CN104404142A - 一种用于荧光定量pcr反应的荧光探针 - Google Patents

一种用于荧光定量pcr反应的荧光探针 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针。其特征在于所述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5’端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并修饰荧光基团，3’端为一段与5’序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团。在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放的荧光信号。所述的探针与一般荧光单针相比，特异性高，灵敏度高，荧光淬灭效率低，因此反应的信噪比更高，可应用于实时荧光定量PCR检测反应以及所有终点荧光检测反应。

Description

一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针
技术领域
本发明涉及一种寡核苷酸荧光探针，更确切地说涉及一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，所述的探针可以应用于实时荧光定量PCR反应检测等，属于生物技术领域。
背景技术
荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR，qPCR)作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。
早期的实时PCR核酸检测技术使用荧光染料指示PCR反应产物的累积过程，例如SYBR GREEN，EVE GREEN等。染料法简单，成本低，无需设计特殊的探针，然而由于其是通过识别双链DNA的量来表征PCR产物的积累，所以，无法区分非特异扩增或引物二聚体引起的非特扩增，在实际应用中还是受到了很大的限制。
随后，人们开始应用荧光基团标记的寡核苷酸片段特异性识别并指示PCR扩增产物，例如TaqMAN探针、分子信标、荧光共振能量转移探针(相邻探针)、蝎型探针(scorpions)等。与靶分子特异性结合的TaqMAN探针会在PCR扩增过程中通过Taq DNA聚合酶的5’外切酶的作用切除5’末端的荧光分子使之游离，从而释放荧光信号，被破坏的探针无法可逆恢复，因此TaqMAN探针虽然拥有更大的信号放大作用，检测的灵敏度更高；但是由于荧光基团和淬灭基团距离较远，荧光淬灭不完整，荧光本底较高。分子信标相反，荧光分子与淬灭分子毗邻，距离较近，荧光淬灭完整，因此荧光本底较低；但是分子信标在PCR反应过程中不被破坏，因此信号放大作用仅仅依靠PCR产物累积，检测的灵敏度较低。蝎行探针类似于分子信标，其缺点也是信号放大能力较TaqMan探针逊色。
本发明拟公开一种新型的用于荧光定量PCR反应的荧光探针。所述的探针结合分子信标与TaqMAN探针的双重优势，一方面克服TaqMan探针荧光本底高的缺陷，另一方面又克服分子信标信号放大能力差的问题，与一般荧光探针相比，荧光本底低，检测特异性高，灵敏度高，可应用于实时荧光定量PCR反应及荧光终点检测PCR技术，所以既克服了现有技术存在的缺陷又具有很高的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于构建一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，命名为TLoop。所述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5’端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并在5’端修饰荧光基团，3’端为一段与5’序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团。在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放的荧光信号。在PCR反应复性温度条件下，5’端序列优先与靶序列结合，5’端荧光报告基团在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶作用下断裂下来，并释放出荧光信号。
所述的“一定条件”指PCR反应或杂交反应过程中所需要的一定的缓冲条件、离子强度和表面活性剂浓度等条件。
所述探针5’端靶序列结合序列特征，包括Tm值与一般TaqMan探针相同，所述的探针使用的核苷酸为DNA、RNA或辅以适当的LNA修饰，3’端反向互补回文结构序列根据5’端序列的GC含量的不同设计为5-12个碱基(核苷),7-9个碱基对最优。
所述探针所形成的分子内发夹结构，其5’端(荧光报告基团修饰端)突出0-5个碱基(核苷)，以利于与靶序列的快速结合且大限度的淬灭荧光信号。3-5个碱基为最佳。
针对荧光修饰，理论上，所有存在荧光共振转移作用的荧光基团-淬灭基团对(荧光基团及其对应的淬灭基团)都可以用在探针修饰上，荧光基团最常用的比如FAM(carboxy-fluorescein，羧基荧光素)、TET(Tetrachlorofluorescein，四氯-6-羧基荧光素)、HEX(Hexachloro fluorescein，六氯-6-甲基荧光素)、VIC、5-TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明)、ROX(X-rhodamine，罗丹明X)、Texas Red-X(德克萨斯红)、cy3(Indodicarbocyanine 3，吲哚菁类染料3)、cy5(Indodicarbocyanine 5，吲哚菁类染料5)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)等；荧光淬灭基团最常用的比如BHQ(Black Hole Quencher)系列，Dabcyl(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)、Eclipse等。
本发明的探针所使用的核苷酸可以是DNA，RNA，并辅以适当的LNA修饰。但是5’端第一个碱基(修饰荧光基团)必须可以被Taq DNA聚合酶的5’外切酶剪切，因此，类似于PNA这样的非自然核苷一定不能用于探针的5’端第一个碱基。
在荧光定量PCR反应过程中，存在PCR反应的变性、复性和延伸三个温度阶段，在变性阶段时，探针颈环结构解离，复性过程中，当体系中含有匹配模板时，探针环状结构区域与模板结合，使探针的颈环结构无法恢复，探针5’端与模板完全结合，在PCR延伸过程中，Taq DNA聚合酶通过5’外切酶的作用剪切探针，探针5’端荧光素从探针上解离，彻底释放出荧光信号。若体系中不含目标DNA，复性过程中探针无法与模板结合，探针倾向于颈环结构恢复，荧光信号被淬灭。经过多个循环以后，被剪切下来的荧光素逐步累积，从而达到检测靶DNA的作用(图1)。
在终点法检测的荧光PCR反应中，比如数字PCR技术，反应结束的最后一步温度降低到室温左右，反应中几乎所有未被破坏的完整探针均会形成稳定的颈环结构，荧光信号被高效淬灭，而被剪切的探针无法恢复，游离的荧光基团释放出荧光信号。
本发明所涉及的荧光探针，主要应用于实时荧光定量PCR检测和数字PCR检测等技术平台。用作实时荧光定量PCR检测时，复性温度检测荧光信号，为了让探针维持颈环结构，可在延长茎干区域长度，或者在茎干区域添加LNA核苷，以提高茎干双链区域的Tm值；用于数字PCR平台等终点检测方法时，对探针茎干区域的Tm值要求就没有那么高，5-10个碱基足够了。
与现有的荧光寡核苷酸探针相比，该具有以下先进性：
[1]设计简单：只要选择适宜的区域设计探针即可，无特殊结构，对GC含量无依赖性，
[2]荧光淬灭效率高：荧光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果最大化。
[3]特异性高：颈环结构的存在，只有当靶序列与探针结合力足够大才能解开颈环结构，探针才可以与靶序列发生杂交。
[4]灵敏度高：每个循环被利用的探针会被彻底剪切，因此会在PCR扩增过程中达到指数累积的作用。
附图说明
图1为本发明提供的TLoop探针。
图2为TLoop探针及PCR反应原理图；
图3为基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因L858Q突变。模板浓度分别为A：105copies/μL、B：104copies/μL、C：103copies/μL、D：102copies/μL、E：101copies/μL、F：无菌水；上图为Taq Man探针，下图为TLoop探针。
图4为基于TLoop探针的数字PCR技术检测EGFR基因L858Q突变结果；
A：使用TLoop探针；B：使用TaqMan探针。
具体实施方式
下面用具体的实施例来进一步阐明本发明突出的特点和显著的进步，但本发明决非仅局限于实施例。
实施例1：基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因L858Q突变
1、探针及引物设计与合成
根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序列为5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列为5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR产物长度92bp。TLoop探针TL858序列为5’-FAM-cagcagtttggccgcccacaaactgctg-BHQ1-3’。TaqMan探针TM858序列为5’-FAM-cagcagtttggccgccca-BHQ1-3’。(探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域)
上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成。合成产物用无菌去离子水稀释至终浓度100μM储存。使用时稀释10倍。
2、荧光定量PCR体系的配制
将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10μM，各PCR组分按以下配方配制。DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒。纯化、定量后用TE缓冲液稀释到终浓度分别为105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃ 15s，58℃ 20s，检测FAM荧光信号，共50个循环。
图3是用PCR反应结果。与一般的TaqMan探针相比，扩增曲线很好，检测灵敏度可以达到10个拷贝的核酸，灵敏度高。阴性对照没有起峰，说明探针的特异性优于一般的TaqMan探针。
实施例2：基于颈环探针的数字PCR技术检测EGFR基因L858Q突变
1、芯片制作
通过模塑法制作PDMS芯片。首先将PDMS预聚体与固化剂按照质量比10：1混合，抽真空除气，浇注在预先制备好的硅片模具上，另外在载玻片上薄涂一层相同的PDMS，静置1h，放于65℃热板上预固化30分钟，将浇注于模具上的PDMS剥离，打孔，将有管道面与涂层后的玻璃涂层面贴合在一起，并在进样槽上方加盖一盖玻片。最后将贴合好的PDMS放入85℃的热板上加热10min，使其键合。
2、探针及引物设计与合成
根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序列为5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列为5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR产物长度92bp。TLoop探针TL858序列为5’-FAM-cagcagtttggccgcccacaaactgctg-BHQ1-3’。TaqMan探针TM858序列为5’-FAM-cagcagtttggccgccca-BHQ1-3’。(探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域)
上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成。合成产物用无菌去离子水稀释至终浓度100μM储存。使用时稀释10倍。
3、荧光定量PCR体系的配制
将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10μM，各PCR组分按以下配方配制。DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒，浓度103copies/μL。
4、进样
首先制备PCR预混液，在样品进样口注入PCR预混液，油进样口注入含乳化剂的液体石蜡(含3％Abil EM90)，将注射器置于泵上，利用负压泵的抽吸作用，PCR预混液及石蜡油由进样口朝出样口方向流动，在芯片十字交叉结构处PCR预混液在两侧石蜡油的夹流作用下切割形成纳升级的乳滴聚集在芯片的乳滴收集区，进样结束后用PDMS封闭进样及出样口。
5、PCR反应及数据分析
将该芯片即可放入PCR仪进行在片的原位PCR扩增，PCR循环程序为：95℃ 10min预变性，95℃ 10s，58℃40s循环，共35个循环，最后采用荧光显微镜观察结果，CCD照相，计数荧光信号阳性乳滴(图3).
图4是用数字PCR反应结果，图4A为用TLoop探针的乳滴的阳性信号，图4B为使用TaqMan探针的乳滴的信号。从图上看看出，使用TLoop探针的阳性乳滴信号明显高于一般的TaqMan探针，TLoop探针应用于数字PCR检测，信噪比明显提高，说明探针的特异性优于一般的TaqMan探针，荧光基团的淬灭效果也优于一般的TaqMan探针。

Claims (10)

1.一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，其特征在于所述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5’端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并在5’端修饰荧光基团，3’端为一段与5’序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团，在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放出荧光信号；
所述的探针，命名为TLoop；
所述的一定条件，指PCR反应或杂交反应过程中所需要的缓冲条件、离子强度和表面活性剂浓度。
2.按权利要求1所述的探针，其特征在于在PCR反应复性温度条件下，5’端序列优先与靶序列结合，5’端荧光报告基团在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶作用下断裂下来，并释放出荧光信号。
3.按权利要求1所述的探针，其特征在于所述的探针使用的核苷酸为DNA、RNA或辅以适当的LNA修饰，但5’端第一碱基修饰荧光基团是被TaqDNA聚合酶的5’外切酶剪切。
4.按权利要求1所述的探针，其特征在于5’端靶序列互补片段Tm值高于PCR复性温度2-10℃；3’端反向互补回文结构序列根据5’端序列的Gc含量的不同，设计为5-12个核苷。
5.按权利要求1所述的探针，其特征在于形成的分子内发夹结构，5’端序列突出0-5个碱基。
6.按权利要求1或5所述的探针，其特征在于5’端序列突出3-5个碱基。
7.按权利要求1或4所述的探针，其特征在于3’端反向互补回文结构序列为7-9个碱基。
8.按权利要求1所述的探针，其特征在于：
①针对修饰荧光，所有存在荧光共振转移作用的荧光基团-淬灭基团对都可以用在探针修饰上，所用的荧光基团是FAM、TET、HEX、VIC、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X、cy3、cy5或JOE；荧光淬灭基团最常用的比如BHQ系列，Dabcyl或Eclipse；
②在荧光定量PCR反应过程中，存在PCR反应的变性、复性和延伸三个温度阶段，在变性阶段时，探针颈环结构解离，复性阶段中，当体系中含有匹配模板时，探针环状结构区域与模板结合，使探针的颈环结构无法恢复，探针5’端与模板完全结合，在PCR延伸过程中，Taq DNA聚合酶通过5’外切酶的作用剪切探针，探针5’端荧光素从探针上解离，彻底释放出荧光信号；若体系中不含目标DNA，复性过程中探针无法与模板结合，探针倾向于颈环结构恢复，荧光信号被淬灭；经过多个循环以后，被剪切下来的荧光素逐步累积，从而达到检测靶DNA的作用。
9.权利要求1所述的探针的应用，其特征在于用于实时荧光定量PCR检测和数字PCR技术检测；用作实时荧光定量PCR检测时，复性温度检测荧光信号，为使探针维持颈环结构，在延长茎干区域的长度，或者在茎干区域添加LNA核苷，以提高茎干双链区域的Tm值；用于数字PCR平台终点检测方法时，对探针茎干区域的Tm值只要求5-10个碱基。
10.按权利要求9所述的应用，其特征在于具体步骤是：
A：基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因L858Q突变
1、探针及引物设计与合成
根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序列为5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列为5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR产物长度92bp；TLoop探针TL858序列为5’-FAM--BHQ1-3’；TaqMan探针TM858序列为5’-FAM--BHQ1-3’；其中，探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域；
然后将上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成，合成产物用无菌去离子水稀释至终浓度100μM储存，使用时稀释10倍；
2、荧光定量PCR体系的配制
将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10μM，各PCR组分按以下配方配制，DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒，纯化、定量后用TE缓冲液稀释到终浓度分别为105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照；
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，58℃20s，检测FAM荧光信号，共50个循环；
与一般的TaqMan探针相比，扩增曲线很好，检测灵敏度可以达到10个拷贝的核酸，灵敏度高，阴性对照没有起峰，说明探针的特异性优于一般的TaqMan探针；
B：基于颈环探针的数字PCR技术检测EGFR基因L858Q突变
1、芯片制作
通过模塑法制作PDMS芯片，首先将PDMS预聚体与固化剂按照质量比10：1混合，抽真空除气，浇注在预先制备好的硅片模具上，另外在载玻片上薄涂一层相同的PDMS，静置1h，放于65℃热板上预固化30分钟，将浇注于模具上的PDMS剥离，打孔，将有管道面与涂层后的玻璃涂层面贴合在一起，并在进样槽上方加盖一盖玻片；最后将贴合好的PDMS放入85℃的热板上加热10min，使其键合；
2、探针及引物设计与合成
根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序列为5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列为5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR产物长度92bp；TLoop探针TL858序列为5’-FAM--BHQ1-3’，TaqMan探针TM858序列为5’-FAM--BHQ1-3’，其中，探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域；
然后将上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成，合成产物用无菌去离子水稀释至终浓度100μM储存，使用时稀释10倍；
3、荧光定量PCR体系的配制
将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10μM，各PCR组分按以下配方配制。DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒，浓度103copies/μL；
4、进样
首先制备PCR预混液，在样品进样口注入PCR预混液，油进样口注入含乳化剂的含3％Abil EM90液体石蜡，将注射器置于泵上，利用负压泵的抽吸作用，PCR预混液及石蜡油由进样口朝出样口方向流动，在芯片十字交叉结构处PCR预混液在两侧石蜡油的夹流作用下切割形成纳升级的乳滴聚集在芯片的乳滴收集区，进样结束后用PDMS封闭进样及出样口；
5、PCR反应及数据分析
将该芯片即可放入PCR仪进行在片的原位PCR扩增，PCR循环程序为：95℃10min预变性，95℃10s，58℃40s循环，共35个循环，最后采用荧光显微镜观察结果，CCD照相，计数荧光信号阳性乳滴。
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