CN112794878A - 去泛素化酶活性探针及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去泛素化酶活性探针及其制备和应用。具体地，本发明提供了如式Ia或式Ib所示的探针，FL‑Wa‑L1‑(Arg‑Leu‑Arg‑Gly‑Gly)‑L2‑Wb‑FQ(Ia)，FQ‑Wa‑L1‑(Arg‑Leu‑Arg‑Gly‑Gly)‑L2‑Wb‑FL(Ib)。本发明的探针能够表征多种去泛素化酶的活性并用于去泛素化酶抑制剂的高通量筛选。
Description
技术领域
本发明属于探针领域，具体涉及一种去泛素化酶活性探针及其制备和应用。
背景技术
蛋白质的泛素化过程在调节许多细胞功能(例如蛋白质降解，DNA修复和细胞信号转导)中起着关键作用。这些过程的失调会导致诸如炎症性疾病，神经退行性疾病或癌症等病理状况，因此严格调控泛素系统至关重要。E3泛素连接酶的泛素化作用可以通过去泛素化酶(DUBs)的活性来抵消。人类细胞含有约100个DUB，它们分属六个家族，其中五个家族，即卵巢肿瘤蛋白酶(OTU)，泛素特异性蛋白酶(USPs)，泛素C末端水解酶(UCH)，约瑟芬域蛋白酶(MJD家族)以及含MIU结构域的新型DUB家族蛋白酶(MINDY)属于半胱氨酸蛋白酶，而JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族成员则是锌依赖性金属蛋白酶。不同的去泛素化酶具有不同的底物特异性和泛素链特异性。特定去泛素化酶中的突变与神经退行性疾病，慢性炎症，自身免疫，传染病和癌症有关。
相较于泛素蛋白酶体系，去泛素化酶的研究方兴未艾。目前，已有报道指出USP4，USP6，USP8，USP14，USP28和UCHL5在癌症的发展进程中占据主导作用。特别的，USP14被认为与卵巢癌和结肠癌有紧密关系。对不同卵巢癌细胞进行基因筛查发现存在USP14的异常，同时另一项研究发现结肠癌病人中的USP14的高表达与病理阶段和淋巴结的转移呈正相关。因此抑制能稳定癌蛋白(oncoprotein)的DUBs以及激活充当肿瘤抑制物(tumorsuppressor)的DUBs可能是一种有前途的治疗策略。比如，通过敲低USP8可以降低细胞内EGFR酪氨酸激酶的活性，从而抑制吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的增殖；而在MM细胞中USP14和UCHL5都存在高表达，这两个去泛素化酶都与蛋白酶体的19s调节亚基可逆结合，通过siRNA敲低它们会使得MM的细胞增殖受到影响。这些发现促使了各种去泛素化酶抑制剂的研究。S.Linder课题组于2011年报道了一个USP14/UCHL5双重抑制剂b-AP15。b-AP15能高效地抑制多发性骨髓瘤细胞株中的USP14，以及泛素链的剪切，进而抑制肿瘤细胞生长，因此，其类似物VLX1570已进入到临床研究当中。而USP7作为稳定癌症治疗靶蛋白MDM2的去泛素化酶，也吸引了多家药企研制其抑制剂，并已有数个特异性抑制剂处于临床前验证阶段。另一类特殊的泛素链——线性泛素链(M1)被认为在NF-kB细胞通路中发挥着重要作用。与线性泛素链相关的去泛素化酶已知的有CYLD，A20和OTULIN，他们都可以负调控NF-kB通路，从而抑制炎症反应的发生。
当前，去泛素化酶活性的表征，以及去泛素化酶抑制剂的体外活性测试主要基于两种人工合成修饰的去泛素酶底物——基于单个泛素分子设计的Ub-AMC和Ub-Rho110。许多已报道的去泛素化酶抑制剂，如USP14的抑制剂IU1、USP8的抑制剂HY50737都是基于Ub-AMC水解试验筛选得到。但是由于这类探针某些去泛素化酶不能对其水解，使得其适用范围受到限制；同时，这类化学合成的生物大分子探针成本高昂，例如，需要对预先表达纯化的泛素蛋白进行人工修饰，该修饰步骤合成效率低下，在完成修饰后还需要再次进行蛋白纯化，并且还需要进行蛋白质复性步骤后才能使用，对运输与保存都有特殊要求(需要低温保存)，也限制其在药物发现中的有效应用。现有技术中也有基于双泛素分子，三泛素分子，四泛素分子的分子内荧光淬灭对探针，期望改善探针的灵敏度，但是这类探针分子的生产成本更高，而普适性更低。
综上所述，本领域迫切需要开发一类新的普适性更好、灵敏度高、易合成、成本更低的新型去泛素化酶探针(或底物)。
发明内容
本发明的目的就是提供一类新的普适性更好、灵敏度高、易合成、成本更低的新型去泛素化酶探针(或底物)。
在本发明的第一方面，提供了一种去泛素化酶探针，所述的探针如式Ia或式Ib所示，
FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-Wb-FQ (Ia)
FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-Wb-FL (Ib)
各式中，
FL为荧光基团；
FQ为能够淬灭所述荧光基团的淬灭基团；
L1为无或具有1至15个链原子的二价连接基团；
L2为具有3至15个链原子(较佳地，3至10个；更佳地，4至7个)且一端为-NH-或-O-的二价连接基团，并且L2通过该-NH-或-O-与Gly的C端连接；L2还任选地通过-L3-Wc-连接有额外的基团FQ’，其中，FQ’为能够淬灭所述荧光基团的淬灭基团，和L3为具有3-6个链原子的二价连接基团；
且L1和L2具有的链原子总数≤25；
Wa、Wb和Wc各自独立地选自下组：无、取代或未取代的C1-C6亚烷基、-R’COR”-、-R’CSR”-、-R’SO2R”-、-R’SOR”-、-R’SR”-、-R’OR”-、-R’N(Ra)R”-、-R’N(Ra)COR”-、-R’N(Ra)CSR”-、-R’N(Ra)SO2R”-、-R’N(Ra)SOR”-、-R’CON(Ra)R”-、-R’CSN(Ra)R”-、-R’SO2N(Ra)R”-、-R’SON(Ra)R”-；
R’和R”各自独立地为选自下组的二价基团：无、取代或未取代的C1-C4亚烷基；
Ra选自：H、取代或未取代的C1-C4烷基；
除非特别说明，所述的取代是指基团上一个或多个(较佳地，1、2或3个)氢被选自下组的取代基所取代：C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、卤素、羟基、氰基、-COOR、-C(O)R、-CON(R)2、-OC(O)R、-N(R)2；
R各自独立地选自：H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基。
在另一优选例中，L1和L2具有的链原子总数≤20。
在另一优选例中，L2为具有3至15个链原子(较佳地，3至10个；更佳地，4至7个)且一端为-NH-或-O-的二价连接基团，并且L2通过该-NH-或-O-与Gly的C端连接。
在另一优选例中，FQ’与FQ为相同或不同的淬灭基团；较佳地，FQ’与FQ为相同的淬灭基团。
在另一优选例中，L2包括0、1或2个-L3-Wc-FQ’。
在另一优选例中，L2不包括-L3-Wc-FQ’。
在另一优选例中，L1为无(单键)或者L1为含1、2、3、4或5个(较佳地，含1、2或3个)氨基酸残基的肽链。
在另一优选例中，L1中，所述的氨基酸残基各自独立地选自下组：Leu、Val、Met、His、Thr、Ser、Phe、Ile、Ala、Gly、Tyr、Trp、Asn、Gln。
在另一优选例中，L1为-(A1)m-；其中，m＝0、1、2、3、4、或5(较佳地，m＝0、1、2或3)，A1为氨基酸残基。
在另一优选例中，L1中，A1各自独立地为选自下组的氨基酸残基：Leu、Val、Met、His、Thr、Ser、Phe、Ile、Ala、Gly、Tyr、Trp、Asn、Gln。
在另一优选例中，L1为选自下组的二价连接基团：无、-Leu-、-Val-Leu-、-Leu-Val-Leu-。
在另一优选例中，L2为由选自下组的一个或多个结构单元组成的二价连接基团：氨基酸残基、-C(Rb)2-、-CO-、-CS-、-N(Ra)-、-O-、-S-；
其中，
Rb各自独立地选自下组：H、取代或未取代的C1-C4烷基、-R’CO-L3-Wc-FQ’、-CO-L3-Wc-FQ’；
附加条件是：(i)与同一个碳原子连接的Rb中至多只有一个为-R’CO-L3-Wc-FQ’或-CO-L3-Wc-FQ’；和(ii)各结构单元之间形成的键是稳定的。
在另一优选例中，Rb的定义同Ra的定义。
在另一优选例中，Rb各自独立地选自：H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-R’CON(R)2(较佳地，-CONH2)、-R’COOR(较佳地，-COOR，更佳地，-COOH)。
在另一优选例中，Ra各自独立地选自：H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-R’CON(R)2(较佳地，-CONH2)、-R’COOR(较佳地，-COOR，更佳地，-COOH)。
在另一优选例中，L2由选自下组的一个或多个结构单元组成：氨基酸残基、-C(Ra)2-、-CO-、-CS-、-N(Ra)-、-O-、-S-；
且附加条件是各结构单元之间形成的键是稳定的。
在另一优选例中，L2中，所述氨基酸残基选自下组：Met、Leu、Val、His、Thr、Ser、Phe、Ile、Ala、Gly、Tyr、Trp、Asn、Gln。
在另一优选例中，-L2-为-L2’-L2”-；其中，-L2’-为由1或2个氨基酸残基组成的二价连接基团，且-L2’-与Gly的C端连接：以及L2”为由选自下组的一个或多个结构单元组成的二价连接基团：-C(Ra)2-、-CO-、-CS-、-N(Ra)-、-O-、-S-。
在另一优选例中，L2为-NH-(C(Ra)2)m-NH-或-O-(C(Ra)2)m-NH-；其中，m＝1至13的整数(较佳地，m为1至8的整数；更佳地，m＝2、3、4或5)。
在另一优选例中，L2为-(A2)m1-(C(Ra)2)m2-NH-；其中，A2为氨基酸残基，m1＝1或2，m2＝0至12的整数，且3*m1+m2≤14。
在另一优选例中，-L2’-为-(A2)m1-。
在另一优选例中，-L2”-为-(C(Ra)2)m2-NH-。
在另一优选例中，m1＝1且m2＝1、2、3、4、5、6或7(更佳地，m2＝1、2或3)。
在另一优选例中，A2各自独立地为选自下组的氨基酸残基：Leu、Val、Met、His、Thr、Ser、Phe、Ile、Ala、Gly、Tyr、Trp、Asn、Gln。
在另一优选例中，L2为取代或未取代的选自下组二价基团：
-NH-(CH2)o1-NH-、-NH-(CH2)o2-CH(CONH2)-NH-、-NH-(CH2)o2-CH(COOH)-NH-、-(A2)-(CH2)p1-NH-、-(A2)-(CH2)p2-CH(CONH2)-NH-、-(A2)-(CH2)p2-CH(COOH)-NH-；
其中，o1＝1、2、3、4或5，o2＝0、1、2、3或4；p1＝0、1、2或3，p2＝0、1或2；
所述的取代是指1、2或3个氢被选自下组的取代基所取代：C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、卤素、-COOR、-CON(R)2、-OC(O)R、-N(R)2；
A2为氨基酸残基；
R的定义如前所述。
在另一优选例中，L3由选自下组的一个或多个结构单元组成：氨基酸残基、-C(Ra)2-、-CO-、-CS-、-N(Ra)-、；且附加条件是各结构单元之间形成的键是稳定的。
在另一优选例中，L3为-NH-(CH2)n-NH-；其中，n＝1、2、3或4。
在另一优选例中，Wa和Wb各自独立地选自下组：-R’COR”-、-R’CSR”-、-R’SO2R”-、-R’SOR”-。
在另一优选例中，R’和R”为无。
在另一优选例中，Wa和Wb各自独立地选自下组：-CO-、-CS-、-SO2-、-SO-。在另一优选例中，FQ和FQ’各自独立地选自下组：
在另一优选例中，FL为如式II所示的荧光基团
其中，R1为吸电子基团；R2和R3各自独立地为相同或不同给电子基团。
或者，FL为选自下组的荧光基团：
在另一优选例中，所述的吸电子基团选自下组：-F、-Cl、-CF3、-CN。
在另一优选例中，所述的给电子基团选自下组：OH、-NMe2、-OMe。
在另一优选例中，R1选自下组：-F、-Cl、-CF3、-CN。
在另一优选例中，R2和R3各自独立地选自下组：OH、-NMe2、-OMe。
在另一优选例中，FL选自下组：
在另一优选例中，-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-选自下组：
在另一优选例中，所述探针为选自表B的探针。
在另一优选例中，所述的探针选自：LK-8-94、LK-9-21、LK-9-24、LK-9-32、LK-10-48、LK-10-55、LK-10-59、LK-10-60、LK-10-66、LK-11-26、LK-11-30、LK-11-97、LK-12-18、LK-12-22、LK-12-76、LK-11-47。
在另一优选例中，所述的探针选自：LK-8-94、LK-9-32、LK-10-48、LK-11-97、LK-12-18、LK-12-22、LK-12-76。
在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述的探针的制备方法，所述的制备方法为方法一；
方法一包括步骤：
(i)使片段1与片段2偶联，从而得到如式Ia所示的探针或如式Ib所示的探针；其中，
片段1选自：FL-Wa-RL、FQ-Wa-RL、FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH、FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH；其中，RL为离去基团；
片段2选自：FQ-Wb-L2-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L1-OH、FL-Wb-L2-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L1-OH、FQ-Wb-L2-H、FL-Wb-L2-H；
FL、FQ、L1、L2、Wa、Wb的定义同第一方面中定义。
在另一优选例中，当-L2-为-L2’-L2”-时，所述的制备方法为方法二；且
方法二包括步骤：
(i)使片段1与片段2偶联，从而得到如式Ia所示的探针或如式Ib所示的探针，
其中，
片段1选自：FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2’-OH、FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2’-OH；
片段2选自：FQ-Wb-L2”-H、FL-Wb-L2”-H。
其中，L2’和L2”的定义如前所述。
在另一优选例中，FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH或FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH通过如下方法制备：
使FL-Wa-RL或FQ-Wa-RL与H-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH或固定于树脂上的H-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-O-；
其中，RL为离去基团。
在另一优选例中，RL为
在另一优选例中，在方法一和/或方法二中，在偶联前，片段1和/或片段2上的活性基团(除偶联反应位点以外的活性基团)被保护基团保护。
在另一优选例中，在方法一和/或方法二中，在偶联前，片段1和/或片段2上的氨基(伯胺)(除偶联反应位点以外的氨基(伯胺)被保护基团保护。
在另一优选例中，所述的保护基团为Boc。
在另一优选例中，方法一和/或方法二还包括脱保护基的步骤。
在本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述的组合包括如权利要求1所述的探针。
在本发明的第四方面，提供了一种用于测试去泛素化酶抑制剂活性的试剂盒，所述的试剂盒包括如第一方面所述的探针。
在另一优选例中，所述的试剂和还包括去泛素化酶。
在另一优选例中，所述的去泛素化酶包括：USP家族去泛素化酶、JAMM家族去泛素化酶、UCH家族去泛素化酶、OUT家族去泛素化酶、和/或MJD家族去泛素化酶。
在另一优选例中，所述去泛素化酶选自：USP2、USP14、USP7、USP8、CYLD、A20、AMSH、UCHL-1、OTUB1、OTULIN、和/或ATXN3。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括稀释缓冲液；较佳地，所述稀释缓冲液为基于HEPES的缓冲液。
在另一优选例中，所述的试剂盒还任选地包括DTT(二流苏糖醇)和/或ATP(腺苷三磷酸)。
在本发明的第五方面，提供了如第一方面所述的探针的用途，所述的探针具有下述一个或多个用途：
(i)用于测试待测物对去泛素化酶的体外抑制活性；
(ii)用于筛选去泛素化酶抑制剂；
(iii)用于表征去泛素化酶活性。
在另一优选例中，所述的去泛素化酶包括：USP家族去泛素化酶、JAMM家族去泛素化酶、UCH家族去泛素化酶、OUT家族去泛素化酶、和/或MJD家族去泛素化酶。
在另一优选例中，所述去泛素化酶选自：USP2、USP14、USP7、USP8、CYLD、A20、AMSH、UCHL-1、OTUB1、OTULIN、和/或ATXN3。
在另一优选例中，所述的探针至少能够用于测试对来自JAMM家族和/或OUT家族的去泛素化酶的体外抑制活性。
在另一优选例中，所述的探针至少能够用于筛选来自JAMM家族和/或OUT家族的去泛素化酶抑制剂：OTUB1、OTULIN、和/或AMSH。
在另一优选例中，所述的探针至少能够用于表征来自JAMM家族和/或OUT家族的去泛素化酶的活性：OTUB1、OTULIN、和/或AMSH的抑制剂。
在另一优选例中，所述的探针至少能够用于测试对选自下组的去泛素化酶的体外抑制活性：OTUB1、OTULIN、和/或AMSH。
在另一优选例中，所述的探针至少能够用于筛选选自下组的去泛素化酶抑制剂：OTUB1、OTULIN、和/或AMSH。
在另一优选例中，所述的探针至少能够用于表征选自下组的去泛素化酶的活性：OTUB1、OTULIN、和/或AMSH的抑制剂。
在本发明的第六方面，提供了一种测试待测物对去泛素化酶的抑制活性的方法，包括步骤：
(i)将待测物与所述去泛素化酶一起孵育，得到经孵育的体系；
(ii)将如第一方面所述的探针加入至步骤(i)得到的经孵育的体系，进行第二次孵育，得到经第二次孵育的体系；和
(iii)读取经第二次孵育的体系的荧光强度，基于荧光强度计算待测物活性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明探针原理示意图。
图2-1显示了我OUTB1水解LK-8-94动力学曲线。
图2-2显示了OTUB1与LK-8-94的米氏曲线。
图3-1显示了ML364对USP2的抑制曲线(探针Ub-Rho.110)。
图3-2显示了ML364对USP2的抑制曲线(探针LK-9-32)。
图4-1和图4-2分别显示了用探针LK-10-48筛选OTULIN的抑制剂。
图4-3显示了用本发明的探针测试已知去泛素化酶抑制剂对OTULIN的抑制活性的测试。
图5显示了本发明探针的示意性结构。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入地研究，意外地发现仅保留泛素分子C端5个氨基酸残基的肽链来替代完整的泛素分子、并在多肽链(C端)与淬灭基团(或荧光)采用不同连接方式来模拟泛素分子之间的连接的情况下，亦能被全部或者大多数去泛素化酶识别(结合)并水解，从而提供了一系列基于分子内荧光淬灭对的去泛素化酶底物(或探针)，从而大大降低合成探针所需的肽链的合成步骤。基于此，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，“去泛素化酶探针”和“去泛素酶化活性探针”(有时简称为探针)以及“去泛素化酶底物”(有时简称为底物)可互换使用，是指可被至少一种去泛素化酶水解并可被探测水解情况，从而能够用于测试去泛素化酶活性的一类物质。类似地，“本发明的探针”、“本发明的去泛素化酶探针”、“本发明的去泛素化酶活性探针”和“本发明的去泛素化酶底物”可以互换使用是指如第一方面所述的探针。
除非特别说明，在本文中，各缩写均代表本领域常规含义。
例如，Arg代表精氨酸残基、Leu代表亮氨酸残基、Gly代表甘氨酸残基、Val代表缬氨酸残基、Met代表蛋氨酸残基。
如本文所用，氨基酸或其残基的“C端”是指氨基酸的羧基端或者氨基酸残基的-CO-基团。
如本文所用，“链原子”是指位于二价连接基团主链上的原子；例如对于肽链而言，一般地每个氨基酸残基具有3个链原子。
如本文所用，“卤素”指F、Cl、Br、和I。
如本文所用，“C1-C6烷基”是指包括1-6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、或类似基团。类似地，C1-C4烷基是指包括1-4个碳原子的直链或支链的烷基。
在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被例如下述取代基取代：卤素、未取代或卤代的C1-C4烷基、和/或未取代或卤代的C2-C6酰基等。
如本文所用，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
去泛素化酶探针
为了解决现有技术中针对去泛素化酶探针的不足，本发明提供了一类以泛素分子C端多肽链为骨架(即图5中所示的核心肽链)，基于分子内荧光淬灭对(荧光分子-荧光淬灭分子对)的去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)底物(或探针)，其结构大致如图5所示，其中，例如Linker可为烷基链、取代的烷基链、氨基酸或肽链，或其组合；例如，可延长部分可为无(单键)或者氨基酸或肽链(如-Leu-Val-Leu-)。上述各部分可通过本领域的常规方式连接或常见活性基团之间反应形成化学键，从而连接。应理解图5仅为了更直观地说明本发明所提供的探针结构。
典型地，本发明提供了如式Ia或式Ib所示的探针，
FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-Wb-FQ (Ia)
FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-Wb-FL (Ib)
各式中，各基团定义如第一方面所述。
本发明探针的原理大致如图1所示，本发明探针一端连有荧光基团另一端接有相应的淬灭基团，没有水解的情况下两者距离近，由于分子内的荧光共振能量转移(FRET)，探针荧光信号弱；当加入去泛素化酶后，探针分子被水解，荧光基团与淬灭基团的距离边缘，FRET减弱，荧光信号变强。因此，去泛素化酶的水解酶活性与荧光信号强度在一定范围内线性相关。
制备方法
以下将更具体地描述本发明式Ia和Ib探针的通用制备方法。应当理解，本发明的探针可通过多种方法合成，下述具体方法不对本发明构成任何限制。本发明探针还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便地制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
典型地，式Ia或式Ib化合物可通过下述方法制备：(i)分别合成或提供各片段(如分别合成或提供片段1和片段2，或者分别合成或提供片段1、片段2和片段3)，和(ii)按照本领域常规合成方法或参考后文所述的详细制备方法将使这些片段互相偶联或反应(例如，使片段1和片段3偶联后，再使偶联产物与片段2偶联)从而得到如式Ia或式Ib所示的探针。
例如，片段1可以是市售的或自行合成的含荧光基团化合物(如片段1可以是FL-Wa-RL(其中，RL为离去基团)，例如，片段1可以是7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯)；片段2可以是，例如，包括淬灭基团和肽链-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-的片段，该片段可以通过，例如，以含淬灭基团的化合物(例如，Fmoc-L2-Wb-FQ，如LK-8-89)作为第一个氨基酸通过固相多肽合成的在该含淬灭基团的化合物上合成所需的肽链，再任选地脱保护基从而获得片段2(片段2的具体例子可以是具体实施例中制备的中间体化合物4)。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的探针(底物)能够表征多种去泛素化酶的活性，适用性更广泛。
(b)本发明的探针(底物)能够用于去泛素化酶抑制剂高通量筛选。
(c)本发明的探针(底物)因其所需肽链较短，仅通过常规有机合成方法即可制备从而显著降低了合成成本。
(d)本发明的探针运输和保存的要求低。例如，因本发明的探针并非蛋白制品，因此，可在室温条件下，而无需像现有的探针(如Ub-AMC和Ub-Rho110)那样在低温下保存。
总的来说，本发明的探针在现有的去泛素化酶活性探针基础上，能够进一步扩展所适用去泛素化酶的范围，从而克服了现有去泛素酶活性检测手段的局限性，同时大幅降低体外测试去泛素化酶活性的测试成本，从而十分适于应用于新型去泛素化酶抑制剂和临床候选药物的研制当中。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
探针的制备
Fmoc固相多肽合成，
方法1：使用Biotage多肽合成仪进行多肽的自动合成，取适量的Rink amide树脂(载荷0.64mol/g)于多肽合成管内，加入二氯甲烷溶胀2h，滤除溶剂后进行多肽合成。分别称取Fmoc(笏甲氧羰基)保护的氨基酸(4倍当量)，HATU(4倍当量)，DIEA(4倍当量)于不同的多肽反应管中，加入DMF使之溶解，浓度均为0.5mmol/L。首先使用20％哌啶/DMF溶液脱去Rink amide树脂的Fmoc保护基，反应时间20分钟。反应结束后用DMF溶剂洗涤，之后进行多肽合成，反应温度为75℃，反应时间为5分钟，当含有精氨酸时，反应温度为50℃，反应时间为15分钟。每一步反应均用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护基，DMF洗涤。当序列的最后一个氨基酸脱除Fmoc保护基之后，使氨基酸序列与7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯(3倍当量)进行反应，使体系分散在超干的DMF中，加入DIEA(3倍当量)，DMAP(0.2倍当量)，室温条件下反应5h。反应结束后，用二氯甲烷，DMF溶液洗涤多肽，滤除反应液。之后进行切割树脂，将树脂连接的多肽在95％三氟乙酸：5％苯甲醚溶液中反应3h，反应结束后，过滤除去树脂，用DCM，DMF洗涤3次，浓缩滤液，经过反相柱分离产物，再使用HPLC进一步纯化得到目标产物。
方法2
使用Biotage多肽合成仪进行多肽的自动合成，取适量的Wang树脂(载荷1.2mol/g)于多肽合成管内，加入二氯甲烷溶胀2h，滤除溶剂后进行多肽合成。当第一个氨基酸与Wang树脂进行偶联时，使用条件为HOBT(4.0倍当量)，DCC(4.0倍当量)，DMAP(2.0倍当量)，氨基酸(4.0倍当量)，使反应物溶解在DMF中，浓度均为0.5mmol，在50℃条件下反应30分钟，之后化合物在20％的哌啶/DMF溶液反应20分钟，脱去Fmoc保护基，经过DMF洗涤后进行下一步的偶联。后续的氨基酸偶联所用条件为Fmoc保护氨基酸(4倍当量)，HATU(4倍当量)，DIEA(4倍当量)，将反应物溶解在DMF中，浓度均为0.5mmol，反应温度为75℃，反应时间5分钟，当含有精氨酸时，反应温度为50℃，反应时间为15分钟。每一步反应均用20％哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护基，DMF洗涤。最后一个氨基酸脱去保护基后经过DMF洗涤，可得到带有Wang树脂的氨基酸序列用于后续的反应。
实施例1化合物LK-8-89的合成路线
(1.1)化合物N6-(9-芴甲氧羰基)-L-赖氨酸(2)的合成。
取原料1(市售)(6.2g,13.2mmol)于200mL圆底烧瓶中，加入100mL二氯甲烷使之溶解，再将10mL的三氟乙酸滴加入反应液中，搅拌均匀，室温过夜。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，浓缩反应液，反相柱层析分离(水：乙腈＝0-70％)，得白色固体产物2(4.37g，11.88mmol)，产率90％。
(1.2)化合物(E)-N6-(9-芴甲氧羰基)-N2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰基)-L-赖氨酸(LK-8-89)的合成。
在50mL的圆底烧瓶中加入化合物2(1.47g，4mmol)，化合物3(1.76g，4.8mmol)，DMAP(97mg，0.8mmol)，加入溶剂超干的二氯甲烷20mL，搅拌均匀，再加入DIPEA(1.65mL，10mmol)，室温反应8h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，加水稀释，乙酸乙酯萃取(30mL*3)，有机相用饱和氯化钠洗涤，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，用硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，得到红色固体产物LK-8-89(1.61g，2.6mmol)，产率65％。
实施例2化合物LK-8-94的合成
化合物(S,E)-N-(1-氨基-6-((7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)-1-氧代己基-2-基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(LK-8-94)的合成。
使用方法1中的SPSS，以化合物LK-8-89作为第一个多肽合成的氨基酸，依次与甘氨酸，甘氨酸，侧链为Boc保护基的精氨酸，亮氨酸，侧链为Boc保护基的精氨酸连接可得到化合物4。取化合物4(67mg，0.05mmol)于8mL的耐压反应瓶中，加入7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯(45mg，0.15mmol)，DIEA(25μL，0.15mmol)，DMAP(1.3mg，0.01mmol)，再加入1.5mL超干的DMF溶剂，室温条件下反应5h。反应结束后加入二氯甲烷稀释反应液，过滤，用二氯甲烷：DMF＝1:1的混合溶剂洗涤滤饼三次，收集滤饼，油泵抽干得到粗品化合物5进行下一步。在15mL的耐压反应瓶中加入化合物5，再加入4.75mL三氟乙酸，0.25mL的苯甲醚，室温条件下反应3h，反应结束后，加二氯甲烷稀释体系，过滤除去树脂，用二氯甲烷洗涤三次，收集滤液，浓缩，先用反相色谱柱进行初步分离纯化(水：乙腈＝0-70％)，收集产物后，再经过HPLC(水：乙腈＝10-60％)进行进一步纯化，冻干机冻干后得到红色固体产物LK-8-94(18mg，0.016mmol)，两步产率为32％。
以类似实施例2的方法合成化合物LK-9-21，LK-9-24，LK-9-32。
实施例3化合物LK-9-36的合成
化合物(S,E)-N-(1,6-二氨基-1-氧代己烷-2-基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(LK-9-36)的合成。
以化合物LK-8-89作为第一个氨基酸与Rink amide树脂进行连接，使用多肽合成方法1，可以得到化合物6，再经过20％的哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护基可以得到化合物7。取带有树脂的化合物7(100mg，树脂约70mg)于8mL的耐压反应瓶中，加入4.75mL的三氟乙酸，0.25mL的苯甲醚，室温反应3h。反应结束后，加入二氯甲烷稀释体系，过滤除去树脂，用二氯甲烷洗涤三次，收集滤液，浓缩，用反相色谱柱进行初步分离纯化(水：乙腈＝0-80％)，收集产物后，再经过HPLC(水：乙腈＝10-60％)进行进一步纯化，冻干机冻干后得到化合物LK-9-36(16mg)。
实施例4化合物MC-10-45的合成
化合物(7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-甘氨酰-甘氨酸(MC-10-45)的合成。
使用方法2，以甘氨酸作为第一个与Wang树脂相连的氨基酸，经过与甘氨酸，精氨酸，亮氨酸的偶联可以得到中间体化合物8。
在8mL的耐压反应瓶中加入化合物8(106mg，0.11mmol)，化合物7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯(99mg，0.33mmol)，DMAP(2.6mg，0.22mmol)，再加入1.5mL的DMF，搅拌均匀后，加入DIEA(54.6μL，0.33mmol)，室温条件下反应6h。反应结束后加入二氯甲烷稀释体系，过滤除去剩余的反应物，用二氯甲烷：DMF＝1:1的混合溶剂反复洗涤滤饼三次，收集滤饼，油泵抽干后得到化合物9。
在8mL的耐压反应瓶中加入化合物9，再加入4.75mL的三氟乙酸，0.25mL的苯甲醚，室温反应3h。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，过滤除去树脂，用二氯甲烷反复洗涤三次，收集滤液，用旋转蒸发仪除去溶剂，经反相色谱柱进行初步分离纯化(水：乙腈＝0-70％)，收集产物后，再经过HPLC(水：乙腈＝10-60％)进行进一步纯化，冻干后得到化合物MC-10-45(15mg，0.02mmol)，两步产率18％。
实施例5化合物11的合成路线
(1)化合物(E)-(2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(10)的合成。
在100mL的圆底烧瓶中加入化合物3(2978g，8.14mmol)，化合物1-BOC-乙二胺(1956g，12.20mmol)，再加入30mL的二氯甲烷，搅拌均匀后向体系中滴加入DIPEA(2.69mL，16.28mmol)，室温条件下，反应5h。反应结束后，浓缩反应液，加水稀释体系，乙酸乙酯萃取(30ml*3)，有机相用饱和食盐水洗涤后，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20：1)，得到红色固体产物10(3010g，7.32mmol)，产率为90％。
(2)化合物(E)-N-(2-氨基乙基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(11)的合成
取化合物10(2000g，4.86mmol)于50mL的圆底烧瓶中，加入25mL二氯甲烷使之溶解，搅拌均匀后，向反应体系中滴加3mL的三氟乙酸，室温反应过夜。反应结束后，用旋转蒸发仪除去反应液，加入乙酸乙酯使之溶解，加入饱和碳酸氢钠调节PH至弱碱性，乙酸乙酯萃取(30mL*3)，有机相经过饱和食盐水洗涤，合并有机相经过无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：2M氨甲醇＝10：1)，得到红色固体产物10(1280g，4.13mmol)，产率为85％。
实施例6化合物LK-10-48的合成路线
化合物(E)-N-(2-((7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰-L-蛋氨酰氨基)乙基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(LK-10-48)的合成
以Fmoc-Met-OH为第一个氨基酸与Wang树脂进行连接，经过方法2以及化合物MC-10-45相似的合成路线可以得到中间体化合物12。
在8mL的耐压反应瓶中加入化合物12(35mg，0.04mmol)，化合物11(24.85mg，0.079mmol)，HATU(30.42mg，0.080mmol)，DMAP(0.016，0.016)，加入溶剂DMF2mL，搅拌均匀后，加入DIEA(20μL，0.12mmol)，室温条件下反应过夜，反应结束后，直接经HPLC分离纯化，收集产物冻干后得到化合物LK-10-48(5mg，4.2μmol)，产率为11％。
实施例7化合物2,5-二氧杂吡咯烷-1-基-3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-占吨]-5-羧酸酯(14)的合成
在15mL的耐压反应瓶中加入化合物13(1g，2.66mmol)，N-羟基丁二酰亚胺(367mg，3.19mmol)，DCC(1.09g，5.31mmol)，再加入8mL超干的DMF作为溶剂，室温条件下反应过夜。反应结束后加水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(30mL*3)，有机相再经过饱和食盐水洗涤，合并有机相，经过无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，经过硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得到产物14(653.5，1.38mmol)，产率为52％。
实施例8化合物LK-10-55的合成路线
化合物(S,E)-N-(1-氨基-6-(3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-占吨]-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)-1-氧代己基-2-基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(LK-10-55)的合成：
(1)在8mL的耐压反应瓶中加入带有Rink amide树脂的化合物4(85mg，0.064mmol)，DMAP(3.91mg，0.032mmol)，加入2mL的DMF作为溶剂，搅拌均匀后再加入DIEA(31.73μL，0.192mmol)，室温反应过夜。反应结束后加入DCM稀释体系，过滤除去剩余的原料，二氯甲烷洗涤(10mL*3)，收集滤饼，得到化合物15，油泵抽干后直接进行下一步。
(2)取化合物15于8mL的耐压反应瓶中，加入4.75mL的三氟乙酸，0.25mL的苯甲醚，室温条件下反应3小时。反应结束后，加入二氯甲烷稀释体系，过滤除去树脂，二氯甲烷/甲醇溶液(1:1)洗涤(15mL*3)，收集滤液，旋蒸除去溶剂后，经反相色谱柱初步分离纯化(水：乙腈＝0-60％)，收集粗品后，在经HPLC进一步纯化(水：乙腈＝10-40％)，收集产物，冻干机冻干后得到产物LK-10-55(18mg，0.014mmol)，两步产率为21％。
实施例9化合物17的合成路线
(1)化合物Methyl(E)-N6-(9-芴甲氧羰基)-N2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯磺酰基)-L-赖氨酸甲酯(16)的合成
在30mL的耐压反应瓶中加入化合物Fmoc-L-赖氨酸甲酯(894.6mg，2.34mmol)，加入6mL的二氯甲烷，DIEA(0.849mL，2.14mmol)，使之搅拌均匀，置于冰浴条件下。将4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯(948mg，2.57mmol)溶解在4mL的二氯甲烷，之后缓慢的滴加至反应液中，加入完毕后，室温条件下反应8h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，直接经硅胶柱层析分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1)，得到固体产物16(550mg，0.82mmol)，产率为32％。
(2)化合物(E)-N6-(9-芴甲氧羰基)-N2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯磺酰基)-L-赖氨酸(17)的合成
在15mL的耐压反应瓶中加入化合物16(550mg，0.82mmol)，再加入6mL的三氟乙酸，搅拌均匀后加热至90℃，反应12h。反应结束后，经过旋蒸除去三氟乙酸，加入二氯甲烷溶解后，再经旋蒸除去溶剂，反复三次，除去三氟乙酸后，经过反相色谱柱分离纯化(水：乙腈＝0-80％)，得到产物17(322mg，0.492)，产率60％。
实施例10化合物LK-10-59的合成路线
化合物(S,E)-N-(1-氨基-6-(3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-占吨]-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)-1-氧代己基-2-基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯磺酰胺(LK-10-59)的合成
使用方法1，以化合物17作为第一个氨基酸与Rink amide树脂反应，经过多肽固相合成，可以得到化合物18。
在8mL的耐压反应瓶中加入化合物18(71mg，0.052mmol)，化合物14(74mg，0.156mmol)，DMAP(3.2mg，0.026mmol)，再加入2mL DMF，搅拌均匀后，加入DIEA(26μL，0.156mmol)，室温条件下反应8h。反应结束后加入二氯甲烷稀释体系，过滤，用二氯甲烷：DMF＝1:1的混合溶剂反复洗涤滤饼三次，收集滤饼，油泵抽干后得到化合物19。在8mL的耐压反应瓶中加入化合物19，再加入4.75mL的三氟乙酸，0.25mL的苯甲醚，室温反应4h。LC-MS监测反应完全后，加入二氯甲烷稀释，过滤除去树脂，用二氯甲烷反复洗涤三次，收集滤液，浓缩，经反相色谱柱进行初步分离纯化(水：乙腈＝0-60％)，收集产物后，再经过HPLC(水：乙腈＝10-40％)进行进一步纯化，冻干后得到化合物LK-10-59(18mg，0.013mmol)，两步产率为23％。
实施例11化合物(S,E)-N-(1-氨基-6-(7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)-1-氧代己基-2-基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯磺酰胺(LK-10-60)的合成
使用方法1，以化合物17作为第一个氨基酸与Rink amide树脂反应，进行多肽固相合成，经过与化合物LK-8-94相同的反应路线，可以得到化合物LK-10-60。
实施例12化合物20的合成路线
化合物N6-(9-芴甲氧羰基)-N2-(7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-赖氨酸(20)的合成
在30mL的耐压反应瓶中加入化合物2(2.21g，6mmol)，7-羟基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯(2.73g，9mmol)，DMAP(146mg，1.2mmol)，加入超干的二氯甲烷15mL，体系搅拌均匀后加入DIEA(1.98mL，12mmol)，室温反应8h。反应结束后，用旋蒸除去溶剂，再加入乙酸乙酯使之溶解，加水稀释，乙酸乙酯萃取(40mL*3)，有机相再经过饱和氯化钠洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，经过反相色谱柱分离纯化(水：乙腈＝0-90％)，得到化合物20(1.835g，3.3mmol)，产率为55％。
实施例13化合物LK-10-66的合成路线
化合物(S)-N-(1-氨基-6-((4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)-1-氧代己基-2-基)-7-羟基-2-氧代-2H-色烯-3-羧酰胺(LK-10-66)
使用方法1，以化合物20作为第一个氨基酸与Rink amide树脂反应，进行多肽固相合成，可以得到化合物21。
取化合物21(70mg，0.055mmol)于8mL的耐压反应瓶中，加入化合物3(60.4mg，0.165mmol)，加入2mL的DMF溶剂，搅拌均匀后，加入DIEA(27μL，0.165mmol)，室温条件下反应过夜。反应结束后加入二氯甲烷稀释体系，过滤除去剩余的原料，用二氯甲烷：DMF＝1:1的混合溶剂反复洗涤滤饼三次，收集滤饼，油泵抽干后得到化合物22。在8mL的耐压反应瓶中加入化合物22，加入4.75mL的三氟乙酸，0.25mL的苯甲醚，室温反应3h，反应完全后，加入二氯甲烷稀释，过滤，再用二氯甲烷反复洗涤三次，收集滤液，浓缩，经反相色谱柱进行初步分离纯化(水：乙腈＝0-60％)，收集产物后，再经过HPLC(水：乙腈＝10-40％)进行进一步纯化，冻干后得到化合物LK-10-66(24mg，0.021mmol)，两步产率为38.2％。
实施例14化合物LK-10-99的合成路线
化合物(3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-占吨]-5-羰基)-L-精氨酰基-L-亮氨酰-L-精氨酰基甘氨酰甘氨酸(LK-10-99)的合成
从利用方法2得到的化合物8出发，与化合物14进行反应，经过与化合物MC-10-45相同的反应路线，可以得到化合物LK-10-99。
实施例15化合物26的合成路线
(1)化合物N-乙基-N-(4-((E)-(2-甲氧基-5-甲基-4-((E)-(4-甲基-2-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)甘氨酸叔丁酯(25)的合成
在50mL的圆底烧瓶中加入化合物24(0.424g，1.8mmol)，加入4mL的乙腈使之溶解，置于冰浴条件下，开启搅拌。另取30mL的反应瓶加入化合物23(1.0g，2.164mmol)，加入乙腈8mL，PH＝4的乙酸钠缓冲溶液8mL，超声使之溶解，过滤除去不溶物，将所得的化合物23的溶液，缓慢滴加到反应体系中，冰浴条件下反应10分钟，之后移至室温反应6小时。反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取(40mL*3)，有机相经饱和氯化钠溶液洗涤，合并有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得到产物25(491mg，0.9mmol)，产率为50％。
(2)化合物N-乙基-N-(4-((E)-(2-甲氧基-5-甲基-4-((E)-(4-甲基-2-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)甘氨酸(26)的合成
在15mL的反应瓶中加入化合物259(106.2mg，0.194mmol)，加入2mL的二氯甲烷使之溶解，在加入2mL的三氟乙酸，室温条件下反应6小时。反应结束后，用旋蒸除去溶剂，经硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得到目标产物26(66.5mg，0.134mmol)，产率70％。
实施例16化合物LK-11-30的合成路线
化合物(S)-6-((3',6'-二羟基-3-氧代-3H-螺[异苯并呋喃-1,9'-占吨]-5-羰基)-L-精氨酰基-L-亮氨酰-L-精氨酰基甘氨酰甘氨酰氨基)-2-(2-(乙基(4-((E)-(2-甲氧基-5-甲基-4-((E)-(4-甲基-2-硝基苯基)二氮烯基)苯基)二氮烯基)苯基)氨基)乙酰氨基)己酰胺(LK-11-30)的合成
使用方法1，以Fmoc-Lys(Boc)-OH作为首个氨基酸与Rink amide树脂相连，进过多肽固相合成以及与LK-10-55相似的反应路线，可以得到化合物27。
在4mL的反应瓶中加入化合物27(70mg，0.067mmol)，化合物26(36.2mg，0.074mmol)，HATU(38mg，.01mmol)，再加入1.5mL的DMF作为溶剂，搅拌均匀后加入DIEA(16.5μL，0.1mmol)，室温条件下反应6小时。反应结束后，经过反相柱层析初步分离纯化(水：乙腈＝0-80％)，收集产物后再经过HPLC进一步纯化，冻干机冻干后得到化合物LK-11-30(28mg，0.019)，产率为28％。
实施例17化合物LK-11-26的合成
经过与化合物LK-11-30相同的反应路线，可以得到化合物LK-11-26。
实施例18化合物29的合成路线
(1)化合物9-芴甲基((S)-5-(4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺基)-6-((2-(4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-6-氧己酮基)氨基甲酸酯(28)的合成
在15mL的耐压反应瓶中加入化合物LK-9-22(400mg，0.65mmol)，化合物11(321.5mg，1.03mmol)，HATU(494.3mg，1.3mmol)，加入二氯甲烷6mL，搅拌均匀，再加入DIEA(268.5μL，1.63mmol)，室温条件下反应过夜。反应结束后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取(30mL*3)，有机相经饱和氯化钠溶液洗涤，合并有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩滤液，经硅胶色谱柱分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，得到目标产物28(360mg，0.39mmol)，产率60％。
(2)化合物N-((S)-6-氨基-1-((2-(4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基]苯甲酰胺基)乙基)氨基)-1-氧己酮-2-基)-4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(29)的合成
在15mL的耐压反应瓶中加入化合物28(320mg，0.35mmol)，加入4mL四氢呋喃使之溶解，搅拌均匀。将氢氧化锂(70mg，1.75mmol)溶解在2mL水中，滴加到反应体系中，室温反应3h。反应结束后，用旋蒸除去溶解，经硅胶色谱柱分离纯化(二氯甲烷：2M氨甲醇＝10:1)，得到产物29(77mg，0.12mmol)，产率34％。LC-MS m/z 691.3[M+H]+。
实施例19化合物LK-11-47的合成路线
化合物N-((S)-6-((7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)-1-((2-(4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺基)乙基)氨基)-1-氧己酮-2基)-4-((E)-(4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(LK-11-47)的合成
在4mL的耐压反应瓶中加入化合物MC-10-45(20mg，0.026)，化合物29(26.9mg，0.039mmol)，HATU(17.8mg，0.047mmol)，加入1mL的DMF，搅拌均匀后加入DIEA(10.1μL，0.078)，室温条件下反应12h。反应结束后直接经HPLC分离纯化(水：乙腈＝20％-65％)，收集后得到化合物LK-11-47(1.5mg，0.001mmol)产率为4％。LC-MS m/z 1418.7[M+H]+。
实施例20化合物LK-11-97的合成路线
化合物(E)-N-(2-((7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰甘氨酰甘氨酰氨基)乙基)-4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰胺(LK-11-97)的合成
在8mL的耐压反应瓶中加入化合物MC-10-45(90mg，0.12mmol)，化合物11(56.35mg，0.18mmol)，HATU(91.55mg，0.24mmol)，加入2mL的DMF使之溶解，搅拌均匀后加入DIEA(59.6μL，0.36mmol)，在室温条件下反应12h。反应结束后，加2mL的水淬灭反应，先经过反相柱层析分离纯化梯度洗脱(水：乙腈＝0-70％)，收集产物浓缩后再经HPLC进一步纯化(水：乙腈＝10-60％)，得到产物LK-11-97(31mg，0.03mmol)，产率为25％。
经过和LK-11-97相同的反应步骤可以得到化合物LK-12-18，LK-12-22，LK-12-76。
上述实施例中制得的中间体和探针列于表A和表B中。
表A中间体
表B探针
测试例1不同Dubs对探针的水解活性测试
所采用的的生物测试方案为：通过将不同浓度的各种Dubs分别与不同的探针孵育一段时间后测试荧光强度。
为了测试各类Dubs对于探针的水解活性，选取USP2，USP14，USP7，CYLD(USP家族)；AMSH(JAMM家族)，UCHL-1(UCH家族)，OTUB1，OTULIN(OUT家族)，Ataxin-3(MJD家族)作为检测的Dubs，通过检测荧光强度值来计算蛋白水解速率，从而得出Dubs对探针的水解活性。
方法：将上诉蛋白和探针用缓冲液(50mM Hepes7.4，150mM NaCl)稀释成相应浓度的2倍(部分蛋白须在缓冲液中加入DTT，ATP等)，用排枪先将蛋白加入384黑孔板中，每孔10μL，离心；后将探针加入相应孔中，离心，混匀，在室温下避光静置合适的时间(4h)，用酶标仪读取荧光强度。激发波长为405nm，检测波长为450nm。以未加蛋白的孔作为背景值，运用Prism Graphpad统计软件计算荧光强度。结果如表1所示。
表1不同Dubs对不同探针的水解活性
| 标志 | 蛋白浓度 |
| ++++ | ≤1.25uM |
| +++ | 1.25uM<x≤2.5uM |
| ++ | 2.5uM<x≤5uM |
| + | 5uM<x≤10uM |
| - | x>10uM |
测试例2有活性Dubs对探针的水解活性测试的动力学曲线
所采用的的生物测试方案为：通过将不同浓度各种Dubs分别与不同浓度的探针孵育，每个十分钟测量荧光强度，通过米氏方程拟合得到米氏常数Km和Kcat。
方法1：以OTUB1为例，具体说明上述过程。将OTUB1分别用上述缓冲液稀释至8μM，4μM，2μM，1μM，将LK-8-94用缓冲液稀释至20μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，用排枪先将蛋白加入384黑孔板中，每孔10μL，离心；后将探针加入相应孔中，离心，混匀，在室温下避光静置，每隔10分钟用酶标仪读取荧光强度。激发波长为405nm，检测波长为450nm。以未加蛋白的孔作为背景值，运用Prism Graphpad统计软件计算荧光强度，绘制荧光强度-时间曲线，用一次函数拟合得到相对的水解速率。拟合结果如图2-1所示。
从图2-1中可以看出探针的荧光强度在较长时间内处于线性增长，这有利于一些对已有探针如Ub-Rho活性非常高的蛋白如UCHL-1的高通量筛选。
方法2：将OTUB1分别用上述缓冲液稀释至2μM，将LK-8-94用缓冲液稀释至14μM，12μM，10μM，8μM，6μM，4μM，2μM，用排枪先将蛋白加入384黑孔板中，每孔10μL，离心；后将探针加入相应孔中，离心，混匀，在室温下避光静置，每隔10分钟用酶标仪读取荧光强度。激发波长为405nm，检测波长为450nm。以未加蛋白的孔作为背景值，运用Prism Graphpad统计软件计算荧光强度，绘制荧光强度-时间曲线，用一次函数拟合得到相对的水解速率V0。以探针浓度为自变量，水解速率V0为应变量，根据米氏方程
拟合曲线，结果如图2-2所示。
从图2-2可以看出，OTUB1对LK-8-94的Km＝4μM，Kcat＝18U/(min*μM)，可见探针LK-10-48对OTUB1具有适合的亲和力，反应速率也适中，因此该探针十分适用于表征OTUB1的水解活性。
测试例3已知抑制剂对Dubs水解探针的活性抑制检测
为进一步验证探针可用于对Dubs抑制剂的高通量筛选，测试已知抑制剂对相应Dub水解探针的活性抑制情况。所采用的的生物测试方案为：通过将不同浓度的抑制剂和相应的Dub孵育后进一步与探针孵育，避光室温静置一段时间后，测量荧光强度，计算IC50。
方法：以USP2为例，具体说明上述过程。ML364是已报道的USP2的抑制剂。将ML364分别用DMSO稀释至1.6mM，0.8mM，0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.025mM，将USP2用缓冲液50mM Hepes 7.4，0.5mM EDTA，150mM NaCl，1mM DTT，1mM ATP稀释至0.25μM，用排枪向384黑孔板中先加入化合物，每孔0.5μL，再加入蛋白，每孔9.5μL，离心，在室温下孵育1h；后将探针LK-9-32用上述缓冲液稀释至10μM，用排枪加入相应孔中，每孔10μL，离心，混匀，在室温下避光静置。用酶标仪读取荧光强度，激发波长为405nm，检测波长为450nm。同时作为对照，将Ub-Rho.110用缓冲液稀释至1μM，用排枪加入相应孔中，每孔10μL，离心，混匀，在室温下避光静置。用酶标仪读取荧光强度，激发波长为485nm，检测波长为535nm。以未加蛋白的孔作为背景值，运用Prism Graphpad统计软件计算荧光强度，绘制抑制曲线，计算IC50。如图3-1和3-2所示。
从图3-1，3-2可以看出，用Ub-Rho.110和LK-9-32测得的IC50分别为6.44μM和9.32μM，相差不大，可见本发明的探针可以用于Dubs抑制剂的高通量筛选。
测试例4用LK-10-48对OTULIN进行抑制剂的筛选
由于现有的探针无法通过检测荧光来表示OTULIN的酶活性，而OTULIN对LK-10-48有较强的水解活性。我们用LK-10-48对OTULIN进行抑制剂的筛选。所采用的生物测试方案为：通过将不同浓度的不同抑制剂和OTULIN孵育后进一步与探针LK-10-48孵育，避光室温静置一段时间后，测量荧光强度。
方法1：将可能具有抑制活性的化合物分别用DMSO稀释至2mM，0.4mM两个不同浓度，将OTULIN用缓冲液50mM Hepes 7.4，150mM NaCl，稀释至0.5μM，用排枪向384黑孔板中先加入化合物，每孔0.5μL，再加入蛋白，每孔9.5μL，离心，在室温下孵育1h；后将探针LK-10-48用上述缓冲液稀释至1μM，用排枪加入相应孔中，每孔10μL，离心，混匀，在室温下避光静置8h。用酶标仪读取荧光强度，激发波长为405nm，检测波长为450nm。以加等量DMSO的孔作为阴性对照，运用Prism Graphpad统计软件计算荧光强度，绘制柱状图。结果如图4-1和4-2所示，从图4-1和4-2中可以看出，#2和#14化合物的孔荧光强度有明显降低。可见本发明的探针适用于对去泛素化酶的抑制剂的筛选。
测试的化合物的信息如下：
| #1 | S4920 | #7 | HY-13453 | #13 | HY-16709 |
| #2 | S7140 | #8 | HY-100708 | #14 | LDN57444 |
| #3 | HY15667 | #9 | VXL1570 | #15 | SK-4-102 |
| #4 | HY17543 | #10 | USP7/USP47抑制剂 | #16 | L802-0939 |
| #5 | WP1130 | #11 | HY-13741A | #17 | L482-0194 |
| #6 | HY-13865 | #12 | P056-0419 | #18 | HY-50736 |
方法2：将#2和#14化合物储液分别用DMSO稀释至1.6mM，0.8mM，0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.025mM，将OTULIN用缓冲液50mM Hepes 7.4，0.5mM EDTA，150mM NaCl，1mMDTT，1mM ATP稀释至0.25μM，用排枪向384黑孔板中先加入化合物，每孔0.5μL，再加入蛋白，每孔9.5μL，离心，在室温下孵育1h；后将探针LK-10-48用上述缓冲液稀释至1μM，用排枪加入相应孔中，每孔10μL，离心，混匀，在室温下避光静置8h。用酶标仪读取荧光强度，激发波长为405nm，检测波长为450nm。以未加蛋白的孔作为背景值，运用Prism Graphpad统计软件计算荧光强度，绘制抑制曲线，计算IC50。
结果如图4-3所示，其中已报道的非特异性去泛素化酶抑制剂(S7140和LDN-57444)展现出对OTULIN去泛素化酶活性较好的抑制效果，可见在使用本发明的探针能够有效地测试去泛素化酶抑制剂对去泛素化酶(OTULIN)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种去泛素化酶探针，其特征在于，所述的探针如式Ia或式Ib所示，
FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-Wb-FQ (Ia)
FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L2-Wb-FL (Ib)
各式中，
FL为荧光基团；
FQ为能够淬灭所述荧光基团的淬灭基团；
L1为无或具有1至15个链原子的二价连接基团；
L2为具有3至15个链原子(较佳地，3至10个；更佳地，4至7个)且一端为-NH-或-O-的二价连接基团，并且L2通过该-NH-或-O-与Gly的C端连接；L2还任选地通过-L3-Wc-连接有额外的基团FQ’，其中，FQ’为能够淬灭所述荧光基团的淬灭基团，和L3为具有3-6个链原子的二价连接基团；
且L1和L2具有的链原子总数≤25；
Wa、Wb和Wc各自独立地选自下组：无、取代或未取代的C1-C6亚烷基、-R’COR”-、-R’CSR”-、-R’SO2R”-、-R’SOR”-、-R’SR”-、-R’OR”-、-R’N(Ra)R”-、-R’N(Ra)COR”-、-R’N(Ra)CSR”-、-R’N(Ra)SO2R”-、-R’N(Ra)SOR”-、-R’CON(Ra)R”-、-R’CSN(Ra)R”-、-R’SO2N(Ra)R”-、-R’SON(Ra)R”-；
R’和R”各自独立地为选自下组的二价基团：无、取代或未取代的C1-C4亚烷基；
Ra选自：H、取代或未取代的C1-C4烷基；
除非特别说明，所述的取代是指基团上一个或多个(较佳地，1、2或3个)氢被选自下组的取代基所取代：C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、卤素、羟基、氰基、-COOR、-C(O)R、-CON(R)2、-OC(O)R、-N(R)2；
R各自独立地选自：H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，L1为无或者L1为含1、2、3、4或5个(较佳地，含1、2或3个)氨基酸残基的肽链。
3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，
L2为由选自下组的一个或多个结构单元组成的二价连接基团：氨基酸残基、-C(Rb)2-、-CO-、-CS-、-N(Ra)-、-O-、-S-；
其中，
Rb各自独立地选自下组：H、取代或未取代的C1-C4烷基、-R’CO-L3-Wc-FQ’、-CO-L3-Wc-FQ’；
附加条件是：(i)与同一个碳原子连接的Rb中至多只有一个为
-R’CO-L3-Wc-FQ’或-CO-L3-Wc-FQ’；和(ii)各结构单元之间形成的键是稳定的。
4.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的探针具有下述一个或多个特征：
(i)FQ和FQ’各自独立地选自下组：
(ii)FL为如式A所示的荧光基团
其中，R1为吸电子基团；R2和R3各自独立地为相同或不同给电子基团；
或者，FL为选自下组的荧光基团：
5.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针为选自表B的探针，
表B
6.一种如权利要求1所述的探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：(i)使片段1与片段2偶联，从而得到如式Ia所示的探针或如式Ib所示的探针；
其中，
片段1选自：FL-Wa-RL、FQ-Wa-RL、FL-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH、FQ-Wa-L1-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-OH；其中，RL为离去基团；
片段2选自：FQ-Wb-L2-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L1-OH、FL-Wb-L2-(Arg-Leu-Arg-Gly-Gly)-L1-OH、FQ-Wb-L2-H、FL-Wb-L2-H；
FL、FQ、L1、L2、Wa、Wb的定义同权利要求1中定义。
7.一种组合物，其特征在于，所述的组合包括如权利要求1所述的探针。
8.一种用于测试去泛素化酶抑制剂活性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如权利要求1所述的探针。
9.如权利要求1所述的探针的用途，其特征在于，所述的探针具有下述一个或多个用途：
(i)用于测试待测物对去泛素化酶的体外抑制活性；
(ii)用于筛选去泛素化酶抑制剂；
(iii)用于表征去泛素化酶活性。
10.一种测试待测物对去泛素化酶的抑制活性的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)将待测物与所述去泛素化酶一起孵育，得到经孵育的体系；
(ii)将如权利要求1所述的探针加入至步骤(i)得到的经孵育的体系，进行第二次孵育，得到经第二次孵育的体系；和
(iii)读取经第二次孵育的体系的荧光强度，基于荧光强度计算待测物活性。
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| CN104404142A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-03-11 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种用于荧光定量pcr反应的荧光探针 |
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2019
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