JPS5856695A - 新規なトロンビン測定用基質 - Google Patents

新規なトロンビン測定用基質

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JPS5856695A
JPS5856695A JP56153472A JP15347281A JPS5856695A JP S5856695 A JPS5856695 A JP S5856695A JP 56153472 A JP56153472 A JP 56153472A JP 15347281 A JP15347281 A JP 15347281A JP S5856695 A JPS5856695 A JP S5856695A
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JP
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thrombin
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pro
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Takeshi Nagasawa
長澤　健
Katsumasa Kuroiwa
黒岩　勝昌
Toshiyuki Takabayashi
高林　利行
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Nitto Boseki Co Ltd
Original Assignee
Nitto Boseki Co Ltd
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    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
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    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トロンｒｙ及びトロンビン様酵嵩に対する新
規発色性且つ螢光性基質に関すゐ。本発明の基質は従来
報告されている基質に比して、きわめて選択性よく、ト
ロンビンの定量を行う事が出来、トロンビｙが形成、阻
害又は・消費される反応の研究、又はそれ等Ｋｌｌ与す
る因子Ｏ測定、例えばプロト四ンＣン、抗トロンーン雇
、及びヘパリンの測定に４１に適している。
凝固・線溶反応に於ける合成基質の導入は、１９５４年
８．８ｈ＠ｒｒｙ等（Ｊ−ｎ、ｏ、＊２ｏｓ　　９５〜
１０５（１９５４））４０合成したテムＭ・（テｏｓ−
ムｒｇ−ＯＭｅ　）　Ｉｌｌのアルヤニンエステルが、
基質としてトロンビンのエステラーゼ活性の＃ＩｉＩ定
に使用されたのに始まるが、エステル氷解活性が凝固活
性と一致せず、基質の特異性中感度が低−等の問題があ
った。しかし、最近のベゾチｒ化学の進歩から、フィブ
リノダンのトロンビンによるＳ＊ＳＯアミノａ＊ｍｔｃ
＊似したベゾチド基質１１ｔ−Ｐｈｅ４ｍｌ−ムｒｇ−
Ｐ３１ム（ａ−２１６０）がＢｌ呂ａｂａｃｋ　（Ｔｈ
ｒｏｍｂ、　Ｒ＠ｓ＠ａｒｃｈ　１　２６７〜２７８（
１９７２））うによ）合成され、酵素反応を受けて遊離
し良パラニトロアニリン（ＰＩム）の黄色Ｑ発色によゐ
薄紫化学的分光分析め容易な事、試薬調整の容易さなど
からしだいに、研究検査に用いられるに至った。更にト
ーンビン用として引ｍＩ′？ｏｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ム
ｒｇ−ＰＮム（商品名０ＨＲ−テ亘−Ｐｓｎｔａｐｈａ
ｒｍ社）（特開昭５２−３４９４）、或は１ｌ−Ｄ−Ｐ
ｈ＠−１１ｉｐ−ムｒｇ−ＰＩム（ａ−２２３８、Ｋａ
ｂｉ社）〔特開１８５２−２４５９０）が開発され、続
いて、同様に遊離すると螢光を発するアずツメチルクマ
リン（ムＭｅ）を結合させ九螢光性ペゾチド基質も春永
等（１９７７）　（Ｊ、Ｂｓｏｃｈ＠ｍ、、　８２．１
４９５〜１４９８（１９７７））によシ開発されて−る
。
一方、酵素測定用合成基質は、酵１／ＡＫ対する鳥感度
、及び４Ｉｌｋ性、水又は生物学的試験液に対する良好
６１ｍ解性及び、分解物の易検出性の４点をこのうちで
も測定しようとする酵素に対する高い特異性は、特に重
要である。
一般に血漿中のプロト窒ンビン或は、アンチトロンビ／
■等を、発色性基質を利用して測定しようとする場合、
血漿中に存在すると予測されるトロンビン以外の凝固・
線溶関連−嵩である、プラスミン、］ｌ’Ｘａ、ウロキ
ナーゼ等と交差反応を起すと、正確な測定が期しがたい
。
又、例えばプロトロンビン（ｙ−ｎ）を測定する場合、
通常最も適した方法として、トロンビンをフオスホリビ
ド、Ｃａ＋、及びファクターｖ１の存在下、ＦＸａ或は
トｐン〆デラスチンにより、トロンビンに変換し、トロ
ンビン用基質に作用させて、その活性を測定するが、こ
の場合、反応系に存在しているＰＸａと基質が反応しな
い事が必要である。
従来開発されて来た最良のトロンビン用基質としては、
上記の０ＵＲ−ＴＨ及びＥｌ−２２３８があげられるが
、基質特異性の点に於いて必ずしも満足出来る亀のでは
ない。
即ち、例えｉＪ　０ＵＲ−テ■は、凝固・線溶系関連酵
素の５ｔ、）ａンビン以外にプラスミン、ＩＦａｃｔｏ
ｒ　＊＊。
ウロキナーゼ（ＵＫ）岬と可成シ反応するし、又比較的
選択性の良好と言われているＢ−２２５８に於いても、
プラスミン或いは［とか＆Ｊ）反応する事が解っている
。
更に、上記の両基質の如く、生成するｐ−＝）ロアニリ
ｙの黄色を比色する方法は、血漿成分の影響を免かれる
事は出来ない。
本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な）ａｙ＆
？ｙ用基質の開発研究を行った結果、上記の欠点を着し
く改良し前述の４条件を満足させる、すぐれた性質を有
する基質を見出した。
即ち、従来開発されて−る、基質に用いられている発色
基ｐ−＝）ロアニリド（略号ｐＨム）の代ＤｔＣ１５−
カル？中シー４−ヒドロキシアニＵＦ（略号ａＨＡ）　
を用いる事により、目的とする、トーンビン以外の＊＊
、例えｄ１シラスｉン、ＦＸａ等の酵素に対する反応性
を抑制し、従来基質と比して、著しく、選択相の改良さ
れたトロンビン用基質の開発に成功した。
本発明による新規な発色性且つ螢光性基質は、次の一般
式 で表わされ、％に発色基として、３−カルボキシ−４−
ヒＩＦ　、キシーアニリ「を用いる事を４１１１とする
。本基質は発色基にヒｒ冒キシル基、カルざキシル基と
言うきわめて親水性の基を持つ九めに卓越した水に対す
る溶解特性を持っている。代表的な用途としては本発明
のＣＩ）基質を、トロンビン測定用基質として用い生成
する°３−カルざキシ−４−ヒドロキシ−アニリンを酸
化縮合して、着色化合物に導き比色定量するか、又は励
起５２８ｎｍ。
螢光５４０ｎ墓にて螢光分析法によシ定量する事により
トロンビンの活性を４ＩＪ！Ｉ的に測定する場合である
。
本基質の４Ｉ徴は、前述した如くそのトロンビンに対す
る優れた基質特異性にある。例えば新規基質トドＰｈ５
−Ｐｒｏ−ムｒｇ−ＯＨムをａ　−２２５８，０ＵＲ−
Ｔｉｔ及び参考の為に合成した上記新規基質と同じアミ
ノ酸配列でＰＭムを発色基としｆｔ−１［−Ｄ−Ｐｈｅ
−Ｐｒｏ−ムｒｇ−ＰＭムと各凝固、線溶に関与するｗ
Ｉ累である、トロンビン（’ｒＨ）　、シラス電ン（Ｐ
Ｌ）、カリクレイン（ＫＬ）、ファクターｉａ　、ウロ
キナーゼ（ＵＫ）等に於ける相対反応性をＨ−Ｄ−ＰＭ
−Ｐｒｏ−ムｒｇ−ＰＨムを１００として示すと表１の
如くなシ、プラス建ン、ＦＸａ。
ＵＫ等に対する反応性がａｍム系の新規基質の場合には
、著しく低く、例えばプラス建ンは１慢ＦＸａ　９　参
、ＵＫ　２１６　Ｌか反応せず又、０ＩＩＲ−’Ｉ’Ｈ
及び８−２２３８のゾラスミン各２２５’ｌｋ、６４チ
ｙｘａ１１６５１！、４２１　Ｕｘ３００１１，７４１
１と比較して著しく選択性が改良されている事が解る。
これ等の事は本発明化合物がトロンビン用基質としてき
わめて優れている事を示している。
本発明の化合物の用途は既に述べ九通りトロンビン活性
測定用の基質であるが、その場合尚該基質をｐＨ８，０
〜８．７間の緩機液中でトロンビンに作用させ生成する
、６−カルざキシ−４−ヒＰロキシテニリンを適当なカ
ゾラーと酸化縮合させて着色物質に導きこれを比色定量
することによるが、又励起３２８　ｎｍ螢光５４０　ｎ
ｍにて螢光分析法により定量することによ）トロｙ＆＃
ｙ活性を測定する。
カゾラーとしては酸性側での発色の場合は、アニリン系
化合物例えばｌｉ、１１−ジエチルアニリン、又アルカ
リ性側では、フェノール、ナフトール系化合物例えは、
２，５−キシレノール、２，６−キシレノール、２．３
−キシレノール、チモール、０−クレψ−ル、〇−エチ
ルフェノール等が用いられる。
又、酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、過ａ識塩等
種々のものが用いられるが、メタ過冒り素識が好適であ
る。
３−＊ルｆｌ＊シー４−ヒト四キシアニリンと上記カプ
ラーとの酸化縮合によ〕生成する色素はカゾラーにより
極大吸収波長が５６０〜７７０　ｎｍに巾広く分布する
が、呈色の楓度による変動は極めて少く安定で、トーン
ビン活性測定に適している。更に発色感度を比べてみて
も、ｐ−ニトロアニリンの場合一般測定使用波長４０５
　ｎｕにてａ　−１０，６００であるのに対し、ｏ−エ
チｋ　７　Ｚノールと３−カル？キシー４−ヒドロキシ
アニリンによる発色に於ては、λ−６４５ｎｍで２９．
ＯＤＤ又、２，６−キシレノールの場合はλ闘６１５ｎ
ｍで２１．＋５００で極めて吸光度が大きく、この点に
於いても測定上極めて有利である。
本発明の基質は、親水性の官能基を有するので水に対す
る溶解性は非常に良好であシ、界面活性剤、有機溶媒等
の溶解補助剤を特に必要としない九め、試薬調整あるい
は測定操作、にお−で非常に管層し易く、且つ反応に必
要十分な基質濃度を使用出来ると重う長所を有している
。、 又、本発明の％像の一つとして、生体試料中の夾雑物に
よる測定上の影響をほとんど受けないことにあるが、こ
れは、ｐ−エトロアニリｒ系化合物に於ては、５６０ｎ
１１以下の波長で測定するのに対し、本発明では５６０
　ａｍ以上の波長で測定する為、試料中の夾雑物の影響
を受けず、又過剰の酸化剤によ〕、試料中の還元性物質
（尿酸、アスコルビン酸）４分解されるので、基質本来
の高特異性と併せて、正確な測定結果が得られる。
以上の通シ本発明の化合−は、トーンビン活性用基質と
して従来のものに比べて、非常に優れていることが明ら
かである。
ＣＩ）で表わされる本発明の化合物は、ペゾチド化学に
おいてよく知られる方法により合成される。
ａ−アミノ保−基としては、カルがペン−キシ又は、ｔ
−ブチルオキシカルボニル又はそれに関連する基、例え
はｐ−メトキシ−ｐ−ニトロ、又は、ｐ−メトキシフェ
ニルアｔ−ルカルざペン−キシ等を用いるのが有利であ
る。
アルイニル基の１−グアニジル基Ｏ保臘には、プロトン
化、カルボベ／ｆ中シ基（Ｊ　、　Ｊ　−、ｄｉ保１１
）ｆｆｉ用いるので有利である。２個のアミノ酸カップ
リング又はジペＩチドとアミノ酸のカッシリングは、ａ
−カルざキシル基の活性化によシ行われる。例えば、活
性化された形がＮ−とｔ？　、キシサクシニックインド
、ｐ−ニトロフェノール、トリクロ四フェノール、４．
６−シメチルピリ（ジル−２−チオ等である事が出来る
。前述のエステル誘導体への活性化はカルがジイミド、
例えば、菫、Ｎ−ジシクロへキシルカルざシイ＜　Ｆ　
（ＤＯＯ）の存在下で行うのが有利である。
基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合させ、遂
次的にカッシリングしていく方法にスよることが出来る
が、或いはＮ−末端ジベゾチＰフラグメント自体を合成
し、それに次いで、発色基を有するアルイニル基に結合
する拳も可能でらるＯ本発明を以下実施例によシ詳細に
説明する力式本発明は、これら実施例に限定され、るも
ので各家ない。
■　略号 ＴＪｅｕＩｗ＋ロイシン　　　　　ＭｅＯ１１厘メタノ
ールＬｙｅ翼リジン　　　　　　Ｔロ霧テトラ／ＳイＰ
ロフラン ｐｈ＠　ｔｍフェニルアラニン　ＩＦ！Ｍ　、＝　Ｍ−
エチルモルホリン Ｐｒｏｗ、ｆロリン　　　　　　］Ｃ８ム陽エタンスル
ホ１Ｔｈｒ社スレオニン　　　　ＴＥＡ−）リエチルア
電ンＴｙｒ　ｚチロシン　　　　　　Ｔ１ムードリフル
オロ酢駿ｖａｌ　ｅｘ　ｚｆ　ＩＪン　　　　　　　　
ＤＯＯ−ａジシク四へキシルカル？ジイミド ２−ぺ／ジルオキシ　　　　　−０１１１−５−カル〆
キシーカルがニル　　　　　　　　　　４−ヒト四キシ
アニリＹＢｏｏ　＝　ｔ−ブチルオキシ　　−ｆｌＤＰ
−４．６−’／メチルピリカルボニル　　　　　　　　
　（シン−２−チオＺ（ＯＭｅ）−ｐ−メトキシベンシ
ルＢｚＬｓｇベンジルオキシカルボニル ’ｊｇｇ　Ｍｐ　−）リルスルホエルＴ′ＬＯＩＩＩＩ
Ｉ薄層りｇマドグラフィー ＡｃＯＨｗ＝　酢１ｌＧＰＯｍ　ｌ’　ｋｆ　過／　Ｅ
”！トグラフイー ムｃｏｌｔ　ａｍ酢酸エチル　（注；ア（〕酸は、特に
ことわらなけれにＬ−型 を示す。） ■　薄層クロマトグラフィー ＴＬＯ分析はシリカゲル’！！黛ｓ、（メルク社製）ｆ
レートを使用、展開溶媒は、 Ｒｆｌ　；　Ｏ輌：　ＭｅＯ３ｌ　：ムｏＯＨ：　ＨＩ
Ｏ−８０：　２０　：２．５　：　５ Ｒｆｌ　；　ｎ−ＢｕＯＨ：ムｃＯＨ：　Ｈ２Ｏ−４：
　１　：　ＩＲｆＨ；　ｎ−ＢｕＯＨ：ムｃＯＨ：　Ｈ
２Ｏ−４：　１　：　２Ｒｆ４　；　ｎ−ＢｕＯＨ：ム
ｃＯＨ：　ＩＩ、Ｏ＝４　：　１　：　５■　ダルｒ過
には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ社（スエーーン）のヒドロキシ１ロｔル化交叉結合
デキストランデルＥｉｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ−Ｈ−２０（
商品名）を使用した。
奥施例−１ Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ムｒｇ−ＯＨムの合成１、　
　Ｚ（ＯＭｅ）−Ａｒｇ（１ｇ）−０１１６０，６ｇｒ
　（０，１ｍｏｌｅ　）のＺ（ＯＭｅ）−ムｒｇ（Ｋｇ
）−ＯＨと１５．４　ｇｒ　（０，１ｍｏｌｅ　）のこ
れに０〜５℃にてＤＯＯ２０，６ｇｒ　（０，１ｍｏｌ
ｅ　）テ■シ２５０１１１７溶液を滴下反応する。１８
時間室温にて反応後（２０〜２５℃）、析出したジシク
ロヘキシル尿素（ＤＯＨＵ　）をｒ別、７１１Ｆを減圧
留去し、合成されたオイル状粗製活性エステルＰＭＺ　
−ムｒｇ（Ｚｇ）−１Ｅｐ　５４　ｇｒ　（７４％　）
を得る。これをそのｔｔ次の反応に使用する。
上記にて合成した活性エステルＰＭＺ−ムｒ　ｇ（Ｚｇ
）−８ＤＰ５４　ｇｒ　（０，４ｍｏｌｅ　）をＴＨＩ
Ｆ　１５０１Ｒ１に溶解し、これを５−７ミノサルチル
ｒｌｔ　１１．４　ｇｒ　（０，７４ｍｏｌｅ　）と’
ｒｍム２０．８１１／　（０，１４８１１０１＠　）を
ＤＭＦ１３Ｑｄに溶解した液に０〜５℃にて滴下反応を
行い、更に室温にて１８時間反応後、溶媒を留去し、残
分をムｃｏｌｔ　８００１ｄに溶解、５−冷！１（Ｊａ
ｑ４００ｄにて２回洗浄、析出した結晶をｆ取乾燥する
と　Ｚ（ＯＭｅ）−ムｒｇ（Ｚ禽）−ＯＢＡ　５６．８
　ｇｒ　（６７，６％）を得る。
Ｒｆｘ−０，５２ｍ、ｐ、　１８２〜１８５℃ＣＭ　）
Ｄ＋　１１．０　（０１，ＤＭＰ　）Ｉ［、Ｂｏｏ−Ｐ
ｒｏ−ムｒｇ（Ｚｇ）−０！ｉムｚ（ｏｎｅ）−ムｒｇ
（Ｋｍ）−０ＨＡ　　３７．１　ｇｒ　（０，０５！Ｅ
ＩＯ１＠）にアニソール１５ｍ１とテ１ム１２５０１１
１／を加え、室温にて２時間反応を行う。反応終了後Ｔ
ＥＡを減圧留去し、次いで乾燥エーテルにて処理すると
結晶化する。２６．！ｉｇｒ（７６％）のＴ′！！ム・
トムｒｇ（Ｚｇ）−０Ｈムを得る。
（α）Ｄ　＋　２２．４　（Ｃ１，Ｉ）ＭＰ　）’１７
．５　ｇｒ　（０，０２５５ｍｏｌ・）のテ１ム、トム
ｒｇ（Ｚｌ）−０Ｈムを０．７５　Ｍ　　ＩＪＦｉＭ／
’ＤＭＦ　１０２Ｍ！に溶解し、０〜５℃にてＢｏｏ−
Ｐｒｏ−８ＤＰ　８．６　ｇｒ（０，０２５５，１１１
０１・）のＤＭＦ　１５　ｍｌ溶液を滴下反応する。１
８時間室温にて反応後（，２０〜２５℃）ＤＭＦを減圧
留去し、残分をムｃｏｄ！ｊｔ　７５０Ｍに溶解、冷５
１！Ｈ（Ｊ２５０＠ｌにて４回、８ａｔ　）Ｉａ（Ｊ　
ａｑ２５０−にて２回洗浄する。Ｍｇ８０．上で乾燥後
溶媒を減圧留去すると７オーム状の粗製 Ｂｏｏ−Ｐｒｏ−ムｒｇ（ｊｓｌ）−０１ｉＡ　ｊ＜得
ら１れ、これを工Ｐｖ′ｘＰ１よシ再結晶して７．４　
ｇｒ　（５７，５９６）の■を得る。
Ｒｆｌ　−０，５３ｍ、ｐ、　１１０〜１３５℃〔α）
Ｄ−１８，０（Ｃ１，ＤＭＩＦ　）ｍ、　　Ｚ−Ｄ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−ムｒｇ（Ｚｌ）−０Ｈム１２Ｍ−ＨＣＪ
／ムｃＯＨ４１ｍＫて２時間室温処理しＢｏｏ基を脱離
し、反応液をエーテ１ル中に再沈する。
析出物をｒ取、乾燥すると肥・Ｈ−Ｐｒｏ−ムｒｇ（Ｚ
ｇ）−ａｎム１２．４　ｇｒ　（９８，４％　）を得る
。
Ｒｆ１禦０．６０　組ｐ、１８４〜１８７℃（’　）ｐ
−２５，８（０１，Ｍ＠ＯＨ）Ｈ（Ｊ、　Ｈ−Ｐｒｏ−
ムｒｇ（ｚ２）−０ＨＡ　　７．４３　ｇｒ　（１０，
５ｎｍｏｌｅ）と！１ム４．５　ｄ　（６，１５Ｉｎｍ
ｏｌｅ　）をＤＭＰ　６４　ｄに溶解し、これに−５〜
０℃に冷却下、Ｚ−Ｄ−Ｐｈｅ−８ＤＰ４．５　ｇｒ　
（１０，５ｍｍｏｌｅ　）を３３ａｌＤＭＦＫ＠解した
液を滴下反応を行う。２時間後室温にもどし、次いで常
電にて１５時間反応後、ＤＭνを留去、残った油状分を
Ｍ・ＯＨ６０ｄに溶解し、３９Ｇクエン酸水１１１［３
０００ｉｌに再沈し、析出した結晶をｒ取・乾燥すると
、結晶７．８　ｇｒを得る。　　　これを、セファデッ
クス′ＬＨ−２０、展開溶媒Ｍ・ＯＨにてダルｆ過し、
結晶３．８　ｇｒを得る。
Ｒｆｌ　諷０．５５　　ｍ、ｐ−２２４〜２２８℃Ｃｍ
　）Ｄ　−４０，２（ａｌ、　Ｍｏｏｎ　）元素分析　
０ｉｘＨａ＋５ｌｉｙＯｘｌ・１．５　ＨｌＯＯＨＮ 測定値　６２，４６　　５．７０　　１０．１７計算値
　６２，３１　　５，７４　　　９．９７ＩＶ、　　２
引：ｊ４−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ムｒｇ−ＯＨムＺ−Ｄ
−Ｐｈｓ−Ｐｒｏ−ムｒｇ（ｊｓｌ）−０Ｈム　２．９
　ｇｒ　（３，０３ｍｍｏｌｅ）をＭｅＯＨ１３０ｍｌ
／に溶解し、ムＣＯＨ５〜６滴を加えパラジウム黒１　
ｇｒを触媒として、接触還元を行う０反応終了後、Ｈ＠
ＯＨｔ＠縮、残分を２トＨＣＩ／ムｏＯＨ５ｍに溶解し
、１１Ｊ２００ｄ中に加え、再沈させ、析出し九結晶を
ＦＭＬＳＫＯＨ上乾燥を行うと２　Ｈ（Ｊ　・１ｌ−Ｄ
−Ｔｈｅ−アｒｏ−ムｒｇ−ＯＨム１．３０　ｇｒ　（
６８９６）を得る。
＋１１ｐｍ　２１３℃（分解）〔すＤ−１０９，２（Ｃ
Ｑ、５ＭｅＱｉｌ）元素分析　０１１’ｌ’ｉ’Ｂ６１
ｈ０６拳ムｃＯＨ・／２ＨＨ０・２ＨｃｔＯＨＮ 測定値　　　４８．６１　　６．０４　１４．０５計算
値　　　４８，８１　　６．２１　１５．７８実施ガ２ ２　Ｈ（Ｊ−１１−Ｄ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−
ムｒｇ−ＯＨムＶ、　　Ｂｏｏ−Ｐｒａ−ムｒＬ−ＯＨ
ム　　ＯＲＢ”Ｊ４０ツＨｇ　　　５　０　６．５　６
　３６．４　ｇｒ　（８，３ｍｍｏｘｅ）のＢｏｏ−Ｐ
ｒｏ−ムｒｇｃＺｓ）−０ＨムヲＭ・ｏＨ１２０Ｍ！Ｋ
ｉｌ解して、パラジウム黒の存在下、６時間水累還元を
する。反応後触＃ｔＦ別してＭ・ＯＨを減圧留去し、エ
ーテルにて結晶化させ、ｒ取、乾燥するとＢｏｏ−Ｐｒ
ｏ−ムｒｇ−ＯＨＡ　５．６　ｇｒ（８５，７％　）を
得る。
Ｒｆ２−０．４８　　ｍｐ、　１９９〜２０３℃〔α）
Ｄ−７６，０（ａｌ、　Ｍ・ＯＨ）２ＨＣ１−Ｈ−Ｐｒ
ｏ−ムｒｇ−ＯＨム　０ＩＩＩＨ２６０Ｉ！１Ｍ６．２
ＨＣＪ４７９．３６７３、Ｏｇｒ　（５，９ｍｍｏｌｅ
　）のＢｏｏ−Ｐｒｏ−ムｒｇ−０１１ムを２９．５１
１１　（５９ｍｍｏｌｅ　）の２　Ｍ　−Ｈ（ｊ／ムｃ
ＯＨにて２時間室温処理して、エーテル中に落す。
析出物をｒ取・乾燥すると２ＨＣＪ・ｎ−ｐｒｏ−ムｒ
ｇ−ＯＨム２．８　ｇｒ　（１００チ）を得る。
Ｒｆ４０．１１　　ｍｐ、〜２０５℃（分解）（ｒ）ｐ
−４２，４（０１，）ｌｅＯＨ）−Ｖｌ、　　Ｂｏｏ−
Ｄ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−ムｒｇ−ＣＭムｏ３
．ａ、５ｌｉ１ｏ、　　６９６．７８８０．９５９　ｇ
ｒ　（２，０１０１１ｏｌｅ　）の２ＨＣＪ・Ｈ−Ｐｒ
ｏ−ムｒｇ−ＯＨムを０．７５　Ｎ−ＭＩＣ１１／ＤＭ
ＩＦ　８　ｉｌに溶解して、０〜５℃にて０．８６３　
ｇｒ　（２，Ｏｍｍｏｌｅ）のＢｏｏ−Ｄ−Ｔｈｒ（Ｏ
ｌｉｚｌ）−８ＤＭＰＹを加えて、１８時間室温にて反
応後、反応液を冷１０−クエン酸／　８ａｔｉ　Ｈａ（
Ｊａｑ　ｍ１／、溶液２０００１１／に落す。析出物を
ｒ取・乾燥するとＢｏｏ−Ｄ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−Ｐ
ｒｏ−ムｒｇ−ＯＨム１．０７　ｇｒ（７２，７１１）
を得る。
Ｒｔ寓−０，６１ｍｐ、　１８０〜１９５℃■、　　２
ＨＣｊ−Ｈ−Ｄ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、−Ｐｒｏ−ムｒ
ｑ−ＯＨムＯｓＩ、ＩＩ、１）１マ０−Ｉ（Ｊ、　　６
７０．５９９０．９　ｇｒ　（１，２ｍｍｏｌｅ　）の
ＢＯＯ−Ｄ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−ムｒｇ−Ｏ
Ｈムを１０Ｍｌ（２０ｍｍｏｌｅ）の２　Ｍ　Ｈ（Ｊ／
Ａｃ０１１にて２時間室温処理して、反応液をエーテル
中に落す。析出物をｆ取・乾燥して粗製の２ＨＣ１−Ｈ
−Ｄ−テｈｒ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−ムｒｇ−０！［Ａ
　ｔＥ得られ、これをセファデックスＬＨ−２０（４Ｘ
１１２ａａ）カラムで展開溶媒ＭｅＯＨＶｃてデルｆ過
を行い、０．３２　ｇｒ　（４０，２−）を得る。
Ｒｆ、　！肌３３　　ｍｐ、１８３〜１９０℃実施例３ 同様な方法にて、下記基質の合成を行った。
―　　へ　　ロ　　Ｑ）Ｃ０ ｕ　　ｕ　　　Ｉｌ　　ｌ　　ｌ Ｆ　　　へ　　　唖　　　寸　　　唖 新規に合成した基質の特異性を各種酵素と反応させる事
により試験した。
試験方法； １）基質液、濃度；　５．５　ｍｍｏｌｅ／ｊ　Ｈ−２
）緩衝液；トリス−塩酸緩衝［５０ｍｍｏｌ／ＩＮａＣ
ｊ　１５０　ｍｍａｏｌｅ／７　（０，８７５％　）を
使用し、反応−は、酵素によｐ次の通シとした。
酵素　　　　　　−（２５℃） トロンビン（ＴＨ）　　　　８．４ プラス建ｙ　（：ｐｂ）　　　　７．４カリクレイン（
ＫＬ）　　　７．９ Ｆ−Ｘａ　（ＦＸａ）　　　　　　８．４ウロキナーゼ
（ＵＫ）　　　８．２ ３）使用酵素 ＾　　へ　　へ　　へ　　リ １１に？ｒ？ｉ！ ＼　　１）　覧　　−−圧 城　　る　　ａ　　ａ　　城 ｍ　　　へ　　％　　％　　へ　　ム 積　　へ　　翫　　覧　　へ　　Ｍ ・・　　・・　　ｈ　　・・　　乍 λ　　ｈ　　マ　　　　　Ｉ Ｑｌｈ　　　費　　　−ロ Ｊ−＼　　負　　−へ ４）反応停止液（ＰＭム） １０チー酢酸 ５）発色試液（Ｃ）Ｉム） ０−エチルフェノール、７．Ｏｍ　ｍｏｌ　＋ｌｉａ工
０４１．５　ｍ　ｍｏｌｅ／　０．２］１−ＩＣｏｉｌ
測定方法： 緩衝液０．５ｄと酵素試薬０．０５１１／を、シリコン
処理硬質ガラス製試験管又は、シラスチック製試験管に
採攻し、３７℃恒温槽中にて５分関予加湿する。次いで
基質液０．１　ＩＩ／を加えて酵素反応を３７℃で１０
分間実施する。正確に、１０分後反応停止液又は停止発
色試液２．５１を加えて酵素反応を停止した後、２５℃
で１０分放装ｉ１４０５ｎｍ又は６４５％ｍＯ＠光度を
測定、 ＃輻２９．８　ｘ　１０”　、　　λ６４５手続補正書
（自制 昭和管６年／）Ｌ月λγ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１５５４７２　　号２、発明の名称 新規なトーンビン測定用基質 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所 ’　　”　　　　（３９７）日東紡績株式会社（名　称
） ４、代理人 氏　　名　　　　　　　（６６６９）　　浅　　　村　
　　　　　　　雫５、補正命令の日付 昭和　　４．　　月　　日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 ８、補正の内容　　別紙のとおり　　　１１１　４Ｌｆ
’Ｆ祷求の範囲を別紙のとＳりに訂正する。
（２）　　明細書５ｇ１ｏ行の「ｃ！ａｍ−Ｔｋｉ−Ｊ
をｉ’ｃＭＲ−ＴＨＪＩに訂正する。
（３）同＝ｉ６頁ｙ行のｊ　ｅ−１Ｊ　Ｙ　「Ｏ”ｒＣ
Ｘ”ＩＪに訂正する。
（４）同Ｊ’７負２０行の「ファクターｘａＪＹｌｉ’
７アクターＸａ　（ＩＦ　Ｘａ　）　Ｊｌに訂正する・
（５）　　同＃９釘「表１」Ｙ次表とさし変える。
ｉ６）　　同１１２両１行の「とにあるが」をｒとがあ
るがＪＫ訂正する。
（７）同１２１２行の「用いるので」ヲ１用いるのが」
ＫＩＴＴ正する、 （８）同４Ｆ１６員１４行のｒＡＣＯＩｉｉｔＪ？１ｉ
’Ａｃ０１１４．　、ｊに訂正する。
（９）　　Ｉ”ｌＪＦ　１７　Ｋ　５行ｆ）「ＴＥＡ　
Ｊ’；ｆ　Ｖ　ＴＦＡ　ＵＫＵ正する。
ａ〔同１１７１１３行［ＡｅＯＦｔｔ　Ｊ　Ｙ　ｆｉ’
　ａｃｏｌｔＪＫ訂正する。
αυ　同書１９１１１行「ｈａ□ｎ　Ｊ　ｙ　ｌ”　ｙ
ｅｏｌｉ　」Ｋ　訂正する。
１３　　同４２１両６行ｒ　ＳＤＭＰｙ　Ｊ　￥　ｇ　
８ＤＰ　、ｇ　Ｋ訂正する０ （１３同１２１両１２行「−Ａｒｑ−ＩＡ　Ｊ　Ｙ　［
ｉ’−Ａｒｇ−（３ＨＪに訂正する。
（ｌＳ　　同１１Ｆ２７頁表中の 「ＵＫ　　　　　　ｊ　　　　　　　　ＵＫ８、　ＮＦ
Ｋ　　・・・　０．０４０　　　　　８．　　Ｎ’！’
−１１ｆ・・０．００４９、　　・・・・・・・　０．
０４０　　　を　　９．・・・・・・０．００４１０、
　　・・・・・・・　０．３００Ｊ　　　　１０．　　
・・・・・・０．００３Ｊに訂正する。
Ｚ、崎ｆｆ晴求の範囲 又は、その壇で表わされる、トロンビン及びトロンピン
様酵素に対して、発色性且つ螢光性を有する新規なトロ
ンビン測定用基質。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 〔式中Ｒは、−（ＯＲ，）ｎ０！（：：：　　（１１Ｗ
    　Ｏ〜２　）％又は、その塩で表わされる、トロンビン
    及びトロンビン様−素に対して、発色性且つ螢光性を有
    する新規なト四ノビン測定用基質・
JP56153472A 1981-09-28 1981-09-28 新規なトロンビン測定用基質 Granted JPS5856695A (ja)

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