CN101652149B - 成像探针 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如本文定义的式(I)的分子探针{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2(I)，其使得可以观察所选择的组织蛋白酶在体外测定、细胞或多细胞有机体中的催化活性，及其制备方法和应用。

Description

成像探针
本发明涉及使得可以观察单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组在体外试验、在细胞或多细胞有机体中的催化活性的分子探针(底物)。本发明还涉及所述探针(底物)的合成和设计方法。
发明背景
蛋白水解酶(蛋白酶)裂解或降解活细胞内和活细胞外的其它酶或肽。蛋白酶与大量的生命过程有关，其中许多蛋白酶在细胞信号传导和组织内稳态中起重要作用。活性异常或提高的蛋白酶与许多种疾病相关，包括：癌症、骨关节炎、动脉硬化、炎症以及许多其它疾病(M.J.Evans，B.F.Cravatt，Chem.Rev.2006，106，3279-3301)。由于蛋白水解活性在生命系统中必须保持在严格控制下，许多蛋白酶被表达为非活性前体蛋白(酶原)，其通过受控的蛋白酶剪切而活化。对蛋白水解活性的另外控制来源于内源性抑制剂，所述内源性抑制剂结合并从而使催化活性形式的酶失活。考虑到这种严格的调控，研究在细胞或生理事件中的蛋白酶功能需要监测蛋白酶的活性而非仅监测蛋白酶的表达。相应地，文献中提出了许多基于化学探针的活性。通常应用的蛋白酶探针(i)通过肽键的酶裂解导致荧光团从荧光淬灭剂中空间上分离或(ii)通过基于机制的抑制剂与感兴趣蛋白酶的共价结合而产生可探测的信号。定位和定量研究特定蛋白酶或蛋白酶组的活性和抑制(例如在基于细胞的测定或全动物成像实验中)需要开发成像探针，所述探针(i)到达蛋白酶功能的生理相关部位(例如，全动物成像中特定的器官或细胞溶胶)并且(ii)对期望的蛋白酶或蛋白酶组而言是选择性的。选择性蛋白酶探针的出现为本领域带来了巨大的变化。本发明涉及(i)新的高选择性半胱氨酸蛋白酶探针，优选来自组织蛋白酶亚家族的半胱氨酸蛋白酶，(ii)所述探针在体外测定、细胞或多细胞有机体中的应用(例如，利用分子成像手段)以及(iii)合成和设计这些探针的方法。
在最近几年中，一些分子成像技术(光学的和非光学的)对体内特定分子靶点和通路的非侵袭性显影已变得越来越重要。由于任何影像信号的信息内容最初都是内部对比的函数，可由酶促反应(例如，肽键的裂解)活化的内部淬灭成像探针的开发已被常规地应用于成像和定位催化活性的蛋白酶。通过常规方法难以实现产生对单个蛋白酶有选择性并显示到达体内蛋白酶作用部位能力的探针。制药工业中的药物化学家在开发具有适当药动学性质和对给定靶点有适当特异性的药物中面临相关挑战。在本发明中我们设计了基于对半胱氨酸蛋白酶选择性活性的探针的新途径，并对来自半胱氨酸组织蛋白酶亚族的蛋白酶应用这种方法。
半胱氨酸蛋白酶的特征是位于活性位点的、在催化过程中作为亲核基团的半胱氨酸残基。催化性半胱氨酸通常与适当的邻近残基通过氢键结合，以便能够形成硫醇根离子。当通过蛋白酶识别到底物时，易裂解的肽键位于接近催化性半胱氨酸处，所述半胱氨酸进攻羰基碳形成氧负离子中间体。然后酰胺键被裂解，释放C端的肽作为胺。易裂解的肽的N端部分保持在共价的酰基-酶中间体中，该中间体随后经水裂解，导致酶的再生。底物的N端裂解产物作为羧酸释放。
人基因组编码11种木瓜蛋白酶样组织蛋白酶(人族CA蛋白酶或半胱氨酸组织蛋白酶：B、C、F、H、K、L、O、S、V、W、X)，其涉及许多功能，包括：溶酶体中常规蛋白降解(持家(house keeping)功能)、抗原加工、颗粒蛋白酶加工以及基质胶原的降解。半胱氨酸组织蛋白酶的功能障碍与很多病理事件相关，例如骨关节炎、肿瘤生物学(血管发生和肿瘤形成)、神经性障碍(例如疼痛)和骨质疏松症(Y.Yasuda等人Adv.Drug DeliveryRev.2005，57，973-993)，因此近年来某些半胱氨酸组织蛋白酶被确认为用于治疗的相关药物靶点(Turk，V.；Turk，B.；Turk，D.Embo J，2001，20，4629-4633)。
例如，组织蛋白酶K和S涉及骨和软骨的降解，并涉及骨质疏松症和关节炎。
另外，组织蛋白酶K主要发现于破骨细胞中并显示对正常骨再造(骨重吸收)是关键性的。组织蛋白酶K活性的缺乏导致骨硬化病症(致密性骨发育不全(pycnodysosis))，然而组织蛋白酶K的过表达加速了骨物质的更新，预示着骨质疏松症。组织蛋白酶K还显示潜在的胶原酶活性，在胶原的螺旋区域裂解三螺旋胶原。在骨关节炎中，软骨基质遭受包括II型胶原降解在内的大规模侵蚀(Y.Yasuda等人Adv.Drug Delivery Rev.2005，57，973-993)。因此，抑制组织蛋白酶B和K例如可用于治疗变性性关节疾病如骨关节炎的方法。例如组织蛋白酶K的抑制导致骨的抑制。组织蛋白酶S在启动对抗原的MHC II类相关免疫应答中起主要作用。作为树突细胞中主要的不变链加工蛋白酶，组织蛋白酶S在免疫相关疾病中显示为令人感兴趣的药物靶点。另外，组织蛋白酶S对细胞外基质降解而言可也能是重要的，并表现出显著的弹性蛋白酶和蛋白聚糖-降解活性。因此组织蛋白酶S涉及牵涉于过度弹性组织解离(elastolysis)的病症，如慢性阻塞性肺疾病(例如肺气肿)、毛细支气管炎、哮喘和支气管炎中的过度弹性组织解离、肺炎和心血管疾病如血小板破裂和粥样化。
组织蛋白酶L显示出涉及表皮内稳态、调节毛发周期以及MHC II类-介导的抗原呈递。
组织蛋白酶B与胰腺炎早期阶段中病理性胰蛋白酶活化相关，并促进TNF-α诱导的肝细胞凋亡。
对蛋白水解酶而言，它们的活性而非仅仅其表达水平决定了它们在细胞生理学和病理学中的功能角色。相应地，抑制组织蛋白酶活性的分子可用作在疾病的治疗中的治疗物质，并且开发使蛋白水解活性及经药物候选物作用后的抑制程度显影的特定成像生物标记物可加速靶点确认、药物开发甚至临床试验(H.Pien，A.J.Fischman，J.H.Thrall，A.G.Sorensen，DrugDiscovery Today，2005，10，259-266)。应用基于活性的显像剂，能够容易地在复杂蛋白质混合物、完整细胞甚至在体内监测特定蛋白质或蛋白质家族。另外，可将酶类特定探针用于开发对可用于功能研究的小分子抑制剂的筛选(D.A.Jeffery，M.Bogyo Curr.Opp.Biotech.2003，14，87-95)。
到目前为止，已开发了基于活性的成像探针来监测和标记基于细胞的试验中的组织蛋白酶B和L(G.Blum等人Nat.Chem.Biol，2005，1，203-209)、某些组织蛋白酶(R.Weissleder等人Nat.Biotech.1999，17，375-378)以及肿瘤组织中的基质金属蛋白酶(C.Bremer等人Nat.Med.2001，7，743-748)。
监测蛋白酶活性的其它工具包括生物发光测定。这种方法利用酶活性测定或非酶生物测定中的荧光素衍生物，其中荧光素衍生物作为目标酶的底物和荧光素酶的前底物。最初的蛋白酶剪切释放荧光素，随后荧光素被荧光素酶转化，成为可检测的发光信号。这种二次测定具有与荧光探针类似的应用光谱，并提供具有高信噪比的另外的优势。
半胱氨酸组织蛋白酶使用的酶促机制已被充分研究并且是高度保守的。通过可裂解肽的研究和筛选数据，已开发了亲电子的底物类似物，该底物类似物仅在所述保守的活性位点背景下反应。这种探针中的亲电子中心通常是所谓“弹头”的一部分，“弹头”是在亲电特性和几何位置优化的分子实体，以完美地适合于半胱氨酸组织蛋白酶的活性位点，在该位点其与催化性半胱氨酸残基反应。数量众多的这种亲电子底物已作为基于机制的半胱氨酸蛋白酶抑制剂而被描述，例如包括但不限于：重氮甲基酮类、氟甲基酮类、酰氧基甲基酮类、O-酰基羟基胺类、乙烯基砜类以及环氧琥珀酸衍生物(S.Verhelst，M.Bogyo QSAR Comb.Sci.2005，24，261-269)。
作为有效的生物学工具，蛋白酶抑制剂必须在结合至特定蛋白酶时不仅非常强效并且有高度选择性。特定蛋白酶的小分子抑制剂的开发常常从肽底物开始。尽管肽类显示出不同范围的生物学性质，它们作为药物的用途受限于其不稳定性及其低的口服生物利用度。为成为有效的药物，期望具有减弱的肽样特性、抵抗非选择性的蛋白水解降解的高稳定性、对给定蛋白酶的高选择性以及对蛋白酶作用部位有良好生物利用度的蛋白酶抑制剂。这些需求导致半胱氨酸-组织蛋白酶抑制剂A-B的开发，其具有与亲电子弹头B共价连接的非肽化学骨架的A。当结合至半胱氨酸-组织蛋白酶B，与催化性半胱氨酸(基于机制的抑制剂)共价反应。在许多情况下这些抑制剂的选择性和药动学性质成功地在生物医学研究背景中优化。为使催化性半胱氨酸能有效地亲核进攻，这些抑制剂的亲电子中心必须被精确地定向于酶的活性位点。催化性半胱氨酸对弹头亲电碳原子的特定排列非常符合催化性半胱氨酸和易裂解肽底物的肽羰基的空间排列。这种对比指导我们下列想法应当是可行：将优化的共价抑制剂(具有化学骨架A和亲电子弹头B)“重新设计”为可裂解的底物。由于化学骨架A可看作抑制剂选择性的主要决定部分，我们的方法可用于将优化的抑制剂的选择性或部分选择性转化为基于活性的化学探针。我们将该过程称为从选择性半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂到选择性的基于活性的探针的“反向设计”。
本发明涉及用于半胱氨酸蛋白酶的具有式(I)的分子探针
{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2    (I)
其中：
A是可被组织蛋白酶识别的基团；
R1是连接基团；
R2是键或连接基团；
L是键或使得易于与L1基团键合的基团；
L1和L2彼此独立地是至少一个任选结合于固体支持物上的标记；并且
n是1；
或者
R2是键；
L2是适用于偶联生物发光测定的底物；并且
n是0。
本发明另外的实施方案是用于半胱氨酸蛋白酶的具有式(I)的分子探针，其中：
n是1，
A是可被半胱氨酸组织蛋白酶识别的基团；
R1和R2彼此独立地是连接基团；
L是键或使得易于与L1基团键合的基团；并且
L1和L2彼此独立地是至少一个任选结合于固体支持物上的标记。
式(I)的化合物是用于半胱氨酸蛋白酶、优选来自半胱氨酸组织蛋白酶亚族的半胱氨酸蛋白酶的基于活性的探针(底物)。
就其最基本形式而言，所述化学探针由四个功能要素组成：a)作为反应基团的酰胺基团-CO-NH-，其能够被蛋白酶作用而裂解；b)骨架A，其决定对给定蛋白酶靶点的选择性；c)连接基团R1和R2，以将亚单元彼此连接；以及d)用于检测的标记组L1和L2。
基团A优选是就对给定的半胱氨酸组织蛋白酶或半胱氨酸组织蛋白酶组(优选组织蛋白酶K或S)的特异性而言的主要决定部分，例如，如化合物2-114中所示。本发明的成像探针显示了对给定的半胱氨酸组织蛋白酶的选择性的因子1000比1，优选因子100比1，其中选择性通过在优选的底物浓度下的相对转换数而定义(酶1的转换数对酶2的转换数)。通过将感兴趣的酶(酶1)的转换数除以另一个酶(酶2)(期望相对其具有选择性)的转换数来对每组酶对确定相对转换数。对在体内应用而言，期望在低(例如，μM或低于μM)底物浓度下的高选择性。
方案1表示蛋白酶P与底物的反应，其中A代表特异性决定部分，以及P代表蛋白酶，所述蛋白酶具有包含硫醇基S-的反应活性半胱氨酸：
(方案1)。
反应速率取决于底物的结构。
连接基团R1或R2优选是分别连接标记L1或L2、或连接多个相同或不同的标记L2或L1的柔性连接基团。连接基团选自预期应用的背景中，即选自对特定蛋白酶而言基于活性的成像探针的背景中。连接基团还可增加底物在适当溶剂中的溶解度。所用连接基团在实际应用的条件下是化学稳定的。连接基团既不干涉选定的蛋白酶靶点的反应也不干涉标记L1和/或L2的检测，但可能结构变化，例如及时在某些位点被裂解。更具体地，连接基团R1或R2是具有1至300个碳原子的直链或支链亚烷基，其中任选地
(a)一个或多个碳原子被氧替代，特别是每隔两个碳原子的碳被氧替代，例如，具有1至100个亚乙基氧基单元的聚亚乙基氧基团；和/或
(b)一个或多个碳原子被带有氢原子的氮替代，并且相邻碳原子被氧代取代，代表酰胺官能团-NH-CO-；和/或
(c)一个或多个碳原子被酯官能团-O-CO-替代；
(d)两个相邻碳原子之间的键是双键或三键；和/或
(e)两个相邻碳原子被二硫键替代。
本领域技术人员可根据探针预期的应用而选择底物的标记L1和L2。
标记L1和L2彼此独立地是光谱探针如荧光团；淬灭剂或生色团；磁探针；对比试剂；作为能够特异性结合于配偶体的特异性结合对的一部分的分子；共价连接于本领域技术人员已知的聚合支持物、树状物(dendrimer)、载玻片、微孔板的分子；或具有上述任何性质的组合的分子。
本发明优选的实施方案是修饰的氨基荧光素或其羧基端被保护的衍生物作为报道基的应用，其从中心骨架A裂解后经荧光素酶转化能够产生发光信号。因此，标记L2可作为选择地是适合于偶联生物发光测定的底物，特征在于修饰的氨基荧光素或其羧基端被保护的衍生物作为报道基。
US7148030公开了生物发光的蛋白酶测定的实例，包含作为与修饰的氨基荧光素连接的组织蛋白酶底物的肽类。
优选的探针由分子内淬灭荧光探针组成，所述分子内淬灭荧光探针包含聚合主链和多个以导致荧光淬灭的密度经骨架A共价连接于所述主链的荧光染料。
本发明另一个优选实施方案是树枝状高分子的应用，两个或更多个荧光团以导致荧光淬灭的密度经骨架A共价连接于所述树枝状高分子上。使用聚合探针具有定向探针递送(靶向的)和延长在人或动物血流中循环时间的优势。聚合物键合改变了低分子量物质的生物分布，(通过渗透性的提高和保留效应(EPR效应))使其能够特异性靶向肿瘤，伴随降低到达毒性位点，并且聚合物轭合物与低分子量成像探针的组合是本发明对于包括哺乳动物如小鼠、大鼠等在内的多细胞有机体的成像的最优选实施方案。聚合主链可由任何生物相容的聚合物组成并可包括多肽、多糖、核酸或合成聚合物。用于本发明的聚合物的综合总结可见于M.J.Vincent等人Trends Biotech.2006，24，39-47和R.Duncan，Nature Reviews Cancer，2006，688-701。用于本发明的聚合物的另外的描述公开于WO99/58161。聚合的或树枝状的探针可包含共价连接于主链或树枝状分子的保护链。保护链包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇以及乙二醇的其它共聚物。
本发明的探针可还包含靶向部分如抗体、抗体片段、结合受体的配体、肽片段或合成的蛋白抑制剂。
进一步地，标记L1和L2可以是正电荷的直链或支链聚合物。本领域技术人员已知所述聚合物促进所连接分子透过活细胞质膜的转移。这对于细细胞膜可透过性低或事实上对活细胞的细胞膜不可透过的物质是特别优选的。非细胞可透过的化学探针与这种L1或L2基团键合后将成为细胞膜可透过的。这种细胞膜传送促进基团L1和L2包含例如具有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的直链聚(精氨酸)、6-15个亚单元的直链聚合物(每个亚单元均携带胍基)、低聚物或具有6至最多50个亚单元的短链聚合物、与胍基相连的部分、和/或具有HIV-tat蛋白序列的各部分，例如亚单元Tat49-Tat57(以单字母的氨基酸代码表示为RKKRRQRRR)。在L1是两个相互作用的光谱探针L1/L2的一个成员且L2是另一个成员的情况下，如在FRET对的情况下，优选使用具有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的直链聚(精氨酸)作为聚合标记。
作为标记L1和/或L2最优选是光谱探针。作为标记L2最优选的是表示与L1形成光谱相互作用对的一部分的分子，进一步地是能够特异性结合于配偶体的标记和共价连接于固体支持物的分子。
特别优选的是使得L1是两个相互作用的光谱探针L1/L2的一个成员且L2是另一个成员的标记，其中能量能够在供体和受体(淬灭剂)间通过动态或静态的淬灭而被非放射性的传递。这种所述的标记L1/L2对一旦从相应的半胱氨酸组织蛋白酶反应/裂解就改变其光谱性质。这种标记L1/L2对的实例是FRET(
Figure G2008800062956D00091
共振能传递)对，例如，在一端(例如，L1)与供体(报道分子)共价标记并在另一个位置(L2)与受体(淬灭剂)共价标记的前荧光探针，反之亦然。
特别地，L1是供体(报道分子)且L2是受体(淬灭剂)，或L1是淬灭剂且L2是报道分子。在使用这种探针中时，半胱氨酸蛋白酶与探针的反应将导致荧光改变。一旦与蛋白酶反应后，双标记的底物中报道分子-淬灭剂的距离就被改变，所述反应导致报道分子和淬灭剂的空间分离，其引发荧光出现或发射波长的改变。大量可选择的报道基可分别地用作标记L1或L2，例如包括近红外发射荧光团。含有报道分子和淬灭剂的底物保持不发光直至其与蛋白酶反应，由于此时报道基团标记和淬灭剂标记被空间分离，于是反应混合物被“点亮”开始荧光团发射。荧光淬灭和能量传递可仅通过两标记中的一个(淬灭的或能量供体标记)的发射而被测量。当发生能量传递，并且能量接受标记也是荧光性的时，也能够测量受体标记荧光。所述两个互作用标记的供体标记可选自化学发光的供体探针，该探针不需要激发灯并降低受体的背景荧光。所提及的使用这种双标记底物的特定方法用于确定基于荧光时间测定的反应动力学，并可用于体内及体外。
或者，底物的标记L2可以是固体支持物或另外连接于固体支持物，或者是连接或可连接于聚合物/固体支持物。优选使用具有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的直链聚(精氨酸)作为对于L1/L2 FRET对的聚合标记。
特别优选的组合是两个不同的亲和性标记，特别是光谱相互作用的标记L1/L2对，例如FRET对。亲和性标记定义为作为特异性结合对的一部分的分子，该特异性结合对能够特异性与配偶体结合。考虑的特异性结合对例如是生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素，还有甲氨蝶呤，其是二氢叶酸还原酶(DHFR)的紧密结合抑制剂。
本领域技术人员能够选择适当的报道分子和淬灭剂对。通常报道分子和淬灭剂是具有大范围光谱重叠的荧光染料，例如荧光黄作为报道分子且罗丹明作为淬灭剂。其它淬灭剂是金簇和金属穴状化合物。
用于本发明的第二类淬灭剂是“暗淬灭剂”(Johansson，M.K.等人，Chem.Eur.J.9：3466-3471，2003)，即不具有天然荧光而具有与常规报道分子染料的发射光谱重叠的吸收光谱的染料，该吸收光谱导致最大的FRET淬灭。另外，可选择染料对使得吸收波段重叠，以便于促进基态复合体中的共振偶极-偶极相互作用机制(静态淬灭)。
特别考虑的荧光团和淬灭剂是：Alexa染料，包括Alexa 350、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 635和Alexa 647(Panchuk-Voloshina，N.等人，J.Histochem. & Cytochem.47：1179-1188，1999)；二甲基氨基香豆素(由Molecular Probes作为产品D374提供的7-二甲基氨基香豆素-4-乙酸琥珀酰亚胺酯)；淬灭剂QSY 35、QSY 9和QSY 21(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR 97402，USA)；花青-3(Cy 3)、花青5(Cy 5)和花青5.5(Cy 5.5)(Amersham-GE健康护理，佐林根，德国)；BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3(Black Hole QuencherTM of Biosearch Technologies，Inc.，诺瓦托，CA 94949，USA)；荧光团ATTO 488、ATTO 532、ATTO 600和ATTO 655以及淬灭剂ATTO 540Q和ATTO 612Q(Atto-Tec，D57076 Siegen，德国)；荧光团DY-505、DY-547、DY-632和DY-647(Dyomics，耶拿，德国)；5/6-羧基荧光黄、四甲基罗丹明、4-二甲基氨基偶氮苯-4’-磺酰基衍生物(Dabsyl)和4-二甲基氨基偶氮苯-4’-羰基衍生物(Dabcyl)。它们能够被有利地组合于下列组合中：
荧光团    淬灭剂
·Alexa 350、二甲基氨基香豆素、5/6-羧基     ·Dabsyl、Dabcyl、
荧光黄、Alexa 488、ATTO 488、DY-505         BHQ 1、QSY 35
·5/6-羧基荧光黄、Alexa 488、Alexa 532、    ·BHQ 2、QSY 9、
Alexa 546、Alexa 555、ATTO 488、ATTO        ATTO540Q
532、四甲基罗丹明、Cy 3、DY-505、DY-547、
·Alexa 635、Alexa 647、ATTO 600、ATTO      ·BHQ 3、ATTO
655、DY-632、Cy 5、DY-647 Cy 5.5            612Q、QSY21
与酶促事件相关的生物发光测定产生与催化瞬时速率偶联的光。该方法包括氨基-修饰的脲醛树酯氨基-荧光素或其羧基端被保护的衍生物，其中氨基荧光素的氨基通过酰胺键连接于中心骨架A，得到被组织蛋白酶识别并随后裂解的底物。组织蛋白酶的酶活性导致将氨基荧光素连接至骨架A的肽键裂解，释放氨基荧光素(荧光素酶的底物)。荧光素酶与其底物的下列反应产生可检测到的信号(发光)。由此该方法使组织蛋白酶活性与第二个酶促反应相联系，产生发光作为读出信号。该类型的测定需要开发“前荧光素”(“加笼荧光素”)，其仅当被之前的酶促事件(例如，蛋白酶剪切)转化为荧光素时才作为底物被荧光素酶识别。这样，发光信号直接取决于之前的酶促事件。因此，本发明的另一个实施方案是提供依靠发光检测组织蛋白酶的蛋白水解活性的探针。
在特定实施方案中，该方法涉及底物，其中L2是固体支持物或连接于固体支持物并进一步带有报道分子/淬灭剂对的一个成员，或其中L2是固体支持物与报道分子/淬灭剂对的一个成员的组合，并且L1是该对的另一个成员。这样，暗固体支持物在与适当的蛋白酶反应后成为荧光的固体支持物。
固体支持物可以是载玻片、微孔板或任何本领域技术人员已知的聚合物，例如，官能化的聚合物(优选以珠的形式)，化学修饰的氧化表面如二氧化硅、五氧化二钽或二氧化钛，或化学修饰的金属表面，例如，贵金属表面如金或银表面。固体支持物也可以是合适的传感元件。
优选地，式(I)化合物包含作为组织蛋白酶K的抑制剂的基团A。国际专利申请WO06076796、WO06076797、WO06063762和WO05049028公开了可用于转化到式(I)探针中的选择性组织蛋白酶K抑制剂的实例。更优选地，式(I)化合物是用于组织蛋白酶K的探针，特征为包含下列优选骨架A的化合物：
Figure G2008800062956D00121
Figure G2008800062956D00141
Figure G2008800062956D00151
Figure G2008800062956D00161
Figure G2008800062956D00191
Figure G2008800062956D00201
Figure G2008800062956D00211
Figure G2008800062956D00221
其中：
X是-CONH-R2-L2，
Y是-{L-R1-L1}n，
R1、R2、L、L1、L2和n如上所描述，并且
R是H、C1-C6-Alkyl。
化合物1.-28.是组织蛋白酶K的底物，用L1进入S1口袋；化合物29.-63.是组织蛋白酶K的底物，L1在S3口袋中或位于其上(外面)。
进一步优选地，式(I)化合物包含作为组织蛋白酶S的抑制剂的基团A。国际专利申请WO04089395、WO05040142、WO0055144、WO05074904和WO0069855公开了可用于转化到式(I)探针中的选择性组织蛋白酶S抑制剂的实例。更优选地，式(I)化合物是用于组织蛋白酶S探针，特征为包含下列优选骨架A的化合物：
Figure G2008800062956D00222
Figure G2008800062956D00231
Figure G2008800062956D00251
Figure G2008800062956D00271
Figure G2008800062956D00281
Figure G2008800062956D00291
Figure G2008800062956D00301
Figure G2008800062956D00311
Figure G2008800062956D00321
其中：
X是-CONH-R2-L2，
Y是-{L-R1-L1}n，
R1、R2、L、L1、L2和n如上所述，并且
R是H、C1-C6-烷基。
化合物64.-85.是组织蛋白酶S的底物，用L1进入S1口袋；化合物86.-119.是组织蛋白酶的底物，L1在S3口袋中或位于其上(外面)。
通过使用适当的本领域已知的保护基化学以建立中心骨架A并经由基团L和基团-C(O)-NH-将连接基团和标记1或2连接于该单元可以合成本发明的成像探针。适当的结构单元和FRET对如花青染料(例如Cy3 B、Cy 5.5、Cy 7)可商购可得(例如，Sigma-Aldrich，GE-健康护理)。对于描述于本发明的探针的一个亚组而言，固相合成方法尤其有用(B.J.Merrifield，Methodsin Enzymology 1997，289，3-13)。取决于合成所需，连接连接基团、淬灭剂或荧光团可以在固体支持物上或经液相化学操作。
一般而言，中心骨架A上的活性侧链残基和任选的基团L将相继地被保护和脱保护，以便于用亚单元L1R1和L2R2分别地进一步修饰。可通过已知的化学合成方法完成这些亚单元的键合。尤其有用的是染料活性酯和骨架A的伯胺基之间的反应，以通过酰胺键连接两单元。中间体和最终的探针分子在其用于标记和成像实验之前可通过高效液相色谱(HPLC)纯化，并通过质谱和分析型HPLC进行表征。
通过下列段落中一些非限制性实例阐述本发明：
在优选的实施方案中，式(I)探针包含衍生自二肽组织蛋白酶S抑制剂的骨架A，其如上述No.62所示以及如WO2005/082876所公开的在P1位置和P1-初始(prime)位置带有生色团的物质。以其光谱性质适合于荧光共振能量转移(FRET)的方式选择适当的生色团。生色团可以是荧光的或非荧光的。原则上，多种生色团可用于本发明，只要满足蛋白酶剪切肽键后光谱改变这一核心条件。任选地通过连接基团单元完成这些相互作用的生色团和中心骨架的连接。
优选地，荧光团选自呫吨-或花青染料。更优选的花青染料选自碳花青类、硫杂花青类、氧杂花青类和氮杂花青类。适合用于本发明的花青染料公开于US5,268,468和U.S.5,627,027。其包括商标为(Amersham，GE健康护理)Cy 3、Cy 3B、Cy 3.5、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7和Cy 7.5的染料。
优选地，淬灭剂单元是非荧光生色团，其包括2，4-二硝基苯基、4-(4-二甲基氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)、7-甲氧基-香豆素-4-基)乙酰基和非荧光花青-染料，如WO9964519中所描述。
在优选的实施方案中，淬灭剂不显示明显的发射，并且更优选地是非荧光生色团。在该实施方案中，成像试剂包含荧光团和非荧光的(暗)受体生色团。更优选地是基于在P1位置带有BHQ3-淬灭剂和在P1-初始位置带有CY 7荧光团的组织蛋白酶S特异性骨架的探针(Abb.2)。
更优选地是基于在P1位置带有QSY 21-淬灭剂和在P1-初始位置带有CY 5.5荧光团的吗啉二肽骨架的式(I)探针(方案2)：
Figure G2008800062956D00351
(方案2)
进一步优选的实施方案包括在P1带有暗淬灭剂BHQ 3和在P1-初始位置带有Cy 7荧光团的相同的骨架(方案3)：
Figure G2008800062956D00361
(方案3)
在进一步优选的实施方案中，如WO9924460中公开的用于组织蛋白酶S的苯甲酰胺二肽骨架A通过使淬灭剂分子QSY 21位于P1和使荧光团CY 5.5位于P1-初始位置而转化为成像探针(方案4)：
Figure G2008800062956D00371
(方案4)
在进一步优选的实施方案中，上述苯甲酰胺二肽骨架是修饰的并且使淬灭剂QSY 21位于相应于P3的位置(方案5)。
Figure G2008800062956D00381
(方案5)
进一步优选的是基于在P1位置带有非荧光的BHQ 3淬灭剂和在P1′位置带有CY7荧光团的组织蛋白酶S特异性苯甲酰胺骨架的探针(方案6)。
Figure G2008800062956D00391
(方案6)
在进一步优选的实施方案中，上述苯甲酰胺骨架是修饰的并且使荧光BHQ 3淬灭剂位于相应于P3的位置(方案7)。
Figure G2008800062956D00401
(方案7)
用于组织蛋白酶K的特异性成像探针以相似于上述组织蛋白酶S探针的方法构建。
在进一步优选的实施方案中，式(I)的探针包含作为基团A的基于哌嗪的骨架，其衍生自如WO2005049028中公开及如上No.1所示的组织蛋白酶K抑制剂，在P1位置和P1-初始位置具有生色团。
在优选的实施方案中，选择荧光黄和四甲基罗丹明作为相互作用的FRET对，并且使四甲基罗丹明位于骨架的P1位置而荧光黄经由P1-初始位置连接，如方案8中所示：
Figure G2008800062956D00411
(方案8)
在优选的实施方案中，淬灭剂不显示明显的发射，并更优选地是非荧光生色团。在这种实施方案中，成像试剂包含荧光团和非荧光(暗)受体生色团。更优选地是式(I)的探针，基于在P1位置带有BHQ 3淬灭剂和在P1-初始位置带有CY 7荧光团的组织蛋白酶K特异性骨架，如方案9中所示：
Figure G2008800062956D00421
(方案9)
基于哌嗪-骨架，进一步优选的实施方案包括式(I)的组织蛋白酶K探针，其中使淬灭剂分子位于骨架的P3位置而相应的荧光团Cy 5.5保留在P1-初始位置(方案10)：
Figure G2008800062956D00431
(方案10)
在进一步优选的实施方案中，组织蛋白酶K探针的淬灭剂单元包含在P3位置的非荧光BHQ 3淬灭剂和在P1-初始位置的相应荧光团Cy 7(方案11)：
Figure G2008800062956D00441
(方案11)
进一步优选的实施方案是用于组织蛋白酶K的探针，包含作为骨架A的噻唑(公开于U.Grabowska等人，Curr.Opin.Drug Disc.2005，8，619-630)。因此，进一步优选的用于组织蛋白酶K活性的成像的式(I)化合物在噻唑骨架的P1位置包含淬灭剂并在P1-初始位置包含荧光团Cy5.5(方案12)：
Figure G2008800062956D00451
(方案12)
相同的设计原则应用于组织蛋白酶K探针，其中非荧光淬灭剂分子BHQ 3用于P1位置且荧光团CY 7经由P1-初始位置连接(方案13)：
Figure G2008800062956D00461
(方案13)
在进一步优选的实施方案中，FRET-对的一个相互作用配偶体包含纳米颗粒。在本发明中更优选地是CdSe纳米颗粒(例如，量子点)和掺杂镧系元素-离子的氧化纳米颗粒(例如，Y0.6Eu0.4VO4)。如果这种纳米颗粒用作FRET对中的供体，它们能够在远小于受体吸收的波长处被激发，由此最小化直接的受体激发。另外，狭窄的供体发射不与受体发射重叠。另外，这种纳米颗粒证明比经历快速光致漂白的有机染料更加耐光。活化的量子点可市购得到(Invitrogen，Molecular probes)并且它们的发射波长能够从许多产品中选择。
方案14和15显示对半胱氨酸组织蛋白酶S特异性的基于量子点的式(I)探针。因此，在进一步优选的式(I)探针中，量子点(QD605)可经由适当的连接基团连接在组织蛋白酶S探针的P1(方案14)或P1-初始位置(方案15)：
Figure G2008800062956D00471
(方案14)，
Figure G2008800062956D00481
(方案15)
量子点表示为灰色圆形物，适当的受体分子用花青染料CY 7代表。
在进一步优选的实施方案中，式(I)探针中的量子点经由可蛋白酶剪切的亚单元与金-纳米颗粒连接(方案16)：
(方案16)
已证明金纳米颗粒(AuNP)是对有机荧光染料和量子点有效的淬灭剂。量子点联合AuNP的应用例如公开于WO2006126570中。
在进一步优选的实施方案中，式(I)的探针由多-FRET系统组成，其中两个特异性蛋白酶探针共价连接在一起(方案17)：
Figure G2008800062956D00491
(方案17)
在这种构型中可以在单个波长激发并使用不同的发射比值作为独特的FRET标志。(参见K.E Sapsford等人Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，4562-4588)。这种探针将两种特异性组合于一个分子中，所述分子是对组织蛋白酶K特异性的骨架且是对组织蛋白酶S特异性的骨架。
在方案18中显示了优选用于式(I)化合物中的组织蛋白酶K探针的结构，其中两个亚基A(对组织蛋白酶K有特异性)用暗淬灭剂BHQ-3衍生化并共价连接于相同的荧光染料(例如Cy 7)：
Figure G2008800062956D00501
(方案18)
在进一步优选的实施方案中，式(I)的探针被设计为具有长的循环时间、高的肿瘤累积并含有淬灭的荧光标记物，该荧光标记物经酶激活后在近红外光谱形成荧光。这些探针基于合成的移植共聚物[局部甲氧基聚(乙二醇)修饰的聚-D或L-赖氨酸]，多个NIR荧光染料与所述共聚物上游离的聚-赖氨酸残基连接。由于NIR-生色团的高密度和密切接近导致的内部淬灭，这些高分子的荧光被极大地降低。
作为实例，方案19显示基于聚合物的组织蛋白酶K探针，其中A与聚-赖氨酸主链的连接经由P1位置的连接基团实现，而NIR-生色团Cy 5.5连接于P1-初始位置：
Figure G2008800062956D00511
(方案19)
方案20中显示了相反的情况，其中NIR-生色团Cy 5.5连接于P1位点，而聚-赖氨酸主链经由在P1-初始位置的连接基团被连接：
Figure G2008800062956D00512
(方案20)
在进一步优选的实施方案中，设计式(I)的探针以用于均相酶联发光测定。下列方案概括地显示上述提及的作用机制。荧光素是荧光素酶的底物并且发光的信号通过第二个酶促反应产生：
Figure G2008800062956D00521
下列方案显示上述提及的作用机制，其中荧光素用哒嗪并二氮杂
Figure G2008800062956D00522
-衍生物掩蔽并经所述组织蛋白酶K的蛋白水解活性而释放：
Figure G2008800062956D00523
本发明进一步涉及用于观察单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组(例如，一种半胱氨酸组织蛋白酶或多种半胱氨酸组织蛋白酶)在体外测定、细胞或多细胞有机体中的催化活性的分子探针的设计方法，特征在于将单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组的抑制剂转化为用于这些单个蛋白水解酶或蛋白水解酶组、优选半胱氨酸组织蛋白酶的基于选择性活性的探针。为实现该目标，我们用易裂解的肽键代替某些已知的半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂的亲电子基团。以通过特定靶点的酶促(例如，蛋白水解的)活性生成可检测信号的方式合成优选的化合物。特别地，优选的探针包含内部淬灭的荧光团(例如，适当的FRET-对)，所述荧光团连接至(i)在易裂解的键的N-端部分的特异性决定部分A以及(ii)在易裂解的键的C-端部分。本发明使得已知抑制剂的所需要的并先前优化的性质的要素转化为新颖的基于活性的探针。
现有技术中描述的组织蛋白酶抑制剂利用了腈基。本发明的成像探针利用所述已知骨架并引入两处修饰，首先用可裂解的酰胺基团取代腈基，其次在酰胺基团的两侧安置相互作用的标记对或性能调节剂。
在体外，蛋白酶与本发明的底物的反应通常能够在细胞提取物中或用纯化的或浓缩的酶的形式完成。对于体内应用而言，报道基团优选在近红外(NIR)区发射，因为该区域没有干扰性生物荧光。符合这些需要的已知花青NIR染料优选结合于本发明的底物中。
式(I)化合物的分子结构由带有酰胺官能团且分别有两个亚单元L1R1和L2R2的中心骨架A组成。如式(I)所示，L2R2总是通过酰胺基连接于骨架A，因为酰胺基能被组织蛋白酶裂解。本领域技术人员能够选择适当的官能团将亚单元L1R1连接于骨架A，并在下文给出实例。可使前体化合物中的特定的官能团L’可位于骨架A上来连接合适的L1R1亚单元而产生式(I)化合物中的基团L，其仅受限于合成策略的需要和该底物作为基于活性的成像试剂的最终应用。因此它们的选择将取决于为构建所需要的底物而选择的特定试剂。可提供于骨架A上以将A与亚单元R1L1连接的官能团L’的实例包括氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、叠氮基、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、醛、羟基、烷氧基、芳基氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳-碳双键、碳-碳三键等。最优选的实例包括氨基、叠氮基、羟基、氰基、羧基、氨基甲酰基、醛、碳-碳双键或碳-碳三键。因此，L优选是直接的键或选自下面的基团：
Figure G2008800062956D00541
-(NRx)-、-O-、-C＝N-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)H、-CRx＝CRy-、-C≡C-和苯基，其中Rx和Ry独立地是H或(C1-C6)烷基。
特别地，优选利用正交的受保护官能团合成式(I)化合物。这种保护基的选择使得能够独立地脱保护，从而每个被释放的官能团依次能进一步被化学处理以将相应的亚单元连接于骨架A。用于预期官能团的适当保护基可由本领域技术人员选择，例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts在“ProtectiveGroups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，John Wiley & Sons，纽约1991中所总结的那些。
式为L’-A-CO-OH(骨架)的化合物可用本领域已知的标准方法制备，例如，国际专利申请WO06076796、WO06076797、WO06063762、WO05049028、WO04089395、WO05040142、WO0055144、WO05074904和WO0069855中所描述的方法。
本发明还涉及式(I)化合物的制备方法，其中n为1，特征在于：
(a)将式(II)化合物在本领域技术人员已知的条件下与式L1-R1-H化合物反应，
L’-A-CO-OH        (II)
其中A如上文其通常及优选的含义所定义，L’是氟、氯、溴、氰基、硝基、氨基、叠氮基、烷基羰基氨基、羧基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、醛、羟基、烷氧基、芳基氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、碳-碳双键、碳-碳三键，优选是氨基、叠氮基、羟基、氰基、羧基、氨基甲酰基、醛、碳-碳双键或碳-碳三键，更优选是氨基，
其中L1如上文其通常及优选的含义所定义，
得到式(III)化合物
L1-R1-L-A-CO-OH    (III)
(b)将化合物(III)与化合物H2N-R2-L2反应，得到式(I)化合物。
任选地，利用正交的受保护官能团合成式(I)化合物。
这种保护基的选择使得能够独立地脱保护，从而每个被释放的官能团依次能进一步被化学处理以向其连接标记或用于引入连接基团R1和/或R2的进一步延伸。用于预期官能团的适当保护基可由本领域技术人员选择，例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts在“Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基)”，John Wiley & Sons，纽约1991中所总结的那些。
另外的式(I)探针的制备方法包括：
(a1)将式(II)化合物在本领域技术人员已知的条件下与式(IV)化合物反应
H2N-L2-PG2  (IV)
得到式(V)化合物
L’-A-CO-NH-R2-PG2  (V)
(b)随后将化合物(V)在对保护基而言的本领域技术人员已知的条件下与化合物(VI)反应
PG1-R1-L”  (VI)
得到化合物
PG1-R1-L-A-CO-NH-R2-PG2  (VI)
其中：
PG1和PG2是彼此独立的保护基，优选是正交保护基，
L”是本领域技术人员选择的对L’而言的各个连接基团或键，
(c1)将化合物(VI)的PG2基团裂解，将所得产物与标记L2反应，随后将保护基团PG1裂解，将所得产物与标记L1反应，得到式(I)化合物，或
(c2)将化合物(VI)的PG1基团裂解，将所得产物与标记L1反应，随后将保护基团PG2裂解，将所得产物与标记L2反应，得到式(I)化合物。
在步骤(b)中，L’和L”的优选组合及反应类型(括号中)如下：
当L’是氟、氯、溴、碘时，L”是氨基(R-NH2)、羟基(R-OH)、三键(薗头(Sonogashira)反应)、双键(赫克(Heck)反应)、烷基硼烷(铃木(Suzuki)反应)；
当L’是氰基时，L”是氨基(R-NH2)、羟基(R-OH)、硫羟基(R-SH)；
当L’是氨基时，L”是活化的羧酸(NHS-酯，......)、醛、氟、氯、溴、碘；
当L’是叠氮基时，L”是三键、膦基团(施陶丁格(Staudinger)连接)；
当L’是羧基时，L”是氨基、羟基、酰肼；
当L’是烷氧基羰基时，L”是氨基、羟基、酰肼；
当L’是芳氧基羰基时，L”是氨基、羟基、酰肼；
当L’是羟基时，L”是氟、氯、溴、碘、羟基(光延(Mitsunobu)反应)、羧基；
当L’是醛时，L”是氨基、肼；
当L’是碳-碳双键时，L”是溴、氯、碘(赫克反应)、烷基硼烷(铃木反应)；
当L’是碳-碳三键时，L”是溴、氯、碘(薗头反应)、叠氮基。
优选地，在固体支持物上合成用不同标记官能团化的半胱氨酸蛋白酶底物。根据标记对固相合成的相容性来使用固体支持物和液相合成的组合。
在实施例5-8中进一步描述了式(1)化合物的制备，其中基团A由组织蛋白酶S抑制剂构成，L1为6-((4，4-二氟-1，3-二甲基-5-(4-甲氧基苯基)-4-硼杂-3a，4a-二氮杂-s-引达省-2-丙酰)氨基)己酸，残基(商品名：BODIPY-TMR-X，Invitrogen)，且L2是淬灭剂QSY-7。使用氯-三苯甲基树脂在固体支持物上制备实施例5的含具有Boc-保护的侧链的氨基的C-端赖氨酸残基的骨架。所得C-端羧酸偶联于单Fmoc-保护的丁烷-1，4-二胺，其在溶液中进一步修饰。通过本领域已知的方法例如通过与TFA反应除去赖氨酸侧链的Boc-基团后，将荧光团(优选作为其N-羟基琥珀酰亚胺酯而被活化)在标准条件下偶联于所述肽。偶联的中间体化合物可任选地被纯化，例如通过制备HPLC纯化。在除去C-端Fmoc-基团后，将淬灭剂(优选作为其N-羟基琥珀酰亚胺酯而被活化)偶联于所述肽，并用制备HPLC纯化最终产物。
对若干具有拟肽结构的半胱氨酸组织蛋白酶底物的合成而言，可以使用非肽结构单元来固相合成。结构单元合成进一步分别描述于实施例20-22，
Figure G2008800062956D00571
实施例23-24，
Figure G2008800062956D00572
以及实施例17，
结构单元(II)优选用于式(I)化合物的合成，其中两个不同的标记连接于探针的C端和N端。
结构单元(III)优选用于组织蛋白酶K探针的合成。
结构单元(IV)优选用于组织蛋白酶B探针的合成，例如，实施例18和19的化合物。
本发明的探针优选是用于组织蛋白酶K、组织蛋白酶S或组织蛋白酶B的探针。
本发明的探针用于体外、细胞培养实验、离体实验或生命有机体(体内)中的分子成像，包括筛选和全动物成像。最优选的是成像模式如光学成像和核磁共振成像(MRI)。
本发明的探针旨在用于蛋白酶活性的诊断成像。最优选的应用是提供监测药物或类药物质对靶蛋白酶的作用的方法。这种药物或类药物质的施用应当对来自本发明探针的信号具有可测量的效果。
本发明的探针进一步最优选的方面是其作为成像试剂在外科指导和监测药物治疗效果中的应用。外科指导包括肿瘤边缘的检测和肿瘤转移进程的检测。
因此，本发明另一个的方面是使生命有机体成像的方法，包括：
(a)向所述有机体施用式(I)的探针，
(b)将所述有机体暴露于激发非淬灭荧光团的电磁辐射，以产生可检测的信号，以及
(c)检测所述信号并由此创建图像。
或者，使生命有机体成像的方法包括：
(a)向所述有机体施用式(I)的探针，
(b)将所述有机体暴露于激发荧光团的电磁辐射，以产生可检测的信号；以及
(c)检测所述信号并由此创建图像。
“生命有机体”可以是任何包含待检测的半胱氨酸蛋白酶的活细胞或整体有机体，优选的生命有机体是哺乳动物，例如，小鼠或大鼠。
本发明的探针有高度选择性，借此能够避免假阳性的风险。
缩写：
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲基亚砜
DCM＝二氯甲烷
equiv.＝当量
sat.＝饱和的
THF＝四氢呋喃
DIPEA＝二异丙基-乙基胺
HOBt＝1-羟基苯并三唑
HBTU＝O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基-脲-六氟膦酸盐
NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺酯
固相肽合成的通用方法
用标准固相肽合成来合成下列探针。用氯-三苯甲基-树脂作为固体支持物。将2当量Fmoc-保护的氨基酸和3当量DIPEA溶解于DCM并将反应混合物加于树脂以负载树脂(负载量1.4mmol/g)。室温下搅拌反应混合物过夜。用DCM和DMF洗涤树脂。用30％哌啶/DMF溶液经15分钟处理所述树脂两次以使Fmoc脱保护。使用标准方案进行固相肽合成：将4当量Fmoc-保护的氨基酸、4当量HBTU、4当量HOBt和8当量DIPEA溶解于DCM/DMF(1/1)的混合物中。室温下搅拌反应混合物20分钟然后加于树脂。保温反应混合物2小时。为从固相上裂解，用含2％TFA的DCM处理树脂。减压下用甲苯共蒸发溶剂并经制备HPLC(洗脱梯度：H2O+0.05％TFA；5至95％CH3CN)纯化最终产物。
实施例1：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00601
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1033.25，实测值：[M+H]+＝1033.40。收率：97％。
实施例2：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00611
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1042.26，实测值：[M+H]+＝1042.40。收率：82％。
实施例3：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00612
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1341.59，实测值：[M+H]+＝1341.45。收率：91％。
实施例4：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00621
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M/2]+＝829.95，实测值：[M/2]+＝829.95。收率：62％。
实施例5
Figure G2008800062956D00622
根据通用方法在固体支持物上制备化合物并未经纯化地进一步使用。
计算值：[M+H]+＝513.7，实测值：[M+H]+＝513.3。
实施例6
Figure G2008800062956D00631
将实施例5的化合物、1.2当量HOBt、1.3当量HBTU和2当量DIPEA溶解于DCM/DMF并在室温下搅拌20分钟。将2当量单-Fmoc-保护的丁烷-1，4-二胺和1.5当量DIPEA加入反应混合物中，然后搅拌过夜。除去溶剂，残余物经硅胶(洗脱梯度：DCM/1-5％MeOH)纯化。计算值：[M+H]+＝805.0，实测值：[M+H]+＝806.5。收率：55％。
实施例7
Figure G2008800062956D00641
将实施例6的化合物溶解于50％TFA/CH2Cl2并在室温下搅拌反应混合物10分钟以除去Boc-基团。溶剂与甲苯共蒸发并将残余物溶解于DMF。将1当量的BodipyTMR-X-OSu和6当量的DIPEA加入反应混合物中。反应混合物在室温下搅拌12小时。除去溶剂并用制备HPLC(Plab)纯化最终产物。计算值：[M+Na]+＝1221.3，实测值：[M+Na]+＝1221.6。
实施例8
Figure G2008800062956D00651
将实施例7的化合物溶解于Et2NH/DMF(1/4)并在室温下搅拌反应混合物30分钟以除去Fmoc-基团。减压除去溶剂并将残余物再溶解于DMF。将QSY 7OSu和6当量的DIPEA加入反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌12小时。除去溶剂并用制备HPLC(洗脱梯度：H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化最终产物。计算值：[M/2]+＝808.4，实测值：[M/2]+＝808.5。
实施例9：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00661
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(洗脱梯度：H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1114.3，实测值：[M+H]+＝1114.4。
实施例10：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00662
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLC(洗脱梯度：H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1198.3，实测值：[M+H]+＝1198.3。
实施例11：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00671
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLC(洗脱梯度：H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+Na]+＝1619.1，实测值：[M+Na]+＝1619.9。
实施例11a：组织蛋白酶S探针
Figure G2008800062956D00681
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLC(洗脱梯度：H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。
实施例12：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00682
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1117.37，实测值：[M+H]+＝1117.50。收率：45％。
实施例13：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00691
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1186.4，实测值：[M+H]+＝1186.3。收率：90％。
实施例14：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00692
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1273.4，实测值：[M+H]+＝1273.4。
实施例15：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00701
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1301.5，实测值：[M+H]+＝1301.3。
实施例16：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00711
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M]+＝1663.9，实测值：[M]+＝1663.7。
实施例17：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00721
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。
实施例18：组织蛋白酶K探针
Figure G2008800062956D00731
根据固相肽合成的通用方法在固体支持物上制备该化合物并按照如实施例5至实施例8的转化所描述的相同方法进一步修饰。化合物用HPLCH2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。
实施例19
Figure G2008800062956D00732
将4-Fmoc-氨基丁酸、1.1当量的HOBt、1.1当量的HBTU和2当量的DIPEA溶解于DMF/DCM(1/1)并在室温下搅拌20分钟。将4-氨基-2-氟苯甲酸和2当量的DIPEA加入反应混合物并在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂并经色谱(洗脱梯度：DCM/1-3％MeOH)处理残余物。计算值：[M+H]+＝463.5，实测值：[M+H]+＝463.1。收率：60％。
实施例20：组织蛋白酶B探针
Figure G2008800062956D00741
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M+H]+＝1615.8，实测值：[M+H]+＝1615.5。收率：42％。
实施例21：组织蛋白酶B探针
Figure G2008800062956D00751
根据通用方法在固体支持物上制备该化合物并用HPLC(H2O+0.05％TFA；4-95％CH3CN)纯化。计算值：[M/2]+＝718.3，实测值：[M/2]+＝718.8。收率：10％。
实施例22：1-Boc-4-(3-氯丙基)-哌嗪
向4.94g 1-哌嗪-甲酸叔丁酯和12.66g 1-溴-3-氯丙烷的15ml DMF(干燥)的溶液加入4.08g K2CO3，将反应物加热至50℃达1分钟，并在室温下再搅拌3小时。将该反应混合物倾入200ml水中并用DCM萃取。合并有机相、用水洗涤、经MgSO4干燥并真空蒸发。产物经快速柱色谱(正庚烷/乙酸乙酯1∶1，RF＝0.3)纯化，产量为3.9g。
实施例23：1-Boc-4-(3-叠氮基丙基)-哌嗪
将4-(3-氯丙基)-1-哌嗪甲酸叔丁酯和叠氮化钠溶解(混悬)于8ml干燥DMSO中并加热至90℃达15小时。将反应混合物冷却至室温并倾入50ml水中。用DCM萃取产物，合并有机相并经MgSO4干燥。产物经快速柱色谱(正庚烷/乙酸乙酯1∶1，RF＝0.34)纯化。产量：3.5g。
实施例24：(3-叠氮基丙基)-哌嗪
将3.5g 1-Boc-4-(3-叠氮基丙基)-哌嗪溶解于30ml MeOH/DCM(3/1)中并加入10ml TFA。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟，通过加入150ml叔丁基-甲基醚，析出产物。产量为2.3g。
实施例25：甲基-哌嗪基硫脲
将硫羰基二咪唑和1当量的N-甲基-哌嗪溶解于THF。将反应混合物在室温下搅拌1小时并在55℃搅拌1小时。除去一半溶剂并向该反应混合物中加入等量的2.0M NH3/MeOH溶液，然后在室温下搅拌过夜，最后在55℃搅拌2小时。过滤产物并用乙醚洗涤，收率：57％。
实施例26：甲基-哌嗪基-噻唑基-苯甲酸
将4-甲基-哌嗪基硫脲和4-(2-溴乙酰基)苯甲酸溶解于THF。将反应混合物加热回流3小时。过滤产物并用醚洗涤。
实施例27：活性测定
对体外测定而言，将含有1μg蛋白酶的20μl AHNP-缓冲液(150mMAcetat/HEPES，300mM NaCl；0.001％普流兰尼克pH6.5和50μl半胱氨酸(300mM)在37℃活化5分钟。将底物溶解于DMSO并以50μM的终浓度加入到酶溶液中。
用Tecan SAFIRE II光谱仪(激发波长：336nm；发射波长：490nm；激发谱带：10.0nm；发射谱带：10.0nm；放大(人工的)：90)测定荧光。
表1：实施例2化合物的体外测定结果
  组织蛋白酶S   组织蛋白酶K   组织蛋白酶X   木瓜蛋白酶   组织蛋白酶B   组织蛋白酶L
  酶分子量(Da)   24000   27000   27000   23400   27500   29000
  EO(摩尔/L)   2.3E-08   6.3E-08   2.8E-08   1.1E-08   5.2E-09   3.6E-09
  KM(M)   3.2E-05   1.9E-04   8.7E-04   5.2E-04   1.2E-04   8.3E-03
  Vmax(纳摩尔/s)   2.4   0.3   72.3   1.6   0.1   4.5
  Kcat(s-1)   0.11   0.00   2.6   0.1   0.0   1.26
  Kcat/KM(M-1s-1)   3260   27   30   273   250   152
(在pH7.5进行测定)
表2：实施例10化合物的体外测定结果
  组织蛋白酶S   组织蛋白酶K   组织蛋白酶X   木瓜蛋白酶   组织蛋白酶B   组织蛋白酶L
  酶分子量(Da)   24000   27000   40000   23400   27500   29000
  EO(摩尔/L)   3.0E-08   3.8E-08   2.8E-08   2.4E-08   1.0E-08   3.2E-09
  KM(M)   -   3.5E-05   4.7E-01   6.3E-06   8.8E-04   7.1E-03
  Vmax(纳摩尔/s)   -   7.3   7997   0.04   2.6   9.7
  Kcat(s-1)   -   0.192   287.4   0.002   0.25   3.01
(在pH5.5进行测定)

Claims (13)

1.用于组织蛋白酶S的式(I)的分子探针
{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2        (I)
其中：
A是
其中
X是-CONH-R2-L2，
Y是-L-R1-L1；
R1和R2彼此独立地是连接基团；
L是键或使得易于与L1基团键合的基团；
L1和L2彼此独立地是至少一个任选结合于固体支持物上的标记；并且n是1。
2.根据权利要求1的探针，其中L是直接的键或选自以下的基团：
Figure FSB00000730377700012
-(NRx)-、-O-、-C＝N-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)H、-CRx＝CRy-、-C≡C-和苯基，其中Rx和Ry独立地是H或(C1-C6)烷基。
3.根据权利要求1至2中任意一项的探针，其中R1或R2是具有1至300个碳原子的直链或支链亚烷基，其中任选地
(a)一个或多个碳原子被氧替代，特别是其中每隔两个碳原子的碳被氧替代，例如，具有1至100个亚乙基氧基单元的聚亚乙基氧基团；和/或
(b)一个或多个碳原子被带有氢原子的氮替代，并且相邻碳原子被氧代取代，代表酰胺官能团-NH-CO-；和/或
(c)一个或多个碳原子被酯官能团-O-CO-替代；
(d)两个相邻碳原子之间的键是双键或三键；和/或
(e)两个相邻碳原子被二硫键替代。
4.根据权利要求1至3中任意一项的探针，其中标记L1和L2彼此独立地是光谱探针如荧光团；淬灭剂或生色团；磁探针；对比试剂；作为能够特异性结合于配偶体的特异性结合对的一部分的分子；共价连接于固体支持物的分子，其中支持物可以是载玻片、微孔板或本领域技术人员已知的任何聚合物；具有需要的酶促、化学或物理性质的生物分子；或具有上列任何性质的组合的分子；或正电荷的直链或支链聚合物。
5.根据权利要求4的探针，其中标记L1和L2彼此独立地结合于正电荷的直链或支链聚合物。
6.根据权利要求5的探针，其中标记L1和L2之一是具有6-15个精氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的直链聚(精氨酸)。
7.根据权利要求4至5中任意一项的探针，其中L1是两个相互作用的光谱探针L1/L2的一个成员且L2是另一个成员。
8.根据权利要求7的探针，其中L1/L2是FRET对。
9.根据权利要求8的探针，其中L1/L2之一是选自下列的荧光团：Alexa350、二甲基氨基香豆素、5/6-羧基荧光黄、Alexa488、ATTO488、DY-505、5/6-羧基荧光黄、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、ATTO488、ATTO532、四甲基罗丹明、Cy3、DY-505、DY-547、Alexa635、Alexa647、ATTO600、ATTO655、DY-632、Cy5、DY-647、Cy5.5并且标记L1/L2中的另一个是选自下列的淬灭剂：Dabsyl、Dabcyl、BHQ1、QSY35、BHQ2、QSY9、ATTO540Q、BHQ3、ATTO612Q、QSY21。
10.根据权利要求1的探针，选自：
Figure FSB00000730377700031
Figure FSB00000730377700041
Figure FSB00000730377700051
11.根据权利要求1至10的式(I)探针用于在体外、细胞培养实验、离体实验或生命有机体中分子成像的应用。
12.根据权利要求1至10的式(I)探针在生命有机体成像中的应用，包括：
(a)向所述有机体施用式(I)的探针，
(b)将所述有机体暴露于激发非淬灭荧光团的电磁辐射，以产生可检测的信号，以及
(c)检测所述信号并由此创建图像。
13.根据权利要求1至10的式(I)探针在生命有机体成像中的应用，包括：
(a)向所述有机体施用式(I)的探针，
(b)将所述有机体暴露于激发荧光团的电磁辐射，以产生可检测的信号；以及
(c)检测所述信号并由此创建图像。
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