CN108251424A - 一种单链环状rna和dna及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单链环状RNA和DNA及其制备方法和应用，该单链环状RNA和DNA可吸附miRNA的单链环状RNA或单链环状DNA，克服了传统的单链RNA容易降解和效率低的缺点，能够解除miRNA导致的抑癌基因“共沉默”，并且通过本发明的方法制备的单链环状RNA或环状DNA可以特异性吸附其目标miRNA，进而起到抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡的作用，并且可以调节免疫细胞的比例，具有较好的抗肿瘤及免疫调节作用，有望开发为肿瘤或免疫性疾病的治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种可吸附miRNA的单链环状RNA或环状DNA及其制备方法和在制备治疗肿瘤或免疫性疾病的药物中的应用。
背景技术
1、miRNA类抑制剂的研究
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为18-25个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70％的哺乳动物miRNA是位于TUs区(transcriptionunits，TUs)，且其中大部分是位于内含子区。一些内含子miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。
MicroRNAs(miRNAs)能够与mRNA的3’非编码区(3’UTR)特异性结合，形成RISC复合体，进而介导mRNA的降解或者翻译抑制，miRNA在细胞分化、凋亡、生物发育、疾病发生等方面均起重要作用，尤其在肿瘤细胞中，一般都存在miRNA的表达异常，调控miRNA的表达是未来抗肿瘤药物的新的研究方向。miRNA的外源调控方式主要有两种，一种是miRNA拮抗剂，一种是miRNA类似物，二者胞内稳定性均较差，作用效果不明显，成药性差。因此寻找一种能够稳定有效调控miRNA的方式变得十分重要。
现阶段的一类miRNA抑制剂是化学修饰的RNA单链，能够与成熟miRNA序列竞争性结合，从而阻止miRNA在细胞内与mRNA结合，由于此类miRNA抑制剂多是单链的RNA，只能瞬时转染，在进入细胞后极其不稳定，不能持久保持作用；另一类miRNA抑制剂是基于克隆载体的抑制剂，但是一般用量都较大，同时会被核酸酶降解。因此如何保持miRNA抑制剂的稳定性和有效性便成了miRNA相关药物研究的主要方面，保持miRNA抑制剂的稳定性的方法主要有化学修饰、胶囊技术以及通过脂质体大分子复合物包裹miRNA抑制剂，但都没有达到特别好的效果。
2、miRNA与肿瘤及免疫性疾病的关系
随着对miRNAs的深入研究，人们发现miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系。miRNA在肿瘤细胞中分为两大类，一类是能够与促癌基因的mRNA结合，抑制促癌基因的表达，从而起到抑制肿瘤的作用；另一类是能够与抑癌基因的mRNA结合，抑制抑癌基因的表达，从而促进肿瘤发展。因此，通过抑制促癌miRNA，同时又不影响抑癌miRNA发挥作用的药物对于肿瘤治疗将是极大地发展。
在乳腺癌、宫颈癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤组织中，都伴随着抑癌miRNA的降低和促癌miRNA的上升。其中，miRNA-9肿瘤中发挥着促癌基因的功能，被定义为是一种促癌miRNA，成熟的miRNA-9的序列为5’-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3’。它能够与抑癌基因的mRNA结合，抑制抑癌基因的表达，从而起到促进肿瘤的作用。因此，通过抑制miRNA-9的表达水平来抑制肿瘤，miRNA-9可以作为治疗肿瘤的潜在靶点。为治疗肿瘤提供了一个新的方向，以miRNA作为治疗靶点相比于化疗和放疗等传统的癌症治疗手段更安全、副作用更少，同时是一种更彻底的治疗手段。
2004年首次报道了miRNAs可以调节免疫应答，它们参与调节免疫细胞的成熟、增殖、分化和活化。有文献报道，miRNA-9能够负调节TIR(Toll-白介素1受体)诱导的先天性免疫反应。
miRNA-9在炎症细胞中也有表达。实验证明，通过分析发现经过Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)激活后，miRNA-9在中性粒细胞与单核细胞中都高表达。同时，TLR2、TLR7/8的激动剂与TNF-α、IL-2等促炎因子也可以诱导miRNA-9的产生。但是，INF-γ(促炎因子)则不能诱导其产生。另外，存在TLR(Toll样受体)刺激诱导miRNA-9等miRNAs的负反馈回路，可以防止过度的炎症反应，从而促进免疫自稳和免疫调节。由此可见，miRNA-9可能参与调控炎症反应的发生。
miRNA参与了生物体很多的生理与病理活动，深入到了机体健康等多个方面。它与肿瘤的发生发展有着密不可分的联系，同时它还参与细胞的分化与增殖，并且在多种人类常见疾病中也检测到其异常表达。促癌miRNA的研究为相关疾病的发生发展以及诊断治疗与预后都提供了一个新的突破点。
3、靶向于抑癌基因的抗肿瘤药物
早在1969年，Harris通过体细胞杂交实验提出了抑癌基因的概念，将癌细胞与同种的正常成纤维细胞融合，产生的杂交细胞的后代存在某些正常亲本染色体时表现为正常的细胞表型，但是随着染色体的丢失，恶性细胞又会重新出现。这一现象说明，正常的染色体内可能存在某些基因抑制肿瘤的发生。这些基因的丢失、突变或者失去功能时，激活的癌基因发挥作用而重现致瘤作用，说明该染色体携带这种抑癌基因。
由于原癌基因的突变一般发生在固定的位点，只有特定位点突变才能使癌基因的活性增强，因此目前针对癌基因的靶向治疗较容易，只需针对某一特定的位点设计靶向药物。但是抑癌基因的突变是随机的，任何位点的突变，丢失或者插入都有可能导致抑癌基因失活，功能丧失，诱发肿瘤发生，因此针对某个抑癌基因开发靶向药物则比较困难。
当肿瘤中出现某个或某些抑癌基因不表达，即出现“共沉默”的现象时，很难有药物直接针对这些基因起作用，只能是通过相关的上下游信号通路实现治疗。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列包括与促癌miRNA互补的单链核苷酸序列。
在以上核苷酸序列中，所述单链核苷酸序列为单链环状核苷酸序列。
在以上核苷酸序列中，所述单链环状核酸序列包括单链环状RNA和单链环状DNA。
在以上核苷酸序列中，与所述miRNA互补包括与所述miRNA完全互补或与所述miRNA部分互补。
在以上核苷酸序列中，与所述miRNA部分互补包括与50％以上的所述miRNA的序列互补。
在以上核苷酸序列中，所述促癌miRNA包括hsa-miR-190b、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1297、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-153-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-181、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-190-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-217、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-346、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-378-5p、hsa-miR-380-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-519d-3p、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-544a、hsa-miR-550a-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-602、hsa-miR-622、hsa-miR-632、hsa-miR-650、hsa-miR-657、hsa-miR-661、hsa-miR-663a、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-675-5p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-886-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-95-3p、hsa-miR-96-5p。
本发明还提供了一种制备核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
根据miRNA的序列设计用于制备所述核苷酸序列的单链核苷酸序列；将所述单链核苷酸序列的一条或多条退火成环，得到退火产物；用核酸外切酶酶切所述退火产物，去除未成环的线性核苷酸；以及回收单链环状核苷酸序列，得到所述核苷酸序列。
在以上方法中，所述单链核苷酸序列与所述miRNA的序列互补。
在以上方法中，所述单链环状核苷酸序列包括单链环状RNA和单链环状DNA。
本发明还提供了上述核苷酸序列在制备抗肿瘤的药物中的应用。
在以上应用中，所述肿瘤包括食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、鼻咽癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、血癌、胰腺癌、结直肠癌、骨癌和前列腺癌。
本发明还提供了上述核苷酸序列在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的应用。
在以上应用中，所述免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺炎、糖尿病、自身免疫性溶血性贫血和溃疡性结肠炎。
本发明通过设计合成的可吸附miRNA的单链环状RNA或环状DNA，克服了传统的单链RNA或者DNA容易降解的缺点，并且可以起到显著的抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡的作用，此外，还可以调节免疫细胞的比例，具有很好的抗肿瘤及免疫调节作用，有望成为肿瘤及免疫性疾病的治疗药物。
附图说明
图1是可吸附miRNA的单链环状RNA或环状DNA的设计示意图(连接序列；接头序列；miRNA；人工环状RNA；人工环状DNA；1-6均含有n(n为大于0的整数)个miRNA吸附位点，其中，1或4代表由一条链退火生成的人工环状RNA或DNA；2或5代表由多条链退火生成的人工环状RNA或DNA，每条链含有相同个数的miRNA吸附位点；3或6代表由多条链退火生成的人工环状RNA或DNA，每条链含有不同个数的miRNA吸附位点)。
图2是CSSD-9退火成环之前的两条单链DNA以及在退火成环之后的酶切前和酶切后的退火产物的核酸胶图。
图3是比较各个miRNA-9抑制剂对Hela细胞增殖能力影响的柱形图。
图4是CSSD-9对解除miRNA-9与抑癌基因KLF17(Krueppel-like factor 17，人Krueppel样因子17)、CDH1(E-钙黏蛋白)和LASS2(人源性长寿保障基因II型)蛋白的“共沉默”的效果的柱形图。
图5是将CSSD-9转染至Hela和A549细胞后的细胞形态图。
图6是CSSD-9对Hela和A549细胞增殖影响的柱形图。
图7是CSSD-9对Hela和A549细胞侵袭能力影响的柱形图。
图8是CSSD-9对Hela和A549细胞迁移能力影响的曲线图。
图9是CSSD-9对Hela和A549凋亡的影响。
图10是CSSD-9对免疫相关细胞因子影响的柱形图。
图11是CSSD-9对正常细胞生长影响的柱形图
图12A、图12B和图12C分别是miRNA-190、miRNA-21、miRNA-17、miRNA-10设计的环状DNA对Hela细胞增殖、迁移、侵袭的影响。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
以下将结合本发明的附图来描述实施例，以对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。此外，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列包括可吸附miRNA的单链环状RNA(Circular Single Stranded RNA，CSSR)或单链环状DNA(Circular Single StrandedDNA，CSSD)，克服了传统的单链RNA容易降解和效率低的缺点，并且通过本发明的方法制备的单链环状RNA或环状DNA可以特异性吸附其目标miRNA，进而起到抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡的作用，并且可以调节免疫细胞的比例，具有很好的抗肿瘤及免疫调节作用。
在以下实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
1、细胞系(包括但不限于Hela(人宫颈癌细胞系)、SiHa(人宫颈癌细胞系)、A549(人肺癌细胞系)、HepG2(人肝癌细胞系)、A375(人皮肤恶性黑色素瘤细胞系)等，以Hela和A549为例:
Hela(人宫颈癌细胞系)
培养基：DMEM高糖培养基，含10％胎牛血清。
A549(人肺癌细胞系)
培养基：1640低糖培养基，含10％胎牛血清。
2.主要实验药物与试剂
纳米微球转染试剂：micropoly货号：MT175
3.主要仪器
生物安全柜：西班牙泰事达(Telstar)，型号：Bio II A；
CO2(二氧化碳)培养箱：施都凯仪器设备(上海)有限公司，型号：STIK IL-161HI；
倒置相差显微镜：奥林巴斯，型号：CKX41；
PCR(聚合酶链式反应)仪:eppendorf型号：6331
实施例1：
可吸附miRNA的单链环状RNA(CSSR)或DNA(CSSD(单链环状DNA))的设计及制备方法(以CSSD-9为例)
1、可吸附miRNA-9(hsa-miR-9-5p)的单链环状DNA(CSSD-9)的设计
通过microRNA数据库查询miRNA-9的序列，根据miRNA-9的序列设计用于制备单链环状DNA的末端完全互补或部分互补的两条单链核苷酸序列(分别标记为F链和R链)；通过两端碱基互补的方式，使两条单链的两端结合成为环状结构，所设计的两条单链核苷酸序列分为以下几种类型：
1)CSSD-9-F1(含有两段与miRNA-9完全互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCTCATACAGCTAGATAACCAAAGATTTTTCATACAGCT AGATAACCAAAGACCATCTTCAACAAT和CSSD-9-R1(含有两段与miRNA-9完全互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACTCATACAGCTAGATAACCAAAGATTTTTCATACAGCT AGATAACCAAAGAATTGTTGAAGATGG；
2)CSSD-9-F2(含有两段与miRNA-9部分互补的DNA序列)GTTCAAACCGCTCATACAGCTAGTAACCAAAGATTTTTCATACAGCTA GTAACCAAAGACCATCTTCAACAAT和CSSD-9-R2(含有两段与miRNA-9部分互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACTCATACAGCTAGTAACCAAAGATTTTTCATACAGCTA GTAACCAAAGAATTGTTGAAGATGG；
根据miRNA-9序列设计的miRNA抑制剂如图1所示。
2、单链核苷酸序列成环实验
1)单链核苷酸溶解：将单链核苷酸溶解到双蒸水之中，配置成单链核苷酸双蒸水溶液，其中，单链核苷酸的浓度为100μM；
2)配制退火反应体系：分别在10μL上述单链核苷酸双蒸水溶液中加入10μL DNA寡核苷酸退火缓冲液(10×)，再加入双蒸水，配置成100μL的反应体系，在PCR仪中进行退火反应。
3、用核酸酶1(核酸外切酶)酶切成环产物
收集每个反应体系，将退火回收的10管100μL反应体系的退火产物合为一管。加入核酸酶1和相应的核酸外切酶缓冲溶液酶切，去掉没有成环的单链DNA，以确保最后回收的DNA为纯净的单链环状DNA。
实验分为5个样品，分别为：单链核苷酸F链、单链核苷酸R链、退火之后产物、核酸酶1酶切的退火产物、核酸酶2(核酸内切酶)酶切的退火产物；之后，利用核酸酶1能够将单链的核酸酶切降解，核酸酶2能够将单链和成环的核酸都酶切降解的性质来验证两条单链核苷酸序列是否成环。
退火实验完成后将单链核苷酸F链、单链核苷酸R链、退火之后产物、核酸酶1酶切的退火产物、核酸酶2酶切的退火产物加入琼脂糖凝胶，进行电泳检测，检测结果如图2所示，由图2可知，单链核苷酸F链、单链核苷酸R链、核酸酶2酶切的退火产物的条带均已被切掉，而核酸酶1酶切的退火产物条带只是略有降低，表明多数的单链都已成环，也表明了实验中采取的退火可以使单链DNA环化，其中，多条链成环时每条链所含的miRNA吸附位点可以相同，也可以不同。
各个miRNA-9抑制剂对Hela细胞增殖的抑制效果如下图3所示，由图3可知，在各个miRNA-9抑制剂对癌细胞增殖能力的影响中，CSSD-9对癌细胞增殖的抑制效果最好。
4、得到特异性吸附miRNA-9的单链环状DNA(CSSD-9)
之后，用酚氯仿抽提DNA回收成环产物(即，核酸酶1酶切后的退火产物)，即得到纯化的特异性吸附miRNA-9的单链环状DNA(CSSD-9)，其中，该单链环状DNA还包括连接序列、互补接头序列及连接核苷酸序列或其生物活性片段或变体；该接头序列为任意长度的任意核苷酸序列，该连接序列为任意长度的任意核苷酸序列，多条单链DNA的接头序列彼此完全互补或部分互补。
实施例2
单链环状RNA或DNA的抗肿瘤作用及免疫调节作用研究(以CSSD-9为例)
1、对Hela、A549细胞抑制效果检测
本文采用纳米微球转染试剂，与Lipofectamine 2000(购自上海浩然生物技术有限公司)以及罗氏转染试剂(购自苏州市赛德生物技术有限公司)相比较，操作更简单，对细胞伤害更小，同时转染效率更高，而纳米微球转染试剂具有独特的缓释效果，充分满足了对人工环状DNA缓慢释放的要求。
将Hela细胞传代培养，分别铺96孔板，纳米微球转染线性的miRNA抑制剂(LinearRNA-9)，环状RNA-9(circR-9)，环状RNA-9，较短单链(每条单链可与一个miRNA互补)DNA形成的环状DNA-9(CSSD-9-s),较长(每条单链可与两个miRNA互补)DNA单链退火形成的环状DNA-9(CSSD-9)，48小时后，MTT检测细胞存活率(如图3所示)。发现较长链DNA形成的CSSD-9抑制效果最好。下面以CSSD-9为例检测单链环状DNA的抗肿瘤作用。
如图4所示，将CSSD-9(较长DNA单链退火形成的环状DNA-9)转染至Hela、A549细胞，48小时后检测发现，CSSD-9提高了KLF17，CDH1和LASS2的表达。
将CSSD-9转染至Hela、A549细胞48小时后，观察细胞形态变化，如图5所示，转染后Hela、A549细胞的形态变化明显，细胞出现大量死亡，因此CSSD-9对细胞生长的抑制效果明显。如图6所示，将CSSD-9转染至Hela、A549细胞48小时后，MTT检测对细胞增殖的影响。从图6中可以看出，将CSSD-9转染至Hela、A549细胞后，CSSD-9特异性吸附miRNA-9，能够明显减弱细胞的增殖能力。
将CSSD-9转染至Hela、A549细胞24小时后，将细胞用胰酶消化，再用PBS(磷酸缓冲盐溶液)清洗两次，制成无血清的细胞悬液，放入铺materigel的Transwell小室中。24小时后，检测细胞侵袭过materigel(基质胶)的细胞数量，结果如图7所示，可以看出，CSSD-9特异性吸附miRNA-9后，能够明显减弱细胞的侵袭能力。
将CSSD-9转染至Hela、A549细胞24小时后，将细胞用胰酶消化，PBS清洗两次，制成无血清的细胞悬液铺入24孔板，细胞贴壁后划痕，拍照测量划痕宽度，作为0小时距离；此后分别于24小时，48小时检测划痕宽度，与0小时对比，计算细胞迁移率，结果如图8所示，可以看出，CSSD-9特异性吸附miRNA-9后，能够明显减弱细胞的迁移能力。
根据细胞凋亡试剂盒(购自南京凯基生物科技有限公司)说明检测CSSD-9对Hela,A549细胞凋亡的影响，结果如图9所示，从凋亡实验的结果可以看出，转染特异性吸附miRNA-9后的CSSD-9能够促进细胞的凋亡，并且解除miRNA-9导致的抑癌基因“共沉默”，促进抑癌基因的表达，达到抗肿瘤的目的。
2、在mRNA水平上检测CSSD-9对免疫相关细胞因子的影响
转染CSSD-9 48h后细胞收样提取RNA，利用qRT-PCR(定量反转录PCR)检测IL-6(白介素-6)、IL-10(白介素10)、IFN-γ(γ干扰素)、CCL3(趋化因子)、CXCL10(趋化因子)的mRNA表达量的变化，如图10所示，转染CSSD-9后mRNA水平检测IL-6、IL-10、IFN-γ、CCL3、CXCL10，结果表明，CSSD-9能够上调免疫相关细胞因子的表达，从而提高免疫。
3、对HEK293(人胚胎肾细胞)细胞毒性检测
将实验分为对照组、转染试剂组、CSSD-9组，通过将CSSD-9转染至HEK293细胞，转染完48h后观察HEK293细胞形态的变化，结果如图11所示，转染试剂和CSSD-9均对正常细胞基本上没有伤害，从而排除了CSSD-9可能会对正常细胞或组织产生伤害的可能。
实施例3
根据多种促癌miRNA设计的单链环状DNA的抗肿瘤作用研究(以miRNA-190(hsa-miR-190b)、miRNA-21(hsa-miR-21-5p)、miRNA-17(hsa-miR-17-5p)、miRNA-10(hsa-miR-10b-5p)为例)
参考实施例2和实施例3，转染根据miRNA-190、miRNA-21、miRNA-17、miRNA-10设计制备的单链环状DNA(分别为CSSD-190、CSSD-21、CSSD-17、CSSD-10)，检测其对Hela细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
其它miRNA-190的的核苷酸序列为5’-UGAUAUGUUUGAUAUUGGGUU-3’，优选的可以吸附miRNA-190的单链环状DNA(CSSD-190)的末端互补的两条单链核苷酸序列为：
CSSD-190-F1(含有两段与miRNA-190完全互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACAACCCAATATCAAACATATCATTTTAACCCAATATCA AACATATCAATTGTTGAAGATGG和CSSD-190-R1(含有两段与miRNA-190完全互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCAACCCAATATCAAACATATCATTTTAACCCAATATCA AACATATCACCATCTTCAACAAT；
或CSSD-190-F2(含有两段与miRNA-190部分互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACAACCCAATATCAACATATCATTTTAACCCAATATCAA CATATCAATTGTTGAAGATGG和CSSD-190-R2(含有两段与miRNA-190部分互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCAACCCAATATCAACATATCATTTTAACCCAATATCAA CATATCACCATCTTCAACAAT。
miRNA-21的核苷酸序列为5-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，优选的可以吸附miRNA-21的单链环状DNA(CSSD21)的末端互补的两条单链核苷酸序列为：
CSSD-21-F1(含有两段与miRNA-21完全互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTCAACATCAGT CTGATAAGCTACCATCTTCAACAAT和CSSD-21-R1(含有两段与miRNA-21完全互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTCAACATCAGT CTGATAAGCTAATTGTTGAAGATGG；
或CSSD-21-F2(上游引物：含有两段与miRNA-21部分互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCTCAACATCAGTCGATAAGCTATTTTTCAACATCAGTC GATAAGCTACCATCTTCAACAAT和CSSD-21-R2(含有两段与miRNA-21部分互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACTCAACATCAGTCGATAAGCTATTTTTCAACATCAGTC GATAAGCTAATTGTTGAAGATGG。
miRNA-17的核苷酸序列为5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’，优选的可以吸附miRNA-17的单链环状DNA(CSSD17)的末端互补的两条单链核苷酸序列为：
CSSD-17-F1(含有两段与miRNA-17完全互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACCTACCTGCACTGTAAGCACTTTGTTTTCTACCTGCAC TGTAAGCACTTTGATTGTTGAAGATGG和CSSD-17-R1(含有两段与miRNA-17完全互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCCTACCTGCACTGTAAGCACTTTGTTTTCTACCTGCAC TGTAAGCACTTTGCCATCTTCAACAAT；
或CSSD-17-F2(含有两段与miRNA-17部分互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACCTACCTGCACTGTAGCACTTTGTTTTCTACCTGCACT GTAGCACTTTGATTGTTGAAGATGG和CSSD-17-R2(含有两段与miRNA-17部分互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCCTACCTGCACTGTAGCACTTTGTTTTCTACCTGCACT GTAGCACTTTGCCATCTTCAACAAT；
miRNA-10的核苷酸序列为5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’，优选的可以吸附miRNA-10的单链环状DNA(CSSD10)的末端互补的两条单链核苷酸序列为：
CSSD-10-F1(含有两段与miRNA-10完全互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACCACAAATTCGGTTCTACAGGGTATTTTCACAAATTCG GTTCTACAGGGTAATTGTTGAAGATGG和CSSD-10-R1(含有两段与miRNA-10完全互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCCACAAATTCGGTTCTACAGGGTATTTTCACAAATTCG GTTCTACAGGGTACCATCTTCAACAAT；
或CSSD-10-F2(含有两段与miRNA-10部分互补的DNA序列)：GCGGTTTGAACCACAAATTCGGTTTACAGGGTATTTTCACAAATTCGG TTTACAGGGTAATTGTTGAAGATGG和CSSD-10-R2(含有两段与miRNA-10部分互补的DNA序列)：GTTCAAACCGCCACAAATTCGGTTTACAGGGTATTTTCACAAATTCGG TTTACAGGGTACCATCTTCAACAAT。
检测结果如图12A至图12C所示，转染针对其它miRNA设计的环状CSSD-190、CSSD-21、CSSD-17、CSSD-10对Hela细胞的增殖、迁移和侵袭均具有很好的抑制作用。
另外，从本领域的相关文献和microRNA数据库(miRBase)中查找了多个促癌的miRNA，并根据其序列设计了人工环状DNA(CSSD)，并在细胞水平上比较了miRNA LNA(锁核酸)抑制剂和CSSD对A549和Hela细胞增殖的抑制效果，如下表1所示：
表1
由上表1可知，miRNA LNA抑制剂及包含1～4个miRNA吸附位点的人工环状RNA和人工环状DNA对肿瘤细胞的抑制效果依次为：人工环状DNA>人工环状RNA>miRNA LNA抑制剂，其中，包含4个miRNA吸附位点的人工环状DNA抑制效果最为明显，即，CSSD对肿瘤细胞有较好的抑制效果，具有明显的优势。
在本文中，miRNA-9(hsa-miR-9-5p，microRNA数据库，数据库编号MIMAT0000441)，miRNA190(hsa-miR-190b，microRNA数据库，数据库编号MIMAT0004929)，miRNA-21(hsa-miR-21-5p，microRNA数据库，数据库编号MIMAT0000076)，miRNA-17(hsa-miR-17-5p，microRNA数据库，数据库编号MIMAT0000070)，miRNA-10(hsa-miR-10b-5p，microRNA数据库，数据库编号MIMAT0000254)，其它hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1297、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-153-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-181、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-190-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-217、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-346、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-378-5p、hsa-miR-380-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-519d-3p、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-544a、hsa-miR-550a-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-602、hsa-miR-622、hsa-miR-632、hsa-miR-650、hsa-miR-657、hsa-miR-661、hsa-miR-663a、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-675-5p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-886-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-95-3p、hsa-miR-96-5p均来自microRNA数据库。
综上，通过本发明可知，特异性吸附促癌miRNA单链环状RNA或环状DNA具有很好的抗肿瘤及免疫调节作用，有望开发成为肿瘤及免疫性疾病的治疗药物。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
序列表
<110> 天利康（天津）科技有限公司
<120> 一种单链环状RNA和DNA及其制备方法和应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知
<400> 1
ucuuugguua ucuagcugua uga 23
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 未知
<400> 2
gttcaaaccg ctcatacagc tagataacca aagatttttc atacagctag ataaccaaag 60
accatcttca acaat 75
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 未知
<400> 3
gcggtttgaa ctcatacagc tagataacca aagatttttc atacagctag ataaccaaag 60
aattgttgaa gatgg 75
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 4
gttcaaaccg ctcatacagc tagtaaccaa agatttttca tacagctagt aaccaaagac 60
catcttcaac aat 73
<210> 5
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 5
gcggtttgaa ctcatacagc tagtaaccaa agatttttca tacagctagt aaccaaagaa 60
ttgttgaaga tgg 73
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 未知
<400> 6
ugauauguuu gauauugggu u 21
<210> 7
<211> 71
<212> DNA
<213> 未知
<400> 7
gcggtttgaa caacccaata tcaaacatat cattttaacc caatatcaaa catatcaatt 60
gttgaagatg g 71
<210> 8
<211> 71
<212> DNA
<213> 未知
<400> 8
gttcaaaccg caacccaata tcaaacatat cattttaacc caatatcaaa catatcacca 60
tcttcaacaa t 71
<210> 9
<211> 69
<212> DNA
<213> 未知
<400> 9
gcggtttgaa caacccaata tcaacatatc attttaaccc aatatcaaca tatcaattgt 60
tgaagatgg 69
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 未知
<400> 10
gttcaaaccg caacccaata tcaacatatc attttaaccc aatatcaaca tatcaccatc 60
ttcaacaat 69
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 未知
<400> 11
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 12
gttcaaaccg ctcaacatca gtctgataag ctatttttca acatcagtct gataagctac 60
catcttcaac aat 73
<210> 13
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 13
gcggtttgaa ctcaacatca gtctgataag ctatttttca acatcagtct gataagctaa 60
ttgttgaaga tgg 73
<210> 14
<211> 71
<212> DNA
<213> 未知
<400> 14
gttcaaaccg ctcaacatca gtcgataagc tatttttcaa catcagtcga taagctacca 60
tcttcaacaa t 71
<210> 15
<211> 71
<212> DNA
<213> 未知
<400> 15
gcggtttgaa ctcaacatca gtcgataagc tatttttcaa catcagtcga taagctaatt 60
gttgaagatg g 71
<210> 16
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知
<400> 16
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 17
<211> 75
<212> DNA
<213> 未知
<400> 17
gcggtttgaa cctacctgca ctgtaagcac tttgttttct acctgcactg taagcacttt 60
gattgttgaa gatgg 75
<210> 18
<211> 75
<212> DNA
<213> 未知
<400> 18
gttcaaaccg cctacctgca ctgtaagcac tttgttttct acctgcactg taagcacttt 60
gccatcttca acaat 75
<210> 19
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 19
gcggtttgaa cctacctgca ctgtagcact ttgttttcta cctgcactgt agcactttga 60
ttgttgaaga tgg 73
<210> 20
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 20
gttcaaaccg cctacctgca ctgtagcact ttgttttcta cctgcactgt agcactttgc 60
catcttcaac aat 73
<210> 21
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知
<400> 21
uacccuguag aaccgaauuu gug 23
<210> 22
<211> 75
<212> DNA
<213> 未知
<400> 22
gcggtttgaa ccacaaattc ggttctacag ggtattttca caaattcggt tctacagggt 60
aattgttgaa gatgg 75
<210> 23
<211> 75
<212> DNA
<213> 未知
<400> 23
gttcaaaccg ccacaaattc ggttctacag ggtattttca caaattcggt tctacagggt 60
accatcttca acaat 75
<210> 24
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 24
gcggtttgaa ccacaaattc ggtttacagg gtattttcac aaattcggtt tacagggtaa 60
ttgttgaaga tgg 73
<210> 25
<211> 73
<212> DNA
<213> 未知
<400> 25
gttcaaaccg ccacaaattc ggtttacagg gtattttcac aaattcggtt tacagggtac 60
catcttcaac aat 73
Claims (13)
1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包括与促癌miRNA互补的单链核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述单链核苷酸序列为单链环状核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中，所述单链环状核酸序列包括单链环状RNA和单链环状DNA。
4.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中，与所述miRNA互补包括与所述miRNA完全互补或与所述miRNA部分互补。
5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其中，与所述miRNA部分互补包括与50％以上的所述miRNA的序列互补。
6.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其中，所述促癌miRNA包括hsa-miR-190b、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-1275、hsa-miR-1297、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-153-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-181、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-187-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-190-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-217、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-346、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-378-5p、hsa-miR-380-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-519d-3p、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-544a、hsa-miR-550a-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-602、hsa-miR-622、hsa-miR-632、hsa-miR-650、hsa-miR-657、hsa-miR-661、hsa-miR-663a、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-675-5p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-886-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-95-3p、hsa-miR-96-5p。
7.一种制备核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
根据miRNA的序列设计用于制备所述核苷酸序列的单链核苷酸序列；
将所述单链核苷酸序列的一条或多条退火成环，得到退火产物；
用核酸外切酶酶切所述退火产物，去除未成环的线性核苷酸；以及
回收单链环状核苷酸序列，得到所述核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述单链核苷酸序列与所述miRNA的序列互补。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述单链环状核苷酸序列包括单链环状RNA和单链环状DNA。
10.根据权利要求1～6中任一项所述的核苷酸序列在制备抗肿瘤的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述肿瘤包括食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、鼻咽癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、血癌、胰腺癌、结直肠癌、骨癌和前列腺癌。
12.根据权利要求1～6中任一项所述的核苷酸序列在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其中，所述免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺炎、糖尿病、自身免疫性溶血性贫血和溃疡性结肠炎。
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