FI56829C - Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser - Google Patents

Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser Download PDF

Info

Publication number
FI56829C
FI56829C FI1308/73A FI130873A FI56829C FI 56829 C FI56829 C FI 56829C FI 1308/73 A FI1308/73 A FI 1308/73A FI 130873 A FI130873 A FI 130873A FI 56829 C FI56829 C FI 56829C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
mmol
leu
arg
product
gel
Prior art date
Application number
FI1308/73A
Other languages
English (en)
Other versions
FI56829B (fi
Inventor
Karl Goeran Claeson
Birgitta Gunilla Karlsson
Lars-Gundro Svendsen
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Application granted granted Critical
Publication of FI56829B publication Critical patent/FI56829B/fi
Publication of FI56829C publication Critical patent/FI56829C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

RSBr^l [B] (11)KUULUTUSJULKAISU - ^ jUA LJ 'V UTLÄGGNI NGSSKRIFT 300/3 fjSajf C (45) Patentti cycr.netty 10 C4 1900 J Patent meddelat V T ^ (51) Kv.lk.VInt.CI.1 C 07 C 103/52 SUOMI—FINLAND (*) Pitvnttihakamui— PatancamBkning 1308/73 (22) Hakamlsplivt — AmBkningtdag 23.OU.73 (23) AlkuptJvl —Glltlfhatadig 25.OU.73 (41) Tulkit Julklsakal — Bllvlt ottantllf 03.11.73
Patentti- ja rekisterihallitus /44) Nlhtivlktlpanon ja kuuL)ulkai«m pvm. — o·. IP 7Q
Patent- och registerstyrelsen ' Aniekan utiagd och uti.sknfcm pubnc*r*d (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeui—Bagird priorltat 02.05.72
Ruotsi-Sverige(SE) 5758/72 (71) Aktiebolaget Kabi, Lindhagensgatan 133,Stockholm, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Karl Göran Claeson, Göteborg, Birgitta Gunilla Karlsson, Göteborg, Lars-Gundro Svendsen, Mölndal, Ruotsi-Sverige(SE) (7U) Berggren Oy Ab (5U) Uusia diagnostiseen käyttöön tarkoitettuja substraatteja, joilla on korkea spesifiteetti trypsiinille ja muille peptidyylipeptidihydro-laasityyppisille entsyymeille - Nya diagnostiskt verksamma substrat, med hög specifitet för trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptidhydrolaser Tämä keksintö koskee uusia taudinmääritykseen käytettäviä substraatteja, joilla on korkea spesifiteetti trypsiinille ja muille valkuaista hajoittaville entsyymeille, jotka ovat peptidyyli-peptidihydrolaasityyppiä. Keksinnön mukaiset substraatit on tarkoitettu luokiteltujen ja tähän saakka luokittelemattomien, tyyppiä E.C. 3-U.U. olevien entsyymien kvantitatiiviseen määritykseen, erityisesti sellaisten, jotka hajoittavat pepti^iketjun peptidejä tai proteiineja arginiinin tai lysiinin karboksyylipuoliskosta.
Näitä substraatteja voidaan käyttää edelleen reaktioiden tutkimiseen, joissa tällaiset entsyymit osallistuvat näiden entsyymien esiasteiden, vasta-aineiden ja inhibiittoreiden määrittämiseen.
Entsyymien luokituksessa käytettiin The International Union of Biochemistry, Elsevier, Amsterdam 1965 suosittelemaa entsyymi-nimistöä. Tähän asti luokittelemattomista entsyymeistä mainittakoon erityisesti REPTILASE® ja ARVIN® .
Yhdisteitä (substraatteja), joita on aiemmin käytetty yllä mainittujen entsyymien kvantitatiiviseen määritykseen, kuvataan teoksessa "Methoden der enzymatischen Analyse", Voi. Is, 1023 &Ö829 2 (julk. Bergmeyer, H.U., Verlag Chemie, 1970). Riippuen siitä, kumpi valkuaista hajottavien entsyymien katalyyttisistä reaktioista tapahtuu - esterolyyttinen vai amidolyyttinen - nämä synteettiset substraatit voidaan periaatteessa jakaa kahteen pääryhmään: esteri-substraatteihin ja amidisubstraatteihin. Suurin aikaisemmin käytettyjen synteettisten substraattien ryhmä on esterisubstraattien ryhmä. Tämä johtuu siitä, että nämä muuttuvat paljon nopeammin peptidyyli-peptidihydrolaasien vaikutuksesta kuin tähän saakka tuotetut amidi-substraatit. Kuitenkin peptidipeptidihydrolaaseiksi luokiteltujen entsyymien pääasiallinen biologinen tehtävä on kuten nimestäkin ilmenee hydrolysoida luonnon substraattien peptidi- tai amidisidoksia, mutta ei esterisidoksia. Kirjallisuudessa (Blood Clotting Enzymo-logy, s. 36 ja 42, 44, julk. Seegers W.H. Academic Press, 1967) ilmoitetaan, että trombiinin esterolyyttisten ja amidolyyttisten katalyysien reaktionopeuksien välinen suhde ei ole vakio eri reaktio-olosuhteissa. Tästä syystä synteettiset amidisubstraatit, jotka ovat paljon herkempiä kyseessä oleville entsyymeille ja jotka myös voivat nopeammin hajota mitattaviksi tuotteiksi kuin tähän saakka tunnetut substraatit, ovat olleet haluttuja.
Entsymaattisen hydrolyysin reaktiokulun tutkimiseksi ja seuraamiseksi ovat erityisen sopivia amidisubstraatit, joilla voidaan saada kromoforisia tuotteita, jotka on helppo mitata spektrofoto-metrisesti ja joilla on absorptiomaksimit, jotka eivät satu yhteen alkuperäisten amidisubstraattien piikkien kanssa.
Joitakin synteettisiä amidisubstraatteja, joissa on hydrolysoituvia kromoforisia ryhmiä, on tullut käyttöön. Nämä ovat pääasiassa niitä tyyppejä kuin Na~ substituoimattomat ja Na- substitu-oidut monoaminohappo -p-nitroanilidijohdannaiset ja monoaminohappo-B-naftyyliamidijohdannaiset. Näistä aineista Na-bensoyyli-DL-argi-niini-p-nitroanilidihydrokloridi (ΒΑΡΝΑ) voidaan mainita trypsiinin (E.C. 3-4.4.) reagenssina ja niiden reaktioiden reagenssina, joihin trypsiini ottaa osaa. Tämän substraatin entsymaattinen hydrolyysi tuottaa kromoforisena tuotteena p-nitroaniliinia, joka voidaan helposti spektrofotometrisesti mitata.
Näillä aiemmin tunnetuilla amidisubstraateilla ei kuitenkaan ole haluttua spesifisyyttä ja herkkyyttä. Tämä on merkittävä haitta, joka saattaa johtaa monimutkaisempaan menettelyyn näytteenotossa, koska tällöin vaaditaan huomattava määrä biologista materiaalia.
Sitä paitsi entsymaattinen reaktioaika on pitkä ja entsyymin määrityksen tarkkuus saattaa olla epätyydyttävä.
3 £)0829 Tämän keksinnön mukaiset uudet amidityyppiset substraatit, joiden herkkyys peptidyylipeptidihydrolaaseille on hyvin suuri, esitetään seuraavalla yleisellä kaavalla: B II 1 R, - N - X - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - NH - R, 1 I I I I 6 r2 r3 (ch2)„
NH
5 tai sen suoloina, jossa voi olla vetyatomi tai bensoyyliryhmä.
R2 voi olla vety tai sykloheksyyli.
X voi olla metyleeni tai yksinkertainen sidos.
R2 voi olla suora, haarautunut tai syklinen alkyyliryhmä, jossa on 3-8 hiiliatomia.
Rjj voi olla haarautunut alkyyliryhmä, jossa on 3-4 hiiliatomia, n voi olla 3 tai 4.
R^ voi olla vety tai guanyyli.
Rg voi olla nitrofenyyli-, naftyyli- tai nitronaftyyliryhmä.
Nämä uudet substraatit voidaan valmistaa kahden periaatteessa eri menetelmän mukaisesti: 1. Ensimmäinen menetelmä perustuu kromoförisen ryhmän R^ parit-tamiseen kyseessä olevaan aminohappoon ja sen jälkeen asteittaiseen halutun peptidirakenteen kokoamiseen jäljellä olevien aminohappojen vähittäisellä parittamisella. Kromoforista ryhmää käytetään tässä ensimmäisen aminohapon C-päätekarboksyyliryhmän suojastusryhmänä.
2. Toinen menetelmä perustuu asteittaiseen halutun peptidirakenteen kokoamiseen ja sen jälkeiseen käytettyjen suojastusryhmien poistoon ja lopulta kromoforisen ryhmän R^ parittamiseen peptidira-kenteeseen.
Näiden kahden menetelmän asteittaisessa peptidirakenteen kokoamisessa voidaan soveltaa systemaattista puhdistamista geeli-suodatuksen avulla, joka suoritetaan jokaisen uuden aminohapon liittämisen jälkeen.
Peptidijohdannaisten vaiheittaisessa synteesissä on käytetty tällaisia paritusmenetelmiä, jotka ovat yleisesti käytettyjä pepti-dikemiassa. Sellaisia hyvin tunnettuja suojastusryhmiä, joita käytetään yleisesti peptidikemiassa, kuten esim. Cbo (karbobensoksi-), MeOCbo (p-metoksikarbobensoksi-), NC^Cbo (p-nitrokarbobensoksi-), ^ $0829 MCbo (p-metoksifenyyliatsokarbobensoksi-), BOC (tert.-butyylioksi-karbonyyli-), TFA (trifluoriasetyyli-) tai formyyliryhmiä, käytetään aminoryhmän suojastusryhminä. α-karboksyyliryhmä voidaan aktivoida muuttamalla se erilaisiksi, peptidikemiassa hyvin tunnetuiksi ja usein käytetyiksi johdannaisiksi, jotka voidaan joko eristää tai kehittää itse seoksessa, esim. p-nitrofenyyliesteriksi, trikloori-fenyyliesteriksi- pentakloorifenyyliesteriksi, N-hydroksisukkinimidi-esteriksi, happoatsidiksi, happoanhydridiksi, joka voi olla joko symmetrinen tai epäsymmetrinen. Se voidaan myös aktivoida karbodi-imidillä, kuten N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidillä. Aminopeptidi-johdannaisissa tai aminohappojohdannaisessa oleva C-päätekarboksyyli-ryhmä voidaan suojata esteröimällä se esim. metyyli-, etyyli- tai isopropyyliesteriksi tai muuttamalla se kromoforiseksi aniliini-johdannaiseksi, joka täten toimii suojastusryhmänä peptidiketjun kokoamisen ajan. Ne vapaat reaktiokykyiset ryhmät, jotka eivät osallistu reaktioon, voidaan peptidien tai peptidijohdannaisten synteesin ajaksi suojata seuraavalla tavalla.
Arginyyli δ-guanidiryhmän ja lysyyli ε-aminoryhmän suojasta-miseen voidaan käyttää sellaisia peptidikemiassa yleisesti käytettyjä aminosuojastusryhmiä kuin esim. N02:a, Tos:ia (p-tolueenisulfonyy-liryhmä) tai pelkkää protonin muodostusta guanidiryhmän suojaamiseen, ja Cbo:a (karboksibensoksiryhmä), B0C:ia (tert.-butyylioksikarbonyyli-ryhmä) tai myös Tos:ia ε-aminoryhmälle. Tyrosiinissa olevan hydrok-syyliryhmän suojauksena voidaan käyttää sellaisia yleisesti peptidikemiassa käytettyjä suojastusryhmiä kuin esim. bensyyli- ja tert.-butyylisuoj astusryhmiä.
Peptidirakenteen vaiheittaisessa synteesissä voidaan suorittaa järjestelmällinen puhdistus geelisuodatuksella jokaisen uuden aminohapon parituksen jälkeen. Tähän geelisuodatukseen käytetään kolonnia, joka on täytetty geelisuodatukseen sopivalla aineella, esim. silloitetulla dekstraanigeelillä, joka on tyyppiä Sephadex® G tai LH, valmistaja Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi.
Toinen sopiva geeli koostuu vinyyliasetaatin kopolymeereista, esim. tyypistä Merckogel® OR-PVA, valmistaja AG E. Merck, Darmstadt, Länsi-Saksa. Geelimateriaalia käytetään tasapainotettuna sopivalla liuottimena ja eluointi suoritetaan sitten samalla liuottimena, esim. metanolilla, etanolilla, asetonilla, dimetyyliformamidilla, dimetyyliasetamidilla, dimetyylisulfoksidilla tai hekdametyylifosfo-ritriamidilla.
Sö629
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä, jotka esittävät erilaisten keksinnön mukaisten substraattien valmistusta asteittaisella synteesillä. Nämä esimerkit eivät kuitenkaan rajoita keksinnön suojapiiriä.
Eluaatin ja tuotteiden ohutlevykromatografisessa analyysissä käytettiin lasilevyjä, joissa silikageeli (P 25^» valm. AG E. Merck, Darmstadt, Länsi-Saksa) toimi absorptioväliaineena. Ohutlevykroma-togrammien kehitykseen on käytetty seuraavia liuotinsysteemejä.
A: n-butanoli:etikkahappo:vesi (3:1:1) C: n-propanoli:etyyliasetaatti:vesi (7:1:2) D: n-heptaani:n-butanoli:etikkahappo (3:2:1) P1: kloroformi-metanoli (9:1)
Ohutlevykromatografoinnin jälkeen levyt kehitettiin ensin UV-valossa (25^ nm) ja sen jälkeen käyttäen kloori/toluidiinireaktio-ta (ref. : g: Pataki: Diinnschluchtchromatografie in der Aminosäure und Peptid-Chemie, Walter de Gruyter & Co., Berliini, 1966, s. 125) kehitysmenetelmänä.
Alla käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset:
Aminohapot: lyhenteet tarkoittavat aminohappojäännöksiä.
Vapaa aminohappo tai peptidi merkitään H:11a aminoryhmässä ja OH:11a karboksyyliryhmässä. Aminoryhmä merkitään aina vasemmalle ja kar-boksyyliryhmä oikealle.
Ellei toisin mainita kaikilla käytetyillä aminohapoilla on L-konfiguraatio:
Ala = alaniini
Arg = arginiini
Ile = isoleusiini
Leu = leusiini
Lys = lysiini
Vai = väliini
Muita esimerkeissä käytettyjä lyhenteitä:
Ac = asetyyli
Ac^O = etikkahappoanhydridi
AcOH = etikkahappo BOC = tert.-butyylioksikarbonyyli
Bz = bensoyyli
Bzl = bensyyli
Bz20 = bensoehappoanhydridi 6 S6829
Cbo = karbobensoksi DCCI = disykloheksyylikarbodi-imidi DCHA = disykloheksyyliamiini DCV = disykloheksyylikarbamidi DMF = dimetyyliformamidi
Et,N = trietyyliamiini 3 HMPTA = Ν,Ν,Ν',N',N",N"-heksametyylifosforitriamidi MCbo = p-metoksifenyyliatsokarbobensoksi
MeOH = metanoli
Na = naftyyliamiini
OtBu = tert.-butyylioksi OEt = etyylioksi OMe = metyylioksi
OpNP = p-nitrofenoksi
OisoPr = iso-propyylioksi pNA = p-nitroanilidi TFA = trifluoriasetyyli
Tos = p4tolu©enisulfonyyli TLC = ohutlevykromatografia
Esimerkeissä käytetyt lämpö ti laxnerkinnät tarkoittavat °C, ellei toisin mainita.
Geelisuodatukseen käytetyt geelit SephadexvS'G-15 ja G-25 ovat molemmat silloitettuja dekstraanigeelejä, joilla on eri silloi-tusasteet, valm. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi. Sephadex® LH-20-geeli on hydroksipropyloitu, silloitettu dekstraanigeeli, valm. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi.
Esimerkki I: H - Leu - Leu - Arg - pNA - 2 HC1 (I)
Esimerkki Ia: Cbo - Arg (NO^) - pNA (Ia) 35,3 g (0,1 mol) kuivaa Cbo-Arg(NC>2)-0H:a liuotetaan 200 ml: an juuri tislattua HMPTA:a huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisätään 10,1 g (0,1 mol) Et^N:a ja 24,6 g (0,15 mol) p-nitrofenyyli-isosyanaattia sekoittaen täysin kuivissa olosuhteissa. 24 tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa reaktioseos kaadetaan litraan 2 5i:sta natriumbikarbonaattiliuosta samalla sekoittaen. Erottuva sakka 7 56829 suodatetaan pois ja pestään kolmasti 0,5 litralla 2 %:sta natriumbi-karbonaattiliuosta, kahdesti 0,2 litralla tislattua vettä, kahdesti 0,5 litralla 0,5-N kloorivetyhappoa ja lopuksi viisi kertaa 0,2 litralla tislattua vettä. Kuivauksen jälkeen epäpuhdas tuote suspendoi-daan lämpimään MeOH:in. Liukenematon osa, joka koostuu N,N1-bis-p-nitrofenyylikarbamidista, suodatetaan pois. Suodos puhdistetaan geeli-kromatografisesti SephadexS'LH-20-kolonnilla, joka on tasapainoitettu MeOH:11a.
Saalis: 29,8 g (63 %) tuotetta Ia, sp. l85-l88°C, joka on homogeenis- — -t24 ta TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja C:llä ja jonka /, q_/D = -1,3° (c = 1,1; AcOH).
Esimerkki Ib: Cbo - Leu - Arg (NO-) - pNA (Ib)
Synteesimenetelmä: 5,0 g (10,6 mmol) tuotetta Ia liuotetaan 21 ml:an AcOH:a ja 22 ml:an 4-N HBr:n AcOH-liuosta täysin kuivissa olosuhteissa. Reaktioseosta sekoitetaan tunnin ajan ja sen jälkeen se kaadetaan hitaasti 200 ml:an voimakkaasti sekoitettua eetteriä, jolloin 1,5 HBr · H-Arg(N02)-pNA saostuu. Eetteriliuos dekantoidaan ja raemaista jäännöstä käsitellään vielä 3 kertaa 100 ml:11a eetteriä bensyylibromidin ja ylimääräisen HBr:n ja Ac0H:n poistamiseksi. Tyhjö-kuivauksen jälkeen P20^:lla aminohappojohdannaisen hydrobromidisuo-lan saalis on kvantitatiivinen (4,87 g). 4,87 g (10,6 mmol) 1,5 HBr*H - Argil^J-pNA liuotetaan 50 ml:an tislattua DMF:a. Liuos jäähdytetään -10°C:en ja 1,6 g (15,9 mmol) Et^N:a lisätään H-Arg(N02)“ pNA:n vapauttamiseksi hydrobromidisuolastaan. Seoksen annetaan reagoida tunnin ajan kuivissa olosuhteissa. Saostunut Et^N*HBr suodatetaan pois ja suodos jäähdytetään -10°C:en. 4,3 g (12,7 mmol)
Cbo-Leu-0pNP:a lisätään ja liuos saa nyt hitaasti lämmetä huoneenlämpötilaan. 3 tunnin kuluttua liuos jäähdytetään jälleen -10°C:en ja puskuroidaan 0,55 g:11a (5 mmol) Et^N:a. Puskurointimenettely toistetaan vielä kerran 2-3 tunnin kuluttua. 24 tunnin reaktioajan jälkeen liuos haihdutetaan 40°C:ssa tyhjössä kuiviin. Jäännöstä käsitellään kolme kertaa 100 ml:11a tislattua vettä ja se kuivataan sitten tyhjössä. Puhdistus: Kuiva jäännös liuotetaan MeOH:in ja puhdistetaan geelikromatografisesti SephadexS) LH-20-kolonnilla tasapainotettuna MeOH:lla. Saalis: 6,1 g (98 %) amorfista tuotetta Ib, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^sllä ja jonka fqjp5 = -33,3° (c = 1,0; MeOH).
Esimerkki Ie: Cbo - Leu - Leu - Arg (N0p) - pNA (Ie) Lähtöaineet: 2,8 g (4,77 mmol) tuotetta Ib ja 2,22 g (5,72 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
8 56829
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti SephadejP^ LH-20-geelillä
MeOH:ssa.
Saalis: 2,5 g (80 %) amorfista tuotetta Ie, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka = -9,9° (c = 1,0; DMF).
Esimerkki Id: H - Leu - Leu - Arg - pNA · 2HC1 (I) 13^,2 mg (0,192 mmol) tuotetta Ie asetetaan Sakakibara-laitteen reaktioastiaan. 5 ml kuivaa fluorivetyä tislataan astiaan ja sen annetaan reagoida tunnin ajan sekoittaen. Tällä tavoin argi-niinin guanidiino-osaa suojaava nitroryhmä ja Cbo-ryhmä lohkeavat pois. Tämän jälkeen fluorivety tislataan pois alipaineessa ja kuiva jäännös liuotetaan DMF:in. Saadun peptidin hydrofluoridijohdannaisen konvertoimiseksi hydrokloridisuolakseen lisätään DMF-liuokseen 0,25 ml väkevää kloorivetyhappoa. Haihdutuksen jälkeen konversio-menettely toistetaan vielä kerran.
Puhdistus: Viimeisen haihdutuksen jälkeinen jäännös liuote taan 50 £:seen AcOH-liuokseen ja puhdistetaan geelikromatografises-ti Sephadex^ G-25-kolonnilla tasapainoitettuna 50 %:sella AcOH:lla. Puhtaan tripeptidihydrokloridijohdannaisen sisältävä eluaattijae lyofilisoidaan.
Saalis: 80,0 mg (71 %) amorfista tuotetta I, jonka kloori-pitoisuus on 11,83 %» joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka ~ -29,9° (c s 0,59> 50 % AcOH). Amino- happoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 2,0; Arg: 0,95· Esimerkki II: Na - Bz - Leu - Leu - Arg - pNA · HC1 (II)
Esimerkki Ha: Na - Bz - Leu - Leu - Arg (N02) - pNA (Ha) Lähtöaineet: 703 mg (1 mmol) tuotetta Ie ja 272 mg (1,2 mmol)
Bz20.
Synteesimenetelmä: Tuotteen Ie dekarbobensoksylointi suori tetaan esimerkin Ib mukaisesti. Kuiva H-Leu-Leu-Arg (N02)-pNA*HBr-tuote suodatetaan pois. Suodos jäähdytetään -10°C:en ja 272 mg (1,2 mmol) Bz20:a lisätään. Kolmen tunnin reaktioajan jälkeen liuos on saavuttanut huoneenlämpötilan. Se jäähdytetään jälleen ja puskuroidaan 0,07 ml:11a (0,5 mmol) Et^N:a. Puskurointimenettely toistetaan vielä kolmen tunnin kuluttua. 2^ tunnin reaktioajan jälkeen liuos haihdutetaan tyhjössä kuiviin. Jäännöstä käsitellään ja kuivataan esimerkissä Ib kuvatun menetelmän mukaisesti.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^) LH-20-geelillä
MeOH:ssa.
9 56829
Saalis: 550 mg (82 %) amorfista tuotetta Ila, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka = -3,6° (c = 1,01; DMF).
Esimerkki II: Na - Bz - Leu - Leu - Arg - pNA * HC1 (II) Lähtöaine: 55*1,8 mg (0,828 mmol) tuotetta Ila.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^ G-15~geelillä 20 i:sessa AcOH:ssa ja SephadejP^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 476 mg (87 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta II, jonka klooripitoisuus on 5,30 %t joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka j_ q_7jp = "73,0° (c = 0,66; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 2,0;
Arg: 0,95·
Esimerkki III: H - g - sykloheksyyli - Ala - Vai - Arg - pNA · 2HC1 (III)
Esimerkki Ula: Cbo - Vai - ArgiNOg) - pNA (lila) Lähtöaineet: 20,6 g (43,5 mmol) tuotetta Ia ja 20,3 g (54,3 mmol) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Epäpuhdas tuote kiteytetään uudelleen MeOH:sta. Emäliuos puhdistetaan geelikromatografisesti Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 23,2 g (93,3 %) tuotetta lila, sp. 200-202°C, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka = +5,8° (c = 1,0; DMF).
Cbo - 8 - sykloheksyyli - Ala - Vai - Argii^) - pNA (Illb) Lähtöaineet: 0,48 g (0,83 mmol) tuotetta lila ja 0,53 g (1,24 mmol) Cbo-8-sykloheksyyli-Ala-0pNP, jonka sp. on 105_106°C ja jonka Γα_= -28,8° (c = 1,0; DMF).
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadej^ LH-20-geelillä
MeOH:ssa.
Saalis: 531 mg (88 %) amorfista tuotetta Illb, joka on homo-geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /_q_7g = -7,3° (c = 2,0; DMF).
H - 8 - sykloheksyyli - Ala - Vai - Arg - pNA · 2HC1 (III) Lähtöaine: 120,4 mg (0,l65 mmol) tuotetta Illb. Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadej^ G-15~geelillä 20 $:sessa Ac0H:ssa.
10 56829
Saalis: 56,6 rag (55 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta III, jonka klooripitoisuus on 11,32 *, joka on homogeenista TLC-analyy-sin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka £a 7*3 = -36,8° (c = 0,62; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0, 3-sykloheksyyli-Ala: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki IV: Na- Bz - 3 - sykloheksyyli - Ala - Vai - Arg ~ pNA · HC1 (IV)
N“- Bz - 3 - sykloheksyyli - Ala - Vai - Arg(N02) - pNA
OVa) Lähtöaineet: 243 mg (0,335 mmol) tuotetta Illb ja 93 mg (0,41 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti SephadejP^ LH-20-geelillä
MeOH:ssa.
Saalis: 147 mg (63 %) tuotetta IVa, sp. 148-152°C, joka on — -r?3 homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka £ a_7p = “6,33° (c = 0,84; DMF).
Na- Bz - 3 - sykloheksyyli - Ala - Vai - Arg - pNA * HC1 (IV) Lähtöaine: 106,0 mg (0,152 mmol) tuotetta IVa. Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ G-15-geelillä 20 %:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 86,7 mg (84 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta IV, jonka klooripitoisuus on 5,10 5£, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka /"a_7g3 = -77° (c = 0,3; 50 %
AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0; 3-sykloheksyyli-Ala: 1,2; Arg: 1,0.
Esimerkki V: N-Bz-N-sykloheksyyli-3-Ala-Val-Arg-pNA·HC1 (V) N-Cbo-N-sykloheksyyli-3-Ala-Val-Arg(N02)-pNA (Va) Lähtöaineet: 286 mg (0,5 mmol) tuotetta lila ja 300 mg (0,7 mmol) N-Cbo-N-sykloheksyyli-g-Ala-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
(S\
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex0'LH-20-geelillä
MeOH:ssa.
Saalis: 313 mg (86 %) amorfista tuotetta Va, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka = - 0° (c = 1,0; DMP) N-Bz-N-sykloheksyyli-3-Ala-Val-Arg(N02)-pNA (Vb) Lähtöaineet: 300 mg (0,413 mmol) tuotetta Va ja 123 mg (0,544 mmol) Bz2o.
56829
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti SephadejP^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 243,5 mg (87 %) amorfista tuotetta Vb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka _/= 0,5° (c = 0,43j DMF).
N-Bz-N-sykloheksyyli-g-Ala-Val-Arg^pNA’HCl (V) Lähtöaine: 170 mg (0,242 mmol) tuotetta Vb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 126 mg (76 %) lyofilisoitua, amofista tuotetta V, jonka klooripitoisuus on 5,11 $, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka ~ "38,5° (c = 0,69i 50 % AcOH).
Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0, N-syklohek-syyli-e-Ala: 1,3, Arg: 0,9-
Esimerkki VI: Nct-Bz-Val-Val-Arg-pNAtHCl (VI)
Cbo-Val-Val-Arg(N02)-pNA (Via) Lähtöaineet: 1,97 g (3,43 mmol) tuotetta lila ja 1,6 g (4,2 mmol) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 1,9 g (82 %) amorfista tuotetta Via, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pirilä ja C:llä.
Na-Bz-Val-Val-Arg(N02)-pNA (VIb) Lähtöaineet: 1,9 g (2,83 mmol) tuotetta Via ja 0,77 g (3,40 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatograf isesti Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 1,45 g (80 %) amorfista tuotetta VIb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /7t_7^p = +5,6° (c = 1,01; DMF).
Na-Bz-Val-Val-Arg-pNH·HC1 (VI) Lähtöaine: 362 mg (0,564 mmol) tuotetta VIb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^G-15~geelillä 33 %:sessa Ac0H:ssa.
12 56829
Saalis: 248 mg (69,7 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta VI, jonka klooripitoisuus on 5,54 %, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka - -57,0° (c = 0,65i 50 %
AcOH).
Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 2,0,
Arg: 0,9.
Esimerkki VII: Na-Bz-Leu-Val-Arg-pNA·HC1 (VII)
Cbo-Leu-Val-Arg(NOg)-pNA (Vila) Lähtöaine: 1,97 g (3,43 mmol) tuotetta lila ja 1,7 g (4,2 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 2,05 g (87 %) amorfista tuotetta Vila, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä ja C:llä.
Na-Bz-Leu-Val-Arg(N02)-pNA (Vllb) Lähtöaineet: 1,75 g (2,55 mmol) tuotetta Vila ja 695 mg (3,06 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^®LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 1,49 g (91 %) amorfista tuotetta Vllb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka = +2,4° (c = 1,01; DMF).
Na-Bz-Leu-Val-Arg-pNA·HC1 (VII) Lähtöaine: 319 mg (0,486 mmol) tuotetta Vllb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^^G-15~geelillä 33 ?:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 276 mg (88 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta VII, jonka klooripitoisuus on 5,41 %, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka = -52,0° (c = 0,65; 50 %
AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0;
Leu:1,1; Arg: 0,95.
Esimerkki VIII: Na-Bz-Ile-Val-Arg-pNA·HC1 (VIII)
Cbo-Ile-Val-Arg(NQ2)-pNA (Villa) Lähtöaineet: 1,97 g (3,42 mmol) tuotetta lila ja 1,7 g (4,2 mmol) Cbo-Ile-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
13 66829
Saalis: 2,0 g (85 %) amorfista tuotetta Vila, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Pirilä.
Na-Bz-Ile-Val-Arg(NOg) -pNA (VHIb) Lähtöaineet: 1,75 g (2,55 mmol) tuotetta Villa ja 695 mg (3,06 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadei^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 1,46 g (39 %) amorfista tuotetta Vlllb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä.
Na-Bz-Ile-Val-Arg-pNA·HC1 (VIII) Lähtöaine: 319 mg (0,486 mmol) tuotetta Vlllb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatograf isesti Sephadeji® G-15~geelillä 33 5S:sessa AcOHrssa.
Saalis: 264 mg (84 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta VIII, jonka klooripitoisuus on 5,43 %, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka /q_7jp = “29,9 (c = 0,59; 50 %
AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0; Ile: 0,9; Arg: 1,1.
Esimerkki IX: Na-Bz-Val-Ile-Arg-pNA·HC1 (IX)
Cbo-Ile-Arg(N02)-pNA (IXa) Lähtöaineet: 4,9 g (10,4 mmol) tuotetta Ia ja 6,2 g (16 mmol) Cbo-Ile-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 4,75 g (78,1¾) osittain kiteistä tuotetta IXa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka C<J^ = +2,3° (c = 1,0; DMF).
Cbo-Val-Ile-Arg(N02)-pNA (IXb) Lähtöaineet: 800 mg (1,37 mmol) tuotetta IXa ja 615 mg (1,65 mmol) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 833 mg (88,5 £) amorfista tuotetta IXb, joka on homo- — —24 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka _/o_/p = -5,23° (c = 1,1; DMF).
14 S6829
Na-Bz-Val-Ile-Arg(NQ2)-pNA (IXc) Lähtöaineet: 500 mg (0,73 mmol) tuotetta IXb ja 193 mg (0,876 mmol) Βζ20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadej^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 374 mg (78 %) amorfista tuotetta IXc, joka on homo- — —23 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /.q_/D = +1,9° (c = 0,99; DMF).
Na-Bz-Val-Ile-Arg-pNA-HCl (IX) Lähtöaine: 200 mg (0,305 mmol) tuotetta IXc. Synteesimenetelmä: Esimerkin Id mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ G-15-geelillä 33 £:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 153 mg (77,5 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta IX, jonka klooripitoisuus on 5,40 %t joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka /_a_7= -56,4° (c = 0,64; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0;
Ile: 1,1; Arg: 1,1.
Esimerkki X: Na-Bz-Val-Leu-Arg-pNA*HCl (X)
Cbo-Val-Leu-Arg(NOp)-pNA (Xa) Lähtöaineet: 880 mg (1,5 mmol) tuotetta Ib ja 670 mg (1,8 mmol) Cbo-Val-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 882 mg (86 %) amorfista tuotetta Xa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka Aä_7jp = -6,6° (c = 1,01; DMF).
Na-Bz-Val-Leu-Arg(NOp)-pNA (Xb) Lähtöaineet: 400 mg (0,583 mmol) tuotetta Xa ja 160 mg (0,707 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 279 mg (73 %) amorfista tuotetta Xb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka A"ö_7jp = -0,4° (c = 1,04; DMF).
15 $6829
Na-Bz-Val-Leu-Arg-pNA·HC1 (X) Lähtöaine: 150 mg (0,23 mmol) tuotetta Xb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadej^ G-15-geelillä 33 #:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 126 mg (84,5 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta X, jonka klooripitoisuus on 5,45 %» joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka /fqJZjp = -5^,0° (c = 0,64; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Vai: 1,0;
Leu: 1,1; Arg: 1,0.
Esimerkki XI: ^-Bz-Ile-Ile-Arg-pNA^HCl (XI)
Cbo-Ile-Ile-Arg(N02)-pNA (Xla) Lähtöaineet: 800 mg (1,37 mmol) tuotetta IXa ja 640 mg (1,66 mmol) Cbo-Ile-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadejr^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 838 mg (87,5 %) osittain kiteistä tuotetta Xla, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /a_7D3 = _5>7° (c = mF)'
Not-Bz-Ile-Ile-Arg(NO?)-pNA (Xlb) Lähtöaineet: 440 mg (0,63 mmol) tuotetta Xla ja 171 mg (0,76 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 409 mg (97 %) osittain kiteistä tuotetta Xlb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä.
Na-Bz-Ile-Ile-Arg-pNA·HC1 (XI) Lähtöaine: 201 mg (0,3 mmol) tuotetta Xlb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatograf isesti Sephade^ G-15-geelillä 33 %:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 172 mg (87 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XI, jonka klooripitoisuus on 5,33 %» joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka _/a_7jp = -57,0° (c = 0,67; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Ile: 2,0;
Arg: 0,9.
16 56829
Esimerkki XII: Not-Bz-Leu-Ile’-Arp:-pNA·HC1 (XII)
Cbo-Leu-Ile-Arg(N02)-pNA (Xlla) Lähtöaineet: 800 mg (1,37 mmol) tuotetta IXa ja 640 mg (1,66 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)£^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 772 mg (8l %) amorfista tuotetta Xlla, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /_a__= -7,3° (c = 1,02; DMP).
N°t-Bz-Leu-Ile-Arg( N0g)-pNA (Xllb) Lähtöaineet: 500 mg (0,72 mmol) tuotetta Xlla ja 205 mg (0,86 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 482 mg (82%) amorfista tuotetta Xllb, joka on homo- — p a geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka = +0,5° (c = 1,03; DMP).
Na-Bz-Leu-Ile-Arg-pNA‘HC1 (XII) Lähtöaine: 193 mg (0,288 mmol) tuotetta Xllb. Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadejc^ G-15-geelillä 33 5S:sessa Ac0H:ssa.
Saalis: 166 mg (86 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XII, jonka klooripitoisuus on 5,34 %, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A :11a ja jonka £07^ = -51,4° (c = 0,67 J 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 1,0;
Ile: 1,2; Arg: 0,9.
Esimerkki XIII: Na-Bz-Ile-Leu-Arg-pNA*HCl (XIII)
Cbo-Ileu-Leu-Arg-(N02)-pNA (XIIIa) Lähtöaineet: 880 mg (1,5 mmol) tuotetta Ib ja 696 mg (1,8 mmol) Cbo-Ileu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 750 mg (71 %) amorfista tuotetta XHIa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka Λχ7^ = -9,85° (C = 1,05; DMP).
17 £>6829
Na-Bz-Ile-Leu-Arg(NO?)-pNA (XUIb) Lähtöaineet: 498 mg (0,71 mmol) tuotetta Xllla ja 193 mg (0,85 mmol) Βζ20.
Synteesimentelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadej^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 3^5 mg (73 %) osittain kiteistä tuotetta Xlllb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka = -5,7°C (c = 1,04; DMF).
N^Bz-Ile-Leu-Arg-pNA^HCl (XIII) Lähtöaineet: 170 mg (0,254 mmol) tuotetta Xlllb.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)^ G-15-geelillä 33 ?:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 129 mg (77 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XIII, jonka klooripitoisuus on 5>31 %t joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a ja jonka ,/"qt_7jp = -49,9° ( c = 0,68; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 1,0; Ile: 1,1; Arg: 1,05.
Esimerkki XIV: Na-Bz-Leu-Leu-Arg-2-NA*HCl (XIV)
Cbo-Arg(N02)-2-NA (XlVa) 3,6 g (10 mmol) kuivaa Cbo-Arg(N02)-0H liuotetaan 200 ml:an THF:a. 1,0 g (10 mmol) Et^N lisätään, minkä jälkeen seos jäähdytetään -10°C:en täysin kuivissa olosuhteissa.
1,3 g (10 mmol) isobutyyliklooriformaattia liuotettuna 10 ml:an THF:a lisätään jäähdytettyyn seokseen 10 minuutin aikana ja vielä 10 min kuluttua lisätään 1,72 g (10 mmol) 2-naftyyliamiinia. Reaktioseoksen annetaan saavuttaa huoneenlämpötila ja jätetään tähän lämpötilaan 24 tunniksi. Reaktioseos haihdutetaan tyhjössä kuiviin, sitä käsitellään sitten 3-5 kertaa tislatulla vedellä, 3-5 kertaa 5 %:sella natriumbikarbonaattiliuoksella ja taas 3-5 kertaa tislatulla vedellä, jonka jälkeen se kuivataan tyhjössä.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadei^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 4,05 g (84 %) osittain kiteistä tuotetta XlVa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja C:llä ja jonka /“a7^3 = +7,35° (c = 1,0; DMF).
Cbo-Leu-Arg(NOp)-2-NA (XlVb) Lähtöaineet : 1,5 g (3,1 mmol) tuotetta XlVa ja 1,43 g (3,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
18 56829
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 1,6 g (86 %) amorfista tuotetta XlVb, joka on homogee-nista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piellä ja jonka _/ α_7^ = -9,1° (c = 1,0; DMP).
Cbo-Leu-Leu-Arg(NO„)-2-NA (XIVc) Lähtöaineet: 1,35 g (2,26 mmol) tuotetta XlVb ja 1,05 g (2,71 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 1,00 g (62,4 %) osittain kiteistä tuotetta XIVc, joka on homogeenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jon-ka /"0.7^ = -20,6° (c = 1,0; DMP).
Na-Bz-Leu-Leu-Arg(NOg)-2-NA (XlVd) Lähtöaineet: 990 mg (1,4 mmol) tuotetta XIVc ja 407 mg (1,8 mmol) Bz^O.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 800 mg (84 %) amorfista tuotetta XlVd, joka on homo- _ 20 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka /_<%_7^ = -13,4° (c = 1,0; DMP).
Na-Bz-Leu-Leu-Arg-2-NA·HC1 (XIV) Lähtöaine: 350 mg (0,52 mmol) tuotetta XlVd.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatograf isesti Sephadex^ G-15-geelillä 33 2:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 260 mg (75 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XIV, jonka klooripitoisuus on 5,30 %t joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka ~ -51,8° (c = 0,57; 50 %
AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 2,0;
Arg: 0,95.
Esimerkki XV: Na-Bz-Leu-Leu-Arg-l-nitro-2-NA·HC1 (XV)
Cbo-Arg(N02)-l-nitro-2-NA (XVa) Lähtöaineet: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg(N02)-0H ja 2,26 g (12 mmol) l-nitro-2-naftyyliamiinia.
Synteesimenetelmä: Esimerkin XlVa mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade*^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
« SG829
Saalis: 3,1 g (58,7 JO amorfista tuotetta XVa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä ja C:llä ja jonka 1\7q9 = -11,8° (c = 1,0; DMF).
Cbo-Leu-Arg(N02)-l-nitro-2-NA (XVb) Lähtöaineet: 950 mg (1,8 mmol) tuotetta XVa ja 850 mg (2,2 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadei^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 900 mg (78 %) amorfista tuotetta XVb, joka on homo- |1H pp geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /^a_7p = -10,2° (c = 1,02; DMF).
Cbo-Leu-Leu-Arg(NOg)-l-nitro-2-NA (XVc) Lähtöaineet: 900 mg (1,4 mmol) tuotetta XVb ja 650 mg (1,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 810 mg (77 %) amorfista tuotetta XVc, joka on homo- — t24 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka LolJ-q ~ -18,2° (c = 1,01; DMF).
Na-Bz-Leu-Leu-Arg(NOp)-l-nitro-2-NA (XVd) Lähtöaineet: 680 mg (0,88 mmol) tuotetta XVc ja 260 mg (1,15 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadei^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 480 mg (73 %) amorfista tuotetta XVd, joka on homo- — -t24 geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka £ol_7^ = -31,4° (c = 0,9; DMF).
Na-Bz-Leu-Leu-Arg-l-nitro-2-NA'HCl (XV) Lähtöaine: 74 mg (0,1 mmol) .tuotetta XVd.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadex^ G-15“geelillä 33 ?:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 47 mg (66 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XV, jonka klooripitoisuus on 4,94 %, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka λ"α_7ρ^ = “33,6° (c = 0,72; 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 2,0; Arg: 0,9.
20 S6829
Esimerkki XVI: Not-Bz-Leu-Leu-Arg-i<-nitro-l-NA,HCl (XVI)
Cbo-Arg(N02)-4-nitro-l-NA (XVIa) Lähtöaineet: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg(N02)-0H ja 2,26 g (12 mmol) 4-nitro-l-naftyyliamiinia.
Synteesimenetelmä: Esimerkin XlVa mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 2,9 g (55 %) amorfista tuotetta XVIa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P-^llä ja C:llä ja jonka Γα7ρ2 = -11,4° (c = l,01i DMF).
Cbo-Leu-Arg(N02)-4-nitro-l-NA (XVIb) Lähtöaineet: 650 mg (1,23 mmol) tuotetta XV]aja 560 mg (1,45 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade*^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 520 mg (66 %) amorfista tuotetta XVIb, joka on homo-geenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /a__7^ ~ -11,8° (c = 0,2; DMF).
Cbo-Leu-Leu-Arg(N02)-4-nitro-l-NA (XVIc) Lähtöaineet: 520 mg (0,81 mmol) tuotetta XVIb ja 375 mg (0,97 mmol) Cbo-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ib mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 378 mg (62 %) osittain kiteistä tuotetta XVIc, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /"q_7jj3 = -18,0° (c = 1,0; DMF).
N0t-Bz-Leu-Leu-Arg(NO2 )-4-nitro-l-NA (XVId) Lähtöaineet: 150 mg (0,2 mmol) tuotetta XVIc ja 57 mg (0,25 mmol) BzgO.
Synteesimenetelmä: Esimerkin Ha mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade)^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 120 mg (83 %) amorfista tuotetta XVId, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /1x7^ = 30,9° (c = 0,95; DMF).
21 56629
Na-Bz-Leu-Leu-Arg-4-nitro-l-NA«HCl (XVI) Lähtöaine: 120 mg (0,165 mmol) tuotetta XVId.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^P^ G-15-geelillä 33 i:sessa AcOH:ssa.
Saalis: 48 mg (42 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XVI, jonka klooripitoisuus on 4,95 %, joka on homogeenista TLC-analyysin
O O
mukaan kehitettynä A:11a ja jonka /”a7p = -36,0° (c = 0,71; 50 %
AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 2,0;
Arg: 0,9.
Esimerkki XVII: Na-Bz-Leu-Lys-pNA·HC1 (XVII)
Na-B0C-Lys(6-Cbo)-pNA (XVIIa) 6,3 g (11,2 mmol) Na-B0C-Lys(£-Cbo)-0H*DCHA:a liuotetaan 40 ml:an kuivaa, juuri tislattua HMPTA:a huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen lisätään 5 g (30,5 mmol) p-nitrofenyyli-isosyanaattia yhtämittaa sekoittaen täysin kuivissa olosuhteissa. 24 tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa reaktioseos puhdistetaan esimerkissä Ia kuvatulla tavalla. Liukenematon osa, joka koostuu NjN^’-bis-p-nitrofenyyli-karbamidista, suodatetaan pois. Suodos puhdistetaan geelikromato-grafisesti Sephade)^ LH-20-kolonnilla tasapainoitettuna Me0H:lla.
Saalis: 4,17 g (74,5 %) osittain kiteistä tuotetta XVIIa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka Γά/β1 = +1,7° (c = 1,0; DMF).
Na-B0C-Leu-Lys(6-Cbo)-pNA (XVIIb) 2,20 g (4,4 mmol) tuotetta XVIIa liuotetaan 10 ml:an juuri tislattua trifluorietikkahappoa täysin kuivissa olosuhteissa. Reak-tioseosta sekoitetaan tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen se kaadetaan hitaasti 150 ml:an kuivaa, voimakkaasti sekoitettua eetteriä, jolloin CF^COOIi‘H-Lys(£-Cbo)-pNA saostuu jäähdytyksen jälkeen. Eetteriliuos dekantoidaan pois ja amorfista jäännöstä käsitellään vielä kolme kertaa 75 ml:11a eetteriä. Kun tuote on kuivattu tyhjössä PgO^illa ja NaOH:lla, on aminohappojohdannaisen trifluori-etikkahapposuolan saalis kvantitatiivinen (2,25 g).
2,25 g (4,4 mmol) CF^COOH*H-Lys(6-Cbo)-pNA liuotetaan 10 ml:an DMF:a. Liuos jäähdytetään -10°C:en ja 0,78 ml (5,5 mmol) Et^N lisätään aminohapposuolan vapauttamiseksi. 2,4 g (6,5 mmol) BOC-Leu-OpNP:a lisätään ja liuoksen annetaan saavuttaa huoneenlämpötila. Kolmen tunnin kuluttua liuos jäähdytetään jälleen -10°C:en ja puskuroidaan 0,31 ml:lla (2,2 mmol) Et^N:a. Puskurointimenettely toistetaan vielä kerran 2-3 tunnin kuluttua. 24 tunnin reaktioajan jälkeen liuos 22 56Θ29
. O
haihdutetaan MO C:ssa tyhjössä kuiviin. Haihdutusjäännöstä käsitellään kolmasti 20 ml:11a tislattua vettä ja se kuivataan tyhjössä. Epäpuhdas, kuiva jäännös liuotetaan MeOH:in ja se puhdistetaan geeli-kromatografisesti Sephade^ LH-20-kolonnilla tasapainoitettuna MeOH: 11a.
Saalis: 1,70 g (70 %) amorfista tuotetta XVIIb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja C:llä ja jonka /“ö_722 = -4,9° (C = 1,1J DMP).
Na-BOC-Leu-Leu-L.vs(fc-Cbo)-pNA (XVIIc) Lähtöaineet: 950 mg (1,55 mmol) tuotetta XVIIb ja 1,16 g (3,1 mmol) BOC-Leu-OpNP.
Synteesimenetelmä: Esimerkin XVIIb mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 9Ö5 mg (88 %) amorfista tuotetta XVIIc, joka on ho-mogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä Piillä ja jonka j_ q_7^ = -22,0° (c = 1,0; DMF).
Na-Bz-Leu-Leu-Lys(£-Cbo)-pNA (XVIId) Lähtöaineet: 1,25 g (1,4 mmol) tuotetta XVIIc ja 384 mg (1,7 mmol) Bz20.
Synteesimenetelmä: Tuotteen XVIIc dekarbobutyylioksylointi suoritettiin esimerkin XVIIb menetelmän mukaisesti.
Kuiva CF^C00H*H-Leu-Leu-Lys(£-Cbo)-pNA liuotettiin 20 ml:an DMP:a ja jäähdytettiin -10°C:en, jonka jälkeen lisättiin 200 ml (1,45 mmol) Et^N:a peptidiamiinin vapauttamiseksi suolastaan. 384 mg (1,7 mmol) Bz20:a lisättiin liuokseen -10°C:ssa, minkä jälkeen puskurointi- ja puhdistusmenettelyt suoritettiin esimerkin XVIIb mukaisesti.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephade^ LH-20-geelillä MeOH:ssa.
Saalis: 920 mg (90 %) osittain kiteistä tuotetta XVIIb, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja C:llä ja jonka /ö_720 = -5,95° (c = 1,02; DMP).
Ne-Bz-Leu-Leu-Lys-pNA·HC1 (XVII) Lähtöaine: 300 mg (0,41 mmol) tuotetta XVIId.
Synteesimenetelmä: Esimerkin I mukainen.
Puhdistus: Geelikromatografisesti Sephadej^G-15-geelillä 33 Strsessa AcOH:ssa.
Saalis: 170 mg (66 %) lyofilisoitua, amorfista tuotetta XVII, jonka klooripitoisuus on 5,51 $, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:lla ja jonka Λχ_7ρ2 = -50,5° (c = 0,62; 23 56829 50 % AcOH). Aminohappoanalyysi osoitti seuraavia suhteita: Leu: 2,0; Lys: 0,35· N0-Bz-Ile-Leu-Lys-pNA · HC1 (XVIII)
Nct-BOC-Ile-Leu-Lys( e-Cbo)-pNA (XVIIIa) Lähtöaineet: 3*0 g (4,9 mmol) esimerkin XVIIb mukaisesti ja
2,2 g (5,9 mmol) BOC-Ile-OpNP
Synteesimenetelmä: Esimerkin XVIIbmukaisesti Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex'S' LH-20 MeOH:ssa Saalis: 3,05 g (85,7 %) osittain kiteistä XVIIIa, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /ä7jp = -15,4° (c = 0,99 DMP).
Na-Bz-Ile-Leu-Lys(e-Cbo)-pNA (XVIIIb) Lähtöaineet: 2,4 g (3,3 mmol) XVIIIa ja 0,9 g (3,98 mmol)
BZ2O
Synteesimenetelmä: Esimerkin XVIId mukaisesti Puhdistus: Raakatuote lietettiin MeOH:iin ja palautuskei-tettiin tunnin ajan ja jäähdytettiin ja suodatettiin.
Saalis 2,15 g (89,2 %) XVIIIb kiteisenä, joka on homogeenistä TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^:llä ja A:11a ja jonka /a/p = -7,2° (c = 0,90 DMF).
Na-Bz-Ile-Leu-Lys-pNA · HC1 (XVIII) Lähtöaineet: 2,0 g (2,73 mmol) XVIIIb Synteesimenetelmä: Esimerkin 1 mukaisesti Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex® G-15 33 % AcOH:ssa Saalis: 1,5 g (87 %) amorfista pakkaskuivattua XVIII, joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A:11a, ja jonka /ä/p3 = -8,62° (c = 1,03 DMF).
Aminohappoanalyysi: Ile: 1,10 Leu: 1,07 Lys: 1,05 Na-Bz-Val-Leu-Lys-pNA · HC1 (XIX )
Na-BOC-Val-Leu-Lys(e-Cbo)-pNA (XlXa)
Lähtöaineet: 0,98 g (1,59 mmol) XVIIb ja 0,69 g (1,90 mmol) BOC-Val-OpNP
Synteesimenetelmä: Esimerkin XVIIbmukaisesti.
Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^' LH-20 MeOH:ssa
Saalis 0,90 g (79,6 %) amorfista XlXa, joka on homogeenista . . . . —24 o TLC-analyysxn mukaan kehitettynä P^:llä ja jonka /a/^ = “7,9 (c = 1,0 DMF).
24 5o829
Na-Bz-Val-Leu-Lys (e-Cbo)-pNA (XlXb) Lähtöaineet: 630 mg (0,88 mmol) XlXa ja 240 mg (1,1 mmol) BZgO.
Synteesimenetelmä, esimerkin XVIId mukaisesti
Puhdistus: Raakatuote lietettään MeOH:iin ja palautus- keitettiin tunnin ajan ja jäähdytettiin ja suodatettiin.
Saalis: 0,43 g (67,4 %) kiteistä XlXb, joka on homogeenista --24 o TLC-analyysin mukaan kehitettynä P^llä ja jonka /a/D = -3,6 (c = 0,85 DMF).
Na-Bz-Val-Leu-Lys-pNA · HC1 (XIX) Lähtöaineet: 395 mg (0,55 mmol) XlXb Synteesimenetelmä: Esimerkin XVIIdmukaisesti Puhdistus: Geelisuodatus Sephadex^ G-15 33 % AcOH:ssa Saalis: 0f28 g (82 S?) amorfista pakkaskuivattua XIX, jonka klooripitoisuus oli 5,9 %, ja joka on homogeenista TLC-analyysin mukaan kehitettynä A: 11a ja jonka /[<17^ = -7,0° (c = 1,0DMF). Aminohappoanalyysi: Vai: 0,96 Leu: 1,03 Lys: 0,98 Esimerkkien mukaisesti valmistettuja substraatteja käytettiin erilaisten entsyymien määrittämiseen seuraavalla tavalla: Määritysperiaate perustuu siihen, että entsymaattisella hyd-rolyysillä muodostunut tuote antaa UV-spektrin, joka on täysin poikkeava substraatin spektristä. Näin ollen esimerkin II mukaisella substraatilla, Na-Bz-Leu-Leu-Arg-pNA1HC1 on absorptiomaksimi kohdassa 302 nm molaarisella ekstinktiokertoimella 12920. Substraatin absorptio on merkityksetön kohdassa 405 nm. p-nitroaniliinilla (pNA), joka muodostuu substraatista entsymaattisen hydrolyysin aikana, on absorptiomaksimi kohdassa 380 nm molaarisella ekstinktiokertoimella 13200, joka kohdassa 405 nm on laskenut vain arvoon 9620.
Tämän vuoksi mittaamalla spektrofotometrisesti aallonpituudella 405 nm voidaan helposti seurata entsymaattista hydrolysoitu-misastetta, joka on verrannollinen muodostuneen p-nitroaniliinin määrään. Läsnä oleva substraatin ylimäärä ei häiritse maittausta tällä aallonpituudella. Asianlaita on lähes sama muilla keksinnön substraateilla ja tästä syystä spektrofotometriset mittaukset suoritettiin kauttaaltaan aallonpituudella 405 nm.
Entsymaattinen reaktio voidaan kaavamaisesti kirjoittaa seuraavaan tapaan: ki . k3 E + S^ZZZTES'-^ES' + kromofon P.^ 2 ^ ik4 E + P, 25 8Ö829 E = entsyymi S = substraatti E£> = entsyymi-substraattikompleksi ja P2 = tuotteita k.^ k2, k^ ja kjj = nopeusvakioita k
Dissosiaatiovakio ES:lle = -£ = K (Michaelis'in vakio) k, m
Jos (S) » (E) ja ki)« k^, on seuraava totta
Li e) - (es)_7x (s) (1) m (ES)
Nopeus, jolla kromofori P^ muodostuu: v = k^ x (ES) k^ x (E) x (S) v = - (2) K + (S) m - Λ 26 S 6 θ 2 9
Kun kaikki E sitoutuu S:in, (ES) = (E) ja v s vmaks = k3 x (E) 0)
Linweaver-Burk'in yhtälö 1 Km 1 1 - = -J!L_ x i + -i- ; (4) v vmaks vmaks
Kuten yhtälöstä (2) ilmenee, vakiot Km ja k^ määräävät entsyymisubstraatin tehokkuuden tiettyyn entsyymiin nähden. Näiden vakioiden määrittämisessä on menettely periaatteessa seuraava: Entsyy^ mi ja substraatti sekoitetaan puskuriliuokseen ja reaktiota seurataan spektrofotometrisesti 5 min. Substraatin väkevyyttä (S) vaihdellaan kun taas entsyymin väkevyys (E) pidetään kullekin substraatille vakiona. Ekstinktio (OD) piirretään ajan funktiona. Tällä tavoin saadun käyrän tangentti (= ekstinktion ero minuutissa, AOD/min, josta muodostunut p-NA/min-määrä ,umol:issa (v) voidaan laskea) ajanhet- . i kellä nolla antaa alkuperäisen reaktionopeuden v. Jos - piirretään 1 v funktiona :sta saadaan Km ja vmaks (yhtälö (4)) diagrammista.
Km ja k^ (= -ygy- ) trypsiinille ja eri entsyymisubstraateille esitetään taulukossa 1 ja trombiinille taulukossa 2. Vakioita Km ja k^ koskevat tiedot puuttuvat tapauksissa, joissa näitä arvoja ei ole määritetty tai kun niitä ei voitu laskea, koska ei saatu lineaarista riippuvuutta muuttujien y ja välille.
Karkea arvio entsyymin ja substraatin väliselle suhteelle eri substraateilla voidaan saada vertaamalla minuutissa ja millilit-raa kohti muodostuneen p-nitroaniliinin määrää samalla substraattien väkevyydellä. Tämä esitetään taulukossa 3 trypsiinille, taulukossa 4 trombiinille ja taulukossa 5 plasmiinille.
Taulukoissa käytetyt kirjaimet NIH viittaavat National Institute of Health-laitoksen yksiköihin. Trypsiiniyksikkö vastaa Na-tosyyli-arginiinimetyyliesterin hydrokloridin (TAME) yhden ^umolrn hydrolyysia minuutissa 25°C:ssa ja pH-arvolla 8,1, kun läsnä on 0,01-M kalsiumionia ja trypsiini saatiin Worthington Biochemical Corporation-yhtiöltä, Freehold, N.J. USA. Plasmiini saatiin AB Kabi-yhtiöltä, Tukholma, Ruotsi, ja 1 mg vastasi kolmea kaseiiniyksikköä (CU).
Trypsiini-aktiivisuus Km ja k^ 27
Taulukko 1 56829 4 4
Substraatti Substraatin Entsyymin Km x 10 k, x 10 «-01«) (/itmol/inin, ' NIH/ml) ΒΑΡΝΑ 250-666 75 16 8,5 I 33,6-112,0 6 7,40 330 II 35,0-150,0 3,3 0,64 276 IV 35,0-150,0 3,3 0,17 71
Taulukko 2
Trombiiniaktiivisuus, K ja k, m 3 m 4
Substraatti Substraatin Entsyymin Km x 10 k, x 10 väkevyys väkevyys (mol/1) (/Umol/min, (/Umol/l) (NIH/ml) / * ' NIH/ml) ΒΑΡΝΑ 250-666 50 ~6 ~11 I 33,6-112,0 10 2,92 40
Trypsiiniaktiivisuus 28
Taulukko 3 S G 8 2 9
Substraatti Substraatin väkev. Entsyymin väkev. Muodostunut p- nmol/ml yks./ml nitroaniliini nmol/min/ml ΒΑΡΝΑ 333,0 50,0 1,0¾ II 66,9 0,0833 14,2 III 66,7 " 16,8 IV 67,0 " 10,2 V 66,3 " 22,7 VI 66,8 " 12,8 VII 66,2 " 16,6 VIII 66,7 " 17,1 IX 67,0 " 12,0 X 67,1 " 15,5 XI 66,3 " 12,¾ XII 65,9 " 16,5 XIII 66,9 " 16,7
Trombiiniaktiivisuus 29
Taulukko 4 5b829
Substraatti Substraatin väkev. Entsyymin väkev. Muodostunut p- nmol/ml NIH-yks./ml nitroaniliini nmol/min/ml ΒΑΡΝΑ 333,0 2,08 6,1 II 66,9 0,417 1,8 III 67,2 " 0,5 IV 67,0 " 0,9 V 66,5 " 1,7 VI 66,8 " 0,2 VII 66,2 " 0,4 VIII 66,7 " 0,1 IX 67,0 " 0,3 X 67,1 " 0,4 XI 66,3 " 0,2 XII 66,3 " 0,7 XIII 66,9 " 0,2 XVII 67,0 " 0,1
Taulukko 5 30 S6829
Plasmiiniaktiivisuus
Substraatti Substraatin väkev. Entsyymin väkev. Muodostunut p-nmol/ml CU-yks./ml nitroaniliini nmol/min/ml II 66,9 0,167 2,7 III 66,7 " 17,2 IV 67,0 " 2,7 V 66,5 " 7,7 VI 66,8 " 2,8 VII 66,2 " 2,2 VIII 66,7 " 4,0 IX 67,0 1,5 X 67,1 " 17,2 XI 66,3 " 2,0 XII 65,9 ” 1,5 XIII 66,9 " 17,9 XVII 67,0 " 21,3
Taulukot 1-5 osoittavat selvästi tämän keksinnön entsyymi-substraattien edut verrattuna aikaisemmin trypsiinille käytettyyn amidisubstraattiin (ΒΑΡΝΑ). Suuremman herkkyyden ansiosta nämä uudet substraatit tekevät pienten entsyymimäärien määrityksen mahdolliseksi vaarantamatta määrityksen tarkkuutta. Tämä on erittäin tärkeää kliiniseltä kannalta, sillä se yksinkertaistaa näytteiden keräämistä.
FI1308/73A 1972-05-02 1973-04-25 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser FI56829C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE575872 1972-05-02
SE7205758A SE380258B (sv) 1972-05-02 1972-05-02 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI56829B FI56829B (fi) 1979-12-31
FI56829C true FI56829C (fi) 1980-04-10

Family

ID=20267173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI1308/73A FI56829C (fi) 1972-05-02 1973-04-25 Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser

Country Status (20)

Country Link
US (1) US3886136A (fi)
AT (1) AT324558B (fi)
AU (1) AU474908B2 (fi)
BE (1) BE798917A (fi)
CA (1) CA1019724A (fi)
CH (1) CH590475A5 (fi)
CS (1) CS172974B2 (fi)
DD (1) DD108282A5 (fi)
DE (1) DE2322115B2 (fi)
ES (1) ES414251A1 (fi)
FI (1) FI56829C (fi)
FR (1) FR2183170B1 (fi)
GB (1) GB1426385A (fi)
IL (2) IL42124A (fi)
IT (1) IT1051562B (fi)
NL (1) NL7306088A (fi)
NO (1) NO135362C (fi)
PL (1) PL89227B1 (fi)
SE (1) SE380258B (fi)
ZA (1) ZA732975B (fi)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2527932C2 (de) * 1974-07-02 1983-04-21 Pentapharm AG, 4052 Basel Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein
US4016259A (en) * 1974-07-26 1977-04-05 Research Corporation Contraceptive polypeptides
US4162941A (en) * 1974-12-05 1979-07-31 Ab Kabi Method for determining a proteolytic enzyme
CH622286A5 (fi) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
US4061625A (en) * 1975-07-11 1977-12-06 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407405B (sv) * 1975-07-11 1979-03-26 Kabi Ab Nya kromogena trombinsubstrat
US4169015A (en) * 1975-07-11 1979-09-25 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
US4147692A (en) * 1977-02-26 1979-04-03 Ajinomoto Co., Inc. Novel dipeptide derivatives, and method of measuring enzymatic activity
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
IL60888A (en) * 1978-06-16 1984-07-31 Yeda Res & Dev Substrates and process for the quantitative assay of enzymes
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4161488A (en) * 1978-08-17 1979-07-17 Abbott Laboratories Enzymatic substrates
US4166825A (en) * 1978-08-17 1979-09-04 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
JPS5559150A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
US4289498A (en) * 1979-01-08 1981-09-15 Ortho Diagnostics, Inc. One-stage prothrombin assay and compositions useful therein
US4219497A (en) 1979-04-06 1980-08-26 Abbott Laboratories Chromogenic substrates
US4409140A (en) * 1979-04-23 1983-10-11 Smith Robert E Substrates and method for determining enzymes
EP0018002B1 (de) * 1979-04-24 1983-02-09 Marcel Jozefonvicz Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
US4308202A (en) * 1979-10-25 1981-12-29 Torii & Co., Ltd. Prolylphenylalanylarginine derivatives, process for producing same and method for measuring activity of enzymes using same
CA1161432A (en) * 1980-02-12 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
WO1982000641A1 (en) * 1980-08-25 1982-03-04 Ab Kabivitrum Peptide substrates for determination of protease activity
JPS5753445A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide compound
US4849353A (en) * 1980-09-30 1989-07-18 Cornell Research Foundation, Inc. Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof
US4568636A (en) * 1981-03-25 1986-02-04 Pentapharm Ag Tripeptide derivatives
US4428874A (en) 1981-03-25 1984-01-31 Pentapharm A.G. Tripeptide derivatives
US4388233A (en) * 1981-05-15 1983-06-14 The Regents Of The University Of California Synthetic substrates for enzyme analysis
JPS5856695A (ja) * 1981-09-28 1983-04-04 Nitto Boseki Co Ltd 新規なトロンビン測定用基質
DE3139719A1 (de) * 1981-10-06 1983-04-21 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von chymotrypsin oder trypsin im stuhl
JPS5863399A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Nitto Boseki Co Ltd 新規なプラスミン測定用基質
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
DE3268329D1 (en) * 1981-11-02 1986-02-13 Pentapharm Ag Process for the quantitative determination of the blood clotting factor xii in human plasma
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
FR2546164B1 (fr) * 1983-05-16 1987-07-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de peptides, leur preparation et leur application comme inhibiteurs de l'elastase
JPS6117956A (ja) * 1984-07-04 1986-01-25 Nitto Boseki Co Ltd 新規な尿中カリクレイン測定用基質
US4897444A (en) * 1985-05-31 1990-01-30 The Research Foundation Of The State University Of New York Immobilized fluorogenic substrates for enzymes; and processes for their preparation
JPS62126196A (ja) * 1985-11-26 1987-06-08 Nitto Boseki Co Ltd 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物
US5399487A (en) * 1993-03-04 1995-03-21 Haematologic Technologies, Inc. 6-peptidylamino-1-naphthalenesulfonamides useful as fluorogenic proteolytic enzyme substrates
US6297024B1 (en) 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
US6235494B1 (en) 1999-02-08 2001-05-22 The Scripps Research Institute Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates
US6455734B1 (en) 2000-08-09 2002-09-24 Magnesium Diagnostics, Inc. Antagonists of the magnesium binding defect as therapeutic agents and methods for treatment of abnormal physiological states

Also Published As

Publication number Publication date
AT324558B (de) 1975-09-10
NL7306088A (fi) 1973-11-06
ES414251A1 (es) 1976-06-16
AU474908B2 (en) 1976-08-05
US3886136A (en) 1975-05-27
ZA732975B (en) 1974-04-24
IL42124A (en) 1977-02-28
PL89227B1 (fi) 1976-11-30
AU5503973A (en) 1974-11-07
FR2183170B1 (fi) 1977-02-11
CH590475A5 (fi) 1977-08-15
DE2322115B2 (de) 1980-01-10
BE798917A (fr) 1973-08-16
NO135362B (fi) 1976-12-20
FR2183170A1 (fi) 1973-12-14
SE380258B (sv) 1975-11-03
CS172974B2 (fi) 1977-01-28
DE2322115A1 (de) 1973-11-22
IT1051562B (it) 1981-05-20
GB1426385A (en) 1976-02-25
DD108282A5 (fi) 1974-09-12
IL42124A0 (en) 1973-06-29
CA1019724A (en) 1977-10-25
FI56829B (fi) 1979-12-31
NO135362C (fi) 1977-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI56829C (fi) Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser
FI56828C (fi) Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
CA1079167A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
EP0046742B1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
SU1277904A3 (ru) Способ получени трипептидов
US4028318A (en) Chromogenic enzyme substrates
US4440678A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4190574A (en) Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators
NO147212B (no) Kormogent h.h.v. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
JPH0346119B2 (fi)
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4216142A (en) Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
CA1068261A (en) Chromogenic thrombin substrates
GB2126720A (en) A method for determination of enzyme activity
EP0074761A1 (en) Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4162941A (en) Method for determining a proteolytic enzyme
US4434096A (en) Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes
Zisapel et al. Peptide inhibitors and activators of carboxypeptidase B
US4771123A (en) Peptide thioneamides as selective substrates for cysteine proteases
HU197757B (en) Process for producing chromogen compounds
JPH0755942B2 (ja) 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法
CA1240987A (en) Urinary kallikrein assay: specific substrates and assay method