JPS60241900A - 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は第Ｘａ因子および第Ｘａ因子様酵素に対する新
規発色性、螢光性基質に関する。本発明の基質は、従来
報告されている基質に比して、極めて選択性がよく第Ｘ
ａ因子の定量を行うことができ、第Ｘａ因子が形成、阻
害または消費される反応の研究、またはそれ等に関与す
る因子の測定、例えば、第Ｘ因子、抗Ｘａ因子、第■因
子、第■因子、第Ｘ因子およびヘパリンの測定に適して
いる。

凝固、線溶反応に於ける合成基質の導入は、１９５４年
８．　Ｓｈｅｒｍｙ等［Ｊ、　Ｂ、　Ｏ，、２０８８５
１０５（１９５４））の合成したＴＡＭｅ（Ｔａ２−Ａ
ｒｇ−ＯＭｅ　）等のアルヤニンエステルが、基質とし
てトロンビンのエステラーゼ活性の測定に使用されたの
に始まるが、エステル氷解活性が凝固活性と一致せず、
基質の特異性や感度が低い等の問題があった。しかし、
最近のベゾチド化学の進歩からフイグリノーｒンのトロ
ンビンによる解裂部のアミノ酸構造に類似したペゾテド
基質、Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＰＮＡ　（ｓ　
−２１６０）がＢｌｏｍｂａｃｈ　［Ｔｈｒｏｍｂ、　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２６７〜２７８（１９７２））ら
により合成され、酵素反応を受けて遊離したバラニトロ
アニリン（ＰＮＡ）の黄色の発色による酵素化学的分光
分析の容易な事、試薬調整の容易さなどからしだいに研
究検査に用いられるに至った。

第Ｘａ因子は、血液凝固カスケード中で酵素前駆体第Ｘ
因子の活性化によシ形成され、リン脂質およびカルシウ
ムイオンと一緒になって、第■因子（プロトロンビン）
をペプチド鎖の２点で蛋白質分解して、第１１ａ因子（
トロンビン）に変じる蛋白質分解酵素である。特定の病
気、例えば肝臓疾患、ビタミン欠乏症等の際に、第Ｘ因
子の形成が減少し、また、この第Ｘ因子形成の合成に関
する遺伝的障害により、もちろん第Ｘ因子の形成が相応
して減少する。従って、簡単かつ正確な方法で、血漿中
の第Ｘａ因子の測定ができることは大きな意義がある。

一方、酵素活性測定用合成基質は、酵素に対する高感度
および特異性、水または生物学的試験液に対する良好な
溶解性および分解物の易検出性の４点を満足させること
が重要である。

このうちでも、測定しようとする酵素に対する高い特異
性は特に重要である。

一般に、血漿中の第Ｘ因子、あるいは抗）（ａ因子等を
、発色性基質を利用して測定しようとする場合、血漿中
に存在すると予測される第Ｘａ因子以外の凝固線溶関連
酵素である、ゾラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ等
と交差反応を起すと、正確な測定が期しがたい。

従来、開発されて来た最良の第Ｘａ因子用基質としては
、西ドイツ国特許出願公開第２５５２５７０号にテトラ
ベゾテド誘導体が記載されている。

Ｂｚ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡ　（Ｓ
　−２２２２）が、第Ｘａ因子により水解されて、　ｐ
−二）ロアニリンを形成するテトラベゾテド誘導体の１
例として記載されているが、基質特異性の点において、
必ずしも満足できるものではない。すなわち、凝固線溶
関連酵素のうち、第Ｘａ因子以外に、ゾラスミン、ウロ
キナーゼ、トロンビンとも反応することが知られている
。

さらに、上記テトラペゾチド誘導体は、水溶媒体中に難
溶であるため、基質飽和で実施されるべき第Ｘａ因子の
分析が可能ではない。例えば、病的血漿中の測定すべき
第Ｘａ因子の濃度が低い場合には、前記テトラベノチド
誘導体は、相応する正確な測定値を得る程度に充分敏感
ではなく、また、測定すべき第Ｘａ因子の量が、さらに
血漿を加えることにより増加したら、血漿蛋白質の影響
下にテトラペゾチド基質の沈殿が生じ、その結果として
、酵素活性分析を実施することが不可能となる。

また、上記基質のごとく、生成するｐ−二）ロアニＩＪ
ンの黄色を比色する方法は、血漿成分の影響を免かれる
ことはできない。

本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な第Ｘａ因
子活性用基質の開発研究を行った結果、上記の欠点を著
しく改善し、前述の４条件を満足する優れた性質を有す
る基質を見出した。

本発明による新規な発色性５螢光性基質は、一般式 （式中 ｎ　＝　３〜４ １ Ｒ，＝−Ｈ又は　−ＯＲ４ ０　０ Ｒ３”　−００Ｒ５＋　−０Ｒ４ であり −０（ＯＨ３）３　（Ｒ６＝Ｈ、０Ｈ３０）でおる） で表わされ５％に発色基として、３−カルボキシ−４−
ヒドロキシ−アニリド（ＯＨＡ）を用いることを特徴と
する。本基質は、発色基にヒドロキシル基、カルボキシ
ル基という極めて親水性の基を持つために、卓越した水
に対する溶解特性を持っている。代表的な用途としては
、ＣＩ３基質を、第Ｘａ因子測定用基質として用い、生
成する６−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリンをペ
ンタシアノアミンフェロエート法や適当なカゾラーと酸
化縮合させた着色物質に導き、これを比色定量する場合
があけられる。また、励起３２８　ｎｍ、螢光５４０　
ｎｍにて螢光分析法により定量することによｐ第Ｘａ因
子活性を特異的に測定することもできる。

本基質の特徴は、前述した如く、その第Ｘａ因子に対す
る優れた基質特異性と水に対する溶解性にある。基質特
異性については、新規基質ＰＳ　−２０００Ｚ−Ｄ−Ｌ
ｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡをＥｌ−２２
２２および診考の為に合成した上記新規基質と同じアミ
ノ酸配列でＦＮＡを発色基としたｐｓ　−２００ＯＮ。

Ｚ　−Ｄ　−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮ
Ａと各凝固、線溶に関与する酵素である第Ｘａ因子（Ｆ
Ｘａ）、）ロンビ／（ＴＨ）、ゾラスミン（ＰＬ）、カ
リクレイン（［、）。

ウロキナーゼ（ＵＫ）等に於ける相対反応性をＰ８−’
Ｉ　Ｑ　［］　ＯＮ　、　Ｚ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆ’ｏｒ）
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡを１００として示すと第１表
のごとくなり、トロンビン、ゾラスミン、ウロキナーゼ
等に対する反応性が、ＯＨＡ系の新規基質の場合には、
著しく低く１例えば、トロンビン４チ、プラスミン１チ
。

ウロキナーゼ２チしか反応せず、またＳ　−２２２２の
トロンビン３１チ、プラスミン１６嗟、ウロキナーゼ４
０％と比較して著しく選択性が改良されでいることがわ
かる。

さらに、水に対する溶解％性については、Ｓ−２２２２
が６ｍｍｏｌ／ｌ程度であるのに対して、ＯＨＡ系の新
規基質は２０　ｍｍｏｌ　／　１以上の溶解性を有し、
界面活性剤、有機溶媒等の溶解補助剤を特に必要としな
いため、試薬調整あるいは測定操作において、非常に管
理し易く、且つ反応に必要十分な基質濃度を使用できる
という長所を有している。

これ等のことは、本発明か第Ｘａ因子用基質として極め
て優れていることを示している。

本発明の化合物の用途は、すでに述べた通り第）（ａ因
子活性測定用の基質であるが、その場合、当該基質をＰ
Ｈ８，０〜８．７間の緩衝液中で第Ｘａ因子に作用させ
、生成する６−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを
適当な着色物に導き、これを比色定量することによシ第
Ｘａ因子活性を測定するが、このほかに励起３２８　ｎ
ｍ、螢光５４０　ｎｍにて螢光分析法により、定量する
こともできる。

着色物に導く方法としては、ペンタアミンフェロエート
法やカプラーと酸化縮合させる法がある。

カプラーとしては、酸性側での発色の場合は、アニリン
系化合物、例えば、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、またア
ルカリ側では、フェノール、ナフトール、チモール、０
−クレゾール、〇−エチルフェノール等が用いられる。

また、酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、過硫酸塩
等、種々のものが用いられるが、メタ過ヨウ素酸が好適
である。

６−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンヲ適当な着色
物に導くことにより、極大波長は５６０〜７７０　ｎｍ
間に分布し、呈色の温度による変動は極めて少く安定で
、第Ｘａ因子活性測定に適している。さらに、発色感度
を比べてみても、ｐ″′′ニトロアニリン合、一般測定
波長４０５　ｎｍにて＄　＝　１０，６００であるのに
対し、ペンタアミンフェロエート法ではλ＝　７００　
ｎｍ　テｇ＝２１ｂｏｏ、酸化縮合による発色において
は、０−エチルフェノールの場合λ＝　６４５　ｎｍで
ε＝２９，０００゜２．６−キシレノールの場合λ＝６
１５ｎｍでｇ−２１，６００と極めて吸光度が大きく、
この点においても測定上極めて有利である。

本発明の特徴の一つとして、生体試料中の夾雑物による
測定上の影響をほとんど受けないことがあげられる。ｐ
−ニトロアニリド系化合物においては、５６０　ｎｍ以
下の波長で測定するのに対して、本発明では５６０　ｎ
ｍ以上の波長で測定するため、試料中の夾雑物の影響を
受けず、基質本来の高特異性とあわせて、正確な測定結
果が得られる。

以上の通り本発明の化合物は、第Ｘａ因子活性測定用基
質として５従来のものに比べて、非常に優れていること
が明らかである。

ＣＩ、］で表わされる本発明の化合物は、ペゾテド化学
においてよく知られる方法によ）合成することができる
。

α−アミン保護基としては、カルがベンゾキシまたはｔ
−グチルオキシカルボニルまたは、それに関連する基、
例えば、ｐ−メトキシカルボベンゾキシ％ｐ−ニトロカ
ルボベンゾキシ、またはｐ−メトキシフェニルアゾール
カルｆベンゾキシ等を用いるのが有利であるつ アルギニンのδ−グアニゾル基の保護は、フロトン化で
行うのが有利である。２個のアミノ酸カップリングまた
はジペプチドとアミノ酸のカップリングは、α−カルボ
キシル基の活性化により行われる。例えば、Ｎ−ヒドロ
キシサクシニックイミド、ｐ−二トロフェノール、トリ
クロロフェノール、４，６−ジメテルピリミソルー２−
チオール等を用いることができる。前述のエステル誘導
体への活性化は、カルボジイミド、例えば、１１゜Ｎ−
シシクロヘキシルカルボジイミｌ、’（ＤＯＯ）の存在
下で行うのが有利である。

基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合させ、逐
次的にカンプリングしていく方法による〇あるいは、Ｎ
−末端ジペプチドフラグメント自体を合成し１次いで、
これを発色基を有するアルイニル基に結合してもよい。

本発明を以下実施例により詳細に貌明するが、本発明は
、これら実施例に限定されるものではない。

■略号 Ｌｙｓ　−リ　う２　ン Ｇｌｙ　−グリシン Ａｒｇ　＝アルギニン Ｓａｒ　＝ずルコシン Ｏｒｎ　＝オルニチン Ｚ　−ベンジルオキシカルボニル Ｂｏｏ　＝ｔ−ブナルオキシ力ルボニルＡｃ　＝アセチ
ル Ｆｏｒ　＝ホルミル ＤＭＦ　＝ゾメチルホルムアミド ＭｅＯＨ＝メタノール ＮＩＭ　＝Ｎ〜エチルモルホリン ーＰＮＡ　＝ｐ−ニトロアニリＰ −ＯＨＡ　＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド ＴＬＯ＝薄層クロマトグラフィー ＧＰＯ＝ゲル濾過クロマトグラフィー ＡｏＯＨ＝酢酸 ＢｕＯＨ＝ｎ−ゲタノール ＡｏＯＢｔ　＝酢酸エチル Ｏｓｕ　−サクシニックイミド （注　アミノ酸は特にことわらなければＬ一体を示す。

） ■　薄層クロマトグラフィー ＴＬＯ分析はシリカゲルＦ２３４　（メルク製）プレー
トを使用。

溶媒は Ｒｆｌ　ｎ−ＢｕＯＨ：　ＡｃＯＨ：　Ｈ２Ｏ＝　４　
：　１：　ＩＲｆ２　ｎ−ＢｕＯＨ：　ＡｃＯＨ：　Ｈ
２Ｏ＝　４　：　１　：　２Ｒｆ３　ｎ−ＢｕＯＨ：　
ＡｃＯＨ：　Ｈ２０＝４　：　１　：　５■　ｒル濾過
には、東洋曹達工業株式会社のポリビニールデル、トヨ
パールＨＷ４０Ｆ（商品名）を使用した。

実施例１ １、ＢＯＯ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−Ｈ（Ｊ ４３００−Ａｒｇ−ＯＨ−ＨＣＬ−１（２ｏ　３８１．
１　ｇ（１，１６ｒｎｏｌ）をＤＭＦ　１３９２　ｍｌ
に溶解し、ｘｑｇＭｌ　５１　ｍｌを加え。

これに−２０℃にてイングチルクロロホルメート１５２
．５ｍ／ｌｌ−滴下する。１０分間反応後、５−アミノ
サリチル酸・塩酸塩２１９．８　ｇ　（１，１６ｍｏｌ
）とＮ８Ｍ３０１．６　ｍｌのＤＭＦ　９２８　ｙｎｌ
溶液を上記反応液に−１５〜−１０℃にて滴下する。滴
下後、同温度にて６時間反応させ、さらに室温にて１５
時間反応させる。反応後、ＤＭＦを減圧留去し、残渣を
ＭｅＯＨ４６４ｙｐｒｌとｎ　−ＢｕＯＨ３３２Ｉｌ！
／に溶解する。

ＡｃＯＨ３６００ｍｌを加え、食塩を飽和させた冷５チ
塩酸２１６０＋１１７にて２回洗浄後、無水硫酸マグネ
シウムにて乾燥する。乾燥後硫酸マグネシウムを濾別し
て溶媒を減圧留去すると、Ｂｏｏ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−Ｈ
（Ｊ４６４．８　ｇ（８９，９％　）を得る。

Ｒ（１＝　０．６４　ｍ、ｐ、２２５．０　’Ｃ（分解
）〔α〕２０　−１０．７（Ｃ−１、ＭｅＯＨ）元素分
析　０２６Ｈ５ＱＮ＋ＳＯＱ” ＯＨＮ 測定値　５０．７９　８．０４　１１．５２計算値　５
１，０１　８．２３　１１．４４Ｉ１．　ＢＯＯ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−ＨＣｆＢｏｏ−Ａｒｇ−（ＨＡ、
ＨＣＪ！　２４３．７　ｇ　（０，５５ｍｏｌ　）を２
　Ｎ　Ｈ（Ｊ／ＡｃＯＨ１０９３ｍｌと少量のＭｅＯＨ
に溶解して、１時間室温にて反応させる。反応終了後。

イソゾロパノール１０９３１１Ｌ／を加え、　Ａｃ０Ｅ
ｔ中に再沈する。析出結晶を濾取・乾燥すると）ｌ−Ａ
ｒｇ−０１（Ａ・２Ｈユ　１５６．２　ｇ（７４，３％
）を得る。

Ｒｆｓ　＝　０．１５　ｍ、ｐ、２４０．５°ｃ（分解
）〔α〕２０　＋５３．５（ａ＝１．Ｉ（２ｏ）’　０
９．２　ｇ（０，２７ｍｏｌ　）のＨ−Ａｒｇ−ＯＨＡ
−２ＨＣＪ！をＤＭＦ　２９０　ｙｄに溶解させ、　Ｎ
ＥＭ　７　Ｑ、２１Ｌｌ　（０，５４ｍｏｌ　）を加え
る。これに０〜５℃にてＢＯＯ−ＧＩＹ−０８ｕ　８１
．７　ｇ　（０，３ｍｏｌ　）　’に加え、室温にて１
８時間反応させる。反応終了後、ＤＭＦを減圧留去し。

残渣をＭｅＯＨ５００ｒｎｌに溶解して、　ＡｃＣＩＥ
ｔ　８ノに再沈する。析出結晶を濾取５乾燥すると、　
ＢＯＯ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−ＨＣＬ　１３５．８
．９（１００％）を得る。

Ｒｆｘ　＝　０．４６　ｍ、ｐ、２１４．５℃（分解）
〔α）２０　２２（０＝１、ＭｅＯＨ）元素分析　０２
０Ｈ３（ＩＮ２Ｏ３’　ＨＣｊ　・Ｈ２Ｏ０ＨＮ 測定値　４６．５５　６．８０　１＋Ｓ、１５計算値　
４６，１１　６．３９　ｔ６．１３ｍ、Ｚ−Ｄ−Ｌｙｓ
（Ｆｏｒ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−ＨＣＩＢｏｏ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−Ｈ（Ｊ　１　２５．７　＆　
（０，２５ｍｏｌ）を少量ｔ７）　ＭｅＯＨに溶解後、
２Ｎ　ＨＵ７’ＡＯＯＨ５００ｎｌ（０，１０ｍｏｌ　
）を加え、１時間室温にて攪拌反応させる。反応終了後
、エーテル４．５１に再沈し、析出結晶を濾取・乾燥す
るとＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ・２ＨＣノ１０９．８
　Ｆ　（１００チ）を得る。

Ｒｆｓ　＝　０．０９　ｍ、ｐ、２１９．５’Ｃ（分解
）Ｃａ〕”　−２１，０（ｏ＝１、ＡＯＯＨ：　Ｈ２Ｏ
＝　１　：　１）Ｌ４．！ｉ’　（１０ｍＭ　）のＨ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ　・２　ＨＣｊ　ｆＯ，７５Ｎ
ＫＭ／ＤＭ’Ｆ　２Ｑ　ｙｄに溶解し、０〜５℃に冷却
攪拌しながらＺ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆ’ｏｒ）−０８ｕ　８
．１　ｇ　（２０ｍｍｏｌ　）を加えて、室温にて１５
時間反応させる。

反応後、溶媒を減圧留去し、残渣をメタノールに溶解し
てＡｃｏＥｔ　８００　ｙｄに再沈する。析出結晶を濾
取、乾燥すると粗製のＺ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ）−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　、　ＨＣｌを得、これを展開溶媒
がＭｅＯＨのトヨパール　ＨＷ４０Ｐカラムにて精製す
ると６．６ｇ（５２，２％）のＺ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｏｒ
）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ　−ＨＣｊを得る。

Ｒｆ１＝　０．４０　ｍ、ｐ、吸湿性 〔α］２０１３．６　（Ｑ＝Ｑ、５．　ＡｃＯＨ：　Ｈ
２０＝１：　１　）元素分析　０３０Ｈ４ＯＮ８０９−
　Ｈ（Ｊ−２，５１（２゜ＯＥ　Ｎ 測定値　４８．５０　６．１８　１５．６０計算値　４
８，７４　６．２８　１５．１８実施例２ Ｚ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡの合成１、Ｚ
−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｏ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−Ｈ
ＣｊＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ　−２ＨｃＬ８．８　
＆　（２０ｍｍｏｌ　）をＤＭＦ　２１．５　′ＩＬｔ
に溶解し、ＮＦ！Ｍ　５．Ｉ　ＩＬ／（４０ｍｍｏｌ）
を加える。これに０〜５℃にてＺ−Ｄ−Ｌｙｅ（Ｂｏｏ
）−０Ｂｕ９−６１１　（２０ｍｍｏｌ　）を加え、室
温にて１８時間反応させる。反応後ＤＭＰを減圧留去し
、残渣をＭｅＯＨに溶解してＡｃ０Ｂｔ　１１に再沈す
る。析出結晶を濾取、乾燥するとＺ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＢＯ
Ｏ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−ＨＣｊ　１４．９　ｇ
（９７゜４チ）を得る。

Ｒｈ　＝　０．５６　ｍ、ｐ、２０７．５℃（分解）〔
α〕２°−８，Ｑ　（０＝０．５、ＭｅＯＨ）元素分析
　０３．）ｌ、８Ｎ８０１ｏ−ＨＣＪ、・１．５　Ｈ２
Ｏ０Ｎ　Ｏ 測定値　５１，６４　６．８１　１３．６１計算値　５
１，５４　６．６２　１４．１４■、Ｚ−Ｄ−Ｌｙｅ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ　−ＯＨＡ　・’ｌ　ＨＣＪＺ−Ｄ−Ｌ
ｙｓ（Ｂｏｏ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ−Ｈｃｉ　２
．７９　（３，５ｍｍｏｌ）’ｉ（−少量のＭｅ　ＯＨ
に溶解し、これに２　Ｎ　ＨＣＪ／ＡＱＯＨ７１１１／
を加え、室温にて１時間反応させる。

反応終了技、乾燥エーテルに再沈し、析出結晶を濾取、
乾燥すると粗製のＺ−Ｄ−Ｌｙｓ　（Ｆｏｒ　）−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ＯＨＡ　−ＨＣＪ　ｔｌ−得る。これを展
開溶媒がＭｅＯＨのトヨパールＨＷ　４０　Ｆカラムに
て精製すると１．８９（７４，６％　）のＺ−Ｄ−Ｌｙ
ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　・２　ＨＣＪを得る。

Ｒｆ２　＝　０．３１　ｍ、ｐ、２２０．０６Ｃ（分解
）〔α）２０　−１６．０　（ｏ＝１，５０チＡｃ０１
（）元素分析　０２９Ｈ４００８ＮＢ　・２ＨＣｊ　２
．２　Ｈ２Ｏ０ＨＮ 測定値　４７，０８　５．８９　１４．９４計算値　４
６．９９　６．２８　１５．１２実施例６ 同様な方法にて、下記の基質を合成した。

実施例４ 新規に合成した基質の特異性を各酵素と反応させること
により試験した。

１）基質液：　２　ｍｍｏｌ／１Ｈ２０２）緩衝液ニド
リス、　ＮａＣｊ、０ａＣ２の各濃度および反応、ＰＨ
は酵素によシ次の通）としたトロン　プラス　カリク　
ウキロナ− ＦＸａ　ピン　ミン　レイン　ゼ ト　リ　ス　（ｍｍｏｌ）　５０　５０　５０　５０　
５ＯＮａＣＪ（ｍｍｏｌ）　５００　１５０　１５０　
１５０　１５００ａＣＪ２（ｍｍｏｌ）　５　０　０　
０　０ＰＨ（２５℃）　８．５　８．５　７．８　７．
８　８．２３）使用酵素 起源　メーカー　Ｌｏｔ　単位 ＰＸａ　：ヒト：ベーリンガー　１３５２３０４　０５
　Ｕ／ｗｉｔトロンビン　：ウシ：　持出製薬　６５１
４６　１ＵＮＩル４ｊゾラスミン　：ヒト：　ミドリ十
字　ｐＬ−６５０２５０Ｕ／ｍｌカリクレイン：ゲタ：
　シグマ　３２　Ｆ−０８１０１Ｊ］Ｕ／ｍ／ウロキナ
ーゼ：ヒト：　持出製薬　２０２３９　１０００Ｕｚ４
７４）反応停止液（ＰＮＡ）：１０％−酢酸５）発色試
薬（ＯＨＡ）：ペンタアミンフエロエート 測定法： 緩衝液０．６１１Ｌｌと酵素試薬０．１１１１／をシリ
コン処理硬質ガラス製試験管又は、プラスチック製試験
管に採取し、３７℃恒温槽中にて５分間予加温する。

次いで基質液０．１１ｎ！を加えて酵素反応′ｆ、６７
℃５分間実施する。正確に５分後、反応停止液、または
停止発色試薬２．ＯＭ／を加えて酵素反応を停止後、続
いて３７℃で１０分間放置後４０５　ｎｍまたは７００
　ｎｍの吸光度を測定する。

結果を第２表に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 （式中 −０（ＯＨ３）３（Ｒ６＝Ｈ，０Ｈ３０）である） の化合物または、その塩で表わされることを特徴とする
   。第Ｘａ因子および第Ｘａ因子様ＰＩ１．素に対して発
   色性又は螢光性を有する新規な第Ｘａ因子測定用基質。