CN115786523A - Sirpg-as1作为乳腺癌诊断标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疾病诊断技术领域，公开了SIRPG‑AS1作为乳腺癌诊断标志物的用途。通过设计特异性引物进行qPCR实验验证了SIRPG‑AS1在乳腺癌中的高表达，但在乳房良性肿瘤和良性肿瘤旁组织中的表达未见明显差异，这使得SIRPG‑AS1适用于快速和经济有效的早期乳腺癌检测。

Description

SIRPG-AS1作为乳腺癌诊断标志物的用途

技术领域

本发明涉及疾病诊断技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA SIRPG-AS1作为乳腺癌诊断标志物的用途。

背景技术

乳腺癌是一种异质性疾病，是女性中最常见的癌症。尽管对乳腺癌的发病机制和治疗进行了大量研究，但它仍然是世界范围内癌症死亡的主要原因。研究人员已经研究了许多乳房诊断方法，乳房x线照相术、磁共振成像、超声、计算机断层摄影术、正电子发射断层摄影术和活检都是可用的乳房诊断方法。然而，这些技术有其局限性，昂贵耗时，不适合年轻女性。开发一种高灵敏、快速的早期乳腺癌诊断方法已迫在眉睫。近年来，研究人员开始关注利用不同的生物标记物来检测乳腺癌的生物传感器的开发，用于快速和经济有效的早期乳腺癌检测。

在癌症中发挥着重要作用的除了蛋白质编码基因的突变或异常表达外，还包括非编码RNA，尤其是长链非编码RNA(lncRNA)的突变和失调。运用肿瘤样本的全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)手段，研究人员发现了大量与各种类型癌症相关的lncRNAs。作为一种新兴的调控因子，lncRNAs参与多种基因表达、生理和病理过程。越来越多的证据表明，lncRNAs对于癌症的功能并不是单一的，它们可能具有抑癌功能，也可能具有致癌功能。它们不仅能调控癌细胞的增殖、分化、侵袭和转移，还能作为诱捕、支架、竞争性内源RNAs调节代谢相关基因的转录和翻译，最终导致癌细胞的代谢新编程。由于其在多种组织中的全基因组表达模式及其组织特异性表达特性，lncRNAs有希望成为新的肿瘤生物标志物和癌症治疗靶点。

SIRPG-AS1(SIRPG antisense RNA1)位于第20号染色体长臂1区3带,包含3个外显子。目前对SIRPG-AS1的研究较少，关于SIRPG-AS1在乳腺癌中的作用需要更多探索。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与乳腺癌诊断相关的lncRNA，SIRPG-AS1作为乳腺癌的分子标志物在制备诊断乳腺癌产品中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了SIRPG-AS1作为乳腺癌的分子标志物在制备诊断乳腺癌产品中的应用。本发明的SIRPG-AS1(Gene ID:101929010)的具体序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。

本发明所述诊断乳腺癌产品通过检测被测试者体内SIRPG-AS1的表达水平，与正常水平相比较来诊断乳腺癌。

用于诊断乳腺癌的SIRPG-AS1来源包括但不限于组织和体液，体液包括血液、组织液等存在DNA的体内液体成分。在本发明的具体实施方案中，用于诊断乳腺癌的SIRPG-AS1的来源是组织。

所述产品包括通过反转录PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测SIRPG-AS1的表达水平以诊断乳腺癌的产品。所述产品包括芯片、试剂盒或试纸。

进一步，所述通过反转录PCR检测SIRPG-AS1表达水平以诊断乳腺癌的产品至少包括一对特异扩增SIRPG-AS1的引物；所述通过实时定量PCR检测SIRPG-AS1表达水平以诊断乳腺癌的产品至少包括一对特异扩增SIRPG-AS1的引物；所述通过原位杂交检测SIRPG-AS1表达水平以诊断乳腺癌的产品包括：与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测SIRPG-AS1表达水平以诊断乳腺癌的产品包括与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针。

本发明还提供了一种诊断乳腺癌的试剂盒，包括至少一对特异性扩增SIRPG-AS1的引物。作为一种实施方式，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述试剂盒还包括RT-PCR试剂或实时定量PCR试剂。

在本发明的具体实施方案中，所述通过实时定量PCR检测SIRPG-AS1表达水平以诊断乳腺癌的产品至少包括的一对特异扩增SIRPG-AS1的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种诊断乳腺癌的原位杂交试剂盒，所述试剂盒包括与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针。

本发明还提供了一种诊断乳腺癌的芯片，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SIRPG-AS1转录水平的与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针。

本发明中，与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

在本发明的上下文中，“诊断乳腺癌”既包括判断受试者是否已经患有乳腺癌，也包括判断受试者是否存在患有乳腺癌的风险。

相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：

本发明通过RNA测序发现SIRPG-AS1在癌组织和癌旁组织中差异表达显著，通过设计特异性引物进行qPCR实验进一步验证了SIRPG-AS1在乳腺癌中的高表达。并且，SIRPG-AS1在乳房良性肿瘤和良性肿瘤旁组织中的表达未见明显差异，这使得SIRPG-AS1适用于快速和经济有效的早期乳腺癌检测。

SIRPG-AS1的发现有助于了解lncRNAs在乳腺癌中的作用机制，同时也为筛选乳腺癌相关的新的生物标志物提供研究方向，为乳腺癌的治疗提供新的靶点。

附图说明

图1为利用qPCR检测SIRPG-AS1在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达差异统计图；

图2为利用qPCR检测SIRPG-AS1在良性乳房肿瘤组织和肿瘤旁组织中的表达差异统计图；

图3为乳腺癌样本SIRPG-AS1的ROC曲线分析及AUC值。

具体实施方式

本发明对乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织进行RNA测序分析发现了差异表达的lncRNAs和mRNAs，通过构建基因共表达网络图，找到一种与α-亚麻酸代谢相关的基因PLA2G2D共表达的lncRNA——SIRPG-AS1(SIRPG antisense RNA1)。SIRPG-AS1在乳腺癌组织和癌旁组织中差异表达显著，通过设计特异性引物进行qPCR实验进一步验证了SIRPG-AS1在乳腺癌中的高表达。SIRPG-AS1在乳房良性肿瘤和良性肿瘤旁组织中的表达未见明显差异，使得SIRPG-AS1能够作为诊断标志物用于快速和经济有效的早期乳腺癌检测。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1SIRPG-AS1在乳腺癌中的差异表达

1、标本来源

恶性肿瘤标本选自医院手术切除的6对乳腺癌组织和癌旁组织。良性肿瘤标本选自医院手术切除的4对乳腺肿瘤组织和肿瘤旁组织。患者年龄41-67岁。

2、病例筛选

(1)所有乳腺癌患者均为初诊，术前均未接受过化疗、放疗或其他治疗。

(2)所有切片均经过常规HE染色，经过至少两位病理学专家独立诊断，并与临床病理报告相对比。

3、所用试剂

表1所用试剂

4、所用设备

表2所用设备

仪器设备	公司	国家
			-80℃低温医用冰箱	海尔	中国
高通量组织研磨仪	浙江美壁	中国
			微量核酸定量分析仪	杭州佑宁	中国
低温高速离心机	ThermoFisher	美国
			Vortex漩涡混合器	华大科技	中国
移液器	Eppendorf	德国
			Ⅱ级生物安全柜	BIOBASE	中国
电子天平	METTLERTOLEDO	瑞士
			PCR仪	ABI	美国

5、RNA提取

1)组织研磨过程中使用过的器具放入84消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜，洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后，180℃烘烤4小时才能够进行RNA抽提。

2)在进行RNA提取之前，磁珠要提前用ONRol Reagent浸泡过夜，实验过程中用到的手术剪、EP管提前冰上预冷。从-80℃冰箱中取出已提前准备好并冻存的样本，快速用手术剪剪取50mg的组织样品，尽量剪碎，转移至预冷的2mL去酶EP管中，并放入两个预冷的磁珠。

3)每50mg研磨完全的组织中加入1mL ONRol Reagent，室温孵育5min，使细胞充分裂解。

4)RNA的分离：加入200μL 1-溴-3-氯丙烷(200μL/1ml ONRol Reagent)，用手剧烈震荡15s，室温静置5min，13,000g 4℃离心5分钟，吸取上层水相至另一干净去酶的离心管。

5)加入750μL无水乙醇至上清液中，漩涡15s。

6)把NAExtraction Mini Columns装在2mL收集管中，转移750μL步骤5)中的混合液至过滤柱，13,000g离心1min。

7)弃掉滤液，将剩余混合液全部转移至过滤柱，13,000g离心1min。

8)弃掉滤液，加入500μL BufferW1R至过滤柱，13,000g离心10s。

9)弃掉滤液，加入600μL BufferW2R至过滤柱，13,000g离心10s。

10)重复步骤9。

11)弃掉滤液，再次13,000g离心2min。

12)将过滤柱转移至1.5mL去酶EP管中，柱子中间加入30～100μL去酶水，室温静置2min，13,000g离心1min。

7)提取RNA质量的检测：取2μL溶解的RNA用微量核酸定量分析仪检测RNA的浓度和纯度，质量较好的RNA OD₂₆₀与OD₂₈₀的比值应该在1.8和2.0之间。

6、逆转录和qPCR

逆转录合成cDNA第一链，反转录条件设置为：25℃10min，42℃15min，85℃5min，4℃保存。反转录的体系为：2μL的5×All-In-One RT MasterMix，500ng的RNA溶液，RNaseFree H₂O补齐至10μL。

qRT-PCR(QPCR)程序为：95℃3min；95℃3s，60℃30s，共40个循环。反应体系为：SYBR Primix Ex TaqⅡ10μL，0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，7.2μL的dH₂O，2μL的cDNA。根据每个反应的Ct值，用2^-△△Ct方法计算目的基因的表达水平，内参为ACTIN。引物序列见表3。

表3引物序列

7、统计分析

实验数据采用GraphPad Prism 8.3.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

8、结果

结果如图1所示，与正常癌旁组织相比，乳腺癌组织中SIRPG-AS1平均表达水平明显上调，差异具有统计学意义(*:P<0.05)。而在乳房良性肿瘤中，良性肿瘤组织与肿瘤旁乳腺组织的SIRPG-AS1平均表达水平无明显差异，如图2所示(ns:P>0.05)。

图3对6对乳腺癌标本的SIRPG-AS1进行ROC曲线分析显示，AUC为0.8163(p＝0.0476)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.SIRPG-AS1作为乳腺癌的分子标志物在制备诊断乳腺癌产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断乳腺癌产品通过检测被测试者体内SIRPG-AS1的表达水平，与正常水平相比较来诊断乳腺癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测被测试者组织或体液中SIRPG-AS1的表达水平。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测SIRPG-AS1表达水平。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或试纸。

6.一种诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，包括至少一对特异性扩增SIRPG-AS1的引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR试剂或实时定量PCR试剂。

9.一种诊断乳腺癌的原位杂交试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针。

10.一种诊断乳腺癌的芯片，其特征在于，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SIRPG-AS1转录水平的与SIRPG-AS1的核酸序列杂交的探针。

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