CN106148562A - 用于检测前列腺癌的标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测前列腺癌标记物，所述的标记物选自以下PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一个或多个基因。本发明进一步公开了所述的标记物在制备前列腺癌诊断和预后产品中的应用。本发明还公开了一种前列腺癌诊断或预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一组或多组的引物序列。本发明利用一个或多个基因作为标记物联合检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测、预后评估，其精确度大大提高，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

用于检测前列腺癌的标记物
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及前列腺癌相关基因的表达水平来诊断癌症并监控治疗效果的产品应用。
背景技术
前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。
前列腺癌的临床诊断方式目前主要有血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠指检、直肠超声波检测、活组织病理检查等。PSA(Prostate Specific Antigen)为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。所以PSA并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：(1)患者前列腺肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。
假基因与正常基因有相似的序列，但是与正常的基因存在结构上的差异。这些差异包括在不同部位上程度不等的核苷酸缺失或插入，在基因内含子和外显子连接区发生序列变化，在编码序列当中含有终止密码子，或在转录启动区出现缺陷等。这些变化使此类基因不能转录翻译，或者产生有缺陷的蛋白质从而失去原有的生物学功能。长期以来，人们认为假基因是貌似正常、却没有功能的“死亡基因”，是基因组进化的“化石记录”。但是近年来，关于假基因的讨论日益增多，越来越多的试验证实假基因能够转录并且表达。假基因在基因表达调控、基因组进化等方面发挥着重要作用。
目前，对于中晚期前列腺癌患者，手术治疗的效果差，大多数采用药物治疗。根据不同的病情可以采用化学药物治疗、外放射治疗、放射性核素内放射治疗以及各种疗法的综合应用等。然而，放化疗药物不仅作用于肿瘤，还可以作用于肿瘤周围健康的组织，因而在杀伤肿瘤的同时，也给机体带来了很大的副作用，最终影响对肿瘤的治疗效果。因此，本领域迫切需要开发早期判断前列腺癌的特异性标志物，并开发前列腺癌的靶向药物。
发明内容
为了实现前列腺癌的早期诊断，预后评估，个体化治疗，本发明的目的之一在于提供用于检测前列腺癌的标记物。
本发明的目的之二在于提供所述的标记物在制备前列腺癌诊断和预后产品中的应用。
本发明的目的之三是在于提供一种前列腺癌诊断或预后评估试剂盒。
为实现上述目的，本发明首先提供用于检测前列腺癌标记物，所述的标记物选自以下PPIEL(NR_003929.2，pseudogene)、RAET1K(NR_024045.1，pseudogene)和/或MBL1P(NR_002724.2，pseudogene)中的一个或多个基因。
优选地，所述基因在前列腺癌组织中均表达下调。
进一步地，本发明提供了所述的标记物在制备前列腺癌诊断和预后产品中的应用。
优选地，所述诊断和预后为诊断、疗效评估或转移复发监控。
优选地，所述产品包括检测试剂或试剂盒。
优选地，所述检测试剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或RNA测序检测待测样品中上述基因的相对含量来诊断前列腺癌。
优选地，所述基因芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的基因核苷酸的部分或全部序列。
优选地，所述的基因的相对含量为待测样品中基因表达水平相比于对照的表达水平。
优选地，所述待测样品包括受试者的细胞组织样品和血液样品；所述细胞组织样品为前列腺癌组织样品；所述前列腺癌组织样本包括治疗前的或治疗后的组织样本；所述对照为癌旁组织样品；所述癌旁组织为正常组织。
优选地，所述治疗包括施用手术干涉，化疗，放疗，药物治疗或其组合。
优选地，所述的检测基因的表达水平包括检测转录物水平。
进一步地，本发明提供一种前列腺癌诊断或预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一组或多组的引物序列。
优选地，所述引物序列包括：
PPIEL：SEQ IDNO.1和2；
RAET1K：SEQ IDNO.3和4；
和/或MBL1P：SEQ IDNO.5和6。
优选地，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。所述试剂盒含有人正常的前列腺组织或细胞的总RNA或DNA。
进一步地，本发明提供一种检测受试者中存在前列腺癌的体外方法。所述方法包括确定来自受试者第一样品中一个或多个基因的表达水平以获得测定值，所述基因选自：PPIEL、RAET1K和/或MBL1P。以及将所述的测定值与参考值相比较，测定值明显低于参考值表明所述受试者患有前列腺癌。所述的参照水平是正常细胞中上述基因的水平。
进一步地，本发明提供一种评估对受试者的前列腺癌治疗效果的体外方法。所述方法包括确定来自受试者的一个或多个基因的相对含量以获得第一值，所述基因选自：PPIEL、RAET1K和/或MBL1P。对受试者实施癌症治疗，确定在其后由受试者获得的后续样品中，所述的一个或多个相同的基因的相对含量以获得治疗值；和将所述的第一值与所述治疗值相比较。评估疗效定为治疗值高于所述第一值的10％，表明所述治疗是有效的，低于或等于10％，说明所述治疗是无效的。
优选地，所述第一和后续样品是已知的或被怀疑包含前列腺癌组织或细胞，例如已知的或被怀疑包含循环前列腺癌细胞(CTC)的血液样品，或已知的或被怀疑含有前列腺癌细胞的活检样品。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一组与前列腺癌相关的基因，并进一步证实这些基因的表达水平在前列腺癌组织中表达下调。利用一个或多个基因联合检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测、预后评估，其精确度大大提高，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1分别为PPIEL、RAET1K和/或MBL1P在前列腺癌组织和癌旁组织的表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人对前列腺癌组织样本及癌旁组织样本进行高通量测序，通过生物信息学方法进行基因筛选，挑选3个候选基因：PPIEL、RAET1K和MBL1P，现有研究中并没有关于上述基因和前列腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了上述基因在前列腺癌细胞中表达下调。
PPIEL(peptidylprolyl isomerase E like pseudogene,肽基脯氨酰异构酶E类假基因)位于1号染色体上，是与PPIE基因转录相关的假基因。PPIEL在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达下调。
RAET1K(retinoic acid early transcript 1K pseudogene，维甲酸早期转录1k假基因)位于6号染色体上。
MBL1P(mannose binding lectin 1,pseudogene，甘露糖结合凝集素1，假基因)，位于第10号染色体上。人类MBL(mannose binding lectin，甘露糖结合凝集素)有两个基因，其中MBL1是伪基因，只有MBL2能够编码蛋白质。
本发明的所述的基因是在本发明之前的已知，基本信息可以在Genbank中查到，来源于人类基因组。
本发明还采用RT-PCR方法检测上述基因在前列腺癌组织和癌旁正常组织的表达，并验证了上述基因在前列腺癌中表达下调。
本发明使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过前列腺癌分期确定与前列腺癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患前列腺癌或通过前列腺癌分期确定的前列腺癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。
在本发明中，“预后”是指癌症患者在通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。预后可以是通过手术、化疗、药物治疗或其组合处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查标志物来评估，所述的标记物选自以下PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一个或多个基因。预后评估可以这样进行：根据标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
实施例1高通量测序筛选差异表达基因
1、取样
取2011年10月到2015年12月期间在北京协和医院泌尿外科手术中获得组织标本27例，所有标本均经病理学检查证实，其中癌旁组织样本8例、前列腺癌标本19例，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、对组织样本进行总RNA提取
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达PPIEL、RAET1K和/或MBL1P基因，上述基因在前列腺癌组织样本中表达下调。
实施例2 RT-PCR验证前列腺癌组织及癌旁组织中基因表达情况
1、材料
前列腺癌组织样本34例及癌旁组织样本8例取自北京协和医院2011至2015年期间泌尿外科手术中前列腺癌样本，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。
2、方法
2.1对组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3 Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI：PPIEL(NR_003929.2，pseudogene)、RAET1K(NR_024045.1，pseudogene)和/或MBL1P(NR_002724.2，pseudogene)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表1引物序列
操作过程如下：
表2 Real Time反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10uM) 0.5μL
下游引物(10uM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
(一)反应体系：用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品Real Time-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
3、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较基因在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，基因在前列腺癌患组织中的表达水平低于癌旁组织中，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析基因在前列腺癌患者中表达下调的结果。具体情况见图1。
实施例3前列腺癌预后评估试剂盒制备
基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中一个或多个基因的引物组如表1所示，具体为：
1、试剂盒包括特异性扩增PPIEL和RAET1K；
2、试剂盒包括特异性扩增PPIEL、RAET1K和MBL1P。
和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4；还包括前列腺正常组织cDNA：作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：
表3 PCR反应体系
组分 加入量
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板cDNA 2.0μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
最佳反应条件为：
95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40个循环，72℃10min。
实施例4前列腺癌预后评估试剂盒的临床验证
对北京协和医院自2011年10月至2015年12月间收治的10例泌尿外科手术中前列腺癌患者组织样本进行了研究，获取的手术组织为前列腺癌组织。利用实施例3所述的两种试剂盒检测10例前列腺癌患者组织中的相应基因表达的相对含量。治疗结束后再检测患者前列癌组织中上述基因表达相对含量。判断标准定为：治疗后基因表达相对含量与治疗前相比相升高小于10％，判断为治疗无效；治疗后基因表达相对含量与治疗前相比升高大于或等于10％，判断为治疗有效，相比越高治疗效果越好，其评估结果如表4所示。同时，医生根据临床症状判断前列腺癌的治疗效果，结果如表4所示。
表4实施例3所述的试剂盒评估前列腺癌疗效结果
由表4可知，在10例临床患者中，试剂盒1检测结果显示其中5例有疗效，其余5例无治疗效果，其中编号为8的患者判断结果与临床结果有误；试剂盒2检测结果为4例有治疗效，其余6例无治疗效果，该试剂盒检测结果与临床判断结果一致。据此推断，试剂盒2比试剂盒1检测更加精确，本前列腺癌的预后评估试剂盒可以对前列腺癌患者治愈效果进行评估，并以此为临床提供有用的参考价值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于检测前列腺癌标记物，其特征在于，所述的标记物选自以下PPIEL(NR_003929.2，pseudogene)、RAET1K(NR_024045.1，pseudogene)和/或MBL1P(NR_002724.2，pseudogene)中的一个或多个基因。
2.如权利要求1所述的标记物，其特征在于，所述的基因在前列腺癌组织中均表达下调。
3.如权利要求1或2所述的标记物在制备前列腺癌诊断和预后产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断和预后为诊断、疗效评估或转移复发监控。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂或试剂盒。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或RNA测序检测待测样品中上述基因的相对含量来诊断前列腺癌。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测基因的表达水平为检测转录物水平。
8.一种前列腺癌诊断或预后评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增PPIEL、RAET1K和/或MBL1P中的一组或多组引物序列。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物序列包括：SEQ ID NO.1和2；SEQID NO.3和4；和/或SEQ ID NO.5和6。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
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