CN117286252B - 一种诊断和预后评估肺癌的生物标志物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诊断和预后评估肺癌的生物标志物组合及其应用，属于生物医药技术领域，该生物标志物组合包括hsa‑miR‑21‑5p、hsa‑miR‑10b‑5p和hsa‑miR‑9‑5p。本发明基于大规模高通量肺癌测序数据和生物信息学分析，建立Cox风险预测模型，筛选出能有效预判非小细胞肺癌的miRNA组合，对3种miRNAs进行特异性检测能达到诊断和/或预后评估非小细胞肺癌的目的；并且通过肺癌细胞生长抑制检测等实验发现，3种miRNA反义寡核苷酸（抑制剂）组合物能够有效抑制肿瘤细胞生长；可见，本发明为临床诊断和治疗非小细胞肺癌提供了新的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种诊断和预后评估肺癌的生物标志物组合及其应用。
背景技术
肺癌是目前全球死亡率最高的恶性肿瘤，其发病率以及死亡率仍呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康以及生命。肺癌的病因至今尚不完全明确。其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占所有肺癌患者的85%左右，具有起病隐匿、首诊晚、早期播散转移、术后极易复发、耐药等特点。所以，非小细胞肺癌的诊疗亟需寻找新的生物标志物和治疗靶点。
人类基因组中编码蛋白质的基因不到3万个，仅仅只占整个基因组序列的2％左右。显然按照生物体的基因数目的多少无法解释生命活动的复杂性。在人类基因组的非蛋白质编码区中实际上有大量的非编码RNA，由这些非编码RNA组成了细胞中高度复杂的RNA调控网络。其中microRNA（miRNA）是一类广泛存在于真核生物中，长度约19~25nt、序列保守的非编码单链小分子RNA，通过其种子序列（5’端第2~8nt）结合靶标mRNA 3’UTR在转录后水平调控靶标mRNA降解或翻译抑制。据保守估计，miRNA可直接调控超过50%的蛋白编码基因，参与近乎所有已知的细胞生命活动，例如细胞周期、分化、细胞增殖、凋亡等。大量研究表明，在肺癌的发生，发展以及转移的过程中都会伴随着miRNA的水平或功能的变化。这些变化可以为早期诊断提供有用的信息，miRNA可成为一种新兴的生物标志物并运用在肿瘤及其他疾病的诊治中。
发明内容
本发明的目的是提供一种诊断和预后评估肺癌的生物标志物组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明筛选出能有效预判非小细胞肺癌的miRNA组合，且采用miRNA组合的抑制剂能够抑制非小细胞肺癌肿瘤细胞生长，可见，本发明为临床诊断和治疗非小细胞肺癌提供了新的靶点。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种肺癌的生物标志物组合，所述生物标志物组合包括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p。
本发明还提供一种检测所述生物标志物组合表达水平的试剂在制备肺癌诊断和/或预后评估产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂盒或试剂。
本发明还提供一种肺癌诊断和/或预后评估产品，包括检测所述生物标志物组合表达水平的试剂。
本发明还提供一种降低所述生物标志物组合表达水平的物质在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
进一步地，所述物质包括反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1-3所示。
本发明还提供一种预防和/或治疗肺癌的药物，包含降低所述生物标志物组合表达水平的试剂。
进一步地，所述试剂包括反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1-3所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明基于大规模高通量肺癌测序数据和生物信息学分析，建立Cox风险预测模型，筛选出能有效预判非小细胞肺癌的miRNA组合，为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p。本发明提供的3个miRNA标志物组合，为最佳的非小细胞肺癌风险预测模型，对3种miRNAs进行特异性检测能达到诊断和/或预后评估非小细胞肺癌的目的；并且通过肺癌细胞生长抑制检测等实验发现，3种miRNA反义寡核苷酸（抑制剂）组合物能够有效抑制肿瘤细胞生长。因此，上述3种miRNA反义寡核苷酸（抑制剂）组合物可用于治疗非小细胞肺癌等肿瘤疾病的药物。可见，本发明为临床诊断和治疗非小细胞肺癌提供了新的靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于3种miRNA组合物的Cox风险预测分析结果；
图2为基于3种miRNA组合物的Cox风险预测模型；
图3为肺癌数据集（GSE137140）中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p在肿瘤组织以及癌旁/正常组织中的表达水平统计图；
图4为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p在肺腺癌（LUAD）中的预后分析结果；
图5为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p在肾透明细胞癌（KIRC）中的预后分析结果；
图6为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p在肝细胞癌（LIHC）中的预后分析结果；
图7为3种miRNA反义寡核苷酸联合给药检测H1299细胞生长抑制率图；
图8为3种miRNA反义寡核苷酸联合给药检测A549细胞生长抑制率图；
图9为3种miRNA反义寡核苷酸联合给药检测动物体内肿瘤大小的对比照片；
图10为3种miRNA反义寡核苷酸联合给药检测动物体内肿瘤抑制率统计图；左图：体积大小；右图：重量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
miRNAs组合物的Cox风险预测：通过OncomiR网站（https://www.oncomir.org）进行miRNAs组合物Cox比例风险回归模型单因素生存分析。
根据图1-图2的分析结果提示：hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p是肺癌患者生存预后不良的高风险因素，可对三者的组合物进行靶向干预。
hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p在多种恶性肿瘤中的预后分析：通过GEO（Gene Expression Omnibus）数据库，对肺癌数据集（GSE137140）中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p在肿瘤组织以及癌旁/正常组织中的表达水平进行分析；通过Kaplan-Meier Plotter网站（http://kmplot.com/analysis/）分别根据hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p的表达水平的高/低对肺腺癌（LUAD）、肾透明细胞癌（KIRC）、肝细胞癌（LIHC）患者进行Kaplan-Meier生存分析。
根据分析结果显示（图3-图6）：hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p在肺癌组织中的表达水平显著高于癌旁/正常组织。hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p或hsa-miR-9-5p高表达的肺腺癌（LUAD）、肾透明细胞癌（KIRC）以及肝细胞癌（LIHC）患者生存率显著下降。综合上述实验结果，证实hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p三个组合指标具备诊断和预后风险评估非小细胞肺癌的潜力。
实施例2
hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p的反义寡核苷酸的合成与修饰：委托吉玛基因（GenePharma）合成。反义寡核苷酸具体序列如下所示：
antagomir-21：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-Chol 3’（SEQ ID NO：1）；
antagomir-10b：5’-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-Chol 3’（SEQ ID NO：2）；
antagomir-9：5’-UCAUACAGCUAGAUAACCAAAGA-Chol 3’（SEQ ID NO：3）；
antagomir-NC：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-Chol 3’（SEQ ID NO：4）。
为增强上述反义寡核苷酸的稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，对其进行化学修饰，在上述反义寡核苷酸的5’端和3’端分别有2个和4个碱基硫代修饰（如下划线所示），在3’端连接有高亲和性胆固醇修饰。
实施例3
平板克隆实验，具体步骤如下：
（1）细胞密度达到80%~90%且细胞状态良好即可用于实验研究。
实验前一天，将处于对数生长期的H1299和A549细胞（购买于ATCC）用PBS洗涤一遍，加入0.05%胰酶常规消化后将细胞吹散并收集至15 ml离心管中，800 g离5分钟后，弃去上清，加入完全培养基进行重悬，采用血球计数板对细胞进行三次计数，取平均值，制备500个细胞/ml的单细胞悬液。
（2）取1 ml（含500个细胞）上述细胞悬液接种到12孔板中，设立2组，每组设计3个复孔。
（3）将完成细胞悬液接种的12孔板置于37 ℃细胞培养箱中预培养24小时后，分别加入hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-9-5p反义寡核苷酸（antagomiRs）连续培养10天。
（4）定期观察细胞克隆形成情况，当肉眼可见清晰克隆时，一般时间为10 ~ 12周左右，吸去上层培养液，加入固定液室温固定30分钟后加入1%的结晶紫于室温中染色30分钟。染色完毕后吸去结晶紫，拍摄细胞克隆大小，通过ImageJ 软件对>0.05 mm克隆数目进行统计。
根据检测结果显示（图7-图8）：采用3种miRNA反义寡核苷酸（antagomir-21 +antagomir-9 + antagomir-10b）联合给药后，肺癌细胞H1299和A549的生长能力显著下降。
实施例4
动物实验，具体步骤如下：
（1）H1299细胞系密度达到80%~90%且细胞状态良好即可用于实验研究。
实验前将处于对数生长期的H1299（购买于ATCC）用PBS洗涤一遍，加入0.05%胰酶，于37℃消化1-2分钟后将细胞吹散并收集至15 ml离心管中，800 g离5分钟后，弃去上清，加入PBS进行重悬，采用血球计数板对细胞进行三次计数，取平均值，制备2×107个细胞/ml的单细胞悬液（一定要将细胞充分吹散，制成单细胞悬液）。
（2）根据实验需要，采用6周龄的BALB/C nude雄性小鼠进行实验。小鼠进行固定后，酒精棉球小鼠背部皮肤，用1ml胰岛素针吸取0.1 ml浓度为2×107/ ml的单细胞悬液，在背部皮下进针约0.5～1.0cm（防止细胞悬液外漏），缓慢推注，在皮下打起皮丘后退针，种植成功。
（3）对注射肿瘤细胞后的实验小鼠持续饲养2周，当瘤体大小长至5mm×5mm时对小鼠进行随机分组并标记，开始实施药物治疗。
实验分为以下3组，每组5只小鼠：
第一组：antagomir-NC（5nmol）；
第二组：antagomir-21（5nmol）；
第三组：antagomir-21 +antagomir-9 + antagomir-10b（5nmol）。
给药方式：antagomir以瘤内多点位注射方式。
给药周期：每4天注射一次，共3次。
（4）评价指标与标准：小鼠给药后，每天观察裸鼠的精神、饮食等情况；治疗周期完成后解剖并称重测量各组肿瘤重量和大小。
根据检测结果显示（图9-图10）：相比对照组以及antagomir-21单独给药组，采用antagomir-21 +antagomir-9 + antagomir-10b联合给药后，小鼠皮下肿瘤病灶的大小和重量均显著下降。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种降低生物标志物组合表达水平的物质在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于，所述生物标志物组合由hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-9-5p组成；
所述物质为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1-3所示：
SEQ ID NO：1：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-Chol 3’；
SEQ ID NO：2：5’-CACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA-Chol 3’；
SEQ ID NO：3：5’-UCAUACAGCUAGAUAACCAAAGA-Chol 3’；
在如SEQ ID NO：1-3所示的反义寡核苷酸的5’端和3’端分别有2个和4个碱基硫代修饰，如下划线所示；在3’端连接有高亲和性胆固醇修饰。
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