CN108342482B - 一种胶质母细胞瘤标记物及其应用、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胶质母细胞瘤标记物METTL3及其应用。METTL3在胶质瘤细胞中显著高表达，且其表达高低与临床分级有显著相关性，在恶性程度最高的胶质母细胞瘤中表达最高；METTL3表达敲低可抑制胶质母细胞瘤细胞的生长，提示METTL3可以成为胶质母细胞瘤治疗的靶点。

Description

一种胶质母细胞瘤标记物及其应用、试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种与胶质母细胞瘤相关的组织肿瘤标记物及其应用。

背景技术

胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤。儿童青少年好发，且进展迅速，病程短，较短时间内可累及脑干，病情凶险；成人病程长、进展慢，由于发展之初没有明显症状，到患者察觉时肿瘤已增大至侵犯相应脑区。而手术切除造成脑组织损伤，加之肿瘤难以切除干净和浸润生长的特点，胶质瘤往往预后不良。目前胶质瘤治疗采取以手术为主，放疗、化疗药物为辅的治疗手段。早期发现肿瘤、找到新的可行的治疗方法迫在眉睫，既往人们对胶质瘤发病等进行了一系列探讨，但仍存在已发现的标志物灵敏度不高、特异性不强等缺点。找到新的胶质瘤标志物和防治靶标具重要意义。胶质瘤有不同的分类标准，可分别按照细胞形态、肿瘤细胞的恶性程度和所处位置分类。临床最常用的是WHO制定的分级系统，根据这一分级系统将胶质瘤分为1-4级，级别越高，恶性程度越高，预后越差。其中程度最高的4级被称为胶质母细胞瘤。

目前的治疗手段只能稍微延长患者的生存期，而且诊断也要综合病史、辅助诊断和术后病理学诊断等确认，因此发展新的治疗手段和诊断标记物成为胶质母细胞瘤防治的迫切需求。通过肿瘤标志物试剂盒，检测患者分子病理变化，做到早期筛查或辅助诊断，这就需要找到有效的肿瘤标记物。通过新的手段如基因治疗、免疫治疗进行胶质瘤特异性治疗则要求找到胶质母细胞瘤细胞的特异性标记。

METTL3(NCBI登录号NM_019852.4，GeneID:56339)是一种对RNA进行甲基化修饰的酶，在人体组织中广泛表达，但其表达水平受到严格调控。在其他物种中的研究中表明METTL3缺陷会引起减数分裂或发育异常。

发明内容

本发明筛选出一种与胶质母细胞瘤相关的肿瘤标志物，METTL3基因。研究发现胶质瘤细胞METTL3异常高表达，且随着胶质瘤级别增加表达更显著，尤其是胶质母细胞瘤中表达最高；METTL3高表达与胶质母细胞瘤患者不良预后显著相关；用shRNA敲降METTL3表达显著抑制胶质母细胞瘤生长。提示METTL3可作为胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的生物标记物和治疗靶点，并用于胶质母细胞瘤辅助诊断、疗效检测、预后判断和治疗，筛选治疗胶质母细胞瘤的药物。经检索，目前没有针对胶质母细胞瘤中METTL3的相关报道和专利申请。

本发明进行了数据库挖掘工作，通过收集TCGA(The Cancer Genome Atlas)胶质母细胞瘤数据库中完整的转录组数据和临床数据，以及利用收集到的胶质母细胞瘤临床切片样品分析基因的差异表达和部分临床病理学参数相关性。筛选数据完整的胶质母细胞瘤样本信息；分析胶质母细胞瘤METTL3基因表达差异；分析胶质母细胞瘤患者生存曲线。结果显示，胶质瘤患者中，METTL3的表达差异与肿瘤有着显著的相关性，不同级别的胶质瘤与正常组织相比METTL3均高表达，而且METTL3的表达量也随着肿瘤级别的增加而增加。

本发明采用RT-PCR、免疫组化、基因敲降的方法验证癌症标志物的表达特征及其对胶质母细胞瘤细胞生长功能的影响。实验方法主要包括以下几个部分：

1.应用RT-PCR技术在正常脑组织和胶质母细胞瘤样本中验证基因表达差异：提取胶质瘤及正常脑组织总RNA；设计引物，进行PCR反应；检测正常脑组织和胶质母细胞瘤样本中METTL3基因的表达变化。结果显示病例样本发现METTL3的高表达。

2.在细胞水平验证该基因对胶质母细胞瘤细胞生长功能的影响：shRNA敲降基因表达；验证基因对细胞生长的影响。结果显示，敲降METTL3基因的胶质母细胞瘤细胞生长能力显著下降。

3.在整体水平验证该基因对胶质瘤细胞生长功能的影响。结果显示，敲降METTL3基因的胶质瘤生长能力显著下降。

METTL3基因可以作为胶质母细胞瘤标志物，用于胶质母细胞瘤诊断和预后判断，并且在研发胶质母细胞瘤靶向药物中有很好的应用前景。

发明人发现，检测METTL3的引物具有良好的特异性，用于诊断胶质母细胞瘤具有很高的准确率。因此，本发明提供了一种胶质瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒。

所述胶质瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括METTL3基因的特异性引物，所述METTL3基因的特异性引物包含上游引物和下游引物，其中上游引物的序列如SEQID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒和免疫组化检测试剂盒两种。其中实时荧光定量PCR检测试剂盒中引物适用于SYBRGreen的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBRGreenII，Taq酶为热启动酶。免疫组化检测试剂盒包括标准品对照，METTL3抗体和免疫组化检测相关试剂。

所述试剂盒的用法包括，从组织或细胞中获得测试样品；确定所述测试样品中生物标志物的表达水平；分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的分级诊断和预后。所述的测试样品是新鲜的、冷冻的或石蜡固定包埋的组织。

所述参考值水平是METTL3基因在正常细胞即正常人脑组织细胞中的表达水平，所述正常细胞与测定细胞同一品系且无癌变，测定组织或细胞已知或被怀疑包含肿瘤细胞。

附图说明

图1为METTL3表达水平与胶质母细胞瘤患者生存曲线的关系。

图2为TCGA数据库中METTL3在胶质瘤组织表达量与正常脑组织中的表达量比较(A)，RT-qPCR检测METTL3在胶质瘤临床样品与正常脑组织临床样品的表达量比较(B)，免疫组化所示METTL3在不同级别胶质瘤和正常脑组织的表达情况(C)。

图3显示不同shRNA对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。分别表示进行METTL3敲降后对两种肿瘤细胞系的细胞生长数量改变(A)及shRNA干扰对裸鼠胶质瘤移植物生长的影响(B)及体积大小的差异(C)。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1:通过TCGA数据库的数据分析，挖掘METTL3基因表达与胶质母细胞瘤患者生存率的关系。

采用TCGA标准方法下载两组胶质母细胞瘤组织样本的表达谱芯片数据和临床随访患者生存状态，利用统计软件做出METTL3表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存率的关系图。

结果：见图1，METTL3的表达与胶质母细胞瘤病人的存活率存在显著相关性，METTL3表达高的患者总生存率显著低于METTL3低表达的患者，提示METTL3很有可能具有促进癌症发展的作用。

实施例2：通过数据库，挖掘METTL3表达与胶质瘤患者总生存率的关系。

采用TCGA数据库下载胶质瘤患者的转录组RNA-seq测序数据，分析METTL3在不同样品中表达水平。

结果：见图2A，分析发现与正常脑组织比较，METTL3在胶质瘤的表达水平显著增高，考虑可作为胶质瘤的早期诊断指标。

实施例3：RT-qPCR验证METTL3基因在胶质瘤样品和正常脑组织中的表达差异。

通过测定在正常脑组织细胞和胶质瘤患者肿瘤组织中的METTL3基因表达状态，对照组10例组织样品来自脑组织外伤患者，胶质瘤组织通过神经外科术切除获得并已得病理诊断证实。

首先，进行细胞总RNA提取。将所有操作及相关试剂置于冰上操作。使用Trizol试剂进行细胞总RNA的提取，具体步骤如下：准备提取总RNA。对细胞直接使用Trizol进行消化、裂解，加入Trizol。细胞加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。使用高速冷冻离心机4℃12000rpm离心5min，弃沉淀。按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀15min，室温放置15min。再次使用高速冷冻离心机4℃12000g离心15min。然后吸取上层水相，至另一离心管中。按0.5ml异丙醇Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。再次使用高速冷冻离心机4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。使用高速冷冻离心机4℃8000g离心5min，尽量弃上清，将残留的RNA在超净工作台下晾干3min，并加入30ulH2O溶解RNA样品。通过测O.D值测定RNA的质量和浓度，A260/A280值在1.6-1.8之能够确保RNA的纯度。

第二步，使用

III反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA，具体操作步骤如下：将所有操作及相关试剂至于冰上操作。按照说明书将试剂按浓度加入PCR反应管中最后加入RNA样品。在PCR仪中设置反应条件为：42℃45min(反转录)，75℃10min(热激终止反应)得到cDNA样品。

第三步，定量PCR鉴定METTL3基因的表达量，具体操作步骤如下：将所有操作及相关试剂至于冰上操作。按照表1所示试剂及浓度加入PCR反应管中最后加入cDNA样品。在PCR仪中设置反应条件为：预变性94℃10s，变性94℃5s，退火/延伸60℃34s，共40个循环，以β-Actin作为相对定量内参。

表1RT-PCR鉴定METTL3基因的表达量的方法

反应物	反应量
		SYBR Greenq PCR Master mix(2X)	10μl
Forward Primer(10μM)	1μl
		Reverse Primer(10μM)	1μl
H2O	7.5μl
		cDNA	0.5μl
总量	20μl

表2RT-PCR鉴定METTL3基因的引物序列

编号	引物名称	序列
			SEQ ID NO：1	METTL3ForwardPrimer	CTGCTTGGTTGGTGTCAAAGG
SEQ ID NO：2	METTL3ReversePrimer	GCGAGTGCCAGGAGATAGTC

数据处理与分析：用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

结果：见图2B，我们检测了METTL3在胶质瘤组织和正常脑组织中的mRNA表达量，发现METTL3mRNA在肿瘤组织中表达增高，验证了数据库的结论。

实施例4：利用免疫组化染色比较在不同级别胶质瘤组织和正常组织中METTL3基因的表达量差异(图2C)。

分别随机选取胶质瘤I级、II级、III级、Ⅳ级病人，取其肿瘤组织和另一人的配对正常组织进行石蜡包埋切片，用METTL3抗体(购自Abcam公司，货号ab195352)分别对METTL3进行免疫组化染色，观察表达情况，并进行阳性表达细胞计数。

结果：统计分析得胶质瘤病人肿瘤细胞中METTL3表达比例明显高于正常组织，且随着级别增高其表达比例增高，IV级胶质瘤(胶质母细胞瘤)METTL3表达量最高。

实施例5：利用基因敲降比较下调METTL3表达水平对胶质母细胞细胞增殖的影响。(图3A)

应用两种不同shRNA对METTL3基因进行敲降(shRNA序列见表3)，比较两种情况下METTL3表达下调的程度。分别将胶质瘤U87MG(ATCC编号：HTB-14TM，人源，上皮样贴壁生长)、U251(Sigma公司，编号：09063001，人源，上皮样贴壁生长)细胞各分为三组，I组为无基因敲降及表达抑制剂的对照组；II组为METTL3shRNA1敲降组；III组为METTL3shRNA2敲降组。在相同培养条件下培养，分别观察培养后24h、48h、72h和96h肿瘤细胞增殖情况。

表3敲降METTL3基因的shRNA序列

结果：与对照组相比较，在shRNA1和shRNA2组中，两种细胞系数目都明显低于对照组(图3A)。这些结果证明敲降METTL3能够抑制胶质母细胞瘤细胞系U87MG、U251细胞生长。

实施例6：METTL3抑制胶质瘤体内肿瘤的生长

将实施例5三个组得到的5×10⁶U87MG细胞分别接种到6周龄雌性裸鼠的皮下，第32天开始进行第一次测量，以后每隔5天测量肿瘤的直径，计算肿瘤组织的体积，第57天结束实验取出肿瘤组织拍照。

结果：裸鼠移植瘤体积大小见图3B和3C，敲降METTL3的U87MG细胞均比对照细胞的肿瘤生长速度更慢，且肿瘤体积明显缩小。

结合上述结果，METTL3在胶质瘤中显著高表达，且随着胶质瘤等级的增加表达水平也增加，在胶质母细胞瘤中最高。并在功能学层面上对以上结论进行了验证。这反映了METTL3的高表达具有标记胶质母细胞瘤进程的能力，可作为胶质母细胞瘤标志物，应用于胶质母细胞瘤的辅助诊断、疗效预测及预后判断。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种胶质母细胞瘤标记物及其应用、试剂盒

<130> 201810080

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 1

ctgcttggtt ggtgtcaaag g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 2

gcgagtgcca ggagatagtc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 3

gctgcacttc agacgaatta t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 4

gccaaggaac aatccattgt t 21

<210> 5

<211> 1743

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

atgtcggaca cgtggagctc tatccaggcc cacaagaagc agctggactc tctgcgggag 60

aggctgcagc ggaggcggaa gcaggactcg gggcacttgg atctacggaa tccagaggca 120

gcattgtctc caaccttccg tagtgacagc ccagtgccta ctgcacccac ctctggtggc 180

cctaagccca gcacagcttc agcagttcct gaattagcta cagatcctga gttagagaag 240

aagttgctac accacctctc tgatctggcc ttaacattgc ccactgatgc tgtgtccatc 300

tgtcttgcca tctccacgcc agatgctcct gccactcaag atggggtaga aagcctcctg 360

cagaagtttg cagctcagga gttgattgag gtaaagcgag gtctcctaca agatgatgca 420

catcctactc ttgtaaccta tgctgaccat tccaagctct ctgccatgat gggtgctgtg 480

gcagaaaaga agggccctgg ggaggtagca gggactgtca cagggcagaa gcggcgtgca 540

gaacaggact cgactacagt agctgccttt gccagttcgt tagtctctgg tctgaactct 600

tcagcatcgg aaccagcaaa ggagccagcc aagaaatcaa ggaaacatgc tgcctcagat 660

gttgatctgg agatagagag ccttctgaac caacagtcca ctaaggaaca acagagcaag 720

aaggtcagtc aggagatcct agagctatta aatactacaa cagccaagga acaatccatt 780

gttgaaaaat ttcgctctcg aggtcgggcc caagtgcaag aattctgtga ctatggaacc 840

aaggaggagt gcatgaaagc cagtgatgct gatcgaccct gtcgcaagct gcacttcaga 900

cgaattatca ataaacacac tgatgagtct ttaggtgact gctctttcct taatacatgt 960

ttccacatgg atacctgcaa gtatgttcac tatgaaattg atgcttgcat ggattctgag 1020

gcccctggca gcaaagacca cacgccaagc caggagcttg ctcttacaca gagtgtcgga 1080

ggtgattcca gtgcagaccg actcttccca cctcagtgga tctgttgtga tatccgctac 1140

ctggacgtca gtatcttggg caagtttgca gttgtgatgg ctgacccacc ctgggatatt 1200

cacatggaac tgccctatgg gaccctgaca gatgatgaga tgcgcaggct caacataccc 1260

gtactacagg atgatggctt tctcttcctc tgggtcacag gcagggccat ggagttgggg 1320

agagaatgtc taaacctctg ggggtatgaa cgggtagatg aaattatttg ggtgaagaca 1380

aatcaactgc aacgcatcat tcggacaggc cgtacaggtc actggttgaa ccatgggaag 1440

gaacactgct tggttggtgt caaaggaaat ccccaaggct tcaaccaggg tctggattgt 1500

gatgtgatcg tagctgaggt tcgttccacc agtcataaac cagatgaaat ctatggcatg 1560

attgaaagac tatctcctgg cactcgcaag attgagttat ttggacgacc acacaatgtg 1620

caacccaact ggatcaccct tggaaaccaa ctggatggga tccacctact agacccagat 1680

gtggttgcac ggttcaagca aaggtaccca gatggtatca tctctaaacc taagaattta 1740

tag 1743

Claims (2)

1.一种胶质瘤细胞U87MG抑制剂，其是序列如SEQ ID NO:4所示的shRNA。

2.如权利要求1所述的抑制剂在体外抑制U87MG细胞增殖中的用途。

Images