CN103509789A - 一种用于扩增短链rna的引物及其相关方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于短链RNA扩增的引物及其相关方法，该引物为一条寡核苷酸，其5`端一段核苷酸序列是固定的，形成一个核苷酸环和核苷酸茎的结构，其3`端连接6-8个核苷酸与成熟miR 3`端相互配对形成特异性互补结合，在核苷酸环的3`端含一段GC含量达70%以上长的核苷酸序列，称为通用探针区；由引物5`端第8-30位核苷酸组成通用反向引物区。本引物存在一个内部双链结构由于空间位阻的关系，不会与位于核苷酸链内部的特异性序列结合，该类序列不会发生反转录反应；只与3`末端特异性配对结合，特异性反转录。本发明的引物特异性高，不形成引物二聚体，设计简单，合成方便，适合短链RNA尤其是成熟miR的反转录。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域，特别涉及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中检测全长为18-25nt的成熟miR所用的反转录引物的设计与应用技术领域。
背景技术
成熟miR是最近发现的一类全长为18-25nt的单链小分子非编码RNA，是由茎环结构的转录前体(包括pri-miRNA约1000bp、pre-miRNA约60-70bp)加工而成。2011年11月Sanger miRBase数据库（18.0版）公布，发现了2万多种转录本，包括人类的近2000种。miRNAs是Victor Ambros及其同事首先在线虫体内发现的，是一类非编码的内源性单链小分子RNA。其5`端的2-8nt种子区域（seed region）可与其靶mRNA的3`UTR以Waston-Crick碱基全部或部分互补配对（Watson-Crick basepairing），从而发挥转录调控作用。人们预测大约30%的人类基因受miRNAs的调控，每种miRNA调控大约200种靶基因，而每种基因又受多种miRNA调控。各项研究亦表明它参与了人体重要的生物学进程，如发育、造血、器官形成、细胞分化、凋亡和增殖、癌症发生等。随着对miRNAs研究的日趋深入，众多的研究数据显示超过50%的miRNAs基因位于癌基因或脆性基因区域，发挥着癌基因或抑癌基因的作用，在多种癌症中表达上调或降低。
第一篇有关miRNA的论文发表于1993年，随后的十年间相关的研究论文相当有限，然而近5-6年来有关miRNA的研究论文数成倍增加，2010年大约就有近12000篇论文公开发表并且有文献表明，成熟miRNA具有组织特异性、疾病特异性、存在于外周血且非常稳定。因此，miRNA不仅有治疗价值而且有诊断价值。miRNA已经成为广大学者研究的热点，并逐渐向应用领域转化。如何进行准确、特异地检测miRNA成为首先要解决的问题。虽然miRNAs是一类表达相对丰富的转录本，但他们在不同物种和组织中的表达水平变化非常大。低丰度的miRNAs，通常用克隆、northern blot和芯片的技术将难以检测。如果要精确和定量检测miRNA尤其是低丰度miRNA，qRT-PCR技术无疑是最佳选择，因为实时荧光定量PCR技术是检测基因表达的金标准。1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。
PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：
1.变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；
2.退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；
3.延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。
以上三步为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR（RT-PCR）用于RNA的扩增，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
应用PCR技术检测有一定长度（如100bp到几个kb）的DNA或RNA，初学PCR的技术人员也不会有多大的困难，但是如何设计长度只有18-25nt的成熟miRNA的反转录引物、特异性的正向引物、标记染料的TaqMan探针和反向引物是解决miRNA定量RT-PCR检测的关键所在。因为普通引物的理想长度在15-30bp之间，按照常规的做法一条成熟miRNA的长度就几乎为引物链覆盖了，这样扩增将难以实现。目前解决这一问题的是美国的AB公司，她采用了一种茎环引物反转录成熟miR，来加长转录后的cDNA，实现PCR扩增检测的目的。
在中国专利文献库检索也没有相关文献。
发明内容
本发明所解决首要技术问题是提供一种用于短链RNA（包括成熟miR）RT-PCR扩增的新式引物。该引物在设计思路上与前述的当前引物根本不同，通过巧妙的设计将引物的特异性大大提高，设计简单，成本低，适用广。
本发明所解决另一个技术问题是提供一种相关的扩增短链RNA的方法。
本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案是：一种用于扩增短链RNA的引物，其引物共4条，分别为茎环反转录引物、特异性正向引物、通用反向引物和通用探针，其特征是：茎环反转录引物由5段不同长度的寡核苷酸组成，3`端的6-8bp组成第一区域与miRNA的3`端形成特异性互补，决定反转录的特异性，第二区域和第五区域互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2-5℃，在反转录的过程中始终保持双链形式，靠近5`端的核苷酸环状结构第四区域设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于2-5℃，靠近3`端的核苷酸环状结构第三区域设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10℃，第三区域与第四区域之间应至少间隔3bp以上；
优选，所述的茎环反转录引物，其3`端和5`端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，并且3`端还有一段6-8个核苷酸的单链结构，该单链与成熟的靶miR特异性互补配对。
优选，所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5℃。
作为优选，所述的特异性正向引物，其Tm值小于通用探针和通用反向引物Tm值2-5℃。
作为优选，所述的通用反向引物，其序列与茎环反转录引物的通用反向引物区序列一致。
作为优选，所述的通用探针，其序列与茎环反转录引物的通用探针区序列一致。
本发明解决上述另一个技术问题所采用的技术方案是：
一种上述引物扩增短链RNA的方法，其特征在于：
茎环反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miRNA的3`端特异性结合，并反转录成cDNA第一链；
特异性正向引物3`端由靶miR 5`端的10-18个碱基决定，其5`端的尾部序列可根据反应Tm值随机构成，通用反向引物由茎环引物的通用反向引物区序列构成，通用探针由茎环引物的通用探针区序列构成；
经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链的3`端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链；
再变性后，cDNA第二链与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物和通用探针Tm值时，通用反向引物和通用探针与cDNA第二链配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二链为模板延伸形成cDNA第二链的互补链，同时当延伸到通用探针时，通用探针被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。
优选，所述茎环反转录引物其3`端和5`端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，该互补双链的Tm值应大于反转录最适温度2-5℃。
优选，所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5℃。
最后，所述cDNA第二链的合成的退火温度为60-65℃，PCR扩增循环的退火温度为65-70℃。
本发明的引物所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，LNA（锁核酸），或PNA（肽核酸），或任何非自然核苷酸组成。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
设计简单：茎环引物设计时没有太多的要求，只要茎环引物内部双链区Tm值高于反转录Tm值2-5℃，低于PCR扩增Tm值2-5℃。任何设计过PCR引物的人员均可以设计。
无引物二聚体产生：在反转录的过程中，由于反转录酶的最适温度低于茎环引物内部双链的Tm值2-5℃，引物内双链不会打开，呈茎环结构，不会与另一条引物形成双链，因此就不会扩增出引物二聚体。
特异性高：由于成熟miR是一类全长为18-25nt的单链小分子非编码RNA，是由茎环结构的转录前体(包括pri-miRNA约1000bp、pre-miRNA约60-70bp)加工而成，因此，生物体内同时存在成熟miR、pri-miRNA和pre-miRNA。在反转录时，茎环引物的内部双链的作用使得引物呈茎环结构，由于空间位组的关系茎环引物的3`端6-8个特异性碱基不能与pri-miRNA和pre-miRNA顺利结合，只会特异地与成熟miR的3`端形成互补结合，实现转录，从而特异性地转录了成熟miR而不受pri-miRNA和pre-miRNA的影响。
适用范围广：对于短小的RNA（甚至DNA）尤其是长度只有18-25nt的成熟miR，无论来自哪一种物种，或是非自然的短小核酸都有很好的适用性。
合成简单、成本低：无需任何特殊的仪器，只需要普通的DNA合成仪就可以完成。并且可以使用通用的反向引物和探针，可以大大减低合成成本。
附图说明
图1茎环引物及其反应原理示意图；
图2cDNA第二链的合成与cDNA的PCR扩增示意图；
图3a、3b茎环RT引物用于实时PCR检测的特异性和有效性的示意图。
具体实施方式
茎环特异性反转录引物的构成及与靶miR反应
本发明的茎环引物为一段寡核苷酸，其5`端核苷酸序列是固定的，形成一个核苷酸茎和核苷酸环的结构，其3`端连接一段核苷酸与成熟的靶miR3`端特异性互补。在核苷酸环的3`端含一段GC含量达70%以上的序列，称为通用探针区；5`端的序列为通用反向引物区。在一定的条件下，比如酸性、碱性或高温条件下，引物内部双链被打开，茎环结构消失，成线性结构，见图1。
根据图1，茎环引物由5段不同长度的寡核苷酸组成。3`端的6-8bp组成第一区域1与miR的3`端形成特异性互补，决定转录的特异性。第二区域2和第五区域5互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2-5℃，在反转录的过程中始终保持双链形式。靠近核苷酸环状结构5`端的第四区域4设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于3-10℃。靠近核苷酸环状结构3`端的第三区域3设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10℃。第三区域3与第四区域4之间应至少间隔3bp以上。特异性反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miR的3`端特异性结合，并反转录成cDNA第一链。
cDNA第一链的特异性扩增（合成cDNA第二链）
特异性正向引物长约24-28个核苷酸，在3`端的10-18个核苷酸与相应的miR互补，而剩余的10-15个核苷酸的Tm值大于42℃。探针由核苷酸环的通用探针区20个核苷酸构成。通用反向引物为23个核苷酸，由茎环引物5`端第8-30位核苷酸组成，见图2。
根据图2，特异性正向引物由3`端的特异性序列7和5`端的尾部序列8构成，通用反向引物10由茎环引物的通用反向引物区的序列构成，通用探针11由茎环引物的通用探针区3的序列构成。经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列7的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链6的3`端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链9；再变性后，cDNA第二链9与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物10和通用探针11Tm值时，通用反向引物10和通用探针11与cDNA第二链9配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物10以cDNA第二链9为模板延伸形成9的互补链，同时当延伸到通用探针11时，通用探针11被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。
实施例1：茎环RT引物结合探针用于实时PCR定量检测hsa-miR-30d
为考察茎环引物应用在实时PCR检测时的特异性和有效性，PCR模板分别为前体hsa-mir-30d
(5`GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGCUAC 3`带下划线的碱基为其成熟体的序列)和成熟hsa-miR-30d(5`UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG3`)的标准RNA样品、及一系列稀释的hsa-miR-30d标准cDNA样品。RT反应的体系总体积为15μl，包括1.5μl 10×buffer，50U/μl逆转录酶1.0μl，100mM dNTP 0.15μl，20U/μl RNA抑制剂0.19μl，1μM RT引物3μl，0.01μM模板RNA 5μl，DEPC水4.16μl。反转录PCR反应在BIO-RAD MyCycler定性PCR仪上进行。反应条件为：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃∞。实时PCR反应体系总体积为20μl，包括Universal PCRMaster Mix 10μl，10μM的正、反向引物及探针各0.5μl，102、103、104、105、106倍稀释的cDNA第一链模板1.5μl，DEPC水7.0μl。实时PCR反应在AB 7500实时PCR仪上进行。反应条件为95℃ 10min，64℃ 2min；93℃ 15s，69℃ 40s(检测FAM荧光信号)，共40个循环。
茎环RT引物为：
5`
CGAGGTGCTCGTAGTCGGAGCGTCCCTGCGAGGCT cttccagt 3`方框中的碱基为茎环引物内部双链部分，靠近5`端带下划线的碱基为通用反向引物序列区，3`端带下划线的碱基为通用探针序列区，小写字体的碱基为与靶has-miR-30d 3`端特异性配对的碱基。
特异性正向引物为：TCAGCTTGTAAACATCCCCGACTGG，下划线的碱基为与靶has-miR-30d的cDNA第一链3`端特异性互补配对的碱基。
通用反向引物为：CCAGAGGTCATCGAGGTGCTCGT，通用探针为FAM-CGGAGCGTCCCTGCGAGGCT-TAMRA，均与cDNA第二链配对结合。
图3a显示茎环引物用于检测前体miRNA与成熟miR的特异性，对成熟miR的检测效果非常好(曲线12)，而前体miRNA则不能检测出(曲线13)；图3b显示茎环引物用于实时RT-PCR检测的有效性。初始的靶浓度在稀释物最浓时的曲线14，曲线15、16、17、18分别表示当模板被连续10倍稀释4个梯度后的荧光曲线。曲线19说明无靶(水)的空白对照。
序列表
<110>刘晓光
<120>一种用于扩增短链RNA的引物及其相关方法
<160>6
<210>1
<211>70
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
gyygyygyaa acayccccga cyggaagcyg yaagacacag cyaagcyyyc agycagaygy
yygcygcyac 70
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
ygyaaacayc cccgacygga ag 22
<210>3
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gtcgtatcca gaggtcatcg aggtgctcgt agtcggagcg tccctgcgag gctatgacct
ctggatacga ccttccagt 79
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tcagcttgta aacatccccg actgg 25
<210>5
<211>23
<212>DNA
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<400>5
ccagaggtca tcgaggtgct cgt 23
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cggagcgtcc ctgcgaggct 20
Claims (10)
1.一种用于扩增短链RNA的引物，其引物共4条，分别为茎环反转录引物、特异性正向引物、通用反向引物和通用探针，其特征是：茎环反转录引物由5段不同长度的寡核苷酸组成，3`端的6-8bp组成第一区域与靶miR的3`端形成特异性互补，决定转录的特异性，第二区域（2）和第五区域（5）互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2-5℃，在反转录的过程中始终保持双链形式，靠近核苷酸环状结构5`端的第四区域（4）设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于3-10℃，靠近核苷酸环状结构3`端的第三区域（3）设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10℃，第三区域（3）与第四区域（4）之间应至少间隔3bp以上。
2.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的茎环反转录引物，其3`端和5`端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，并且3`端还有一段6-8个核苷酸的单链结构，该单链与成熟的靶miR特异性互补配对。
3.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5℃。
4.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的特异性正向引物，其Tm值小于通用探针和通用反向引物Tm值3-10℃。
5.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的通用反向引物，其序列与茎环反转录引物的通用反向引物区序列一致。
6.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于：所述的通用探针，其序列与茎环反转录引物的通用探针区序列一致。
7.一种采用权利1-6的任意一种引物扩增短链RNA的方法，其特征在于：
茎环反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miR的3`端特异性结合，并反转录成cDNA第一链；
特异性正向引物由3`端的特异性序列（7）和5`端的尾部序列（8）构成，通用反向引物由茎环引物的通用反向引物区序列构成，通用探针由茎环引物的通用探针区序列构成；
经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列（7）的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链（6）的3`端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链（9）；
再变性后，cDNA第二链9与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物和通用探针Tm值时，通用反向引物和通用探针与cDNA第二链（9）配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二链（9）为模板延伸形成cDNA第二链（9）的互补链，同时当延伸到通用探针时，通用探针被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。
8.如权利要求7所述扩增短链RNA的方法，其特征在于所述茎环反转录引物其3`端和5`端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，该互补双链的Tm值应大于反转录最适温度2-5℃。
9.如权利要求7所述扩增短链RNA的方法，其特征在于所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5℃。
10.如权利要求7所述的扩增短链RNA的方法，其特征在于：所述cDNA第二链的合成的退火温度为60-65℃，PCR扩增循环的退火温度为65-70℃。
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