CN104673786A - 一种选择性扩增rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种选择性扩增RNA的方法，属于生物技术和医学领域。方法原则上按需求可以只扩增样本中的RNA，不扩增DNA。整个操作过程完全可以在同一个试管内进行，通过cDNA合成探针和cDNA扩增探针的相似率设计调整，扩增反应是可以在不同的恒温下进行，属于线性扩增原理，扩增的产物是cDNA(单链或双链)，可直接用于PCR，定量PCR或各种芯片的基因分析。由于使用的RNA样本量少，扩增效率高，大大地减少了样本中的DNA对基因表达结果分析的影响，是小量RNA样本或少量细胞甚至单细胞的基因功能分析和细胞鉴定的好方法。

Description

一种选择性扩增RNA的方法

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种选择性扩增RNA的方法。

背景技术

在分析基因表达时，常规方法抽提RNA的样本，经常会遇到如何排除DNA干扰和污染的问题。通常会使用DNA酶处理，以保证RNA检测结果的真实性。大量的RNA样本还可以忍耐由于DNA酶处理所造成的样本损失，但是小量的RNA，单细胞的RNA样本分析则不是有效方法。珍贵的小量RNA或单细胞RNA，需要做多种基因表达分析时，通常需要对样本做基因扩增。扩增RNA的方法通常有以T7为基础的cRNA扩增和DNA多聚酶反应(PCR等)为基础的DNA扩增，但从原理上不能解决DNA的干扰或污染问题。一些利用DNA和RNA杂交探针扩增cDNA的方法，扩增时，DNA结合部分在一定温度下，难以展开，造成很多的非特异性产物。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足，提出一个可靠的选择性扩增RNA，而不扩增DNA的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种选择性扩增RNA的方法，包括以下步骤：

(1)由cDNA合成探针结合到RNA模板上，在有RNA转录酶的条件下，合成第一链cDNA；

(2)在有RNA酶的条件下，对结合的RNA进行切割；

(3)在有DNA合成酶的条件下，合成第二链cDNA；

(4)在RNA转录酶存在的条件下，合成cDNA合成探针中RNA部分的cDNA；

(5)在RNA酶存在的条件下，酶切结合的cDNA合成探针的RNA部分；

(6)在cDNA扩增探针存在的条件下，cDNA扩增探针结合到空出的部位，在DNA合成酶(DNAPolymerase)的作用下,扩增cDNA产物；

(7)通过改变cDNA扩增探针和cDNA合成探针的核苷酸的相同序列程度，可调式cDNA扩增的温度条件。

进一步地，所述cDNA合成探针是一种由DNA和RNA片段连成的杂交探针，定位性或随机性结合的探针。

更进一步地，所述cDNA合成探针的DNA部分是和要扩增的RNA有配对结合的，其RNA部分原则上是整个RNA样本中没有完全一样的，序列结构特殊；

所述cDNA合成探针的DNA部分是用来合成RNA的第一和第二cDNA链，其RNA部分是为了在合成的第二cDNA链上带有该RNA配对结构的cDNA，作为cDNA扩增的结合点和启动点。

优选地，为达到高效、全面扩增RNA的目的，需要连续合成第一和第二cDNA链，以提高探针模板的合成效率。

进一步地，所述cDNA扩增探针也是一种DNA和RNA片段连成的杂交探针，而且cDNA扩增探针和由cDNA合成探针可有一个碱基或多个碱基不配对。

优选地，所述要扩增的RNA样本可以为RNA样本、多细胞或者为单个细胞。

优选地，如果为RNA样本，可以调制在蒸馏水或缓冲液中；如果是多细胞或者单细胞，则可以调制在细胞裂解液或缓冲液中。

进一步地，如果为RNA样本，还包括定量小样本的RNA或裂解细胞处理，合成第一cDNA链、合成第二cDNA链以及扩增cDNA步骤。

优选地，所述该扩增法是线性扩增，扩增后的产物是cDNA，扩增的产物可以直接用于PCR，定量PCR或各种基因芯片分析。

进一步地，所述该扩增法可以扩增样本中所有的、不同大小的RNA，或者设计定位的扩增探针，扩增所需要扩增的RNA。

cDNA扩增中使用cDNA合成探针，RNaseH,cDNA扩增探针，DNA链分离合成酶相配合，而达到高效扩增的目的。cDNA扩增还包括使用单链DNA结合蛋白质结合扩增后的cDNA产物，使cDNA扩增反应有效地、长时间地进行。

本方法的原理为：其核心是要在合成第一链和第二链cDNA以及在扩增所合成的cDNA时，选择性地扩增由RNA由来的产物，而不是由样本中的DNA由来的产物。该方法选择性扩增RNA的原理，如传统的cDNA合成法和扩增法明显不同之处有三点点。第一点是，利用DNA和RNA杂交cDNA合成探针，保证了只有RNA由来的样本，才能合成cDNA合成探针中的RNA部分的cDNA模板，作为cDNA扩增的起点(T7扩增法用的是DNA探针)；第二点是，每次新扩增都需要RNase酶切，腾出位子让新的cDNA扩增探针结合，扩增产物特异性强，并且可在恒温下(当然也可以在变化的温度下，只是恒温更理想)，不断地扩增，扩增的产物是cDNA(T7扩增法的产物是cRNA)，可以直接用于PCR、定量PCR或各种基因芯片的多基因分析、检测和定量基因表达水平。第三点是，由于cDNA扩增探针的特殊设计结构，其和合成模板的结合温度是按酶反应要求进行设计调节的。本方法扩增RNA可达百万级以上，所以即使原来有存在于样本中的微量DNA，因为不能扩增，在最终的基因表达分析上，基本没有影响。所以该方法既可以用在小量的RNA样本上，也可以用在单细胞水平的基因表达分析上。

本发明方法所采用的技术方案，概括起来为：1.使用的生物样本可以是小量的RNA样本或少数甚至单个细胞，使用或不使用细胞裂解处理。2.用特殊设计的DNA和RNA结构组成的cDNA合成探针合成cDNA的第一和第二链，特别是让第一cDNA链中含有cDNA合成探针结构中的RNA部分的cDNA。3.在有cDNA扩增探针、RNA酶和DNA合成酶存在的条件下，高效率地扩增cDNA产物。

本发明的有益效果是：

(1)可以对小量的RNA样本或少量细胞甚至是单细胞的RNA作选择性的高效率扩增。

(2)扩增的产物是cDNA，结构稳定，可直接用于PCR，定量PCR或各种芯片杂交分析。

(3)扩增可以在恒温条件下进行，容易操作。

(4)该方法属于线性的扩增，适用于作基因定量分析。

(5)扩增产物可以是单链的DNA或最终产物为双链，可供芯片杂交使用或PCR使用。

(6)操作方法和过程简单，对仪器、设备要求较低。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的一种选择性扩增RNA方法的原理图；

图2为本发明实施例2和3提供的多个基因获得较均等的高效率扩增以后的比较图。

具体实施方式

实施例1

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

一种选择性扩增RNA的方法，其原理图参照图1。该方法包括以下步骤：

(1)由cDNA合成探针结合到RNA模板上，在有RNA转录酶的条件下，合成第一链cDNA；

(2)在有RNA酶的条件下，对结合的RNA进行切割；

(3)在有DNA合成酶的条件下，合成第二链cDNA；

(4)在RNA转录酶存在的条件下，合成cDNA合成探针中RNA部分的cDNA；

(5)在RNA酶存在的条件下，酶切结合的cDNA合成探针的RNA部分；

(6)在cDNA扩增探针存在的条件下，cDNA扩增探针结合到空出的相当于cDNA合成探针的RNA部位，在DNA合成酶(DNA Polymerase)的作用下,扩增cDNA产物。结合到cDNA模板上的cDNA扩增探针的RNA部分又被RNA酶切割，新的cDNA合成探针又会结合到cDNA模板上，在DNA合成酶的作用下，合成新的cDNA产物。由此重复、不断地扩增cDNA。

cDNA合成探针是一种由DNA和RNA片段连成的杂交探针，定位性或随机性结合的探针。cDNA合成探针的DNA部分是和要扩增的RNA有配对结合的，其RNA部分原则上是整个RNA样本中没有完全相同的，序列结构特殊；cDNA合成探针的DNA部分是用来合成RNA的第一和第二cDNA链，其RNA部分是为了在合成的第二cDNA链上带有该RNA配对结构的cDNA，作为cDNA扩增的结合点和启动点。

为达到扩增RNA的目的，需要连续合成第一和第二cDNA链。

cDNA扩增探针是一种DNA和RNA片段连成的杂交探针。

扩增RNA的样本可以为RNA样本、多细胞或者为单个细胞。如果为RNA样本，可以调制在蒸馏水或缓冲液中；如果是多细胞或者单细胞，则可以调制在细胞裂解液或缓冲液中。如果为RNA样本，还包括定量小样本的RNA或裂解细胞处理，合成第一cDNA链、合成第二cDNA链以及扩增cDNA步骤。

该扩增法是线性扩增，扩增后的产物是cDNA，扩增的产物可以直接用于PCR，定量PCR或各种基因芯片分析。

实施例2

由RNA样本选择性地扩增RNA：

取所需RNA样本，调制在2.5微升放入0.2毫升的PCR试管内；加入1微升的cDNA合成探针，混合，离心后，放在PCR仪上，65度处理5分钟，然后放到冰上降温处理1分钟以上。

加入6.5微升第一链cDNA合成混合液(包括合成缓冲液，dNTP，RNaseInhibitor和RNA转录酶)，混合，离心后，于48度处理60分钟，然后于70度，处理15分钟。然后放置在冰上。

加入10微升的第二链cDNA合成混合液(包括DNA合成酶，RNaseH酶,Klenow Exo-等)。混合，离心后，于37度，处理30分钟。

加入20微升cDNA扩增混合液(包括cDNA扩增探针，RNaseH酶，DNA多聚酶，单链DNA结合体等)，混合，离心后，于50度，处理30分钟。

于80度处理5分钟，作基因分析用，或加EDTA后，保存备用。

实施例3

由单细胞直接选择性扩增RNA：

将细胞控制在1微升的细胞裂解液中。

加入1微升的cDNA合成探针，混合，离心后，放在PCR仪上，65度处理5分钟，然后放到冰上降温处理1分钟以上。

加入3微升第一链cDNA合成混合液(包括合成缓冲液，dNTP，RNaseInhibitor和RNA转录酶)，混合，离心后，于48度处理60分钟，然后于70度，处理15分钟。然后放置在冰上。

加入5微升的第二链cDNA合成混合液(包括DNA合成酶，RNaseH酶,Klenow Exo-等)。混合，离心后，于37度，处理30分钟。

加入10微升cDNA扩增混合液(包括cDNA扩增探针，RNaseH酶，DNA多聚酶，单链DNA结合体等)，混合，离心后，于50度，处理30分钟。

于80度处理5分钟，作基因表达分析用，或加EDTA后，保存备用。

从图2中可以看出，不管是利用RNA样本选择性地扩增RNA或者是由单细胞直接选择性扩增RNA，均达到了高效的扩增，扩增的产物机构稳定。

本发明的房可以对小量的RNA样本或少量细胞甚至是单细胞的RNA作选择性的高效率扩增。扩增的产物是cDNA，结构稳定，可直接用于PCR，定量PCR或各种芯片分析。扩增可以在恒温条件下进行，容易操作。该方法属于线性的扩增，更适用于作基因定量分析。扩增产物可以是单链的DNA或在最后制成双链，可以芯片杂交使用或PCR使用而选择。操作方法和过程简单。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种选择性扩增RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)由cDNA合成探针结合到RNA模板上，在有RNA转录酶的条件下，合成第一链cDNA；

(2)在有RNA酶的条件下，对结合的RNA进行切割；

(3)在有DNA合成酶的条件下，合成第二链cDNA；

(4)在RNA转录酶存在的条件下，合成cDNA合成探针中RNA部分的cDNA；

(5)在RNA酶存在的条件下，酶切结合的cDNA合成探针的RNA部分；

(6)在cDNA扩增探针存在的条件下，cDNA扩增探针结合到空出的部位，在DNA合成酶(DNAPolymerase)的作用下,扩增cDNA产物；

(7)通过改变cDNA扩增探针和cDNA合成探针的核苷酸的相同序列程度，可调式cDNA扩增的温度条件。

2.根据权利要求1所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，所述cDNA合成探针是一种由DNA和RNA片段连成的杂交探针，定位性或随机性结合的探针。

3.据权利要求2所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，所述cDNA合成探针的DNA部分是和要扩增的RNA有配对结合的，其RNA部分原则上是整个RNA样本中没有完全一样的，序列结构特殊；

所述cDNA合成探针的DNA部分是用来合成RNA的第一和第二cDNA链，其RNA部分是为了在合成的第二cDNA链上带有该RNA配对结构的cDNA，作为cDNA扩增的结合点和启动点。

4.据权利要求3所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，为达到高效、全面扩增RNA的目的，需要连续合成第一和第二cDNA链，以提高探针模板的合成效率。

5.根据权利要求1所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，所述cDNA扩增探针也是一种DNA和RNA片段连成的杂交探针，而且cDNA扩增探针和由cDNA合成探针可有一个碱基或多个碱基不配对。

6.根据权利要求1所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，所述要扩增的RNA样本可以为RNA样本、多细胞或者为单个细胞。

7.根据权利要求6所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，如果为RNA样本，可以调制在蒸馏水或缓冲液中；如果是多细胞或者单细胞，则可以调制在细胞裂解液或缓冲液中。

8.根据权利要求7所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，如果为RNA样本，还包括定量小样本的RNA或裂解细胞处理，合成第一cDNA链、合成第二cDNA链以及扩增cDNA步骤。

9.根据权利要求1所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，所述该扩增法是线性扩增，扩增后的产物是cDNA，扩增的产物可以直接用于PCR，定量PCR或各种基因芯片分析。

10.根据权利要求1所述的选择性扩增RNA的方法，其特征在于，所述该扩增法可以扩增样本中所有的、不同大小的RNA，或者设计定位的扩增探针，扩增所需要扩增的RNA。