JPH04305560A - アルギニン誘導体またはその可溶性塩、及びエキソペプチダーゼ活性測定法 - Google Patents

アルギニン誘導体またはその可溶性塩、及びエキソペプチダーゼ活性測定法

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JPH04305560A
JPH04305560A JP9098091A JP9098091A JPH04305560A JP H04305560 A JPH04305560 A JP H04305560A JP 9098091 A JP9098091 A JP 9098091A JP 9098091 A JP9098091 A JP 9098091A JP H04305560 A JPH04305560 A JP H04305560A
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Japan
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manufactured
precipitate
peptide institute
substrate
synthesis
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Application number
JP9098091A
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English (en)
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Noriko Sato
佐藤　徳子
Yuzo Sugita
杉田　裕三
Masato Okada
岡田　昌人
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Tokuyama Corp
Original Assignee
Tokuyama Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は被検体中のエキソペプチ
ダーゼ活性測定のための基質及び酵素活性測定法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】トリプシンは、食物消化に大きな役割を
果たすタンパク質分解酵素であり、前駆体トリプシノー
ゲンとして膵で生合成され、膵液中に分泌され、小腸に
てトリプシンによって自己消化されトリプシンとなる。 このため、成人の膵不全の指標として糞中のトリプシン
の活性が測定されている。また、膵の一次閉鎖や子供の
膵繊維症の診断に、糞中のトリプシンの活性測定値が役
立つ可能性があるといわれている（臨床酵素ハンドブッ
ク、４４１頁）。
【０００３】このトリプシンの活性測定法にはタンパク
質を基質とするプロテアーゼ活性を測定する方法と、合
成基質を用いペプチダーゼ活性を測定する方法がある。
【０００４】タンパク質を基質とする方法は、カゼイン
を基質とし、被検体と反応させた後、その反応液の上清
のニンヒドリン発色あるいは２８０ｎｍの吸光度を測定
するものである。
【０００５】合成基質を用いる方法には以下のものがあ
る。α，Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステ
ルを基質とし、ｐＨ７．８０で滴定を行い、アルカリ消
費量から基質分解量を求める方法（滴定法）。ｐ−トル
エンスルホニル−Ｌーアルギニンメチルエステルを基質
とし、２４７ｎｍの吸収増加を測定する方法（分光法）
。ベンゾイル−Ｄ，Ｌ−アルギニルｐ−ニトロアニリド
等を基質とし、遊離するｐ−ニトロアニリンの４１０ｎ
ｍの吸収増加を測定する方法（発色基質法）。
【０００６】
【発明が解決しようとする問題点】上記のようにトリプ
シンの活性測定法は数多くあるが、多くの検体を測定す
るためにはそれぞれ問題点がある。
【０００７】タンパク質を基質として用いる測定法は操
作が煩雑であり、大量の検体を測定することは不可能で
ある。
【０００８】滴定法は、検体中に存在する他の物質の影
響を受けにくい方法であるが、やはり操作が煩雑である
という欠点を有する。
【０００９】分光法は、操作は単純であるが、検出波長
が２４７ｎｍであるため、生体成分の多くの吸収波長と
重なり、検体中に存在する他の物質の影響を受け易いと
いう欠点を有する。また、検量線が直線性を示す範囲が
狭いという欠点も有する。
【００１０】発色基質法は遊離するｐ−ニトロアニリン
の検出波長が４１０ｎｍであるため、検体中の他の成分
、特にビリルビン系色素の影響を大きく受けてしまうと
いう欠点を有する。また、このｐ−ニトロアニリンをア
ルデヒド系化合物と反応せしめて、その発色の吸収波長
で測定する方法もあるが、この反応は反応過程が複雑で
、測定条件が厳しく制限されるという欠点を有する。
【００１１】発色基質としてはベンゾイル−Ｄ，Ｌ−ア
ルギニルｐ−ニトロアニリドの他に、ベンゾイル−Ｄ，
Ｌ−アルギニルーαーナフチルアミドやベンゾイル−Ｄ
，Ｌ−アルギニルーβーナフチルアミド、またそれらの
アルギニンのアミノ基を他の保護基で保護したもの等が
ある。しかし、遊離するαーナフチルアミンやβーナフ
チルアミンは毒性特に発癌性の大変高い物質であり、取
扱に厳重な注意を要する欠点がある。また、これらの合
成基質は水に対する溶解度が低いという欠点も有する。
【００１２】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、簡便で
高感度な測定結果を得られるペプチダーゼ活性測定法を
鋭意研究した結果、下記一般式 で表される化合物が水に対する溶解度が高く、また、意
外にもこの化合物がペプチダーゼによって加水分解され
やすいことを見いだした。そして、この化合物を基質と
して用い、遊離されるベンジルアミンを定量することに
より簡便で高感度なペプチダーゼ活性測定が行えること
を見いだし、また、ベンジルアミンが生体内には存在し
ないことから、検体中の他の生体成分の阻害を受ける事
なく活性測定を行えることを見いだし、本発明を完成し
た。
【００１３】本発明は前記一般式で表されるアルギニン
誘導体またはその可溶性塩である。前記一般式において
、Ｒは水素、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブトキシカルボ
ニル基を示し、Ｒ’はアミノ酸残基を示す。これらのア
ミノ酸残基のカルボニル基はアルギニン残基のアミノ基
とペプチド結合で結合する。また、本発明は、前記一般
式のアルギニン誘導体またはその可溶性塩を基質とし、
検体と反応せしめ、検体中のエキソペプチダーゼ作用に
より遊離するベンジルアミンを定量することを特徴とす
る検体のエキソペプチダーゼ活性測定法である。 尚、エキソペプチダーゼ活性とはペプチド鎖の末端アミ
ノ酸を遊離するペプチダーゼの作用の程度を示す。
【００１４】本発明のペプチダーゼ活性測定用基質は、
ベンジルアミンのアミノ基とアルギニンのカルボキシル
基を結合せしめた構造をもつ、前記一般式で表される化
合物である。式中のＲは水素、カルボベンゾキシ基また
はｔ−ブトキシカルボニル基を示し、Ｒ’のアミノ酸残
基はアミノ酸がアルギニンのアミノ基にペプチド結合し
たものを表す。ここでいうアミノ酸とは、グリシン、フ
ェニルアラニン、バリン、グリシルグリシン、グリシル
バリン、フェニルアラニルグリシン等が挙げられる。該
アミノ酸は単独に、又はシペプチドの形でアルギニンと
結合している。更に該アミノ酸残基が存在しない場合も
本発明の範囲である。
【００１５】これらの化合物は、公知のペプチド合成の
手法を用いて合成することができる。合成の目的に従っ
てアミノ酸のカルボキシル基あるいはアミノ基を保護基
にて保護し、あるいは既に保護誘導体として市販されて
いるものを試薬として用い、保護されていないカルボキ
シル基とアミノ基を脱水的に縮合させてペプチド結合を
生成させる。アミノ基の保護基としては、例えば、カル
ボベンゾキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル基、トシル基
、ｔ−アミロキシカルボニル基等が挙げられる。また、
カルボキシル基の保護基としては、メトキシ基、エトキ
シ基、ベンジロキシ基、スクシミド−　オキシ（Ｎ−ヒ
ドロキシスクシニミドエステル）等が挙げられる。ペプ
チド結合の生成法としては、塩化物法、アジド法、混合
酸無水物法、活性エステル法、Ｎ，Ｎ’−　ジシクロヘ
キシルカルボジイミド等のカップリング試薬を用いる方
法等が挙げられる。
【００１６】ペプチド結合生成反応後、必要に応じてア
ミノ基あるいはカルボキシル基の保護基を脱離せしめる
。脱離にあたっては、脱離させる保護基に応じた方法を
用いる。例えば、保護基がカルボベンゾキシ基であれば
、パラジウム−炭素を用いる接触還元の手段を用い、保
護基がｔ−ブトキシカルボニル基であれば、トリフルオ
ロ酢酸を用いる手段が好ましい。保護基の脱離反応を終
えたこれらの化合物は適宜精製し、さらに塩酸塩、リン
酸塩、酢酸塩などの可溶性塩としてもよい。
【００１７】本発明の化合物の合成方法は特に限定され
ず、如何なる方法を用いてもよいが、一般に好適に用い
られる代表的な合成方法を以下に示す。
【００１８】前記一般式においてＲ’が０個の場合、ま
ず、ベンジルアミンと、アミノ基とグアニジン基を保護
したアルギニン誘導体とを前記の方法にて反応させ、ペ
プチド結合を生成せしめる。次にアルギニン残基のグア
ニジン基保護基のみ、あるいは、グアニジン基保護基と
アミノ基保護基の両方を前記の方法にて脱離、精製し、
目的の化合物を得る。
【００１９】前記一般式においてＲ’が１個のアミノ酸
である場合、まず、ベンジルアミンと、アミノ基とグア
ニジン基を保護したアルギニン誘導体とを前記の方法に
て反応させ、ペプチド結合を生成せしめる。次にアルギ
ニン残基のアミノ基保護基のみを前記の方法にて脱離さ
せる。これをアルギニルベンジルアミド誘導体と称する
。このアルギニルベンジルアミド誘導体のアミノ基と、
アミノ基を保護した該アミノ酸のカルボキシル基とを前
記の方法にて反応させ、ペプチド結合を生成せしめる。 目的に応じてアルギニン残基のグアニジン保護基、該ア
ミノ酸の保護基を脱離させ、適宜精製して目的の化合物
を得る。
【００２０】前記一般式においてＲ’が２個のアミノ酸
である場合、ベンジルアミンと、アミノ基とグアニジン
基を保護したアルギニン誘導体とを前記の方法にて反応
させ、ペプチド結合を生成せしめる。次にアルギニン残
基のアミノ基保護基のみを前記の方法にて脱離させる。 これをアルギニルベンジルアミド誘導体と称する。一方
、該当するアミノ酸のアミノ基を保護した誘導体と、カ
ルボキシル基を保護した誘導体を前記の方法で反応させ
、ペプチド結合を生成せしめる。得られた化合物のカル
ボキシル基保護基のみを脱離させ、上記のアルギニルベ
ンジルアミド誘導体と反応させ、ペプチド結合を生成せ
しめる。得られた化合物の保護基を目的に応じて脱離せ
しめ、適宜精製して目的の化合物を得る。
【００２１】ベンジルアミンの定量法は、公知の測定法
の如何なるものでもよい。具体例を挙げれば、イオン交
換あるいは逆層カラムを用い、ｏ−フタルアルデヒドに
よる発蛍光検出を用いた液体クロマトグラフィー法、ベ
ンジルアミンオキシダーゼの作用により生成した過酸化
水素を定量する方法等がある。
【００２２】生成する過酸化水素の定量法は公知の方法
の如何なるものでもよいが、例えば、２・４ージクロロ
フェノール、４ーアミノアンチピリン、ペルオキシダー
ゼを含有する試薬、２，２’ーアジノー　ビス（３−エ
チルベンゾー　チアゾリンー６ー　スルホン酸）、ペル
オキシダーゼを含有する試薬等の呈色試薬と過酸化水素
を反応させ、呈色の吸光度を測定する方法、ルミノール
を含有する試薬を過酸化水素と反応させ発光強度を測定
する方法等が挙げられる。
【００２３】本発明のペプチダーゼ活性測定を実施する
場合前記一般式で表される基質の濃度は、被検体中のト
リプシン等ペプチダーゼ活性をもつものがその酵素活性
を充分に発現させる濃度であればよく、好ましくは反応
液中の最終濃度が　１０〜１，０００μＭ　の範囲であ
ることが適当である。反応条件は、被検体中の酵素の性
質により異なるが、ｐＨ条件としては　４．０〜１０．
０、好ましくは　６．０〜８．０　の範囲が好適であり
、温度条件としては　１５〜４０℃　、好ましくは　２
０〜４０℃　の範囲が好適であり、反応時間は　５〜　
６０　分の範囲が好適である。生じるベンジルアミンの
定量は前記公知の測定方法により測定すればよい。
【００２４】
【発明の効果】本発明によるエキソペプチダーゼ活性測
定用基質を用いた活性測定法は、操作が簡便であり、多
くの検体を短時間で活性測定することができる。また、
その測定感度が高いため、少量の検体で、測定を行うこ
とが可能である。
【００２５】
【実施例】以下実施例を上げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。
【００２６】実施例１ ｛アルギニルベンジルアミド二塩酸塩の合成｝Ｎα−　
カルボベンゾキシーＮｇ−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ペ
プチド研究所社製）３．５　ｇ、Ｎ，Ｎ’−　ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド　２．２　ｇ、１−　ヒドロキ
シベンゾトリアゾール　１．５　ｇ　　をクロロホルム
４０　ｍｌ　ジメチルホルムアミド　１０　ｍｌ　　の
混合溶媒に氷冷下で溶解し、ベンジルアミン　１．１　
ｇ　　を加え、氷冷下３時間攪拌し、さらに室温で一晩
攪拌した。析出した沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮し
、残渣を酢酸エチルに抽出し、１０　％クエン酸水溶液
、飽和食塩水、４　％　炭酸水素ナトリウム水溶液、次
いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥
した。 酢酸エチル層を減圧濃縮し、エーテルを加えて沈澱物を
得た。この沈澱物をメタノール　３０　ｍｌ、酢酸　２
０　ｍｌ、水　２０　ｍｌの混合溶媒に溶解し、パラジ
ウム−炭素を　２　％となるよう加え、水素ガスを室温
下　２０　時間通じ、接触還元を行った。反応液中のパ
ラジウム−炭素を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣をメ
タノールに溶解し、氷冷下にて　４Ｎ　塩化水素／ジオ
キサン（ペプチド研究所社製）　４　ｍｌを加え、減圧
濃縮し、残渣にエーテルを加えて沈澱を得た。
【００２７】性状　　　　：白色固体、室温にて融解収
量　　　　：１．９　ｇ（５４．８　％）ＴＬＣ　　：
Ｒｆ＝０．６８ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：１６７５（Ｃ＝Ｏ），１２６０（Ｃ
−Ｎ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝２６３（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ１３Ｈ２３Ｏ１Ｎ５Ｃｌ２・Ｈ２Ｏ）実
施例２ ｛ｔ−ブトキシカルボニルアルギニルベンジルアミド塩
酸塩の合成｝Ｎα−　カルボベンゾキシーＮｇ−ニトロ
−Ｌ−アルギニンのかわりに、Ｎα−　ｔ−ブトキシカ
ルボニルーＮｇ−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ペプチド研
究所社製）を原料とし、実施例１と同様の方法で合成し
た。
【００２８】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．６　ｇ（６４．１　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．６６ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝３６３（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ１８Ｈ３０Ｏ３Ｎ５Ｃｌ）実施例３ ｛カルボベンゾキシアルギニルベンジルアミド塩酸塩の
合成｝Ｎα−　カルボベンゾキシーＬ−アルギニン塩酸
塩（ペプチド研究所社製）　３．１　ｇ、Ｎ，Ｎ’−　
ジシクロヘキシルカルボジイミド　２．２　ｇ、１−　
ヒドロキシベンゾトリアゾール　１．５　ｇ　　をクロ
ロホルム　４０　ｍｌ　　ジメチルホルムアミド　１０
　ｍｌ　　の混合溶媒に氷冷下で溶解し、ベンジルアミ
ン　１．１　ｇ　　を加え、氷冷下３時間攪拌し、さら
に室温で一晩攪拌した。析出した沈澱物を濾去し、濾液
を減圧濃縮し、残渣に混合溶媒（クロロホルム：メタノ
ール＝１９：１）を加えて溶解させ、同じ混合溶媒を用
いたシリカゲルカラムクロマトにて精製し、精製画分を
減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて沈澱物を得た。
【００２９】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：１．８　ｇ（４１．６　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８１ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝３９７（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２１Ｈ２８Ｏ３Ｎ５Ｃｌ）実施例４ ｛グリシルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩の合成｝
Ｎα−ｔ−　ブトキシカルボニルーＮｇ−ニトロ−Ｌ−
アルギニン（ペプチド研究所社製）３．２　ｇ、Ｎ，Ｎ
’−　ジシクロヘキシルカルボジイミド　２．２　ｇ、
１−　ヒドロキシベンゾトリアゾール　１．５　ｇをジ
メチルホルムアミド　４０　ｍｌ　　に氷冷下で溶解し
、ベンジルアミン　１．１　ｇを加え、氷冷下３時間攪
拌し、さらに室温で一晩攪拌した。析出した沈澱物を濾
去し、濾液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルに抽出し、
１０　％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４　％　炭酸水
素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水
硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチル層を減圧濃縮
し、エーテルを加えて沈澱物を得た。この沈澱物を氷冷
下でトリフルオロ酢酸１０ｍｌに溶解し、２時間氷冷下
で放置し、減圧濃縮した。残渣をメタノールに溶解し、
氷冷下にて　４Ｎ　塩化水素／ジオキサン（ペプチド研
究所社製）　４　ｍｌ　を加え、減圧濃縮し、残渣にエ
ーテルを加えて沈澱物　３．１　ｇを得た。カルボベン
ゾキシグリシン（ペプチド研究所社製）１．８　ｇ　、
Ｎ，Ｎ’　−ジシクロヘキシルカルボジイミド　２．０
　ｇ、１−　ヒドロキシベンゾトリアゾール　１．４　
ｇ、トリエチルアミン　１．２５ｍｌをジメチルホルム
アミド　３０　ｍｌに氷冷下で溶解し、前記沈澱物　３
．１　ｇを加え、氷冷下３時間攪拌し、さらに室温で一
晩攪拌した。析出した沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮
し、残渣をクロロホルムに抽出し、１０　％クエン酸水
溶液、飽和食塩水、４　％炭酸水素ナトリウム水溶液、
次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾
燥した。クロロホルム層を減圧濃縮し、メタノールとエ
ーテルを等量ずつ加えて沈澱物を得た。この沈澱物２．
１　ｇ　をメタノール　２０　ｍｌ、酢酸　２０ｍｌ、
水　１０　ｍｌの混合溶媒に溶解し、パラジウム−炭素
を　２　％となるよう加え、水素ガスを室温下　２０　
時間通じ、接触還元を行った。反応液中のパラジウム−
炭素を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣をメタノールに
溶解し、氷冷下にて　４Ｎ　塩化水素／ジオキサン（ペ
プチド研究所社製）　４．５　ｍｌ　を加え、減圧濃縮
し、残渣を水に溶解し、エーテルで洗浄した後水層を減
圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて沈澱を得た。
【００３０】性状　　　　：白色固体、室温にて溶解収
量　　　　：１．４　ｇ（３６．１　％）ＴＬＣ　　：
Ｒｆ＝０．６３ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝３２０（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ１５Ｈ２６Ｏ２Ｎ６Ｃｌ２・５Ｈ２Ｏ）
実施例５ ｛バリルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩の合成｝カ
ルボベンゾキシグリシン（ペプチド研究所社製）のかわ
りに、カルボベンゾキシーＬ−バリン（ペプチド研究所
社製）を用いて、実施例４と同様の方法で合成した。
【００３１】性状　　　　：白色固体、室温にて溶解収
量　　　　：１．７　ｇ（３８．９　％）ＴＬＣ　　：
Ｒｆ＝０．５９ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３１０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝３６２（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ１８Ｈ３２Ｏ２Ｎ６Ｃｌ２）実施例６ ｛フェニルアラニルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩
の合成｝カルボベンゾキシグリシン（ペプチド研究所社
製）のかわりに、カルボベンゾキシーＬ−フェニルアラ
ニン（ペプチド研究所社製）を用いて、実施例４と同様
の方法で合成した。
【００３２】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．６　ｇ（３９．６　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．６１ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４１１（Ｍ＋）元素分析：（
Ｃ２２Ｈ３２Ｏ２Ｎ６Ｃｌ２） 実施例７ ｛ｔ−ブトキシカルボニルグリシルアルギニルベンジル
アミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシン（ペプ
チド研究所社製）のかわりに、ｔ−ブトキシカルボニル
グリシン（ペプチド研究所社製）を用いて、実施例４と
同様の方法で合成した。
【００３３】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：１．５　ｇ（３１．８　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７８ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４２１（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２０Ｈ３３Ｏ４Ｎ６Ｃｌ）実施例８｛ｔ
−ブトキシカルボニルバリルアルギニルベンジルアミド
塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシン（ペプチド研
究所社製）のかわりに、ｔ−ブトキシカルボニルーＬ−
バリン（ペプチド研究所社製）を用いて、実施例４と同
様の方法で合成した。
【００３４】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．１　ｇ（４２．４　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８０ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４６３（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２３Ｈ３９Ｏ４Ｎ６Ｃｌ）実施例９ ｛ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニルアルギニル
ベンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシ
ン（ペプチド研究所社製）のかわりに、ｔ−ブトキシカ
ルボニルーＬ−フェニルアラニン（ペプチド研究所社製
）を用いて、実施例４と同様の方法で合成した。
【００３５】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．２　ｇ（３９．４　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８１ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５１１（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２７Ｈ３９Ｏ４Ｎ６Ｃｌ）実施例１０ ｛フェニルアラニルグリシルアルギニルベンジルアミド
二塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシーＬーフェニルアラ
ニン（ペプチド研究所社製）６．０　ｇ、　Ｎ，Ｎ’　
−ジシクロヘキシルカルボジイミド　４．４ｇ、１−　
ヒドロキシベンゾトリアゾール　３．０　ｇ　、トリエ
チルアミン　２．８　ｍｌ　　をジメチルホルムアミド
　５０　ｍｌ　　に氷冷下で溶解し、グリシンエチルエ
ステル塩酸塩（ペプチド研究所社製）３．３　ｇ　を加
え、氷冷下３時間攪拌し、さらに室温で一晩攪拌した。 析出した沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣を酢
酸エチルに抽出し、１０　％クエン酸水溶液、飽和食塩
水、４　％　炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食
塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸
エチル層を減圧濃縮し、エーテルを加えて沈澱物を得た
。この沈澱物をエタノール　９０　ｍｌに溶解し、１Ｎ
　水酸化ナトリウム　３０　ｍｌ　を加え、室温にて５
時間放置した。反応液を減圧濃縮し、残渣に氷冷下で　
１０％　クエン酸水溶液　９０　ｍｌを加え、沈澱物を
濾取し水洗した。この沈澱物をメタノールに溶解しエー
テルを加えて再度沈澱物を得た（沈澱物１）。
【００３６】Ｎα−　ｔ−ブトキシカルボニルーＮｇ−
ニトロ−Ｌ−アルギニン（ペプチド研究所社製）６．４
　ｇ、　　Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
　４．４　ｇ、１−　ヒドロキシベンゾトリアゾール　
３．０　ｇ　　をジメチルホルムアミド　６０　ｍｌ　
　に氷冷下で溶解し、ベンジルアミン　２．２　ｇ　　
を加え、氷冷下３時間攪拌し、さらに室温で一晩攪拌し
た。析出した沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣
を酢酸エチルに抽出し、１０　％クエン酸水溶液、飽和
食塩水、４　％　炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽
和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。 酢酸エチル層を減圧濃縮し、エーテルを加えて沈澱物を
得た。 この沈澱物を氷冷下でトリフルオロ酢酸２０　ｍｌに溶
解し、２時間氷冷下で放置し、減圧濃縮した。残渣をメ
タノールに溶解し、氷冷下にて　４Ｎ　塩化水素／ジオ
キサン（ペプチド研究所社製）　８ｍｌ　を加え、減圧
濃縮し、残渣にエーテルを加えて沈澱を得た（沈澱物２
）。沈澱物１　４．３　ｇ、Ｎ，Ｎ’−　ジシクロヘキ
シルカルボジイミド　２．６　ｇ、１−　ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール　１．８　ｇ、トリエチルアミン　１
．７　ｍｌ　をジメチルホルムアミド　５０　ｍｌ　　
に氷冷下で溶解し、沈澱物２　３．７　ｇ　　を加え、
氷冷下３時間攪拌し、さらに室温で一晩攪拌した。析出
した沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣に水を加
えた。 得られる沈澱物を濾過にて集め、ロート上の沈澱物を、
１０　％クエン酸水溶液、４　％　炭酸水素ナトリウム
水溶液、次いで水で洗浄した。この沈澱物をメタノール
　３０　ｍｌ、酢酸　２０　ｍｌ、水　２０　ｍｌの混
合溶媒に溶解し、パラジウム−炭素を　２　％となるよ
う加え、水素ガスを室温下　２０　時間通じ、接触還元
を行った。反応液中のパラジウム−炭素を濾去し、濾液
を減圧濃縮し、残渣に氷冷下にて　４Ｎ　塩化水素／ジ
オキサン（ペプチド研究所社製）　４　ｍｌ　を加え、
減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて沈澱を得た。
【００３７】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：３．４　ｇ（３２．１　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７６ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４６８（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２４Ｈ３５Ｏ３Ｎ７Ｃｌ２）実施例１１ ｛フェニルアラニルバリルアルギニルベンジルアミド二
塩酸塩の合成｝グリシンエチルエステル塩酸塩（ペプチ
ド研究所社製）のかわりにＬ−バリンメチルエステル塩
酸塩（ペプチド研究所社製）を用い、実施例１０と同様
の方法で合成を行った。
【００３８】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：３．４　ｇ（２９．２　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７９ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５１０（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２７Ｈ４１Ｏ３Ｎ７Ｃｌ２）実施例１２ ｛バリルグリシルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩の
合成｝カルボベンゾキシーＬーフェニルアラニン（ペプ
チド研究所社製）のかわりにカルボベンゾキシーＬー　
バリン（ペプチド研究所社製）を用い、実施例１０と同
様の方法で合成を行った。
【００３９】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：３．４　ｇ（３４．８　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７５ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４２０（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２０Ｈ３５Ｏ３Ｎ７Ｃｌ２）実施例１３ ｛バリルバリルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩の合
成｝カルボベンゾキシーＬーフェニルアラニン（ペプチ
ド研究所社製）のかわりにカルボベンゾキシーＬーバリ
ン（ペプチド研究所社製）を用い、グリシンエチルエス
テル塩酸塩（ペプチド研究所社製）のかわりにＬ−　バ
リンメチルエステル塩酸塩（ペプチド研究所社製）を用
い、実施例１０と同様の方法で合成を行った。
【００４０】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：４．２　ｇ（３８．９　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８２ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４６２　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２３Ｈ４１Ｏ３Ｎ７Ｃｌ２）実施例１４ ｛グリシルグリシルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩
の合成｝カルボベンゾキシーＬーフェニルアラニン（ペ
プチド研究所社製）のかわりにカルボベンゾキシグリシ
ン（ペプチド研究所社製）を用いて、実施例１０と同様
の方法で合成を行った。
【００４１】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．６　ｇ（２６．３　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７３ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３１０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝３７７　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ１７Ｈ２９Ｏ３Ｎ７Ｃｌ２・２Ｈ２Ｏ）
実施例１５ ｛グリシルバリルアルギニルベンジルアミド二塩酸塩の
合成｝カルボベンゾキシーＬーフェニルアラニン（ペプ
チド研究所社製）のかわりにカルボベンゾキシグリシン
（ペプチド研究所社製）を用い、グリシンエチルエステ
ル塩酸塩（ペプチド研究所社製）のかわりにＬ−　バリ
ンメチルエステル塩酸塩（ペプチド研究所社製）を用い
、実施例１０と同様の方法で合成を行った。
【００４２】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．８　ｇ（２８．５　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７６ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４１９　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２０Ｈ３５Ｏ３Ｎ７Ｃｌ２）実施例１６ ｛ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニルグリシルア
ルギニルベンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキ
シーＬーフェニルアラニン（ペプチド研究所社製）のか
わりにｔ−ブトキシカルボニルーＬーフェニルアラニン
（ペプチド研究所社製）を用い、実施例１０と同様の方
法で合成を行った。
【００４３】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：４．６　ｇ（３７．８　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８３ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３１０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５６７　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２９Ｈ４２Ｏ５Ｎ７Ｃｌ）実施例１７ ｛ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニルバリルアル
ギニルベンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシ
ーＬーフェニルアラニン（ペプチド研究所社製）のかわ
りにｔ−ブトキシカルボニルーＬーフェニルアラニン（
ペプチド研究所社製）を用い、実施例１１と同様の方法
で合成を行った。
【００４４】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：４．７　ｇ（３６．２　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８７ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝６０９　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ３２Ｈ４８Ｏ５Ｎ７Ｃｌ）実施例１８ ｛ｔ−ブトキシカルボニルバリルグリシルアルギニルベ
ンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシーＬーバ
リン（ペプチド研究所社製）のかわりにｔ−ブトキシカ
ルボニルーＬーバリン（ペプチド研究所社製）を用い、
実施例１２と同様の方法で合成を行った。
【００４５】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：４．７　ｇ（２７．５　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８０ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３１０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５１９　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２５Ｈ４２Ｏ５Ｎ７Ｃｌ）実施例１９ ｛ｔ−ブトキシカルボニルバリルバリルアルギニルベン
ジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシーＬーバリ
ン（ペプチド研究所社製）のかわりにｔ−ブトキシカル
ボニルーＬーバリン（ペプチド研究所社製）を用い、実
施例１３と同様の方法で合成を行った。
【００４６】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：４．１　ｇ（３４．２　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８５ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３３０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５６１　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２８Ｈ４８Ｏ５Ｎ７Ｃｌ）実施例２０ ｛ｔ−ブトキシカルボニルグリシルグリシルアルギニル
ベンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシ
ン（ペプチド研究所社製）のかわりにｔ−ブトキシカル
ボニルグリシン（ペプチド研究所社製）を用い、実施例
１４と同様の方法で合成を行った。
【００４７】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：３．３　ｇ（３０．７　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．７９ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝４７７　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２２Ｈ３６Ｏ５Ｎ７Ｃｌ・Ｈ２Ｏ）実施
例２１ ｛ｔ−ブトキシカルボニルグリシルバリルアルギニルベ
ンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシン
（ペプチド研究所社製）のかわりにｔ−ブトキシカルボ
ニルグリシン（ペプチド研究所社製）を用い、実施例１
５と同様の方法で合成を行った。
【００４８】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：３．７　ｇ（３３．０　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８２ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６０（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５１９　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２５Ｈ４２Ｏ５Ｎ７Ｃｌ）実施例２２ ｛カルボベンゾキシグリシルグリシルアルギニルベンジ
ルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシン（ペ
プチド研究所社製）５．８　ｇ、Ｎ，Ｎ’　−　ジシク
ロヘキシルカルボジイミド　４．３　ｇ、１−　ヒドロ
キシベンゾトリアゾール　　３．２　ｇ　、トリエチル
アミン　２．８　ｍｌ　をジメチルホルムアミド　４０
　ｍｌ　　に氷冷下で溶解し、グリシンエチルエステル
塩酸塩（ペプチド研究所社製）３．３　ｇ　を加え、氷
冷下３時間攪拌し、さらに室温で一晩攪拌した。析出し
た沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチ
ルに抽出し、１０　％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４
　％　炭酸水素ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で
洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチル
層を減圧濃縮し、エーテルを加えて沈澱物を得た。この
沈澱をメタノールに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム　３
０　ｍｌを加え６時間室温に放置した。反応液を減圧濃
縮し、氷冷下で　１０　％　クエン酸水溶液　　３０　
ｍｌ　を加え沈殿物を濾取し、水洗した（沈澱物１）。
【００４９】Ｎα−　カルボベンゾキシ−Ｎｇ−ニトロ
−Ｌ−アルギニン（ペプチド研究所社製）７．０　ｇ、
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド　４．３　
ｇ、１−　ヒドロキシベンゾトリアゾール　３．０　ｇ
　　をクロロホルム　５０　ｍｌ　　ジメチルホルムア
ミド　２０　ｍｌの混合溶媒に氷冷下で溶解し、ベンジ
ルアミン　２．１　ｇ　　を加え、氷冷下３時間攪拌し
、さらに室温で一晩攪拌した。析出した沈澱物を濾去し
、濾液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチルに抽出し、１０
　％クエン酸水溶液、飽和食塩水、４　％　炭酸水素ナ
トリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸
マグネシウムで乾燥した。酢酸エチル層を減圧濃縮し、
残渣にエーテルを加えて沈澱物を得た。この沈澱物をメ
タノール　３０　ｍｌ、酢酸　２０　ｍｌ、水　２０　
ｍｌの混合溶媒に溶解し、パラジウム−炭素を　２　％
となるよう加え、水素ガスを室温下　２０　時間通じ、
接触還元を行った。反応液中のパラジウム−炭素を濾去
し、濾液を減圧濃縮し、残渣に氷冷下にて　４Ｎ　塩化
水素／ジオキサン（ペプチド研究所社製）　４　ｍｌ　
を加え、減圧濃縮し、残渣にエーテルを加えて沈澱物を
得た（沈澱物２）。
【００５０】沈澱物１　２．７　ｇ、Ｎ，Ｎ’　−ジシ
クロヘキシルカルボジイミド　２．２　ｇ、１−　ヒド
ロキシベンゾトリアゾール　１．５　ｇ、トリエチルア
ミン　１．４　ｍｌ　をジメチルホルムアミド　４０　
ｍｌ　　に氷冷下で溶解し、沈澱物２　３．２　ｇ　　
を加え、氷冷下３時間攪拌し、さらに室温で２日攪拌し
た。析出した沈澱物を濾去し、濾液を減圧濃縮し、残渣
を水に溶解し、エーテルで洗浄した。水層を減圧濃縮し
、アセトンとエーテルを等量ずつ加えて沈澱物を得た。
【００５１】性状　　　　：白色固体 融点　　　　：１１０−１１４．５　℃収量　　　　：
２．９　ｇ（２４．４　％）ＴＬＣ　　：Ｒｆ＝０．８
３ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３１０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５１２　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２５Ｈ３４Ｏ５Ｎ７Ｃｌ・２Ｈ２Ｏ）実
施例２３ ｛カルボベンゾキシフェニルアラニルグリシルアルギニ
ルベンジルアミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリ
シン（ペプチド研究所社製）のかわりにカルボベンゾキ
シーＬーフェニルアラニン（ペプチド研究所社製）を用
いて実施例２２と同様の方法で合成を行った。
【００５２】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．９　ｇ（２５．３　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８４ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３２０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝６０１　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ３２Ｈ４０Ｏ５Ｎ７Ｃｌ）実施例２４ ｛カルボベンゾキシバリルグリシルアルギニルベンジル
アミド塩酸塩の合成｝カルボベンゾキシグリシン（ペプ
チド研究所社製）のかわりにカルボベンゾキシーＬーバ
リン（ペプチド研究所社製）を用いて実施例２２と同様
の方法で合成を行った。
【００５３】性状　　　　：白色固体 収量　　　　：２．９　ｇ（２３．７　％）ＴＬＣ　　
：Ｒｆ＝０．８３ （展開溶媒；ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝４：１
：１：２） ＩＲ（ｃｍ−１）：３３１０（Ｎ−Ｈ），１６６５（Ｃ
＝Ｏ）Ｍａｓｓ：ｍ／ｅ＝５５３　（Ｍ＋） 元素分析：（Ｃ２８Ｈ４０Ｏ５Ｎ７Ｃｌ・Ｈ２Ｏ）実施
例２５ ｛エキソペプチダーゼ活性測定｝実施例２２の方法で合
成したカルボベンゾキシグリシルグリシルアルギニルベ
ンジルアミドを基質としてペプチダーゼ活性測定を行っ
た（基質１）。比較のためにカルボベンゾキシグリシル
グリシルアルギニル−β−ナフチルアミドを基質とした
（基質２）。それぞれの基質を０．４　ｍＭ　となるよ
うに　０．１　Ｍ　リン酸緩衝液に溶解したものを基質
溶液とした。検体として、トリプシン様酵素を分泌する
ことが知られている微生物の培養上清液を用いた。この
基質溶液５容と検体２容と水と３容を混合したものを反
応液とした。反応は　３０　℃で、１０分間行い、　５
％　となるようトリクロロ酢酸を反応液に加えることで
反応を終わらせた。反応液を中和した後、逆層カラムを
用いた液体クロマトグラフィーを用いて遊離したベンジ
ルアミン、β−ナフチルアミンの濃度を測定した。濃度
測定の結果を次表に示す。 　　表からわかるように従来基質よりも本発明による基
質はエキソペプチダーゼ作用を受け易く、鋭敏に反応す
るため、結果として測定感度が上昇し、少量のサンプル
中の活性測定を行うことが可能である。また、測定操作
も簡便なため、多くの検体を短時間で処理することが可
能である。
【００５４】
【表１】

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式 　　（式中、Ｒは水素、カルボベンゾキシ基、またはｔ
    −ブトキシカルボニル基を示し、Ｒ’はアミノ酸残基を
    示し、ｍは０〜２の整数を示す）で表されるアルギニン
    誘導体、またはその可溶性塩。
  2. 【請求項２】請求項１のアルギニン誘導体、またはその
    可溶性塩を基質とし、該基質に対するエキソペプチダー
    ゼ作用により遊離したベンジルアミンを定量することを
    特徴とするエキソペプチダーゼ活性の測定方法
JP9098091A 1991-03-30 1991-03-30 アルギニン誘導体またはその可溶性塩、及びエキソペプチダーゼ活性測定法 Pending JPH04305560A (ja)

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