CN106591428B - 一种胃癌新型分子标记物hsa_circ_0001017的检测及应用 - Google Patents

一种胃癌新型分子标记物hsa_circ_0001017的检测及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于胃癌诊断的环状RNA分子标记物，其特征在于：该环状RNA为hsa_circ_0001017，本发明还提供一种检测血浆中状RNA分子标记物的方法，包括如下步骤：(1)采集血液，提取血浆中的总RNA；(2)将总RNA逆转录成cDNA；(3)利用特异性扩增背对背引物和看家基因GAPDH的扩增上下游引物对步骤(2)的cDNA溶液进行数字微滴PCR检测，反应结束后检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据阈值确定微滴是否包含环状RNA或看家基因GAPDH，高于阈值的微滴为阳性微滴，低于阈值的微滴为阴性微滴；(4)统计阳性微滴数，计算得到血浆中hsa_circ_0001017和看家基因GAPDH的拷贝数，以对血浆中的hsa_circ_0001017进行定量检测，与现有技术相比，本发明的优点在于在胃癌患者血浆中的特异性表达上调hsa_circ_0001017可作为胃癌诊断的新型分子标记物。

Description

一种胃癌新型分子标记物hsa_circ_0001017的检测及应用
技术领域
本发明涉及一种血浆中环状RNA的检测方法，尤其涉及一种微滴式数字PCR检测血浆中环状RNA的方法及其应用。
背景技术
全球癌症统计中，胃癌发病率列居前位，中国又是胃癌高发大国。尽管诊断技术在不断提高，以手术治疗为主的综合治疗手段越来越丰富，但胃癌依旧是全球主要癌症致死性疾病之一。而且，现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌诊断中的敏感度与特异性并不高，虽然CA72-4对胃癌具有较高特异性，但通常也只有在胃癌的III-IV期才出现增高。因此，寻找可靠的生物标志物作为早期诊断依据和可靠的治疗靶点成为当务之急，如lncRNAs。但随着基因工程研究的深入，科学家逐渐将目光转向环状RNA(circular RNA，circRNA)，因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点，circRNA是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明，circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在疾病诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种hsa_circ_0001017以作为胃癌检测中的分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种在血浆中检测hsa_circ_0001017的方法。
本发明所要解决的又一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种hsa_circ_0001017在胃癌诊断中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该用于胃癌检测的环状RNA分子标记物，其特征在于：该环状RNA为hsa_circ_0001017，其在基因组上的定位为：chr2:61749745-61761038，相应的线性基因为XPO1(NM_003400)，该环状RNA的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
进一步地，所述hsa_circ_0001017在胃癌患者血浆中的特异性表达水平上调。
本发明还提供一种检测血浆中环状RNA分子标记物的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：
(1)采集血液，提取血浆中的总RNA；
(2)将总RNA逆转录成cDNA；
(3)利用hsa_circ_0001017的特异性扩增背对背引物和看家基因GAPDH的扩增上下游引物对步骤(2)的cDNA溶液进行数字微滴PCR检测，反应结束后检测所有微滴的荧光信号值并设定阈值，根据阈值确定微滴是否包含环状RNA hsa_circ_0001017或看家基因GAPDH，高于阈值的微滴为阳性微滴，低于阈值的微滴为阴性微滴；
(4)统计阳性微滴数，计算得到血浆中hsa_circ_0001017和看家基因GAPDH的拷贝数，以对血浆中的hsa_circ_0001017进行定量检测。
进一步地，所述步骤(3)中的hsa_circ_0001017的特异性背对背引物为：
P1：5’-AACCAGTGCGAAGTAATCTATGC-3’；
P2：5’-TCTTTGCTGGGCTCCTTCT-3’。
进一步地，所述步骤(3)中的看家基因GAPDH的特异性扩增上下游引物为：
P3：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’；
P4：5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’。
进一步地，所述步骤(1)中提取血浆中总RNA的过程如下：
步骤a，收集血浆：血液收集在EDTA抗凝管中，3000rpm离心10分钟，离心后吸取300μL血浆；
步骤b，释放RNA：在200～250μl血浆中加入TRIzol LS 800μL，旋涡震荡混匀后，室温静置15分钟，使血浆中的RNA充分释放至溶液中；
步骤c，氯仿提取：在步骤b中加入40～50μl的三氯甲烷/异戊醇溶液，三氯甲烷和异戊醇的体积比为：24：(2～3)，采用徒手上下振摇至乳状，室温静置5分钟；4℃下，12000rpm离心15分钟，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA，吸取上层水相至无RNase离心管中；
步骤d，异丙醇沉淀：加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟后12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；
步骤e，乙醇洗涤：倾倒上清并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心5分钟，小心吸取上清，室温干燥至沉淀呈半透明，用适量无RNase的水溶解沉淀，得到血浆中总RNA提取液，-80℃保存备用。
在提取血浆中总RNA中使用TRIzol-LS试剂提取血浆RNA的过程中，由于试剂呈酸性，加入氯仿后若涡旋剧烈震荡极易引起水相的乳化，严重地降低了RNA的得率，本发明采用徒手振摇的方法，减轻了震荡的剧烈程度，消除了乳化现象，同时又能很好地混匀液体，从而提高RNA的得率。
优选地，所述步骤c中三氯甲烷和异戊醇的体积比为24：2。三氯甲烷和异戊醇溶液的体积比为24：2，三氯甲烷可以促使有机相和水相分层，提高异戊醇的比例至2可以更有效地消除气泡，减轻血浆中脂质的干扰。
进一步地，所述步骤(3)中数字微滴PCR反应条件如下：先95℃激活酶5分钟；然后95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，40个循环；最后4℃保温5分钟、90℃酶变性5分钟和4℃保温。
与现有技术相比，本发明的优点在于在胃癌患者血浆中的特异性表达上调的hsa_circ_0001017可作为胃癌诊断的新型分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行胃癌诊断，而检测血浆中该分子标记物的方法是基于荧光染料法数字微滴PCR来检测，相对于以往的荧光定量PCR，微滴式数字PCR在检测低拷贝基因时更加灵敏和准确，并且不需要使用探针进行定量检测，费用成本大大降低，本发明提供的方法取样方便快捷，仅需采集微量1ml血液即可检测出hsa_circ_0001017的存在，灵敏度高，可检测出每微升血液中所含hsa_circ_0001017的确切拷贝数；本发明提供的方法准确率高，检测快速，仅需2小时就可完成检测过程。
附图说明
图1为circRNA芯片检测结果图；
图2为正常人血浆标本hsa_circ_0001017检测结果图；
图3为胃癌患者血浆标本hsa_circ_0001017检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一：检测hsa_circ_0001017在胃癌患者和健康人血浆中的表达情况：
1、芯片分析：采用美国Arraystar公司的Human circRNAArray(6×7K)芯片检测胃癌患者和健康人血浆中circRNA的水平。
2、芯片结果：结果如图1及表格1所示。
表1显著性差异列表
表1胃癌患者血液中差异表达的典型circRNA(P<0.05)
Figure GDA0001218042040000041
3、结果分析：hsa_circ_0001017在胃癌患者和健康人血浆中二者差异达6.85倍，提示hsa_circ_0001017在胃癌中可能作为一个癌基因发挥作用。
实施例二：采集健康人血浆作为正常对照组，每份血液按照如下步骤进行环状RNA的检测，包括以下步骤：
a.血浆收集：全血EDTA抗凝，室温下3000rpm离心10分钟，取上层淡黄色血浆约300μL转移到无RNase离心管中，置于冰上保存；
b.释放RNA:在血浆中加入TRIzol-LS(市售)800μL补足至总体积为1mL，旋涡震荡混匀后，室温静置15分钟，使血浆中的RNA充分释放；
c.氯仿提取：加入40μl体积的三氯甲烷/异戊醇溶液(配比为24：2)，用手上下振摇至乳状，室温静置5分钟，此时可看到溶液初步分层，上层为较为清澈的水相；4℃下，12000rpm离心15分钟，此时液体彻底分层，其中上层水相中富集了RNA，中间层为白色，含有DNA和蛋白质。小心吸取上层水相400μL左右至无RNase的离心管中，注意不要吸到中间层；
d.异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清得白色沉淀于管底；
e.乙醇洗涤：加入1mL75％的乙醇清洗沉淀，4℃下，12000rpm离心5分钟，小心吸取上清，室温干燥至沉淀呈半透明，用适量无RNase的水溶解沉淀，得到血浆中总RNA提取液，保存于-80℃备用；
f.RNA逆转录：使用逆转录试剂盒对上述步骤e提取出的RNA进行逆转录，得到cDNA，保存于-20℃备用；
g.荧光染料法微滴式数字PCR检测：将上述步骤f获得的cDNA按照表2的配比加入反应体系中，并按照表3的程序设定进行PCR参数。
表2.PCR体系
Figure GDA0001218042040000051
表3.PCR参数
Figure GDA0001218042040000052
Figure GDA0001218042040000061
最后得到如图2所示的荧光信号值。图中编号1至4分别代表4例正常人血浆标本；阴性条带位于荧光信号值10000的位置，GAPDH的条带集中在荧光信号值17000～18000，hsa_circ_0001017条带集中在荧光信号值24000～25000，三条条带能明显区分，说明环状RNA hsa_circ_0001017或看家基因的微滴在反应中得到了有效的区分。两种微滴以信号值15000为界，在界限上下集中分布，系统设定阈值为15000。高于该值为阳性微滴，低于该值为阴性微滴，最后经设备分析计算阴阳性微滴数，得出结果，每mL阳性对照组正常人血浆标本拷贝数均值为1070copies/mL，GAPDH的拷贝数均值为10070copies/mL。
实施例三
采集胃癌患者术前血浆和术后第10天血浆进行检测，方法与实施例1方法基本相同。由图3可以看出存在大量“.”点阳性微滴和阴性微滴且分布区分度极明显，在阈值上下集中分布，术后阳性微滴的荧光信号值下降，又经设备分析计算胃癌患者术前血浆环状RNAhsa_circ_0001017的拷贝数为4100copies/mL高于正常人血浆标本拷贝数均值的1070copies/mL，而术后的血浆环状RNA hsa_circ_0001017的拷贝数为600copies/mL，说明术前术后胃癌患者的环状RNA hsa_circ_0001017的拷贝数明显下降，以证明hsa_circ_0001017能灵敏地作为胃癌患者诊断胃癌的分子标记物。
Figure IDA0001120008060000011

Claims (2)

1.一种检测血浆中环状RNA表达水平的引物在制备胃癌诊断标记物试剂中的应用，其特征在于：该环状RNA为hsa_circ_0001017，该环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述hsa_circ_0001017在胃癌患者血浆中的特异性表达水平上调；
所述引物为：
P1：5’-AACCAGTGCGAAGTAATCTATGC-3’；
P2：5’- TCTTTGCTGGGCTCCTTCT-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胃癌诊断标记物试剂还包括有看家基因GAPDH的特异性扩增上下游引物：
P3：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’；
P4：5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’。
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