诊断胰胆道癌中的应用
JP2018139537A (ja) 食道がんのリンパ節転移可能性のデータ取得方法
CN116479119A (zh) 胃癌相关环状RNA hsa-circ-0005927标志物的临床应用
CN106148562A (zh) 用于检测前列腺癌的标记物
KR102550113B1 (ko) 전립선암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
CN106148563A (zh) 前列腺癌的生物标记
CN115786523A (zh) Sirpg-as1作为乳腺癌诊断标志物的用途
Kawanishi et al. Gene expression profiles of genes related to canceration, invasion or conversion for metastasis in patients with poorly differentiated gastric adenocarcinoma treated by gastric endoscopic submucosal dissection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230627

Address after: 315000 No. 59 Liuting Street, Haishu District, Ningbo City, Zhejiang Province

Applicant after: The First Affiliated Hospital of Ningbo University

Address before: No. 247, Renmin Road, Jiangbei District, Ningbo City, Zhejiang Province

Applicant before: THE AFFILIATED HOSPITAL OF MEDICAL SCHOOL OF NINGBO University

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant