CN105219841B - 一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用。检测试剂盒包括引物、内参基因和阴性对照；所述引物的正向引物的碱基序列如SEQ ID No.42～82所示中的至少一种，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.83所示。本发明发现SEQ ID No.1～41所示的miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺癌诊断标记物，并针对miRNA分子设计了相应的引物以及含有该引物的试剂盒，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在差异性表达miRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。

Description

一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌已成为世界范围内最主要的肿瘤死亡原因，大约31％与癌症相关的死亡是由肺癌造成的。早期诊断是降低癌症患者死亡率的关键因素。目前的临床诊断手段对发现早期肺癌并不十分有效，3/4的病人在确诊时肺癌已发生转移。另外，由于肺癌的多样性和复杂性，许多肺癌患者的发展和治疗结果与临床分期极不相符，导致同期的癌症患者在接受相同的治疗措施后，预后效果却差异很大。因此寻找早期肺癌诊断以及分子分型的临床分子标记物成为当务之急，是急需解决的重大科学问题。

现有的临床诊断技术远不能满足早期诊断的需要。早期的X光仅能发现直径在1cm以上的瘤块，CT扫描及B超检查，可检出直径在0.5cm左右的肿瘤，MRI和PET检查，可以发现更小的肿瘤组织，但其特异性低，仍需要病理活检的辅助才能明确诊断。支气管镜、胃镜、膀胱镜等内窥镜的使用，极大地提高了肺癌、消化系统肿瘤及膀胱癌等的诊断率，但均为介入性检查，对患者的损伤和痛苦大，且对操作者技术要求高，价格昂贵，不适用于大规模的人群筛选普查。因此，寻找正确、可靠的、无创伤的肿瘤早期诊断方法成为当务之急。早期诊断肿瘤最快速的方法是通过检测和分析血液中的肿瘤标记物。这些分子标记物并不局限于原发肿瘤所处的位置，而且较易采集，在肿瘤的早期诊断和预后等方面发挥着重要作用。

目前，人类发现的血清标记物已有百余种，但由于肿瘤的多样性和复杂性，特异性强、具有明确诊断作用的标记物并不多。临床常用的仅20多种，能用于大规模人群普查的肿瘤标记物更少。美国食品医药管理局(FDA)批准的生物指标如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异抗原(PSA)等，对肝癌、结肠癌及前列腺癌诊断的特异性和敏感性都较低，无法达到诊断肿瘤的指标，只能作为诊断的辅助指标或者与其他临床参数一起作为判断患者预后的参考指标。

研究发现，循环miRNA不仅能有效区分正常个体和肿瘤病人，而且能正确评估肿瘤的恶性程度。血浆miR-92用于结直肠癌的分子诊断，其灵敏度可达89％，特异度达到70％，肿瘤切除后血浆miR-92的表达水平较术前显著降低。血清miR-21的浓度不仅能区分乳腺癌病人和健康个体，而且能区分乳腺癌早期和晚期病例。

近几年来，随着对miRNA研究的深入，人们发现循环miRNA不仅具有良好的稳定性，而且具有显著的肿瘤相关性和组织特异性，这些研究奠定了循环miRNA作为肿瘤生物标记物的理论基础。细胞中miRNA能在转录后水平调控靶基因表达和蛋白质翻译，广泛参与各种正常的生命过程，其功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关。然而多数循环miRNA的生成机制、生物学功能以及与相关肿瘤的关系目前尚不明确。

发明内容

本发明提供了一类用作肺癌诊断标记物的miRNA，该miRNA在肺癌组织中存在差异表达。

本发明利用miRNA基因芯片(TaqMan MicroRNA Array(human A+B板3.0)技术对临床收集的正常肺组织和肺癌组织标本进行分析，筛选出在肺癌组织中表达均异常且有明显上升趋势的118种miRNA分子。然后利用实时荧光定量PCR对筛选得到的118种miRNA分子进行验证和进一步筛选，从中得到了41种miRNA分子。

申请人发现，这41种miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，因此可作为肺癌诊断标记物，用于判断受检个体是否有肺癌风险。

因此，本发明提供了miRNA作为标记物在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的应用，所述miRNA为碱基序列如SEQ ID No.1～41所示核苷酸中的一种或多种。

利用该试剂盒进行肺癌诊断时，如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风险。所述样品优选为血清。

作为优选，所述试剂盒为逆转录实时荧光定量PCR试剂盒。利用该试剂盒进行肺癌诊断的方法，可按以下步骤进行：

(1)提取样品中的miRNA，并将miRNA反转录为cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用引物进行实时荧光定量PCR，检测相应miRNA的相对表达量并与阴性对照进行比较，判断该miRNA是否存在差异性表达。

作为优选，采用2^-△△CT法比较样品与阴性对照中miRNA的相对表达量；然后通过T检验比较两者的相对表达量是否存在显著差异(p<0.05)。若碱基序列如SEQ ID No.1～41所示的miRNA分子中的任一种存在差异性表达，则将该样品所属个体诊断为有患癌风险。

本发明还提供了一种用于检测肺癌差异性表达microRNA的引物，可用于扩增所述miRNA分子，其中，正向引物为碱基序列如SEQ ID No.42～82所示核苷酸中的至少一种，反向引物为碱基序列如SEQ ID No.83所示的核苷酸。

碱基序列如SEQ ID No.42～82所示的正向引物是与碱基序列如SEQ ID No.1～41所示的miRNA分子一一对应的特异性扩增引物，碱基序列如SEQ ID No.83所示的反向引物是通用引物。

鉴于所述引物能够特异性扩增上述的miRNA分子，因此本发明还提供了所述引物在制备用于检测肺癌差异性表达microRNA的试剂盒中的应用。

进一步地，本发明还提供了一种肺癌差异性表达microRNA的检测试剂盒，包括所述引物，以及内参基因和阴性对照。

本发明中，所述内参基因为hsa-miR-16-5p。其碱基序列如SEQ ID No.84所示。用于扩增该内参基因的引物，其正向引物的碱基序列如SEQ ID No.85所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.83所示。

阴性对照即为从正常个体组织中提取的miRNA。

进一步地，本发明还提供了所述的检测试剂盒在诊断肺癌中的应用；如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风险。

进一步地，本发明还提供了所述的检测试剂盒在判断肺癌预后中的应用；如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则判断为预后不良；反之则判断为预后良好。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现了碱基序列如SEQ ID No.1～41所示的miRNA分子在肺癌组织、癌旁组织以及正常组织中均存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺癌诊断标记物，并针对miRNA分子设计了相应的PCR引物，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在本发明所述的差异性表达miRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。

附图说明

图1为本发明差异性表达miRNA的筛选流程图。

具体实施方式

1基因芯片筛选差异性表达miRNA分子

临床收集15份人正常肺组织(正常组)和15份人肺癌组织(肿瘤组)，利用基因芯片技术分析各样本中的miRNA表达谱。

(1)基因芯片筛选肺癌组织中差异性表达的miRNA

1)总RNA提取[试剂盒mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion)]

①称取约50ng组织，在液氮中研磨。

②将研磨好的组织粉末加入含300μL裂解液的EP管中，充分混匀后再加入300μL裂解液，分成2管。

③每管加入300μL变性剂，充分混匀后置于冰上5min。

④加入600μL酚：氯仿：异戊醇，涡旋1min充分混匀，室温离心10000g，5min。

⑤小心吸取上层水相至另一干净的EP管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，充分混匀。

⑥将混匀的溶液加入过滤柱中，室温离心10000g，15s。

⑦弃废液，用700μL洗液1洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液。

⑧用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液；

⑨再次用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液；

⑩加入适量95℃预热的RNasefree water于过滤柱的柱心上，室温放置5min后离心，10000g，1min，滤液即是包含总RNA的溶液。

2)反转录[试剂盒(TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit)]

①如下配制反应体系：

颠倒6次混匀，稍离心。

②加3μL(350～1000ng)Total RNA到反应管，颠倒6次混匀，稍离心，冰上放5min。

③PCR仪上设如下反应程序并反应：

反应完成后，将反转录产物置于冰水上备用。

(2)miRNA基因芯片筛选肺癌组织中的差异性表达miRNA

①配制PCR reaction mix，在1.5ml离心管加入下列试剂：

颠倒6次混匀，稍离心。

②TaqMan MicroRNA Array(A+B)上样。

每个上样点加100μL PCR reaction mix，1200rpm离心2次，每次1min。上机反应。

③将正常组数据与肿瘤组的数据进行比较，利用随机方差模型(RVM)进行差异性表达miRNA位点筛选(以大于1.5，或小于0.5倍为界)。分析工具为TwoClassDif，筛选出118个差异性表达miRNA。具体如下：

2实时荧光定量PCR筛选差异性表达miRNA

(1)正常肺组织、肺癌组织和癌旁正常组织的miRNA抽提及其反转录

临床收集25份人正常肺组织(正常组)、24份人肺癌组织(肿瘤组)和19份人肺癌旁组织(癌旁组)，从实施例1筛选获得的miRNA分子中挑选预期差异最大的41个miRNA，利用实时荧光定量PCR技术分析样本中相应miRNA的表达谱，进行验证。这41个miRNA具体如下：

1)miRNA提取

①称取约50ng组织，在液氮中研磨。

②将研磨好的组织粉末加入含300μL裂解液的EP管中，充分混匀后再加入300μL裂解液，分成2管。

③每管加入300μL变性剂，充分混匀后置于冰上5min。

④加入600μL酚：氯仿：异戊醇，涡旋1min充分混匀，室温离心10000g，5min。

⑤小心吸取上清于另一干净EP管中，加入1/3上清体积量的无水乙醇，混匀后加入过滤管上层，室温离心10000g，30s。

⑥弃过滤柱，在滤液中加入其2/3体积的无水乙醇，混匀后加入过滤管上层，室温离心10000g，30s，弃滤液。

⑦用700μL洗液1洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液。

⑧用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液。

⑨再次用500μL洗液2/3洗涤过滤柱，室温离心10000g，15s，弃滤液。

⑩加入适量95℃预热的RNasefree water于过滤柱的柱心上，室温放置5min后离心，10000g，1min，弃去过滤柱，测定滤液中miRNA浓度。

2)反转录[试剂盒miRNA cDNA Synthesis Kit(OriGene)]

①根据microRNA浓度计算500ng microRNA所需的体积XμL，并配制以下反转录体系：

总体积10μL。

②将上述溶液加入EP管中，混匀后短暂离心，37℃水浴2h。

③管子中加入1μL oligo d T，混匀离心后70℃水浴5min。

④将水浴完成的管子迅速置于冰上2min。

⑤向管子中加入：

5x MMLV buffer 4μL

MMLV 1μL

RNase free water 5μL；

混匀离心后，42℃水浴1h。

⑥95℃水浴5min。

⑦管子中加入180μL RNase free water，混匀离心，50μL每管分装后于-80℃保存。

(2)荧光实时定量PCR鉴定肺癌组织中的差异性表达miRNA

(1)实时荧光定量PCR检测

①PCR反应体系：

总体积25μL。

②PCR反应程序：

③数据统计和分析

采用2^-△△CT法计算各样品中118种miRNA分子的cDNA扩增产物的荧光强度，用于表示各miRNA分子的起始模板量(相对表达量)：

ΔCT＝CT(目的基因)-CT(内参基因)；

ΔΔCT＝ΔCT-ΔCT的中位值

2^-ΔΔCT＝power(2，-ΔΔCT)。

并通过T检验对正常组、肿瘤组、癌旁组中同一种miRNA的2^-ΔΔCT值进行两两比较，检验该miRNA在三种组织中的表达否存在显著差异。

通过分析验证可知，这41种miRNA在肺癌组织和健康组织中确实存在差异性表达，可用作肺癌诊断标记物。

Claims (6)

1.miRNA作为标记物在制备用于诊断肺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为碱基序列如SEQ ID No27所示的核苷酸。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，如所述试剂盒检测出样品中所述miRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风险。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为逆转录实时荧光定量PCR试剂盒。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括正向、反向引物，以及内参基因和阴性对照；

其中，正向引物为碱基序列如SEQ ID No.68所示的核苷酸，反向引物为碱基序列如SEQID No.83所示的核苷酸。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述内参基因为hsa-miR-16-5p。

6.miRNA作为标记物在制备用于判断肺癌预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为碱基序列如SEQ ID No27所示的核苷酸。