CN106434968B - Ccdc168作为标记物在检测胰腺癌试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测胰腺癌的分子标记物，所述标记物为CCDC168或其表达蛋白。本发明进一步公开了所述的分子标记物在制备检测胰腺癌试剂中的应用。本发明还公开了一种检测胰腺癌组织中CCDC168基因启动子区甲基化状态的试剂盒，所述试剂盒包括甲基化引物对和非甲基化的引物对。本发明发现了一种检测胰腺癌的分子标记物CCDC168，并进一步证实在胰腺癌组织中CCDC168基因启动子区处于甲基化状态。应用本发明试剂盒来检测CCDC168基因启动子区甲基化状态可作为胰腺癌的诊断、疗效观察、预后判断等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广价值。

Description

CCDC168作为标记物在检测胰腺癌试剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及CCDC168作为标记物在检测胰腺癌试剂中的应用。
背景技术
胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，在西方国家恶性肿瘤死亡率第四位,全球每年约250万人死于胰腺癌。我国胰腺癌发病率逐年上升，近20年增长迅速。胰腺癌的治疗主要为手术、化疗和放疗相结合的综合治疗，其五年生存率小于5％。由于胰腺的解剖学位置较深，腹部疼痛、体重减轻、黄疸等临床特异性的症状不易被发现，多数患者确诊时已发生癌症转移。胰腺癌发生肝转移较早，早期诊断、根治性手术切除是胰腺癌患者获得长期存活的唯一希望，但80％以上的患者就诊时已经失去了根治性切除的机会。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，抑制肿瘤的生长和转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键因素。
临床上常用的胰腺癌肿瘤学标志物是CA19-9。CA19-9单独作为诊断胰腺癌的指标尚不精确，敏感性较低，并且在其他消化道肿瘤及良性疾病中也有升高，因此对胰腺癌早期诊断的价值有限。另外，一些基因肿瘤标志物也用于临床胰腺癌的早期诊断，但始终未能达到诊断的目的。
目前应用于临床的胰腺癌的诊断和治疗手段，尤其是对肿瘤的早期诊断、残留病灶及复发的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。
DNA甲基化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转移酶的作用下,以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上,形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。
CCDC168又名C13orf40(Coiled-coil domain containing 168，卷曲螺旋结构域168)是蛋白编码基因，位于13号染色体上。有研究发现CCDC168蛋白在膀胱组织中的表达量高于癌旁正常组织。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的胰腺癌相关mRNA CCDC168，以及其表达蛋白。
本发明的目的之二在于提供CCDC168或其表达蛋白在制备检测胰腺癌试剂中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种用于检测胰腺癌组织中CCDC168基因启动子区甲基化状态的引物组。
本发明的目的之四在于提供一种用于检测胰腺癌组织中CCDC168基因启动子区甲基化状态的试剂盒。
为实现上述目的，本发明首先提供一种检测胰腺癌的分子标记物，所述标记物为CCDC168或其表达蛋白。
优选地，所述的mRNA CCDC168或其表达蛋白在胰腺癌组织中表达下调。
优选地，所述的CCDC168基因启动子区在胰腺癌组织中处于甲基化状态。
进一步地，本发明提供了CCDC168或其表达蛋白在制备检测胰腺癌试剂中的应用。
优选地，所述检测试剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或免疫方法检测CCDC168的表达水平；所述检测试剂还包括用MS-PCR方法检测CCDC168基因启动子区甲基化状态。
优选地，所述的荧光定量PCR方法包括特异扩增CCDC168的引物对；所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物为SEQ ID NO:2。
优选的，所述基因芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于CCDC168核苷酸的部分或全部序列。
优选的，所述免疫方法为ELISA和/或胶体金检测方法。
所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒包括：包括CCDC168克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
所述胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的CCDC168单克隆抗体，也可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的CCDC168蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对CCDC168蛋白的单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗CCDC168单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
进一步地，本发明提供了一种用于检测胰腺癌组织细胞中CCDC168基因启动子区甲基化状态的引物组，所述引物组包括甲基化引物对和非甲基化引物对；所述甲基化引物对包括上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQ ID NO:6所示；所述非甲基化引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物如SEQ ID NO:8所示。
进一步地，本发明提供了一种检测胰腺癌组织细胞中CCDC168基因启动子区甲基化状态的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物组。
优选地，所述试剂盒包含甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的CCDC168基因启动子区100％甲基化的胰腺癌细胞DNA。优选地，所述试剂盒还包含非甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的CCDC168基因启动子区100％非甲基化的正常胰腺细胞DNA。
优选地，所述试剂盒还包含10×MSP buffer缓冲液，20mMdNTP，hotstar taq酶，去离子水。
本发明还提供一种检测CCDC168基因启动子区甲基化状态的方法，以此来对胰腺癌进行早期诊断、疗效判定等，包括如下步骤：
首先，利用甲基化引物对，以硫化修饰后的DNA为模板进行MS-PCR扩增；然后，根据扩增产物判断甲基化状态。
优选地，同时利用甲基化引物对和非甲基化引物对，以硫化修饰后的DNA为模板进行MS-PCR扩增；根据甲基化引物以及非甲基化引物的扩增产物，判断甲基化状态。用甲基化引物进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物进行扩增则无扩增产物为完全甲基化；用甲基化及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物，为部分甲基化；用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物，为无甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定为甲基化。
本发明的有益效果如下：
本发明发现了一种检测胰腺癌的分子标记物CCDC168，并进一步证实在胰腺癌组织中CCDC168基因启动子区处于甲基化状态。应用本发明试剂盒来检测CCDC168基因启动子区高甲基化状态可作为胰腺癌的诊断、疗效观察、预后判断等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广价值。
附图说明
图1TCGA中数据库中胰腺癌组织及癌旁组织CCDC168cDNA表达情况；图2胰腺癌组织及癌旁组织CCDC168cDNA表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明基于TCGA数据库信息中160个胰腺癌患者的数据进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因，筛选得到与生存时间相关CCDC168，通过单因素Cox回归分析发现CCDC168为保护性因素。运用SPSS统计学分析法，分析TCGA中160例胰腺癌病人和10例癌旁组织的CCDC168表达差异，发现胰腺癌组织CCDC168表达显著低于癌旁组织。
本发明所述的基因是在本发明之前的已知基因，均来源于人类基因组。Genebank登录号：CCDC168：Gene ID:643677。
进一步本发明通过实时定量PCR验证CCDC168在胰腺癌组织中表达下调。
进一步本发明通过甲基化特异性PCR法(MS-PCR)对胰腺癌组织及癌旁正常组织进行检测，发现胰腺癌组织中CCDC168基因启动子区处于甲基化状态。
实施例1基于TCGA数据库信息进行胰腺癌的生存分析筛选相关基因
1、临床信息筛选
检索TCGA数据库中的胰腺癌患者临床信息，截至2015年12月10日，TCGA数据库中总共记载了185例胰腺癌临床病例。对这些数据进行筛选，共有160例患者纳入研究。筛选时排除具有其他恶性肿瘤病史、曾接受过放疗或化疗的患者，同时纳入研究的患者需含临床信息和mRNA数据。
2、生存期研究样本统计
160例胰腺癌患者生存时间的统计结果如下表所示:
表1 160例胰腺癌患者生存时间统计
生存期时间t(年) 期初进入研究人数 期内死亡人数 期内失访人数
t<1 160 27 74
1≤t<2 59 22 15
2≤t<3 22 10 2
3≤t<4 10 2 2
4≤t<5 6 0 1
5≤t 5 4 1
3、mRNA表达数据生存分析研究方案
(1)对胰腺癌高通量mRNA转录组数据检索、数据下载及样本挑选和归类。由下载的转录组数据通过生物信息学分析筛选得出与胰腺癌生存时间相关的mRNA。
(2)用Cytoscape软件构建由mRNAs组成的生物信息网络，通过DAVID对生物信息网络中与胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO分析和Pathway分析。
4、胰腺癌mRNA表达数据的生存分析结果
将胰腺癌组织的转录组数据下载后，去除read count＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100个mRNA。提取mRNA基因表达量和胰腺癌TCGA数据库生存时间数据，采用survival包的coxph函数完成，经单因素Cox回归分析，筛选得到单因素Cox回归中p值<0.05的mRNA有580个，包括328个风险性mRNA和252个保护性mRNA。Coef值是回归系数，HR＞1为风险性因素，HR＜1为保护性因素。
为了更好的研究与生存时间相关的mRNA的功能，我们通过GORILLA和GeneCodis软件对胰腺癌生存时间相关的mRNA进行GO功能富集和KEGG通路富集，筛选标准皆为FDR<0.05。其中CCDC168的p值为0.019414，HR<1，均为胰腺癌保护性mRNA。
运用SPSS统计学分析法，分析TCGA中160例胰腺癌病人和10例癌旁组织的CCDC168表达差异，发现胰腺癌组织CCDC168表达显著低于癌旁组织，P<0.05认为在统计学上有显著性差异，具体情况见图1。
实施例2RT-PCR验证胰腺癌组织及癌旁组织CCDC168表达情况
1、材料
收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的45例胰腺癌患者组织及20癌旁组织标本，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织。取样来源于北京协和医院2010年10月到2015年12月期间确诊为胰腺癌并接受外科术切除的病人。手术切除胰腺癌组织后在病理科医生的指导下立即取胰腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、方法
2.1对组织样本进行总RNA提取
依据编号分别对45例胰腺癌组织及20例癌旁组织进行总RNA提取，采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
2.2RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3逆转录合成cDNA
采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。
2.4Real-Time PCR
2.4.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。
2.4.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001146197.1(CCDC168)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表2引物序列
操作过程如下：
表3Real Time反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10uM) 0.5μL
下游引物(10uM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
(一)反应体系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec)×35个循环。
(二)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(三)样品Real Time-PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
3、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较CCDC168在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CCDC168在胰腺癌患组织中的表达水平为癌旁组织的54％，具体情况见图2。以上结果验证了TCGA数据统计分析CCDC168在胰腺癌患者中表达下调的结果。
实施例3检测CCDC168启动子区CpG岛的甲基化状态
为了探索CCDC168低表达的机制，采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测胰腺癌组织和癌旁组织CCDC168启动子区CpG岛的甲基化状态。
1、材料
实施例2中的45例胰腺癌组织和20例癌旁正常组织。
2、实验方法
2.1基因组DNA的提取及硫化修饰过程
应用常规酚-氯仿抽提的方法分别提取基因组DNA，紫外分光光度仪测定吸光度(A)值确定其含量及纯度。
亚硫酸盐修饰：参考《J.G.Herman，J.R.Graff，S.Myohanen，B.D.Nelkin andS.B.Baylin，Methylation-specific PCR：anovel PCR assay for methylation statusofCpG islands，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)，9821-9826.》文献的MSP方法：取上述制备的基因组DNA，经稀释后精确取2ugDNA，加去离子水至终体积50μL，加入新鲜配制的3M的NaOH 5μL，37℃孵育25min。之后加入新鲜配制的10mM的氢醌30μL及3M亚硫酸氢钠520μL混合均匀(其内已加入新鲜配制的3M的NaOH，计算方法：10mL 3M亚硫酸氢钠中加入3M的NaOH 740μL)，50℃孵育16h，此后应用DNA纯化试剂盒(Promega公司产品)纯化并回收DNA，应用50μL去离子水洗脱DNA，向其内加入5μL3M的NaOH以终止硫化修饰，用3倍体积的无水乙醇沉淀DNA，最终硫化修饰后的DNA重新溶解在20μL去离子水中，得到DNA模板，立即使用或-20℃保存备用。
2.2MS-PCR扩增
以甲基化引物进行扩增的PCR反应体系，以总体积25μL计，包括如下：
表4甲基化反应体系
上游引物SEQ ID NO:5：(5'GTGTTTTAGTTTTTTGAGTAGTCGG3')；
下游引物SEQ ID NO:6：(5'GAATCACTTAAAATTAAAAATTCGAA3')。
以非甲基化引物进行扩增的PCR反应体系，以总体积25μL计，包括：与甲基化引物进行扩增的PCR反应体系所不同的是：引物不同，在该体系中为非甲基化引物(50pmol/μL)：
上游引物SEQ ID NO:7：(5'GTGTTTTAGTTTTTTGAGTAGTTGG3')；
下游引物SEQ ID NO:8：(5'AAATCACTTAAAATTAAAAATTCAAA3')。
其余均与甲基化引物进行扩增的PCR反应体系中的相同。
应用上述MSP反应体系对已制备的DNA模板(45个胰腺癌组织样本PC1～PC45，20个正常癌旁组织样本PN1～PN20)分别进行扩增，并以ddH2O作为阴性对照，扩增程序为：95℃预变性5min，在95℃下变性30s，甲基化引物在57℃下退火30s，非甲基化引物在55℃退火30s，72℃下延伸40s，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸7min。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。
2.3结果判断
判断标准如下：
(1)应用甲基化引物进行扩增，有扩增产物，并且应用非甲基化引物进行扩增，无扩增产物的样本则判读为完全甲基化结果；
(2)应用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的样本判读为部分甲基化结果；
(3)应用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，并且用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的样本则判读为非甲基化结果。
(4)部分甲基化及完全甲基化的样本均判读为甲基化结果。
数据采用SPSS20.0软件统计与分析，计数资料采用(例，％)表示，采用卡方检验。结果以P<0.05表示具有统计学意义。
3、结果
经检测后，20例癌旁正常胰腺组织中未检测到CCDC168基因启动子甲基化；在45例胰腺癌组织中，发现CCDC168基因启动子均检测到甲基化，两组之间具有统计学意义(X2＝65.00，P<0.0001)。
实施例4检测胰腺癌组织的试剂盒组成
检测胰腺癌组织的试剂盒包括以下成分，其中，进行1次MS-PCR的用量为：
1、浓度为50pmol/μL的甲基化引物：上游引物为SEQ ID NO:5，下游引物为SEQ IDNO:6，各为0.5μL。
2、浓度为50pmol/μL的非甲基化引物：上游引物为SEQ ID NO:7，下游引物为SEQID NO:8，各为0.5μL。
3、反应液2份，分别配合甲基化引物和非甲基化引物试用，每份反应体系包括：
(1)10xMSP buffer(缓冲液):2.5μL；
(2)20mM dNTP：1.25μL；
(3)Hot start taq酶：0.15μL；
(4)ddH2O：18.1μL。
一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次MS-PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。
试剂盒还包括：
(1)阳性对照PCR模板：硫化修饰后的CCDC168基因启动子区为100％甲基化的胰腺癌组织DNA，进行1次MSP的用量为：2μL。
(2)阴性对照PCR模板：硫化修饰后的CCDC168基因启动子区为100％非甲基化的正常胰腺组织DNA，进行1次MSP的用量为：2μL。
(3)双阴性的体系对照：ddH2O，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH2O检测的结果为双阴性，则体系结果可信。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京致成生物医学科技有限公司
<120> CCDC168作为标记物在检测胰腺癌试剂中的应用
<130> p16yxa77
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgagagcaaa gccagcaact 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acacaatgtt ggtcctcacc ta 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgttttagt tttttgagta gtcgg 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaatcactta aaattaaaaa ttcgaa 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtgttttagt tttttgagta gttgg 25
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aaatcactta aaattaaaaa ttcaaa 26

Claims (7)

1.CCDC168或其表达蛋白在制备检测胰腺癌试剂中的应用，所述CCDC168或其表达蛋白在胰腺癌组织中表达下调，所述的CCDC168基因启动子区在胰腺癌组织中处于甲基化状态。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或免疫方法检测CCDC168的表达水平；所述检测试剂还包括用MS-PCR方法检测CCDC168基因启动子区甲基化状态。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量PCR方法包括特异扩增CCDC168的引物对；所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物为SEQ ID NO:2。
4.一种用于检测胰腺癌组织细胞中CCDC168基因启动子区甲基化状态的引物组，其特征在于，所述引物组包括甲基化引物对和非甲基化引物对；所述甲基化引物对包括上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQ ID NO:6所示；所述非甲基化引物对的上游引物如SEQ ID NO:7所示，下游引物如SEQ ID NO:8所示。
5.一种检测胰腺癌组织细胞中CCDC168基因启动子区甲基化状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含甲基化阳性对照PCR模板和非甲基化阳性对照PCR模板。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含10×MSP buffer缓冲液，20mMdNTP，hot star taq酶，去离子水。
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