CN108949976A - C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途 - Google Patents

C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途 Download PDF

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狄文玉
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Abstract

本发明公开了C12orf70和C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的应用。并证实了C12orf70和C17orf107基因在胰腺癌生物学样品中下调。本发明还提供了用于检测C12orf70和C17orf107基因的表达水平的试剂盒和生物试剂，以及其在胰腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后中的应用。利用C12orf70和C17orf107基因在胰腺癌高危人群中进行检测，能够快速有效的做到胰腺癌的早期诊断，而且为预测诊断胰腺癌的发生发展甚至是为今后在生物学水平治疗胰腺癌提供了治疗靶点和重要依据，可应用于胰腺癌的诊断、治疗、监测及预后。

Description

C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途。
背景技术
胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，世界上最致命的癌症之一，5年生存率低于5％。造成胰腺癌预后较差的原因主要是胰腺癌发病隐匿，诊断滞后，远处转移较早、局部侵袭性强，缺乏有效治疗药物。目前，手术切除被认为是唯一确定有效的治疗方法。由于胰腺癌发现时多伴有转移，手术根治在多数情况下已无法实现。到目前为止，大约仅有20％的胰腺癌患者可以进行根治性切除，即使在这些患者中，由于早期转移或复发其5年生存率依然很低。目前可用于诊断有症状的胰腺癌的方法主要是影像学：电脑断层扫描(CT)，内窥镜超声(EUS)，内镜下逆行胰胆管造影(ERCP)，但早期诊断仍十分困难。高敏感性和特异性的胰腺癌无创诊断方法有望提高胰腺癌早期诊断率和预后生存率，提高手术切除的可能性，降低胰腺癌死亡率。
因此，寻找参与胰腺癌发生发展，尤其是与胰腺癌早期诊断及预后相关的新的生物学指标，对于早期发现胰腺癌并改善胰腺癌患者的预后具有重要意义。
发明内容
为了实现胰腺癌的早期诊断，提高预后生存率，降低死亡率，本发明的目的在于提供C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途。
本发明的目的之二在于提供一种胰腺癌检测试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种检测胰腺癌的生物试剂。
为了实现上述目的，本发明首先提供了C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途。
优选的，所述C12orf70和/或C17orf107基因或其表达产物在胰腺癌生物学样品中表达下调。
优选的，所述产品包括胰腺癌辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒或生物试剂。
优选的，所述试剂盒或生物试剂能够通过检测生物学样品中C12orf70和/或C17orf107基因或其表达产物的表达水平来判断受试者是否患有胰腺癌、受试者胰腺癌的治疗效果或受试者预后情况。
进一步地，本发明提供了一种胰腺癌检测试剂盒，所述试剂盒包含检测C12orf70和/或C17orf107基因表达水平的工具，以及如何使用所述试剂盒的说明。
优选的，所述工具包括用于检测C12orf70和/或C17orf107基因的引物对或探针。
优选的，所述C12orf70引物对具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述C17orf107引物对具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
优选的，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen荧光染料。
进一步地，本发明还提供了一种检测胰腺癌的生物试剂，所述生物试剂包括一组或两组引物对，所述生物试剂包括一组或两组引物对，其中一组引物对为特异性扩增C12orf70基因的引物对，具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；一组引物对为特异性扩增C17orf107基因的引物对，具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；所述引物对通过转录介导扩增技术来检测人体体内C12orf70和/或C17orf107基因的表达水平。
更进一步地，本发明还提供了所述的生物试剂在胰腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、本发明还提供了所述的试剂盒在胰腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了胰腺癌相关肿瘤标记物C12orf70和C17orf107，并证实了C12orf70和C17orf107基因在胰腺癌生物学样品中表达下调，可作为胰腺癌检测指标。利用C12orf70和C17orf107基因在胰腺癌高危人群中进行检测，能够快速有效的做到胰腺癌的早期诊断，而且为预测诊断胰腺癌的发生发展甚至是为今后在生物学水平治疗胰腺癌提供了治疗靶点和重要依据，可应用于胰腺癌的诊断、治疗、监测及预后。
附图说明
图1为PCR验证C12orf70在胰腺癌组织中表达上调；
图2为PCR验证C17orf107在胰腺癌组织中表达上调。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库包含了多种肿瘤类型多种层次的数据信息，包括：miRNA、mRNA、蛋白质谱、突变谱、临床诊断信息等。这些数据为肿瘤数据分析提供了丰富的资源。因此，本发明的发明人首先借助TCGA数据库对C12orf70和C17orf107基因与胰腺癌的相关性进行分析。
本发明的C12orf70和C17orf107基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：
Genbank登录号：C12orf70GeneID:341346C17orf107GeneID:100130311，来源于人类基因组。
C12orf70又名SMCO2，(single-pass membrane protein with coiled-coildomains 2，具有卷曲结构域2的单程膜蛋白)位于12号染色体上，是一个蛋白编码基因。C17orf107(chromosome 17 open reading frame 107)位于17号染色体上，也是一个蛋白编码基因。
本发明的发明人研究发现，C12orf70和C17orf107在胰腺癌样品中表达下调，表达水平与病人不良生存预后存在显著相关性。
本发明的技术方案具体包括：检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因C12orf70和C17orf107，现有研究中并没有C12orf70、C17orf107和胰腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了C12orf70和C17orf107在胰腺癌生物学样品中表达下调，其相关制剂产品可用于胰腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后。
本发明的C12orf70和C17orf107基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于组织、血、血清、唾液、等样品。
本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常生物样本与胰腺癌生物学样本中的同一基因相比，所述基因在从胰腺癌生物学样本中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少30％或更多的表达降低。
实施例1 基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因
1、临床信息筛选
检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息，截至2015年12月10日，TCGA数据库中总共记载了185例胰腺癌临床病例。对这些数据进行筛选，共有160例患者纳入研究。筛选时排除具有其他恶性肿瘤病史、曾接受过放疗或化疗的患者，同时纳入研究的患者需含临床信息和mRNA数据。
2、生存期研究样本统计
160例胰腺癌患者生存时间的统计结果如下表所示:
表1 160例胰腺癌患者生存时间统计
3、mRNA表达数据生存分析研究方案
(1)对胰腺癌高通量mRNA转录组数据检索、数据下载及样本挑选和归类。由下载的转录组数据通过生物信息学分析筛选得出与胰腺癌生存时间相关的mRNA。
(2)用Cytoscape软件构建由mRNAs组成的生物信息网络，通过DAVID对生物信息网络中与胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO分析和Pathway分析。
4、胰腺癌mRNA表达数据的生存分析结果
将胰腺癌组织的转录组数据下载后，去除read count＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100个mRNA。提取mRNA基因表达量和胰腺癌TCGA数据库生存时间数据，采用survival包的coxph函数完成，经单因素Cox回归分析，筛选得到单因素Cox回归中p值<0.05的mRNA有580个，包括328个风险性mRNA和252个保护性mRNA。
为了更好的研究与生存时间相关的mRNA的功能，我们通过GORILLA和GeneCodis软件对胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO功能富集合KEGG通路富集，筛选标准皆为FDR<0.05。其中基因C12orf70和C17orf107表达组病人生存率显著降低，生存率差异存在统计学意义。
实施例2 RT-PCR检测胰腺癌和癌旁组织中基因C22orf41的表达情况
1、材料
1.1组织病理标本
收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的10例胰腺癌患者组织及对应癌旁组织标本，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。取样来源于北京协和医院2014年10月到2016年12月期间确诊为胰腺癌并接受外科手术切除的病人。手术切除胰腺癌组织后在病理科医生的指导下立即取胰腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。
1.2纳入标准如下：
(1)接受外科手术切除的病例；
(2)术后病理确诊为胰腺癌并有相应的癌旁组织，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。
(3)病人均未接受过术前新辅助治疗。
2、试验方法
2.1对组织样本进行RNA提取
依据编号分别对胰腺癌组织及对应的癌旁组织进行RNA提取，每例病人的胰腺癌组织和对应癌旁组织编为一组，胰腺癌组织作为实验样本，对应的癌旁组织作为对照样本。
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)对10组样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
(1)加入1mLTrizol，室温保存5分钟；
(2)加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温放置5-10分钟；
(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
(5)弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
(6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.4Real-Time PCR
(1)引物设计用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct法进行数据相对定量分析。
采用在线引物设计软件，C12orf70基因序列参照NM_001145010.1，C17orf107基因序列参照NM_001145536.1，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表2所示：
表2引物序列
(2)反应体系：用Green PCR MasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环。
(4)样本RealTime-PCR检测
以SYBR Green作为荧光标记物，在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，采用2-△△Ct法进行数据的相对定量分析。
3、数据处理及实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较基因在胰腺癌组织和癌旁组织(control)中的表达水平。
采用统计学软件SPSS 17.0，统计学显著性差异定义为P＜0.05。应用Mann–Whitney U检验比较基因在胰腺癌组织与癌旁正常胰腺组织中表达的差异。C12orf70和C17orf107基因在胰腺癌组织中的总体表达水平均低于癌旁组织，其胰腺癌组织中的表达水平分别为癌旁组织中的46％和57％(如图1和图2所示)，p＜0.001，提示C12orf70和C17orf107可能具有很好的胰腺癌辅助诊断价值。
实施例3试剂盒的制备
基于实施例2得到的引物，组装本发明所述用于胰腺癌检测的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增C12orf70和/或C17orf107的引物对如表2所示；具体为：
1、试剂盒一包括特异性扩增C12orf70的引物对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
2、试剂盒二包括特异性扩增C17orf107的引物对：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
3、试剂盒三包括特异性扩增C12orf70和C17orf107的引物对：SEQ ID NO:1和SEQID NO:2以及SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl，2.5mM MgCl2，200mM(NH4)2SO4。通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：
表3 PCR反应体系
组分 加入量
SYBRGreen聚合酶链式反应体系 12.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板cDNA 2.0μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。
为方便使用，试剂盒还可包含对照：正常C12orf70和/或C17orf107cDNA。
取受检者生物学样本，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从生物学样本中提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常cDNA作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA，检测受试者生物学样本中C12orf70和/或C17orf107的表达量相对正常cDNA的表达量变化。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途。
<130> P18036
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 1
atggttcctc tctgcctttg g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 2
agcaaatcct gcattgcacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 3
ctggacaaga cctcacacca 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 4
gaggtgctcc agcctcttca t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 5
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence(人工序列)
<400> 6
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.C12orf70和/或C17orf107基因在胰腺癌检测产品中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述C12orf70和/或C17orf107基因或其表达产物在胰腺癌生物学样品中表达下调。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述产品包括胰腺癌辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒或生物试剂。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒或生物试剂能够通过检测生物学样品中C12orf70和/或C17orf107基因或其表达产物的表达水平来判断受试者是否患有胰腺癌、受试者胰腺癌的治疗效果或受试者预后情况。
5.一种胰腺癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测C12orf70和/或C17orf107基因表达水平的工具，以及如何使用所述试剂盒的说明。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述工具包括用于检测C12orf70和/或C17orf107基因的引物对或探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述C12orf70引物对具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述C17orf107引物对具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBR Green荧光染料。
9.一种检测胰腺癌的生物试剂，其特征在于，所述生物试剂包括一组或两组引物对，其中一组引物对为特异性扩增C12orf70基因的引物对，具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；一组引物对为特异性扩增C17orf107基因的引物对，具有SEQ IDNO:3和SEQID NO:4所示的核苷酸序列。
10.如权利要求5-9所述的试剂盒或生物试剂在胰腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后中的应用。
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