FI56525C - Nya kromogena trombinsubstrat - Google Patents
Nya kromogena trombinsubstrat Download PDFInfo
- Publication number
- FI56525C FI56525C FI762010A FI762010A FI56525C FI 56525 C FI56525 C FI 56525C FI 762010 A FI762010 A FI 762010A FI 762010 A FI762010 A FI 762010A FI 56525 C FI56525 C FI 56525C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- arg
- phe
- pna
- analysis
- group
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
- C07K1/064—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amino or -guanidino functions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
[B] (11)KUULUTUSjULKAISU CCCOC 1 J ' ' UTLÄGGNI NGSSKMFT 3Q3‘5 ^ (45) Patentti oyönnetty II Γ.2 1930 *^Sv3 Patent meddelat (51) Kv.lk.*/lnt.CI.· Q Q? C 103/52 β 01 N 31/1* SUOMI—FINLAND pi) hw^i»ic.i»u.-PK«itwei<ni«i 762010 (22) HakmnitpUvl—AmBkitlngadag O9.O7.76 (23) Alkupttv·—GUtlghatsdag 09.0j.j6 (41) Tullut julkitaksl — Bltvit offwttllf 12.01.77
Patentti· ia rekisterihallitut /ϋ, , ,. „ • (44) Nihtlvikslpanon |a kuuLJulkaisun pvm. —
Patent- och registerstyrelaen ' AniBktn utl*|d och utl.»krHtan publlcarad 31.10.79 (32)(33)(31) Pyy*1·**/ atuolkau* — Begird prlorltat H. 07. J 5
Ruotsi-Sverige(SE) 7507975“6 (71) Aktiebolaget Kabi, S-lOH 25 Stockholm, Ruotsi-Svenge(SE) (72) Bo Thuresson af Ekenstam, Mölndal, Leif Erik Aurell, Särö,
Karl Göran Claeson, Särö, Birgitta Gunilla Karlsson, Mölndal,
Ruotsi-Sverige(SE) (7^) Berggren Oy Ab (5M Uusia kromogeenisia trombiinin substraatteja - Nya kromogena trombinsubstrat Tämä keksintö koskee uusia kromogeenisia substraatteja trombiinia ja trombiinintapaisia entsyymejä varten. Keksinnön mukaiset substraatit sopivat erityisesti trombiinin kvantitatiiviseen määritykseen tai sellaisten reaktioiden tutkimiseen, joissa trombiinia muodostetaan, inhiboidaan tai kulutetaan tai niiden tekijöiden määrittämiseen, joilla on vaikutusta tällaisiin reaktioihin tai jotka ottavat osaa niihin, esimerkiksi anti-trombiinin, protrombiinin ja hepariinin määrittämiseen.
Entsyymien määrittämiseen tarkoitetuilla substraateilla on suuria etuja verrattuna luonnon substraatteihin edellyttäen, että ne täyttävät tietyt ehdot, joita ovat suuri herkkyys ja spesifisyys ko. entsyymille, hyvä liukoisuus veteen tai biologiseen koenesteeseen ja joidenkin lohkeamistuotteiden helppo todettavuus.
Erästä tähän saakka parhaista kasvualusta-aineista trombiinimääri-tykseen kuvataan ruotsalaisessa patentissa nro 380257 (vastaa FI hak. 1299/73) ja se koostuu kromogeenisesta tripeptidijohdannaisesta (lyhenteiden suhteen katso sivu 4):
Bz-Phe-Val-Arg-pNA (S-2160) A
2 56525 Tällä on suuri herkkyys trombiinille ja se antaa entsymaattisessa hydrolyysissä kromoförisen p-nitroaniliinituotteen, joka voidaan helposti määrittää spektrofotometrisesti. Yhdisteen S-2160 haittana on kuitenkin sen suhteellisen pieni liukoisuus (1 mg/ml).
Pieni liukoisuus aiheuttaa sen haitan, että on toimittava hyvin lähellä substraatin kyllästysrajaa jotta saavutettaisiin substraatin tyydyttävä väkevyys. Entsyymin määrityksessä erilaisissa biologisissa systeemeissä voi tapahtua substraatin saostumista sellaisenaan tai yhdistettyä proteiini/substraatin saostumista. Sanotut saostumiset voivat aiheuttaa virheellisiä spektrofotometrilukemia ja näin ollen virheellisiä entsyymimäärityksiä. Entsyymin substraatti S-2160 tulee huomattavasti liukoisemmaksi jos bentsoyyliryhmä korvataan vetyatomilla, siis
H-Phe-Val-Arg-pNA B
Nyt vapaan protonin sisältävä aminoryhmä Phe-ryhmässä parantaa liukoisuutta, mutta aiheuttaa myös sen, että se nopeus, jolla trombiini lohkaisee substraattia, pienenee voimakkaasti, n. 30-kertaisesti (vrt. Taulukko I). Edelleen aminopeptidaasit voivat hajottaa kasvu-substraatin biologisessa koeliuoksessa ei-toivotulla tavalla N-ketjun-päätteestä.
Tämän keksinnön mukaisesti kaavan B mukaista substraattia on modi-foitu vaihtamalla Vai sykliseen iminohappoon (Aze, Pro tai Pip) ja L-Phe ryhmään D-Phe. Odotetusti näin saadut substraatit ovat yhä erittäin liukoisia, mutta aivan yllättäen aktiivisuus trombiinpa vastaan ei ole laskenut, vaan sensijaan se on 30-50 kertaa suurempi kuin vastaavalla substraatilla, jossa on pelkästään L-aminohappoja (taulukko I). Edelleen nämä uudet substraatit ovat n. 400 % aktiivisempia kuin S-2160. N-päätteessä oleva D-aminohappo estää myös aminopeptidaasien ei-toivotun vaikutuksen, sillä viimemainitut ovat spesifisiä L-aminohapoille. Keksinnön mukaisille uusille kromogeenisille substraateille on luonteenomaista seuraava yleinen kaava D-NH„ - CH - CO - N - CH - CO - NH - CH - CO - NH - R~ 2 I I I T 2 CH2 CH2-(CH2)n «JH2>3
I NH
φ A
H2N NH
R1 3 56525 •tai sen suolat, jossa voi olla vetyatomi tai hydroksiryhmä.
R2 on nitrofenyyli-, naftyyli- tai metoksinaftyyliryhmä ja n voi olla 1, 2 tai 3.
Näiden uusien kromogeenisten entsyymien substraattien synteesiin käytetään tavanomaisia suojaavia ryhmiä ja kytkentämenetelmiä, jotka kaikki ovat hyvin tunnettuja peptidikemiassa.
«.-aminoryhmää suoj aavana ryhmänä voidaan käyttää karbobentsoksi-tai t-butyylioksikarbonyyliryhmiä edullisesti tai mitä tahansa niihin verrattavaa ryhmää, kuten esimerkiksi p-metoksi-, p-nitro-tai p-metoksifenyyliatsokarbobentsoksiryhmää.
Arginyyliryhmän tf-guanidoryhmän suojauksena on edullista käyttää protonointia, NC^-ryhmää tai p-tolueenisulfonyyliryhmää.
Tyrosiiniryhmässä olevan hydroksiryhmän suojaukseen on edullista käyttää t-butyyli- tai bentsyyliryhmää. Lohkeavana karboksiryhmää suojaavana ryhmänä on sopivaa käyttää metyyli-, etyyli- tai bentsyy-liesteriä.
Kytkentä kahden aminohapon tai dipeptidin ja aminohapon välillä saavutetaah aktivoimalla oc-karboksiryhmä. Aktivoitu johdannainen voidaan joko eristää tai kehittää itse seoksessa ja se voi olla esimerkiksi p-nitrofenyyli-, trikloorifenyyli-, pentakloorifenyyli-tai N-hydroksisukkinimidiesteri, symmetrinen tai asymmetrinen an-hydridi, happoatsidi tai N-hydroksibentsotriatsoliesteri.
Synteesin periaate voi olla aminohappojen asteittainen kytkentä C-päätteiseen arginyyliryhmään, joka on joko jo varustettu kytketyllä kromoforisella ryhmällä, joka toimii karboksiryhmää suojaavana ryhmänä, tai varustettu lohkeavalla karboksiryhmää suojäävällä ryhmällä ja kromoforinen ryhmä kytketään sitten suojattuun tripep-tidijohdannaiseen tai vaihtoehtoisesti on mahdollista syntetisoida N-päätteinen dipeptidiosa sellaisenaan, joka sitten kytketään arginyyliryhmään kromoforisen ryhmän lenssa tai ilman sitä yllä olevien selostusten mukaisesti. Samantapaisten helposti liukenevien kromo-foristen substraattien valmistus on kuvattu edellä mainitussa ruotsalaisessa patentissa, suomalaisissa patenttihakemuksissa 1308/73 4 56525 ja 753246 sekä julkaisuissa FEBS Letters 11 (1970) Dec. 249-253 ja Bull.Chem. Soc. Japan 46 (1977) No 2 572-576.
Riippumatta valitusta periaatteesta väli- ja lopputuotteiden puhdistus geelisuodatuskromatografiällä on sopivaa, sillä tämä tekee mahdolliseksi nopean synteesityöskentelyn ja antaa maksimisaannot.
TLC-analyysi on suoritettu osittain GPC:stä saaduista eluaateista ja osittain haihdutetuista ja kuivatuista loppu- ja välituotteista.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä.
Lyhenteet
Aminohapot^ ellei toisin ole mainittu tarkoitetaan L-muotoa Arg = Arginiini
Aze = 2-atsetidiinikarboksyylihappo
Phe = Fenyylialaniini
Pip = Pipekoliinihappo
Pro = Proliini
Tyr = Tyrosiini
Vai = Väliini
AcOH = Etikkahappo
Bz = Bentsoyyli-
Cbo- = Karbobentsoksi- DMF = Dimetyyliformamidi
Et^N = Trietyyliamiini
EtOAc = Etyyliasetaatti HMPTA = Ν,Ν,Ν',N',N",N"-heksametyylifosforihappotriamidi GPC = Geelisuodatuskromatografia
MeOH = Metanoli -OpNP = p-Nitrofenoksi- -pNA = p-Nitroanilidi TLC = Ohutlevykromatografia £NA = P-Naftyyliamidi 0ΝΑ(4-oME)= 4-Metoksi-^-naftyyliamidi
Ohutlevykromatografia TLC-analyysiä varten käytetään ennalta valmistettuja lasilevyjä, joissa on piihappogeeliä F254 (Merck) absorptioaineena. Käytetyt liuotinsysteemit ovat seuraavat: 56525 5 P^: kloroformi: MeOH 9:1 (tilavuussuhde) A: n-butanoli: AcOH:vesi 3:2:1 (tilavuussuhde)
Kromatografiän päätyttyä levyä tutkitaan UV-valossa (254 nm) ja kehittäminen suoritetaan sen jälkeen kloori/o-toluidiinireagens-silla yleisen käytännön mukaisesti. Kun todetaan, että "tuote on homogeeninen TLC-analyysin mukaan", analyysi on suoritettu ^ug:n ainemäärällä. Esitetyt R^-arvot ovat tuloksia erillisistä kromatografisista menettelyistä.
Geelisuodatukseen käytetty geeli Sephades^ G-15 on silloitettu deks-traanigeeli. Sephadei^ LH-20-geeli on hydroksipropyloitu silloitettu dekstraanigeeli. Käytetty ioninvaihtaja Sephade^® QAE-25 on silloitettu dekstraanigeeli, jossa funktionaalisena ryhmänä on dietyyli-(2-hydroksipropyyli)-aminoetyyliryhmä. Näiden geelien valmistaja on Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi.
Keksinnön mukaisten substraattien synteesi kuvataan seuraavissa esimerkeissä.
Esimerkki 1
H-D-Phe-Pro-Arg-pNA·2 HC1 I. Cbo -Arg (NC^JpNA
35,3 g (10 mmol) kuivaa Cbo-Arg (N02)-0H:a liuotetaan 200 ml:an kuivaa, juuri tislattua HMPTAra huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisätään 10,1 g (100 mmol) Et3N:a ja 24,6 g (150 mmol) p-nitro-fenyyli-isosyanaattia sekoittaen ja kosteudelta suojatuissa olosuhteissa. 24 tunnin reaktioajan kuluttua liuos kaadetaan 2 litraan 2 %:sta natriumbikarbonaattiliuosta sekoittaen. Muodostunut saostuma poistetaan suodattamalla ja pestään 2 %:sella bikar-bonaattiliuoksella, vedellä, 0,5-N HCl:n vesiliuoksella ja vedellä ja lopuksi kuivataan. Raakatuote uutetaan lämpimällä MeOH:11a ja vaikeasti liukenevat sivutuotteet suodatetaan. Suodos puhdistetaan kromatografisesti Sephades^ LH-20-kolonnilla, joka on paisutettu ja eluoidaan MeOH:11a.
Saanto: 29,8 g (63 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^=0,34) /Vp4 + 20 *5° <c !'9' DMF> 56525 IX. Cbo-Pro-Arg (Ν02)-ρΝΑ 4.8 g (10 mmol) Cbo-Arg(NO2)-pNA lietetään 25 ml:an kuivaa AcOH:a, minkä jälkeen lisätään 15 ml 5,6-N HBr:a AcOH-liuoksessa. 50 mi nuutin reaktioajan kuluttua huoneenlämpötilassa liuos kaadetaan voimakkaasti sekoittaen 300 ml:an kuivaa eetteriä. Eetterifaasi imetään saadusta sakasta ja sakka pestään kahdella 100 ml:n erällä eetteriä. Näin saatua HBr*H-Arg-(N02)-pNA:a kuivataan tyhjössä NaOH:n yläpuolella 40°C:ssa 16 tunnin ajan. Tämän jälkeen se liuotetaan 25 ml:an DMF:a ja liuos jäähdytetään -10°C:en. Nyt lisätään Et.jN:a riittävä määrä, jotta kostealla pH-paperilla, jota pidetään välittömästi liuoksen pinnan yläpuolella, saadaan heikosti emäksinen reaktio (1,9 ml). Saostunut Et^N-HBr poistetaan suodattamalla ja 4,1 g (11 mmol) Cbo-Pro-OpNP:a lisätään. Yhden ja myös neljän tunnin kuluttua lisätään vielä 0,7 ml Et2N:a. Liuoksen annetaan asettua huoneenlämpötilaan yön aikana. Jotta estettäisiin Cbo-Pro-OpNP ylimäärän saastuttamasta lopputuotetta GPC:n aikana, koska niillä on samanlaiset eluointitilavuudet käytetyssä kromatografisessa systeemissä, lisätään 0,5 ml (5 mmol) n-butyyliamiinia. 30 minuutin kuluttua lisätään 10 mmol laimennettua HCl:ä, reaktioliuos haihdutetaan kiertohaihduttimella, sekoitetaan parin vesierän kanssa, joka poistetaan dekantoimalla. Jäännös liuotetaan MeOH:in ja kroma-tografoidaan Sephade^® LH-20-kolonnilla, joka paisutetaan ja eluoi-daan MeOH:lla. Saatu tuote on homogeeninen TLC-analyysin mukaan. Saanto: 5,5 g (96 %)
Analyysi: TLC P^-liuottimessa (R^: 0,28) /k/lA -33,0° (C 1,0, DMF) III. Cbo-Pip-Arg(N02)-pNA Suoritetaan kohdan II mukaisesti Saanto: 5,1 g (86 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^:0,30) - 26,2° (C 1,0, DMF)
IV. Cbo-Phe-Pip-Arg(N02)-pNA
2.9 g (5 mmol) Cbo-Pip-Arg(N02)-pNA:a dikarbobentsoksiloidaan AcOH:in liuotetussa HBr:ssa ja pestään eetterillä ja kuivataan kohdan II mukaisesti. HBr-H-Pip-Arg(N02)-pNA liuotetaan sitten 15 ml:an DMF:a. Liuos jäähdytetään -10°C:en, tehdään heikosti emäksiseksi 0,9 ml:11a Et^^a ja suodatetaan. 3,0 g (7,15 mmol) Cbo-Phe-OpNP:a lisätään ja sen jälkeen vielä 0,65 g (5 mmol) N-hydroksibensotriatsolia katalyytiksi. Yhden tunnin kuluttua lisätään 0,35 ml Et3N:a ja sama 7
5652S
menettely toistetaan 4 tunnin kuluttua. Reaktioliuoksen lämpötilan annetaan nousta huoneenlämpötilaan yön aikana. Liuos haihdutetaan kuiviin kiertohaihduttimessa. Jäännös liuotetaan EtOAc:in ja sitä käsitellään 2 %:sella natriumbikarbonaattiliuoksella ja vedellä ja haihdutetaan sitten. Jäännös liuotetaan nyt MeOHrin ja kromatogra-foidaan Sephade^ LH-20-geelillä, joka paisutetaan ja eluoidaan MeOH: 11a. Saatu tuote on homogeeninen TLC-analyysin mukaan.
Saanto: 2,7 g (73 %}
Analyysi: TLC P^-liuottimessa (R^:0,35) -32,9° ( c 1,0, DMF) V. Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NOj)-pNA Suoritetaan kohdan IV mukaisesti Saanto: 2,6 g (70 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^:0,44) /*/£4 - 38,4° (c 1,0,DMF) VI. Cbo-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA Suoritetaan kohdan IV mukaisesti Saanto: 2,9 g (80 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti P^-liuottimessa (R^:0,38) 1*7^ - 39,2° (c 1,0, DMF) VII. Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA Suoritetaan kohdan IV mukaisesti Saanto: 3,1 g (86 %)
Analyysi: Homogeeninen, TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^:0,46) - 6,2° (c 1,0, DMF) VIII. H-D-Phe-Pro-Arg-pNA · 2HC1 175 mg (0,246 mmol) Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA vapautetaan suoja-ryhmästä antamalla sen reagoida 5 ml:n kanssa kuivaa HF:ä, kun läsnä on 0,3 ml anisolia Sakakibara'n mukaisessa laitteessa (Sakakibara et ai. Bull.Chem.Soc. Japan 40 (9), 2164-67 (1967) 60 minuutin aikana 0°C:ssa. Reaktion päätyttyä ja kun kaikki HF on tislattu, raakatuote puhdistetaan ja se käsitellään ioninvaihtajalla kahdessa vaiheessa: a) GPC Sephade^ G-15-kolonnissa, joka on paisutettu AcOH:n 33 %: sella vesiliuoksella saman väliaineen ollessa liuotus- ja eluointi-väliaineena. Puhdas tuote kylmäkuivataan AcOH:sta (vesiliuos).
8 5652b b) Ioninvaihto kloridimuodossa olevassa Sephadex"* QAE-25-kolonnissa, joka on paisutettu MeOH:vesiliuoksessa (95:5) saman väliaineen ollessa liuotin- ja eluointiväliaineena. Puhdas tuote kylmäkuivataan vedestä.
Saanto: 120 mg (80 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan A-liuottimessa (R^:0,29) Kloridipitoisuus 11,53 % (teoreettisesti 11,6 %) /«/p4 - 122° (c 0,5, 50 % AcOH (vesiliuos))
Esimerkki 2 H-Phe-Pro-Arg-pNA·2HC1 valmistetaan vertailutarkoituksia varten esimerkissä 1/I-VIII selostetulla tavalla Saanto: (71 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti A-liuottimessa (R^:0,22) Kloridipitoisuus 11,0 % (teoreettisesti 11,6 %) /öc7^4 - 73,6° (c 0,5, 50 % AcOH (vesiliuos)).
Esimerkki 3 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA · 2HC1
Valmistetaan vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 1/I-VIII on kuvattu. Saanto: (72 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti A-liuottimessa (Rf:0,44) Kloridipitoisuus 11,4 % (teoreettisesti 11,3 %) /öc/p4 - 109° (c 0,4, 50 % AcOH (vesiliuos))
Esimerkki 4 H-Phe-P ip-Arg-pNA . 2HC1
Valmistetaan vertailutarkoituksia varten esimerkissä 1/I-VIII kuvatulla tavalla.
Saanto: (55 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan A-liuottimessa (R^:0,41) Kloridipitoisuus 11,3 % (teoreettisesti 11,3 %) /Sc7£4 - 80,3° (c 0,5, 50 % AcOH (vesiliuos))
Esimerkki 5 H-D-Tyr-P ip-Arg-pNA · 2HC1 I. Cbo-D-Tyr(OBz)-Pip-Arg(NO2)-pNA valmistetaan esimerkin 1/I-IV mukaisesti Saanto: 3,2 g (75 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti P^-liuottimessa (Rf:0,50) 56525 9 II. H-D-Tyr-Pip-Arg-pNA · 2HC1 valmistetaan esimerkin 1/VIII mukaisesti Saanto: (68 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^liuottimessa (R^:0,44) Kloridipitoisuus 10,8 % (teoreettisesti 11,1 %) - 75,2° (c 0,5, 50 % AcOH (vesiliuos)).
Esimerkki 6 H-D-Phe-Aze-Arg-pNA * 2HC1 I. Cbo-Aze-Arg(NO2)-pNA valmistetaan esimerkin l/II mukaisesti Saanto: 4,2 g (75 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti P^-liuottimessa (R^:0,27) II. Cbo-D-Phe-Aze-Arg(NO2)-pNA valmistetaan esimerkin 1/IV mukaisesti Saanto: 2,4 g (69 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti P^-liuottimessa (R^:0,47) III. H-D-Phe-Aze-Arg-pNA · 2HC1 valmistetaan esimerkin 1/VIII mukaisesti Saanto: (71 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti A-liuottimessa (Rf:0,21)
Kloridipitoisuus 11,6 % (teoreettisesti 11,9 %) /«7^4 - 130° (c 0,5, 50 % AcOH)
Esimerkki 7 H-D-Phe-Pip-Arg-ftNA * 2HC1
I. Cbo-Arg(NO 2)-£NA
7,2 g (20 mmolj kuivaa Cbo-Arg(NO2)-OH:a liuotetaan 400 ml:an THF:a. 2,0 g ( 20 mmol)Et.jN lisätään, minkä jälkeen liuos jäähdy tetään -10°C:een täysin kosteudelta suojatuissa olosuhteissa.
2,7 g (20 mmol) isobutyyliklooriformiaattia liuotettuna 20 ml:an THF:a lisätään jäähdytettyyn liuokseen 10 minuutin aikana ja toisen 10 minuutin kuluttua lisätään 344 g (20 mmol) £-naftyyliamiinia. Reaktioseoksen annetaan saavuttaa huoneen lämpötilassa ja jätetään tähän lämpötilaan 24 tunniksi. Reaktioseos haihdutetaan tyhjössä 10
S6S2S
kuiviin, käsitellään 3-5 kertaa tislatulla vedellä, 3-5 kertaa 5 %:sella natriumbikarbonaattiliuoksella ja jälleen 3-5 kertaa tislatulla vedellä, minkä jälkeen se kuivataan tyhjössä. Tuote liuotetaan MeOH:in ja kromatografoidaan Sephadesi^ LH-20-kolonnissa, joka paisutetaan ja eluoidaan MeOH:lla. Saatu tuote on homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti P^-liuottimessa.
Saanto: 8,1 g (84 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P.-liuottimessa (Rf:0,40) &Jq + 7,4° (C 1,0, DMF) II. Cbo-Pip-Arg(N02)-8NA valmistetaan esimerkin l/II mukaisesti Saanto: 4,8 g (82 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^:0,36) III. Cbo-D-Phe-Pip-Arg(N02)-βΝΑ valmistetaan esimerkin 1/IV mukaisesti Saanto: 2,6 g (71 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (Rf:0,48) IV. H-D-Phe-Pip-Arg-gNa * 2HC1 valmistetaan esimerkin 1/VIII mukaisesti Saanto: (68 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan A-liuottimessa (R^:0,44) Kloridipitoisuus 11,2 % (teoreettisesti 11,3 %) - 105° (c 0,5, 50 % AcOH (vesiliuos))
Esimerkki 8 H-D-Phe-Pip-Arg-SNA(4-OMe) · 2HC1 I. CbO-Arg (N02) -n$NA (4-OMe) valmistetaan esimerkin 7/1 mukaisesti Saanto: 7,1 g (70 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaisesti P^-liuottimessa (Rf:0,42) II. Cbo-Pip-Arg(N02)-^NA (4-OMe) valmistetaan esimerkin l/II mukaisesti Saanto: 4,9 g (79 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^:0,38) 56525 11 III. Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO2)-0NA (4-OMe) valmistetaan esimerkin 1/IV mukaisesti Saanto: 2,7 g (70 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan P^-liuottimessa (R^:0,51) IV. H-D-Phe-Pip-Arg-0NA (4-OMe) · 2HC1 valmistetaan esimerkin 1/VIII mukaisesti Saanto: (64 %)
Analyysi: Homogeeninen TLC-analyysin mukaan A-liuottimessa (R^:0,44) Kloridipitoisuus 10,4 % (teoreettisesti 10,7 %) “ 102° (c 0,5, 50 % Ac OH (vesiliuos)).
Trombiinin määritys kromogeenlsllla substraateilla Esimerkkien mukaisesti valmistettuja substraatteja käytetään trombiinin määrittämiseen seuraavalla esitetyllä tavalla.
Määritysperiaate perustuu siihen, että entsymaattisella hydrolyysil-lä muodostuneella lohkeamistuotteella on UV-spektri, joka on oleellisesti erilainen kuin substraatilla. Niinpä esimerkin X mukaisella substraatilla H-D-Phe-Pip-Arg-pNA on absorptiomaksimi kohdassa 315 nm ja molaarinen ekstinktiokerroin 12500. Kohdassa 405 nm substraatin absorptio on lähes olematon, p-nitroaniliinilla, joka on lohjennut substraatista entsymaattisen hydrolyysin aikana, on absorptiomaksimi kohdassa 380 nm ja molaarinen ekstinktiokerroin 13200, joka kohdassa 405 nm on laskenut vain arvoon 9620. Spektrofotometrisellä määrityksellä aallonpituudella 405 nm on näin ollen mahdollista helposti seurata muodostuneen p-nitroaniliinin määrää, jonka määrä riippuu entsymaattisesta hydrolyysiasteesta, joka puolestaan määräytyy aktiivisesta trombiinimäärästä. Muille tämän keksinnön mukaisille substraateille vallitsevat lähes identtiset olosuhteet ja tästä syystä määritykset on yhdenmukaisesti tehty aallonpituudella 405 nm.
Taulukko 1 esittää suhteellisten reaktionopeuksien vertailua edellä mainitun trombiinin substraatin S-2160 (A) sen bentsoyloimattoman muodon (B) ja keksinnön mukaisen substraatin (Esim. 1 ja 3) sekä vastaavien L-muotojen (Esim. 2 ja 4) välillä. Tämä taulukko osoittaa selvästi tämän keksinnön mukaisten substraattien paremmuutta.
Ne reagoivat 4 kertaa nopeammin trombiinin kanssa kuin paras aikaisemmin tunnettu substraatti S-2160 ja ovat edelleen n. 10 kertaa liukoisempia veteen kuin S-2160.
Claims (2)
- 56525 12 Taulukko 1 Substraatti Suhteellinen Liukoisuus _ reaktionopeus veteen (rog/ml) A (S-2160) Bz-Phe-Val-Arg-pNA 100 0,1 B H-Phe-Val-Arg-pNA 3 1 Esim. 2 H-Phe-Pro-Arg-pNA 15 1 Esim. 1 H-D-Phe-Pro-Arg-pNA 400 3 Esim. 4 H-Phe-Pip-Arg-pNA 9 1 Esim. 3 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA 420 3 Patenttivaatimus Uudet diagnostisesti aktiiviset kromogeeniset substraatit, joilla on suuri spesifisyys trombiinille ja trombiinin tapaisille entsyymeille, tunnettu siitä, että niillä on yleinen kaava D-NH- - CH - CO - N - CH - CO - NH - CH - CO - NH - R„2. I I I 2 CH2 CH2-(CH2)n (CH2)3 (o) I V /\ H2N nh *i ja sen suolat, jossa R^ on vetyatomi tai hydroksiryhmä, R2 on nitro-fenyyli-, naftyyli- tai metoksinaftyyliryhmä ja n on 1, 2 tai 3. Nya diagnostiskt aktiva kromogena substrat med hög specificitet för trombin och trombinliknande enzymer, kännetecknade därav, att de har den allmänna formeln
- 2. I ,1 I 2 φ λ R1 och salter därav, väri R2 är en väteatom eller hydroxigrupp, R2 en nitrofenyl-, naftyl- eller metoxinaftylgrupp och n är 1, 2 eller 3.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7507975-6A SE407405B (sv) | 1975-07-11 | 1975-07-11 | Nya kromogena trombinsubstrat |
| SE7507975 | 1975-07-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI762010A FI762010A (fi) | 1977-01-12 |
| FI56525B FI56525B (fi) | 1979-10-31 |
| FI56525C true FI56525C (fi) | 1980-02-11 |
Family
ID=20325116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI762010A FI56525C (fi) | 1975-07-11 | 1976-07-09 | Nya kromogena trombinsubstrat |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5224590A (fi) |
| AT (1) | AT348686B (fi) |
| AU (1) | AU497547B2 (fi) |
| BE (1) | BE843970A (fi) |
| CA (1) | CA1068261A (fi) |
| CH (1) | CH622287A5 (fi) |
| CS (1) | CS196314B2 (fi) |
| DD (1) | DD128691A5 (fi) |
| DE (1) | DE2629195C3 (fi) |
| DK (1) | DK145799C (fi) |
| ES (1) | ES449739A1 (fi) |
| FI (1) | FI56525C (fi) |
| FR (1) | FR2317280A1 (fi) |
| GB (1) | GB1510926A (fi) |
| IL (1) | IL49829A (fi) |
| IT (1) | IT1062605B (fi) |
| NL (1) | NL188355C (fi) |
| NO (1) | NO142576C (fi) |
| PL (1) | PL103003B1 (fi) |
| SE (1) | SE407405B (fi) |
| SU (1) | SU719492A3 (fi) |
| ZA (1) | ZA763586B (fi) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5255593A (en) * | 1975-10-30 | 1977-05-07 | Ajinomoto Kk | Measuring method of enzyme activity |
| DE2757992A1 (de) * | 1977-12-24 | 1979-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur prothrombin-bestimmung |
| DE2812943C3 (de) * | 1978-03-23 | 1981-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma |
| US4289498A (en) * | 1979-01-08 | 1981-09-15 | Ortho Diagnostics, Inc. | One-stage prothrombin assay and compositions useful therein |
| FR2471410A2 (fr) * | 1979-12-17 | 1981-06-19 | Jozefonvicz Marcel | Perfectionnements apportes a un procede de dosage des proteases et des anti-proteases et notamment des proteases et antiproteases des systemes de la coagulation et du complement |
| DE3061860D1 (en) * | 1979-04-24 | 1983-03-17 | Marcel Jozefonvicz | Process for the determination of proteases and antiproteases |
| DE3005540A1 (de) * | 1980-02-14 | 1981-08-20 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmung der biologischen aktivitaet von heparin im plasma |
| DK155051C (da) * | 1980-05-06 | 1989-07-03 | Pentapharm Ag | Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf |
| JPS5856695A (ja) * | 1981-09-28 | 1983-04-04 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なトロンビン測定用基質 |
| DE3211254A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| DK201084A (da) * | 1983-04-28 | 1984-10-29 | Kimberly Clark Co | Fremgangsmaade til bestemmelse af cathepsin b i naervaerelse af andre proteolytiske enzymer, og forbindelser til anvendelse ved fremgangsmaaden |
| EP1889919A4 (en) | 2005-05-20 | 2009-04-15 | Mitsubishi Kagaku Iatron Inc | METHOD FOR ANALYZING AN ENZYME |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE380258B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
| SE380257B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
-
1975
- 1975-07-11 SE SE7507975-6A patent/SE407405B/xx not_active IP Right Cessation
-
1976
- 1976-06-16 ZA ZA763586A patent/ZA763586B/xx unknown
- 1976-06-17 IL IL49829A patent/IL49829A/xx unknown
- 1976-06-21 GB GB25580/76A patent/GB1510926A/en not_active Expired
- 1976-06-25 AT AT463976A patent/AT348686B/de not_active IP Right Cessation
- 1976-06-25 AU AU15305/76A patent/AU497547B2/en not_active Expired
- 1976-06-29 DE DE2629195A patent/DE2629195C3/de not_active Expired
- 1976-06-29 NL NLAANVRAGE7607104,A patent/NL188355C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-07-06 CA CA256,417A patent/CA1068261A/en not_active Expired
- 1976-07-08 CS CS764544A patent/CS196314B2/cs unknown
- 1976-07-09 FI FI762010A patent/FI56525C/fi not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 NO NO762407A patent/NO142576C/no unknown
- 1976-07-09 DD DD7600193785A patent/DD128691A5/xx unknown
- 1976-07-09 BE BE168774A patent/BE843970A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 DK DK312676A patent/DK145799C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 FR FR7621196A patent/FR2317280A1/fr active Granted
- 1976-07-09 CH CH887476A patent/CH622287A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-07-09 SU SU762379659A patent/SU719492A3/ru active
- 1976-07-09 ES ES449739A patent/ES449739A1/es not_active Expired
- 1976-07-09 PL PL1976191068A patent/PL103003B1/pl unknown
- 1976-07-09 IT IT50364/76A patent/IT1062605B/it active
- 1976-07-10 JP JP51082442A patent/JPS5224590A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4061625A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| SU957762A3 (ru) | Способ получени пептидов или их солей | |
| FI56524C (fi) | Nya komogena substrat foer serinproteaser | |
| SU1277904A3 (ru) | Способ получени трипептидов | |
| FI56828C (fi) | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser | |
| FI56829C (fi) | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser | |
| US4137225A (en) | Novel chromogenic enzyme substrates | |
| US4457866A (en) | Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates | |
| FI56525C (fi) | Nya kromogena trombinsubstrat | |
| JPH0253040B2 (fi) | ||
| CA1086614A (en) | Substrate for the determination of plasminogen activators | |
| EP0170797B1 (en) | Novel substrate for determining the activity of blood coagulation factor xa (stuart-prower factor) | |
| US4247454A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| US4428874A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4568636A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4169015A (en) | Novel chromogenic thrombin substrates | |
| US5097014A (en) | Chromogenic tripeptides | |
| US5063152A (en) | Synthetic peptidic substrate for determination of trypsin and α1 | |
| JPS62122599A (ja) | 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法 | |
| EP0505428B1 (en) | Chromogenic substrate | |
| KR840001485B1 (ko) | 펩타이드의 제조방법 | |
| JPH0244518B2 (ja) | Tanpakubunkaikosooteiryobunsekisuruhoho | |
| JPH0776232B2 (ja) | ペプチド誘導体及びその使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: AKTIEBOLAGET KABI |