CN111808946B - 一种骨髓增生异常综合征标记物及其试剂盒 - Google Patents

一种骨髓增生异常综合征标记物及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组骨髓增生异常综合征相关的标志物SNORD113‑6、SNORD113‑9、SNORD114‑1以及一种用于检测其表达水平的试剂盒。SNORD113‑6，SNORD113‑9，SNORD114‑1在骨髓增生异常综合征患者骨髓单核细胞中显著高表达，敲低其表达可抑制MDS细胞的生长，促进凋亡，诱导分化，提示可作为骨髓增生异常综合征诊断及治疗的靶点，具有重要的临床价值。

Description

一种骨髓增生异常综合征标记物及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种与骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)相关的标记物及其应用。
背景技术
骨髓增生异常综合征(myelodysplasia syndromes，MDS)多发于老年人中，是一类骨髓增生性疾病，其表现特征为骨髓细胞异常增生、血细胞减少，并且具有较高风险转化为继发性急性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，sAML)。其发病机制目前并不清楚。MDS异质性较强，且与多种疾病血液疾病临床表现极为相似，为临床诊断带来一定困难。例如：再生障碍性贫血(aplastic anemia)患者与低增生MDS(hypoplastic MDS)患者都表现出泛血细胞减少(pancytopenia)以及骨髓细胞异常减少等临床症状，sAML与MDS之间亦较难区分，除此之外CMML、非典型性慢性髓系白血病(atypical chronic myeloidleukemia，aCML)等都与MDS具有相似症状。
虽然MDS与类似疾病在部分临床表现方面类似，但其各自之间在病理学、治疗方法以及预后等方面具有显著差异。例如，与MDS患者相比，CMML患者具有更高比例的CD14+以及CD16-单核细胞，这些单核细胞对于部分生长因子刺激更加敏感，因此治疗过程中通常不推荐采用G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)或GM-CSF(granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)类细胞因子，以免加剧单核细胞增多症状。因此，精确诊断以及个性化治疗对于改善MDS患者预后至关重要。早期诊断、寻找新的可行的治疗方法迫在眉睫。
既往人们对MDS发病等进行了一系列探究，但仍存在已发现的标志物灵敏度不高、特异性不强等缺点。找到新的MDS标志物和防治靶标具重要意义。近些年来随着高分辨率、高通量测序技术的迅速发展，研究人员揭示了一系列与疾病发生发展关系密切的基因型突变，绘制了多种疾病特征性遗传学图谱，为解决该问题提供了有力的工具。表观遗传学修饰对于维持造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)以及血液系统正常功能至关重要，但目前关于表观遗传学因子，尤其是长度在60-300nt之间的snoRNA分子MDS疾病进程中的调控作用仍缺乏深入研究。
发明内容
本发明筛选出一组与MDS相关的标志物，SNORD113-6，SNORD113-9和/或SNORD114-1。研究发现MDS患者骨髓单核细胞中SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1异常高表达；用siRNA敲降各snoRNA表达显著抑制MDS细胞系生长。提示其可作为MDS生物标记物和治疗靶点，用于MDS辅助诊断、疗效检测、预后判断和治疗，筛选治疗MDS的药物。经检索，目前没有针对MDS中此三种snoRNA的相关报道和专利申请。
本发明进行了高通量测序(SnoRNA-Seq)工作，通过收集MDS患者骨髓样本，分离纯化单核细胞，并提取RNA针对50～300nt非编码RNA进行测序。测序结果分析显示，MDS患者中SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1表达差异显著升高。
本发明采用基因敲降、RT-qPCR、CCK8、流式细胞术等方法验证标志物的表达特征及其对MDS细胞生长功能的影响。实验方法主要包括以下几个部分：
1.应用RT-qPCR技术在健康供者外周血单核细胞和MDS样本中验证基因表达差异：提取MDS及正常外周血总RNA；设计引物，进行qPCR反应；检测正常样本和MDS样本中SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1的表达变化。结果显示病例样本中三种snoRNA高表达。
2.在细胞水平验证三种snoRNA对MDS细胞生长功能的影响：siRNA敲降snoRNA表达；验证snoRNA对细胞生长的影响。结果显示，敲降snoRNA的MDS细胞生长速率显著下降。
3.利用流式细胞术验证snoRNA对MDS细胞凋亡、分化水平的影响。结果显示，敲降snoRNA的MDS细胞凋亡水平增强，分化水平显著下降。
SNORD113-6，SNORD113-9和/或SNORD114-1可以作为MDS标志物，用于MDS诊断和预后判断，并且在研发MDS靶向药物中有很好的应用前景。
发明人发现，SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1的引物具有良好的特异性，用于诊断MDS具有很高的准确率。因此，本发明提供了一种MDS辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒。
所述MDS辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1的特异性引物，所述特异性引物包含上游引物和下游引物，序列如SEQ IDNO:1-6所示。
所述试剂盒为荧光实时定量PCR检测试剂盒。荧光实时定量PCR检测试剂盒中引物适用于SYBRGreen的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为荧光实时定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液中包含dNTP、Mg2+、DNA聚合酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBRGreen。
所述试剂盒的用法包括，从组织或细胞中获得测试样品；确定所述测试样品中生物标志物的表达水平；分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的分级诊断和预后。所述的测试样品是新鲜的或冷冻的骨髓单核细胞。
所述参考值水平是SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1在正常细胞即正常外周血单核细胞中的表达水平，所述正常细胞与测定细胞同一品系且无癌变，测定组织或细胞已知或被怀疑包含MDS细胞。
附图说明
图1为健康供者以及MDS患者样本中snoRNA差异表达水平热图。
图2为RT-qPCR方法检健康供者以及MDS患者中SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1表达水平。
图3显示不同siRNA对MDS细胞中SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1表达水平的影响。
图4显示敲降snoRNA对MDS细胞增殖水平的影响。
图5显示敲降snoRNA对MDS细胞凋亡水平的影响。
图6显示敲降snoRNA对MDS细胞分化水平的影响。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1:利用高通量测序方法检测健康供者以及MDS患者骨髓单核细胞中snoRNA表达水平差异。
首先分离所收集骨髓样本中的单核细胞。取2mL人骨髓样本，加入等体积PBS+2％FBS进行稀释。取3.5mL人淋巴细胞分离液至15mL离心管中，将稀释后的血液样本小心加至淋巴细胞分离液上层，注意不要扰动界面，使其形成清晰分界面。于常温1500rpm离心30min，注意应取消离心程序中的加速及刹车环节。离心后小心吸取中间白色单核细胞层，加入10mL PBS+2％FBS清洗，于1500rpm离心10min，弃上清。
接下来对样本进行高通量测序。将细胞计数后重悬于1mL Trizol中，提取总RNA，利用TruSeq Small RNA sample preparation kit(Illumina)反转录建立cDNA文库。利用琼脂糖凝胶电泳分离纯化50-300bp部分条带，用HiSeq2000测序仪(Illumina)进行单端50bp(single-end 50bp)高通量测序。最后对测序结果进行生物信息学分析。
结果：见图1，MDS患者中一系列snoRNA表达水平异常，其中SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1显著升高，提示这三种snoRNA很有可能具有促进MDS发展的作用。
实施例2：RT-qPCR验证SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1在MDS样品和正常样本中的表达差异。
首先，进行细胞总RNA提取。将所有操作及相关试剂置于冰上操作。使用Trizol试剂进行细胞总RNA的提取，具体步骤如下：准备提取总RNA。对细胞直接使用Trizol进行消化、裂解，加入Trizol。细胞加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。使用高速冷冻离心机4℃12000rpm离心15min，弃沉淀。按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀15min，室温放置15min。再次使用高速冷冻离心机4℃12000g离心15min。然后吸取上层水相，至另一离心管中。按0.5ml异丙醇Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。再次使用高速冷冻离心机4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1ml75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。使用高速冷冻离心机4℃10000g离心5min，尽量弃上清，将残留的RNA在超净工作台下晾干3min，并加入30uLH2O溶解RNA样品。
第二步，使用
Figure BDA0002572093830000061
III反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA，具体操作步骤如下：将所有操作及相关试剂至于冰上操作。按照说明书将试剂按浓度加入PCR反应管中最后加入RNA样品。在PCR仪中设置反应条件为：42℃45min(反转录)，75℃10min(热激终止反应)得到cDNA样品。
第三步，实时定量PCR鉴定SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1基因的表达量，具体操作步骤如下：将所有操作及相关试剂至于冰上操作。按照表1所示试剂及浓度加入PCR反应管中最后加入cDNA样品。在PCR仪中设置反应条件为：预变性94℃10s，变性94℃5s，退火/延伸60℃34s，共40个循环，以U6作为相对定量内参。
表1 RT-PCR鉴定SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1的表达量的方法
Figure BDA0002572093830000071
表2 RT-PCR鉴定METTL3基因的引物序列
Figure BDA0002572093830000072
Figure BDA0002572093830000081
数据处理与分析：用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
结果：见图2，我们检测了SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1在MDS和正常样本中的表达量，发现SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1在MDS样本中表达增高，验证了高通量测序结果。
实施例3：利用siRNA敲降SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1表达，并检测MDS细胞增殖的变化。(图3，图4)
针对三种snoRNA应用不同siRNA进行敲降(siRNA序列见表3)，比较snoRNA表达下调的程度。将MDS细胞系SKM-1细胞各分为二组，I组为无基因敲降及表达抑制剂的对照组；II组为siRNA敲降组。在相同培养条件下培养，分别观察培养后24h、48h、72h细胞增殖情况。
表3敲降snoRNA的siRNA序列
Figure BDA0002572093830000082
Figure BDA0002572093830000091
结果：与对照组相比较，在siRNA组中，snoRNA表达水平明显低于对照组(图3)，同时细胞增殖速率显著降低(图4)。这些结果证明敲降SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1能够抑制MDS细胞生长。
实施例4：敲降SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1后检测MDS细胞凋亡。
针对上述对照组以及snoRNA敲降的实验组，利用流式细胞术检测细胞凋亡水平，所用分子标记未AnnexinV以及PI。
结果：敲降SNORD113-6后，AnnexinV和PI双阳性细胞比例显著增高，表明细胞晚期凋亡水平升高。敲降SNORD113-9，SNORD114-1未见显著变化。
实施例5敲降SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1后，检测MDS细胞分化水平。
针对上述对照组以及snoRNA敲降的实验组，利用流式细胞术检测细胞分化水平，所用分子标记为CD11b以及CD14。
结果：敲降SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1后，CD1b以及CD14阳性细胞比例未见显著变化，表明该三种snoRNA并不影响细胞分化水平。
结合上述结果，高通量测序结果显示SNORD113-6，SNORD113-9，SNORD114-1在MDS患者中显著高表达，并且RT-qPCR实验结果也验证了以上结论。同时，敲降snoRNA后MDS细胞增殖水平降低，凋亡水平升高，分化水平未见显著变化。这反映了该三种snoRNA的高表达具有标记MDS疾病发生和发展的能力，可作为MDS标志物，应用于MDS的辅助诊断、疗效预测及预后判断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种骨髓增生异常综合征标记物及其试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
tggaccagtg atgaatatca t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
tggacctcag agttgcagat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
tggatcaatg atgagtaccc t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<400> 4
tggacctcag agttataggg t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> 5
tggacctatg atgatgactg 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<400> 6
tggacctcag acttccaga 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> artificial
<400> 7
ccuuccctga aggttccucc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> artificial
<400> 8
cagaaacccc atgatauuca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> artificial
<400> 9
cagacacccc agggtacuca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> artificial
<400> 10
ucauacgcca ccagtcauca 20

Claims (5)

1.SNORD113-6，SNORD113-9和SNORD114-1作为骨髓增生异常综合征(MDS)标志物在制备检测MDS的试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒中包含特异性检测SNORD113-6，SNORD113-9和SNORD114-1的探针或引物。
2.一种MDS检测试剂盒，其由检测SNORD113-6，SNORD113-9和SNORD114-1表达的试剂组成，所述的检测SNORD113-6，SNORD113-9和SNORD114-1表达的试剂是特异性检测snoRNA成熟体的探针或引物。
3.如权利要求2所述的MDS检测试剂盒，所述引物选自以下各种中的一种或几种：(1)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；(2)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；和(3)SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的引物。
4.SNORD113-6，SNORD113-9和SNORD114-1的表达抑制剂在制备治疗MDS的药物中的用途；所述的表达抑制剂是抑制SNORD113-6，SNORD113-9和SNORD114-1表达的siRNA，dsRNA或shRNA，或者是包含所述的siRNA，dsRNA或shRNA的过表达质粒载体或慢病毒。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的表达抑制剂包含如
5‘-CmAmGmAmAmACCCCATGATAmUmUmCmAm-3’(SEQ ID NO:8)，5’-CmAmGmAmCmACCCCAGGGTAmCmUmCmAm-3’(SEQ ID NO:9)和/或 5’-UmCmAmUmAmCmGCCACCAGTCmAmUmCmAm-3’(SEQ ID NO:10)所示的序列。
CN202010642943.XA 2020-07-06 2020-07-06 一种骨髓增生异常综合征标记物及其试剂盒 Active CN111808946B (zh)

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