CN110607367A - 用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的检测引物组合及试剂盒 - Google Patents

用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的检测引物组合及试剂盒 Download PDF

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张贞
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Abstract

本发明提供一种用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa‑miR‑141‑3p检测引物组合，包括逆转录引物和PCR引物，逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。可使逆转录后的hsa‑miR‑141‑3p序列延长。还提供了用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa‑miR‑141‑3p检测试剂盒，检测结果准确可靠，操作简便，适于推广应用。

Description

用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的检 测引物组合及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合及试剂盒。
背景技术
微小RNA(microRNA，miRNA)是大小为18～25个核苷酸的内源性小分子RNA。成熟的miRNA通过与靶基因mRNA3’非编码区结合，介导mRNA降解或抑制表达翻译，因此miRNA在疾病发生发展中具有重要的研究价值。但是成熟miRNA由于核酸序列短，无法采用常规的PCR或荧光定量PCR方法进行基因表达的分析，因此需要设计特殊的引物。
2005年，chen等(Chen C,2005,Nucleic Acids Res,33,e179)设计出一种茎环结构的逆转录引物，使成熟的miRNA逆转录后序列延长，方便 miRNA的基因表达分析。随后很多miRNA的研究基于这种思路设计逆转录引物。由于miRNA种类众多，公开发表的通用茎环结构逆转录引物并不是对任何miRNA的逆转录都能成功，这与miRNA本身的长度和碱基序列特点有关。
在乳腺癌患者的乳腺癌组织标本中hsa-miR-141-3p表达含量降低，体外细胞实验研究表明hsa-miR-141-3p参与抑制乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭能力，可作为预示乳腺癌的抑瘤性miRNA(Li P,2017,Cancer Medicine,6,662-672)。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合，可使逆转录后的hsa-miR-141-3p序列延长，PCR扩增为特异性扩增。本发明还提供一种用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa-miR-141-3p检测试剂盒，检测结果准确可靠，操作简便，适于推广应用。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合，包括逆转录引物和PCR引物，逆转录引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
优选地，PCR引物包括PCR上游引物和PCR下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ IDNo.3所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
一种试剂盒，其包含如上所述的引物组。
如上所述的引物组合或试剂盒在乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价中的应用。
进一步地，应用的方法包括以下步骤：
S1、提取待测样品的总DNA。
S2、采用如上所述的引物组合对总DNA进行PCR扩增。
S3、对步骤S2获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步地，PCR的扩增体系包括：25mM的MgCl2溶液4μL，缓冲液 5μL，Taq DNA聚合酶2μL，2mM的dNTP 5μL，10μM的上游引物1 μL，10μM的下游引物1μL，ddH2O 30μL，逆转后cDNA模板2uL。
进一步地，PCR的扩增过程包括变性过程、退火过程和延伸过程，变性过程的条件为94℃变性15秒，退火过程的条件为60℃退火30秒，延伸过程的条件为70℃延伸30秒。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合，可使逆转录后的微小RNA序列延长，PCR扩增为特异性扩增，对乳腺癌的检测具有很好的敏感性和特异性，能很好的辅助乳腺癌的检测。
2、本发明提供的RNA hsa-miR-141-3p检测试剂盒，含有本发明提供的检测hsa-miR-141-3p的引物组，检测结果准确可靠，操作简便，适于推广应用。
【附图说明】
图1为本发明具体实施方式中miRNA逆转录引物设计模式图；
图2为本发明具体实施方式中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；泳道说明：1-2为miR-141，产物长度为59bp；3为Marker；
图3为本发明具体实施方式中has-miR-141-3p测序及序列比对图；
图4为本发明具体实施方式中has-miR-141-3p构建的质粒浓度为1 ×102copies、1×103copies、1×104copies、1×105copies、1×106copies、 1×107copies、1×108copies、1×109copies共8个浓度的实时荧光定量分析图；
图5为本发明具体实施方式中has-miR-141-3p构建的质粒浓度为 1×102copies、1×103copies、1×104copies、1×105copies、1×106copies、 1×107copies、1×108copies、1×109copies共8个浓度的实时荧光定量分析标准曲线图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
微小RNA hsa-miR-141-3p荧光定量PCR(realtime-PCR)引物设计方法：
1、逆转录引物设计：基于通用的茎环结构，按照不同的miRNA序列在其后增加一段与特定的miRNA 3’端反向互补的7～9个碱基即可，如图1所示。
其中，通用茎环结构为一个序列长度为44nt的固定序列：5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3’ (SEQ ID No.1)。与miRNA互补的碱基不得少于7nt，否则逆转录引物的特异性降低。环状结构本身有空间位阻的作用，根据碱基互补结合规则，能够使RT引物只与相匹配的成熟miRNA单链的3’末端特异性结合。
2、PCR上游引物设计：总的设计原则与普通引物的设计原则相同，只是PCR上游引物的3’端与成熟miRNA按碱基互补配对原则设计，通常含11～18个核苷酸，并且使上游引物的3’端与RT引物的3’端一般重叠6-7个碱基，重叠碱基过多会使灵敏度下降、引物二聚体形成增多。若Tm值过高或过低，可以在上游引物的5’端添加碱基调整。
3、PCR下游引物设计：下游引物是针对反转录引物中一段通用不变的序列，这条通用引物(Univers primer)适用于所有miRNAs的PCR反应，由茎环结构配对柄端的4-7个碱基和11-13个环端碱基构成，通常和茎环引物的5’端约15-20个核苷酸序列相同。PCR反应时，从下游引物的末端开始延伸得以复制出模板相同序列。
4、引物设计好后，通过试验检测引物的特异性。
通过以上方法，筛选得到用于检测hsa-miR-141-3p的特异性引物，其逆转录引物的序列信息见表1，其上、下游PCR引物的序列信息见表 2。
表1逆转录引物序列信息
表2上、下游PCR引物序列信息
利用上述逆转录引物对hsa-miR-141-3p逆转录后，并经荧光定量PCR 技术进行扩增，PCR的扩增体系包括：25mM的MgCl2溶液4μL，缓冲液 5μL，Taq DNA聚合酶2μL，2mM的dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)5 μL，10μM的上游引物1μL，10μM的下游引物1μL，ddH2O(双蒸水) 30μL，逆转后cDNA模板2uL。PCR的扩增过程包括变性过程、退火过程和延伸过程，变性过程的条件为94℃变性15秒，退火过程的条件为 60℃退火30秒，延伸过程的条件为70℃延伸30秒。
将扩增产物电泳，结果如图2所示，可见产物大小与预期符合。图2 中，泳道说明：1-2为miR-141，产物长度为59bp；3为Marker。对扩增产物进行测序，结果如图3所示，可见与预期序列一致，且为特异性扩增。图3中，Query为克隆测序序列，Sbjct为has-miR-141-3p以Stem- loop法逆转录后的cDNA标准序列，其荧光定量PCR产物长度为59bp。将本发明中的引物用于has-miR-141-3p，使用SYBR Green进行实时荧光定量分析，结果见图4、5，可知本发明中的引物用于hsa-miR-141-3p的扩增效率E在90％-110％之间，相关系数平方R2>0.990，目标miRNAs表达结果稳定可靠。
综上，本发明提供的检测hsa-miR-141-3p的引物，可使逆转录后的微小RNA序列延长，PCR扩增为特异性扩增，有利于后续miRNA的定量或定性分析。
由此，本发明提供的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合对乳腺癌的检测具有很好的敏感性和特异性，在乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价中能起到良好作用。因此，本发明还提供一种用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNAhsa-miR-141-3p检测试剂盒，包含本发明提供的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合。
本发明还提供如上所述的引物组合或试剂盒在乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价中的应用，应用的方法包括以下步骤：S1、提取待测样品的总DNA。S2、采用如上所述的引物组合对总DNA进行 PCR扩增。S3、对步骤S2获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
以上结合具体实施方式描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南中医药大学
<120> 用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的检测引物组合及
试剂盒
<130> 2019
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgac 44
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccatct tt 52
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgtaacact gtctggtaaa gatg 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgcagggtc cgaggtattc 20

Claims (8)

1.一种用于乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价的RNA hsa-miR-141-3p检测引物组合，其特征在于，包括逆转录引物和PCR引物，所述逆转录引物的碱基序列如SEQID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述PCR引物包括PCR上游引物，
所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述PCR引物还包括PCR下游引物，
所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
4.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1至3任一项所述的引物组合。
5.如权利要求1至3任一项所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒在乳腺癌的早期筛查、诊断、疗效监测和/或预后评价中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
S1、提取待测样品的总DNA；
S2、采用权利要求1至3任一项所述的引物组合对所述总DNA进行PCR扩增；
S3、对步骤S2获得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR的扩增体系包括：25mM的MgCl2溶液4μL，缓冲液5μL，Taq DNA聚合酶2μL，2mM的dNTP 5μL，10μM的上游引物1μL，10μM的下游引物1μL，ddH2O 30μL，逆转后cDNA模板2uL。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR的扩增过程包括变性过程、退火过程和延伸过程，所述变性过程的条件为94℃变性15秒，所述退火过程的条件为60℃退火30秒，所述延伸过程的条件为70℃延伸30秒。
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