KR840001485B1 - 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

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펩타이드의 제조방법

본 발명은 가수분해 작용을 가진 효소의 검출 및 측정에 기질로 적절한 펩타이드의 제조방법에 관한 것이다. 효소의 활성을 측정하는데 사용되는 색원체성 기질은 오랫등안 알려져 왔다. 예를들어, 벤조일-알기닐-4-니트로아닐리드를 사용하여 효소의 트립신 작용을, 단위시간당 유리되는 4-니트로 아닐린의 양을 측정하므로써 정량적으로 측정하여 왔다. 이러한 측정이 가능한 것은 유리 4-니트로 아닐린의 UV스펙트럼이 N-아실화 화합물과 크게 차이나기 때문이다.

세린프로테아제의 활성을 측정하는데 사용되는 기질로서, 독일공개 특허 공보 제2,527,932호, 2,552,570호 및 2,629,067호에 EC 3.421이 알려져 있다. 이는 벤조일 라디칼 대신 3-4 아미노산의 보호 펩타이트를 함유한다. 이 경우도 발색단은 통상적으로 4-니트로 아닐린이다.

그러나 상기 문헌에 기술된 이들 물질의 단점은 선택성이 약하다는 점이다. 예를들어 Thromb Res. 10,549(1977)에 따르면 그런 기질은 프로테아제 뿐 아니라 일부 에스테라제에 의해서도 거의 동일 속도로 분해될 수 있다. 본 발명의 목적은 특히 이런 결점을 개선하는 것이다.

신규 화합물을 본 발명에 따라 효소 기질로 사용할때, 종래 기질의 단점이던 비특이성이 종래의 기질에 비해 현저히 감소된다. 문헌에 기술된 기질에서는 늘 염기성 아미노산 및 색원체 사이의 비-펩타이드성 결합이 끊어지는 반면, 본 발명에 따른 펩타이드에서는 효소에 의해 끊어지는 지점에는 염기성 아미노산 및 다른 천연아미노산사이의 진(true)펩타이드 결합이 위치한다. 효소 분해에 있어, 본 신규 기질은 이제까지 알려진 화합물보다 단백질의 성질에 가까운 특성을 나타낸다. 절단부위 및 발색단 사이에 하나 또는 그이상의 아미노산을 삽입하므로써 에스테라제에 대한 감수성을 현저하게 감소시키는 반면에, 이들 아미노산의 변형에 의해 특이성은 증가될 수 있다. 본 발명은 또한 신규 화합물의 단백질분해 효소의 검출 및 바람직하게는 정량분석을 위한 색원체성 또는 형광성 기질로서의 용도를 포함한다. 본 화합물은 또한 효소 억제제의 측정에도 기지 방법으로 사용할 수 있다. 다시말해, 본 화합물은 사람 및 동물 체액중의 단백질 분해효소 측정에 색원체성 기질로서 적절하다.

본 발명은 다음 일반식(I)의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

W-P-B-X -NH-R (I)

상기식에서 W는 수소원자, 아실그룹 또는 벤젠-또는 톨루엔-설포닐 그룹을 나타내며, P는 측쇄그룹이 치환될 수 있는 아미노산라디칼 또는 디-내지 헥사-펩타이드라디칼 또는 본드를 나타내며, B는 알기닌, 리신, 페닐 알라닌, 티로신 또는 호모알기닌을 나타내며 X는 단백질에 존재하며, 그 측쇄 그룹이 치환될수 있는, L-아미노산의 1 또는 2라디칼을 나타내며, R은 임의 치환된 방향족 탄화수소 라디칼을 나타내며, -X-NH-R은 색원체성 또는 형광성 그룹을 나타내며 효소의 가수분해 작용에 의해 분해 생성물 NH₂-R을 생성하며, 이의 양은 광도법(photometric method), 분광광도법(Spectrophotometric method), 또는 형광광도법 (fluorescencephotometric methods)으로 측정할 수 있다.

바람직한 정의는 다음과 같은 경우이다.

W : R₁이 탄소수 1 내지 6의 지방족 탄화수소 라디칼, 탄소수 6 내지 10의 방향족 탄화수소 라디칼, 탄소수 7 내지 10의 아르지방족 탄화수소 라디칼, 또는 탄소수 6 내지 10의 알크아릴그룹을 나타내는 R₁-CO-그룹, R₂가 탄소수 1 내지 6의 지방족 탄화수소 라디칼, 탄소수 7 내지 10의 아르지방족 탄화수소 라디칼, 알킬 1-6 설포닐 알킬 2-6그룹, 벤젠설포닐 그룹 또는 탄소수 7 내지 10의 알크아릴 설포닐그룹을 나타내는 R₂-O-CO-그룹 :

R : 니트로페닐, 나프틸, 니트로나프틸, 메톡시나프틸, 페닐, 메틸니트로페닐, 디니트로페닐, 퀴놀릴 또는 니트로퀴놀릴 그룹 또는 그 염. 특히 바람직한 것은 다음과 같은 경우이다.

R : 할로겐원자, 트리플루오로메틸그룹, 카복실그룹, 메톡시그룹, 설폰산그룹 또는 시아노그룹, 디메톡시카보닐페닐 그룹으로 치환될 수 있는 니트로페닐라디칼, 피리딘라디칼, 니트로벤조티아졸라디칼 또는 피라진, 트리아졸, 벤조피라졸, 크리센, 나프틸, 메톡시나프틸, 아줄렌 또는 아미노쿠마린라디칼(이들 라디칼은 치환 가능하다).

그런 화합물의 B-X결합이 검출하거나 측정하고자 하는 효소의 작용에 의해 끊어지면, 색원체성 아미노산, 유도체 H--X-NHR이 생성된다. 이 유도체로부터 발색단 또는 형광단인 NH₂-R을 유리시키려면, 결합 X-N이 끊어져야 하며, 이를 위해서는 아미노펩티다제 작용을 갖는 효소가 특히 적절하다. 분해속도가 가능한한 최고이며, 용액상태에서 안정성이 우수하며 가능하다면 동결 건조성인 효소는 진균인 트리티라키움 알붐 림버(Tritirachium album Limber)로부터 얻은 아미노펩티다제 K이다.

반응 연쇄과정은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

상기한 연쇄 반응은 동시에 단백질 분해효소 측정에서의 본 발명 화합물의 사용 원리를 나타낸다. 단백질 분해효소는 기질의 특정 결합부위를 끊으며, 그후에 아미노펩티다제가 발색단을 유리시키는데 이는 측정 가능하다.

본 발명은 또한, 일반식(I) 화합물의 가수분해 활성 효소 측정을 위한 사용에 관한 것이다. 이는 본 및 아미노펩티다제 작용이 있는 효소를, 측정하려는 효소 용액에 가하고, 일정 배양기간 후에, 일반식(I)화합물의 분해로부터 수득된 NH₂R을 측정하여, 가수분해 활성효소를 측정하는 방법에 관한 것이다. 발색단 또는 형광단 분해는 가수분해 활성효소 활성의 직접적인 척도이다. 아미노펩티다제 작용이 있는 효소는 이 과정에서 조효소로 작용한다. 동물 또는 인체 조직 또는 미생물에서 분리되었으며 아미노펩티다제 작용이있는 효소가 이경우에 특히 적절하다.

이런 효소의 예로는 로이신 아미노펩티다제, 아미노 펩티다제, 아미노펩티다제 M 또는 상기 언급한 트리티라키움 알붐림버로부터 수득한 효소를 들 수 있다. 본 발명 화합물은 다음 일반식(II)에 의해 더 상세히 특징지을 수 있다.

W-A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-A₆-B-X-NH-R (II)

이 일반식에서, A₂내지 A6 각각은 같거나 틀리며, 측쇄가 치환될 수 있는 α-아미노산 또는 α-이미노산 라디칼을 나타내거나 화학 결합을 나타낸다. 만일 아미노산이 키랄 아미노산이면, 그의 형태는 L-형 또는 D-형이다. 그러나, 아미노산 A₂내지 A₆는 단백질을 구성하는 아미노산에만 한정되지 않는다. β-아미노산뿐 아니라 α-아미노이소부티르산 (Aib) 피페콜린산, 아제티딘카복실산, OMe-티로신, 1-아미노-사이클로헥산-카복실산, 시스테산, 페닐글리신(Phg), r-벤즈이미다조일-아미노부티르산, 스피나신 같은 β-아미노산이 높은 효소 특이성을 위해 적절하다고 입증되었다.

아미노산 A₂내지 A₆이 OH, COOH, NH₂또는 SH 같은 다른 작용성 그룹을 부가적으로 가질때, 이들은 유리상태 또는 보호된 상태일 수 있으며, 보호된 아미노산의 예로는 보호된 알기닌, 히스티딘, 아스파라긴 또는 글루타민을 들 수 있다. 염기성 아미노산으로서 또 다른 절단부위를 제공하지 않도록 측쇄 아미노그룹은 반드시 아실화되어야 한다. 가능한 보호그룹은 펩타이드 화학에서 통상적인 라디칼이며(E. Wunsch in Houben-Weyl, Vol. xv 1/2), 예를들면 카복실 그룹에 대해선, 에스테르 또는 아마이드, 하이드록실 및 머캅토 그룹의 경우에는 알킬, 아릴 또는 아르알킬 그룹, 아민의 경우에는 단순 알카노일 또는 아로일 라디칼 카본산반에스테르, 톨루엔설포닐, 트리플루오로아세틸 등이다.

펩타이드 화학에서 보호그룹으로 불리우는 그룹은 펩타이드 결합에 거의 영향을 주지 않는 조건에서 제거될 수 있는 화학적 그룹이다. 그러나 본 발명에 따른 화합물로부터는 보호그룹을 반드시 제거할 필요가 없다. 예를들어, 본 발명에 따른 목적에 화합물을 사용할 수 있게 하기 위해 말단 N원자상의 보호그룹 W를 제거할 필요는 없다.

따라서 본 발명의 펩타이드 유도체에 존재하는 보호 그룹은, 나머지 분자를 손상시킴 없이 떼어낼 수 있는 조건을 반드시 만족시킬 필요는 없다.

본 발명에서 가능한 보호그룹은 따라서, 본 발명 화합물의 말단 아미노 그룹을 보호하거나, 아미노산라디칼이 함유하는 측쇄 그룹을 보호하는데 적절하며, P 및 X로 표시한 분자부위에 존재하여 이들 화합물의 합성도중의 바람직하지 못한 반응을 막을 수 있는 화학적 그룹이면, 이들이 분자를 손상함이 없이 본 발명 화합물로부터 제거될 수 없다하더라도 무방하다. 말단 N원자상의 보호그룹 W 또는 P 또는 X로 표기한 분자부위의 아미노산중 한 아미노산의 측쇄중의 보호그룹으로는 아실 또는 설포닐그룹, 바람직하게는 R₁-CO-그룹, 또는 R₂O-CO-그룹 및 유리 OH 그룹이 에스테르-아마이드, 우레탄 또는 우레탄-우레이드결합. 석시닐(Suc) 또는 말레일(Mal)에 의해 A₁과 연결된 단일 알킬화 폴리에틸렌 글리콜을 들수 있는데, 여기에서 R₁은 1 내지 3개의 불소, 염소, 브롬 또는 요드원자 또는 카복실 그룹으로 치환될 수 있는 탄소수 1 내지 6의 지방족 탄화수소 라디칼, 1 내지 3개의 할로겐 원자로 치환될 수 있는 탄소수 6 내지 10의 방향족탄화수소 라디칼, 탄소수 7 내지 10의 지방족 탄화수소 라디칼 또는 탄소수 6 내지 10의 알크아릴그룹이며, R₂는 탄소수 1 내지 6의 지방족 탄화수소 라디칼, 탄소수 7 내지 10의 아르지방족 탄화수소 라디칼 또는 알킬 1-6-설포닐알킬 2-6그룹 또는 벤젠설포닐 그룹 또는 탄소수 7 내지 10의 알크아릴 설포닐 그룹을 나타내며, 여기에는 포밀(For), 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 트리플루오로 아세틸(TFA), 벤질옥시카보닐(Z), 3-급-부톡시카보닐(BOC), 메톡시카보닐(MeOC), 에톡시카보닐(Etoc), 메틸설포닐에톡시카보닐(Msc), 톨루엔설포닐(Tos), 메실(Mes) 또는 피로글루타밀(pGlu)이 포함된다.

아미노산 A₂내지 A₆에 관해 앞에서 기술한 내용은 아미노산 A₁에도 적용된다.

그러나 W가 수소이면, A₁은 아미노펩티다제의 작용을 받지 않거나 최소한 쉽게 분해되지 않아야 한다.

이는 D-α-아미노산 또는 β-알라닌 같은 자연에 존재하는 β-아미노산, 또는 α-아미노카프로산, 피로글루탐산, 글리신 또는 세린 같은 다른 아미노산 A₂로서의 특히 프롤린, 피페콜린산 또는 D-아미노산에 적용된다.

B는 L-알기닌, L-리신, L-페닐알라닌, L-티로신 또는 L-호모알기닌이다. X는 단백질에 천연적으로 존재하며, 바람직하게는 L-아미노산에 측쇄가 소수성 측쇄로 치환될 수 있는 아미노산(예, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 로이신 및 메티오닌)의 하나 또는 두개의 라디칼, 및 3급 부틸-세린등의 천연 아미노산의 소수성 유도체를 의미한다.

많은 화합물이 발색단 H₂N-R 역활을 한다. 유일한 전제 조건은 유리 및 아실화 발색단(-X-NH-R로 결합된)이 측정 조건하에서 서로 현저하게 다른 형광 또는 흡수 스펙트라를 나타내야 하며, 아실화 발색단 존재하에 유리 발색단의 정량분석을 명확히 할 수 있어야 한다. 실제 사용되는 화합물은 문헌에 공지되어 있다.

가장 빈번히 사용되는 단순 4-니트로-아닐린 외에도 2-또는 3-카복시-4-니트로아닐린, 2-또는 3-할로게노-4-니트로아닐린, 2-메톡시-4-니트로-5-메틸아닐린, 나트륨-4-니트로 아닐린-2-설포네이트, 2-니트로-4-트리플루오로메틸-아닐린, 2-니트로-4-시아노니트로아닐린, 4-아미노 아조벤젠, 1-아미노나프탈렌-4-설폰산, 2-아미노벤즈이미다졸, 2-아미노피리미딘, 4-아미노피리딘, 1-아미노트리아진, 3-아미노인다졸, 5-니트로-2-아미노벤조티아졸, 메틸 3-아미노-이소프탈레이트, 아미노피렌 또는 아미노쿠마린 또는 그 유도체를 예로들 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 펩타이드 화학의 공지 방법으로 합성할 수 있다.

제조방법의 한 예는 다음 일반식(III)의 아미노산 유도체 또는 펩타이드 유도체와 다음 일반식(IV)의 펩타이드를 축합시키는 것이다.

W-A_(1-6)-OH (III)

H-B-X-NH-R (IV)

상기식에서, W 및 A₁내지 A₆, B, R 및 X는 상기한 바와 같으나, W는 수소가 아니며 아미노산 라디칼 측쇄의 아미노 및 카복실 그룹은 보호그룹으로 보호된다.

다른 측쇄그룹도 치환될 수 있다.

필요하면, 보호그룹을 후에 제거할 수 있다.

축합공정은 펩타이드 화학에 통상적인 방법으로 이루어질 수 있는데, 예를들면 아자이드법 또는 혼합 무수물법이 있다. 편리한 카보디이미드법이 바람직하게 사용되는데, 임의로는 chem. Ber. 103,788 (1970)에 기술된 1-하이드록시 벤조트리아졸 등과 같은 화합물을 가한다. 활성 에스테르와 아민성분을 반응시킬 수도 있다. 혼합무수물법에 적절한 용매의 예로는 테트라하이드로푸란을 들 수 있다.

디메틸포름아마이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸설폭사이드 또는 N-메틸피롤리돈은 나머지 방법에 사용하면 바람직하다.

상기에 기술한 가운데 특징적인 몇가지 색원체성 효소기질이 본 발명에 따른 가능한 화합물의 예로서 표 1에 나와있다. 모든 화합물은 원소분석 및 아미노산 분석으로 특징지어진다.

[표 1]

다수의 일반식(IV)의 화합물이 표 2에 나열되어 있다. 그들은 본 발명 기질의 합성에 적절한 출발물질이며, 절단점 및 색원체 모두를 함유한다.

[표 2]

표 3은 색원체 라디칼이 변형되었으며 W-A-B-X-NH는 그대로 유지된 된 발명에 따른 몇가지 화합물을 나타내고 있다.

본 발명에 따른 몇가지 화합물이 여러 단백질 가수분해 효소에 의해 분해되는 속도를 비교한 결과가 표 4이다.

수치는 효소에 의해 405mm에서 기질의 1.5몰 농도 용액의 흡광도 (OD)가 0.1단위(U) 증가하는데 소요되는 시간을 분으로 표시한다.

대부분의 경우 니트로 아닐리드 결합에 비해진 펩타이드 결합의 결합 에너지가 크므로 분해 속도가 감소된다. 특이성외에, 분해 속도 역시 X의 변화에 영향을 받을 수 있다.

분해속도가 더 쉽게조절되므로(X를 변화시키므로써), 효소 농도를 고농도로 사용할 수 있다. 따라서, 효소 측정에서 오차의 추가 원인인 반복 희석이 필요없다.

[표 3]

[표 4]

여러가지 기질의 단백질 가수분해 효소에 의한 분해속도 비교(405nm에서 흡광도(OD)의 0.1U 증가에 필요한 시간).

↓ =세린 프로테아제에 의해 기질이 끊어지는 부분

‥‥ =측정 불가능

표 5는 X의 변화에 의한 기질 특이성 변화의 몇가지 예이다. 그룹 X의 도입은 특이성에 영향을 미치는 새로운 가능성을 제공한다.

표 6은 문헌에 따른 기질 및 본 발명에 따른 기질이 Landabulu 및 Seegers, Can. J. Biochem. Physiol. 37,1361(1959)에 기술 된대로 트롬빈 및 아세틸화 트롬빈에 의해 분해되는 속도 계수를 비교한 결과이다.

아세틸화 트롬빈은 응고활성을 상실하나, 아세틸화 되기전과 비슷한 에스테라제 활성을 나타낸다. 문헌에 기술된 기질의 활성화 산아마이드 결합에 비교해서, 본 발명 기질의 진펩타이드 결합의 분해는, 단백질분해활성은 소실하나 에스테르 분해 활성은 그대로 가지는 부분적으로 변형된 프로테아제와 천연 프로테아제 사이의 구별을 좀더 용이하게 하며 특이성을 크게 증가시킨다.

이들 기질을 사용한 프로테아제 측정 결과의 오역 위험성은 Gaffney 등이 Thromb. Res. 10,549. (1977)에서 이제까지의 색원체성 기질에 대해 기술한 경우보다 현저히 감소된다.

[표 5]

일반식(I)의 X위치 아미노산치환에 의한 프로테아제 기질의 특이성변화(405nm에서의 흡광도(CD) 0.1u증가에 필요한 시간)

↓ =세린 프로테아제에 의해 기질이 끊어지는 부분

‥‥ =측정 불가능.

다음 실시예는 신규 화합물의 제조 및 그의 단백질 가수분해 효소 측정을 위한 사용을 설명한다.

[실시예 1]

Z-VA1-Arg-Val-pNa

1.1 Z-Val-pNa

25.1g(0.1몰)의 Z-Val-OH, 13.8g(0.1몰)의 P-니트로아닐린 및 13.6g(0.2몰)의 이미다졸을 120ml의

[표 6]

아세틸화를 전후해서, 트롬빈의 색원체성 기질이 분해되는 속도계수

↓ =색원체 기질의 세린 프로테아제/에스테라제에 의해 끊어지는 부위.

테트라하이드로푸란에 용해하고, 용액을 -20℃로 냉각하고 9.3ml((0.1몰)의 포스포러스 옥시트리 클로라이드를 가한다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 교반하고 빙수에 붓고, 탄산나트륨으로 알칼리성화한다. 에틸 아세테이트로 수회에 걸쳐 수용액을 추출하고 유기상을 나트륨설페이트 상에서 건조하고 증발시킨다. 활성탄을 사용하여 잔사를 열(hot) 알콜로부터 재결정한다.

수율 : 18.9g(51%)

융점 : 192 내지 194; (α)_D ²²: -16.4° (C=1, 메탄올)

원소분석 : (371.38) C₁₉H₂₁N₃O₅

C6l.3(61.44) H5.55(5.70) N11.2(11.31)

1.2 H-Val-pNa-HBr

11.8g(32밀리몰)의 Z-Val-pNa를 150ml의 빙초산에 현탁시키고 37.5ml의 40% 농도 HBr/빙초산을 가하고 용액을 실온에서 1시간 교반한다.

반응 배치를 1.5ℓ의 에테르에 붓고, 수득 침전을 여과하고, 건조에테르로 철저하게 세척하고 진공에서 KOH 상에서 건조한다. 수율 : 7.7g, 융점 : 130℃(분해) : (α)_D ²²: +52.7°(C=1, 메탄올), 원소분석 : (318.18) C₁₁H₁₆BrN₃O₃, C4l.4(41.62) H5.0(5.06) Br 24.9(25.11) N13.1(13.2).

1.3 H-Arg-Val-pNa. 2HCl

7.3g(23밀리몰)의 H-Val- pNa. HBr, 7.1g(23밀리몰)의 BOC-Arg-OH · HCl 및 3.1g(23밀리몰)의 HOBt를 70ml의 디메틸포름아마이드에 용해하고, 0℃로 냉각하고, 4.7g(23밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드를 가한다. 혼합물을 8.7ml의 N-에틸모르폴린으로 중화하고 실온에서 16시간 교반한다. 반응 혼합물로부터 침전된 디사이클로헥실 우레아를 제거하고 투명한 용액을 증발시킨다. 잔사를 NaHCO₃및 N-부탄올 가운데 분배시키고, 부탄올상을 증발건고시킨다. 잔사를 CHCl₃/CH₃OH/H₂O/HCOOH(400/100/10/3 : V/V)를 유동상으로 사용하여 실리카겔상에서 크로마토그래프한다. 순수한 디펩타이드 분획을 모아 증발 건고시키고 잔사를 에테르로 연마하고, 여과하고 진공에서 P₂O₅상에서 건조한다. 50% 농도의 수성-메킨올 용액을 이온 교환기 암베르리트 IRA-410(Cl-형)으로 처리하여 하이드로클로라이드로 전환시킨다. 수율 : 9.3g(

76%).

수득물을 빙초산중 100ml의 1.2N HCl에 층해하고, 용액을 실온에서 1시간 교반한다. 용매를 증발시킨후 잔사를 에테르로 연마하고, 혼합물을 여과하고, 생성물상을 에테르로 세척하고 진공중 KOH로 건조한다.

수율 : 7.8g(95.5%)

융점 : >91℃(분해) : (α)_D ²³: +6.8°(C=1, 메탄올)

1.4 Z-Vol-Arg-Vol-pNa. HCl

7.8g(16.7밀리몰)의 H-Arg-Val-pNa. 2HCl, 8.6g(20밀리몰)의 Z-Val-OTc 및 2.7g(20밀리몰)와 HOBt를 75ml의 디메틸포름 아마이드에 용해하고, 6.5ml의 N-에틸모르폴린을 가한다. 16시간동안 반응시킨후, 용매를 증발시키고, 잔류잔사를 석유 에테르로 수회 연마하고, 이후에 석유에테르 추출물을 버린다. 생성물을 NaHCO₃용액 및 n-부탄올 가운데 분배시키고, 부탄올상을 증발시키고, 수득물을 CHCl₃/CH₃OH/H₂O/HCOOH(400/100/10/1 : V/V)를 유동상으로 사용하여 실리카겔상에서 크로마토그래프한다. 순수한 트리펩타이드 분획을 모아 증발건고시키고 잔사를 에테르로 연마하고, 여과하고, P₂O₅상에서 건조한다.

수율 : 7.0g(63%)

융점 : 152℃(분해) ; (α)_D ²²; -51.5°(C=1, 메탄올).

원소분석 : (663.17) C₃₀H₄₃ClN₈O₇, C54.0(54.33) H6.5(6.54) N16.9(16.89) Cl5.2(5.38)

본 화합물은 인체 혈장의 칼리크레인 측정기질로 적절하다.

[실시예 2]

BOC-Gly-Pro-Glu(O-But) -Gly-Arg-Phe-pNa

2.1 Z-Phe-pNa

29.9g(0.1몰)의 Z-Phe-OH, 13.8g(0.1몰)의 니트로아닐린 및 13.6g(0.2몰)의 이미다졸을 150ml의 테트라하이드로푸란에 용해하고 1.1과 비슷한 방법으로 POCl₃와 반응시킨다. 수율 29.6g (70.5%)

융점 : 132℃(분해) : (α)_D ²²: +55.6°(C=1, 메탄올/디메틸포름아마이드 1 : 1)

2.2 H-Phe-pNa. HBr

15g(35.8밀리몰)의 Z-Phe-pNa를 100ml의 빙초산에 현탁시키고 빙초산중 80ml의 36% HBr을 가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 교반한다. 이어서 1.5ℓ의 건조 에테르에 붓고, 침전을 여과하고 에테르로 세척하고 진공중 KOH상에서 건조한다. 수율 12.3g(13.8%).

융점 : 126 내지 128℃ ; (α)_D ²²: +77.7°(C=1, 디메틸포름아마이드)

2.3 H-Arg-Phe-pNa. 2HBr.

18.3g(50밀리몰)의 H-Phe-pNa. Br, 15.5g(50밀리몰)의 BOC-Arg-OH. HCl 및 6.75g(50밀리몰)의 HOBt를 150ml의 디메틸포름아마이드에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하고 10.3g(50밀리몰)의 디사이클로헥실카보디마이드 및 13.9ml의 N-에틸모르폴린을 가한다. 16시간 반응시킨후, 석출된 침전을 여과하고, 여액을 증발건고시킨다. 잔사를 NOHCO₃및 에틸아세테이트 가운데 분배하고, 에틸 아세테이트 추출물을증발시키고, 잔사를 테트라하이드로푸란에 용해하고 생성물을 에테르로 침전시킨다.

수율 : 27.7g(95%)

물질을 이온교환기 암베르리트 IRA 410(Cl^-형)으로 하이드로클로라이드로 전환시킨다. (α)_D ²²: +10.8° (C= 1, 메탄올).

13.5g(23.3밀리몰)의 BOC-Arg-Phe-pNa · HCl을 실온에서 빙초산중 100ml의 1N염산중에서 1시간 교반하고, 혼합물을 농축하고, 에테르로 침전시키고 여과한다. 고체침전을 소량의 메탄올에 용해하고 용액을 5g의 피리딘 하이드로브로마이드와 함께 교반한다.

에테르를 가한후, 생성된 침전을 여과하여, 에테르로 철저하게 세척하고 진공중 KOH 상에서 건조한다.

수율 : 12.4g(=88%)

융점 : 99℃(분해) ; (α)_D ²²: +59.4° (C=1, 메탄올).

2.4 BOC-Gly-Pro-OH

27.6g(78몰)의 BOC--Gly-- OTcp 및 8.95g(78밀리몰)의 프롤린을 200ml의 디메틸포름 아미드에 용해한다. 10ml(78밀리몰)의 N-메틸모르폴린을 가하고 혼합물을 실온에서 철야유지한다. 용매를 진공증류하고 잔사를 100ml의 n-부탄올 및 50ml의 10% KHSO₄/K₂SO₄(1 : 1) 가운데 분배하고, 수상을 매회 50ml의 n-부탄올로 2회 추출하고, 부탄올상을 합해 20ml의 10% NaOH용액으로 세척하고 부탄올을 진공 증류한다. 잔사를 50ml의 에틸아세테이트에 용해한다. 소량의 염을 여과하고, 에틸 아세테이트 용액을 반으로 농축하고 100ml의 석유에테르로 침전시켜 17.5g의(82.5%)의 크로마토그래프적으로 순수한 펩타이드를 수득한다.

2.5 Z-Glu (O-But) -Gly-OMe

33.8g(0.1몰)의 Z-Glu(O-But)-OH, 12.6g(0.1몰)의 H-Gly-OMe. HCl, 13.5(0.1몰)의 1-하이드록시벤조트리아졸 및 26ml (0.2몰)의 N-에틸모르폴린을 300ml의 디메틸포름아마이드에 용해한다. 22g(106밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드를 가하고, 혼합물을 실온에서 철야교반한다.

디사이클로헥실 우레아를 여과한후, 용매를 진공증류한다, 잔사를 100ml의 에틸 아세테이트에 용해하고 용액을 여과한다. 여액을 포화 비카보네이트 용액 및 100% 시트르산으로 진탕 추출하고, 에틸 아세테이트 용액을 소량의물로 세척하고 나트륨 설페이트상에서 건조하고, 용매를 진공증류한다. 서서히, 완전히 결정화하는 잔사가 남는다. 크로마토그래프적으로 거의 순수이 화합물의 수율 : 37.1g(91%).

26 H-Glu (O-But)-Gly-OMe. TosOH

13.2g의 Z-화합물을 100ml 메탄올중 pd 상에서 촉매적으로 수소화하고 1N메탄올성 TosOH로 여과한다. 30분후, 반응이 끝난다. 촉매를 여과하고 메탄올을 진공 증류한다. 잔사를 오일펌프를 사용하여 건조한다.

수율 : 13.0g의 오일(91.5%) : 크로마토그래프적으로 거의 순수하다.

2.7 Boc-Gly-Pro-Glu (O- But) -Gly-OMe

2.7g(10밀리몰)의 Boc -Gly -Pro-OH 및 4.5g (10밀리몰)의 H-Glu(O-But)-Gly-OMe-TosOH를 20ml의 디메틸포름아마이드에 용해한다. 1.28ml(10밀리몰)의 N-에틸포르폴린 및 2.2g(10.6밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드를 가하고, 혼합물을 실온에 철야 정치한다. 디사이클로헥실우레아를 여과하고, 용매를 진공에서 증류하고 잔사를 에틸 아세테이트에 녹이고 용액을 시트르산, 비카보네이트 용액 및 물로 상술한 바와같이 세척하고, 나트륨 설페이트상에서 건조하고 증발건고한다. 잔사를 에테르에 용해하고, 석유 에테르로 침전시켜 그 침전을 여과한다. 수율 : 2.9g(55%)의 크로마토그래프적으로 순수한 화합물.

2.8 Boc-Gly-Pro-Glu(O-But)-Gly-OH

2.2g(4.2밀리몰)의 메틸에스테르를, 15ml의 디옥산, 5ml의 메탄올 및 7ml의 물의 혼합물에 용해한다.

pH12.5에서 자동 적정기를 사용하여 에스테르를 비누화한다. 4.6ml의 1N NaOH가 소비된 후, 반응은 끝난다. 혼합물을 1N HCl로 중화하고 용매를 증류하고, 잔사를 물로 희석하고 나머지 1N HCl을 당량점까지 가한다. 혼탁한 수용액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 합한 에틸 아세테이트 용액을 소량의 물로 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조하고 진공에서 농축 건고시킨다. 생성물을 에테르/석유 에테르로부터 침전시킨다. 수율 : 1.88g(89%)의 크로마토그래프적으로 순수한 화합물.

(α)_D ²²; -65.2°(C=1, 메탄올), C.H.N : 보정.

2.9 Boc-Gly-Pro-Glu (O-But)-Gly-Arg-Phe-pNa·HBr

514mg(1밀리몰)의 Boc-Gly-Pro-Glu(O-But)-Gly-OH, 603.5mg(1밀리몰)의 H-Arg-Phe-PNa·2HBr 및 135mg(1밀리몰)의 HOBt를 2ml의 디메틸포름아마이드에 0℃에서 용해하고 206mg(1밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드 및 0.38ml의 N-에틸모르폴린을 가한다. 용액을 실온에서 16시간 교반하고, 석출된 침전을 여과하고 여액을 증발 건고시키고, 잔사를 에틸 아세테이트 및 NaHCO₃용액가운데 분배한다. 에틸 아세테이트상을 Na₂SO₄상에서 건조하고, 증발시키고, 잔사를 소량의 메탄올에 용해하고 에테르로 생성물을 침전시킨다. 최종적으로 CHC₃/CH₃OH/H₂O/CH₃COOH(200/100/15/101 : V/V)를 유동상으로 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래프한다. 순수한 헥사펩타이드-아닐리드 분홍을 모아 증발시키고, 잔사를 소량의 메탄올에 용해하고, 50mg의 피리딘 하이드로브로마이드를 이 용액에 가하고, 에테르를 격렬하게 교반한 용액에 적가하여 생성물을 침전시키고 원심 분리한다.

수율 : 146mg ; (α)_D ²²: -22.7° (C=1, 메탄올). 아미노산조성 : Glu 0.93 ; Pro 0.8; Gly 1.95 : Phe 0.96; Arg 1.0. 화합물은 인체 혈장의 칼리크레인 측정 기질로 적절하다.

[실시예 3]

Meoc -Ile-Glu - (O-But) -Gly-Arg-Phe-pNa

3.1 Meoc-Ile-OH

26.2g(0.2몰)의 이소로이신을 100ml의 2N NaOH 및 80ml의 물에 용해한다. 진동 혼합기로 혼합하며 17ml(0.22몰)의 메틸클로로포르메이트 및 116ml의 2N NaOH를 0℃에서 동시 적가한다. 적가한지 1시간후, 에테르로 혼합물을 추출하고 농염산으로 수용액의 pH를 2로하고 에테르로 재추출한다. 소량의 1N HCl 및 물로 에테르 용액을 세척하고 나트륨 설페이트 상에서 건조하고 증발 건조시킨다.

잔사를 소량의 에테르에 녹이고 석유에테르로 침전시켜 31.2g의 Meoc-Ile-OH(82%)를 수득한다. 융점 : 73℃ ; (α)_D ²²: -3.0° (C=1, 메탄올).

3.2 Meoc-Ile-Glu (O-But) -Gly-OMe

1.89g (10밀리몰)의 Meoc-Ile-OH 및 4.5g(10밀리몰)의 H-Glu (O-But) -Gly-OMe· ToeOH를 20ml의 디메틸포름아마이드에 용해한다. 1.28ml(10밀리몰)의 N-에틸모르폴린 및 2.2g(10.6밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드를 가하고 혼합물을 철야 교반한다. 여과한후 용매를 진공증류하고, 잔사를 에틸아세테이트에 녹이고 에틸아세테이트 용액을 시트르산, 나트륨 비카보네이트 용액 및 물로 상기한 바와같이 세척하고, 나트륨 설페이트상에서 건조하고 증발시킨다. 잔사를 소량의 빙냉한 에틸 아세테이트 및 에테르로 연마한다. 수율 : 3.15g(70.8%), 융점 : 155 내지 156℃, (α)_D ²²; -42.8° (C=1, 메탄올)C.H.N :보정.

3.3 Meoc-Ile-Glu (O-But) -Gly-OH

30ml의 디옥산/메탄올/물(30 : 20 : 5) 중 2.9g(5.9밀리몰)의 상기 에스테르를 6.9ml의 1N NaOH로 pH로 12.5로 비누화한다(자동적정기 사용). 1.8ml의 lN HCl로 혼합물의 pH를 중성으로 맞추고 진공에서 농축하고 5.1ml의 1N HCl을 잔사에 가하고 에틸 아세테이트로 혼합물을 추출한다. 소량의 물로 에틸 아세테이트용액을 세척하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조하고 농축한다. 잔류오일은 에테르에 의해 고화한다. 수율 : 1.95g(76%), 융점 : 110℃ ; (α)_D ²²: -44.7° (C=1, 메탄올) C.H.N ;보정.

3.4 Meoc-Ile-Glu (O-But) -Gly-Arg-Phe-pNa. HCl

648mg(1.5밀리몰)의 Meoc-Ile-Glu (O-But) -Gly-OH, 905mg (1.5밀리몰)의 H-Arg-Phe-pNa. 2HBr 및 205mg(1.5밀리몰)의 HOBt를 4.5ml의 디메틸포름아마이드에 용해하고 용액을 0℃로 냉각한다. 309mg(1.5밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드 및 0.57ml의 N-에틸모르폴린을 이 혼합물에 가한다. 16시간 반응시킨후 석출된 침전을 여과하고, 용매를 증발시키고, 잔류 오일을 에테르로 연마하면, 고체가 생성된다. 이를 여과하여 에테르로 철저하게 세척하고, LH 20/메탄올을 사용하여 2회 크로마토그래프하여 정제한다. 수율 : 575mg (α)_D ²²; -11.2°(C=1, 메탄올) 본 화합물은 응고인자 X의 측정기질로 적절하다.

[실시예 4]

H-D-Phe-Pro-Arg-Phe-pNa

4.1 Boc-D-Phe-Bzl

13.43g(55.5밀리몰)의 H-Pro-OBzl. HCl 및 7.5g(55.5밀리몰)의 HOBt를 70ml의 디메틸포름아마이드에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하고 7.1ml의 N-에틸모르폴린 및 12.1g(58.7밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드를 가한다. 반응혼합물을 0℃에서 3시간, 실온에서 4시간 교반하고, 침전을 여과하고 여액을 증발 건고시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트/에테르(2:1;V/V)에 녹이고 각 3부씩의 시트르산용액→HaH-CO₃용액 및 NaCl 용액으로 진탕하여 추출하고, 유기상을 Na₂SO₄상에서 건조하고 농축하고, 잔사를 CHCl₃/CH₃OH(50/ℓ, V/V)를 유동상으로 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래프하여 분리한다.

순수한 디펩타이드 분획을 모아 증발시킨다. 박층 크로마토그래프 분석결과 순수한 유상잔사를 수득한다. 수율 : 19g(

75%)

4.2 Boc-D-Phe-Pro-OH

19g(41.9밀리몰)의 Boc-D-Phe-Pro-OBzl을 400ml의 메탄올에 용해하고 pd/활성탄 존재하에 4시간 동안 수소화한다. 촉매를 규조토상에서 여과하여 분리하고 여액을 농축하고, 석유에테르로 생성물을 침전시킨다. 수율 : 14.2g(93%), 융점 : 168 내지 171℃ ; (α)_D ²²: -90.8°(C=1, 메탄올).

4.3 H-D-Phe-Pro-Arg-Phe-pNa·CF₃COOH

370.4mg(1.02밀리몰)의 Boc-D-Phe-Pro-OH, 615.4mg(1.02밀리몰)의 H-Arg-Phe-pNa. HBr 및 137.9mg(1.02밀리몰)의 HOBt를 3ml의 디메틸포름아마이드에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하고 230mg(1.12밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드를 가한다. 0.13ml의 N-에틸모르폴린을 가한후, 혼합물을 0℃에서 1시간, 실온에서 8시간 교반하고, 침전을 여과하고 여액을 증발건고시킨다. 잔사를 NaHCO₃용액 및 n-부탄올 가운데 분배하고, 부탄올상을 K₂CO₃로 건조하고, 농축하고, 에테르로 생성물을 침전시킨다. 수율 : 504mg(

54%) ; (α)_D ²²: -32.3°(C=1, 메탄올), 융점 : 160℃ 450mg(0.44밀리몰)의 Boc-D-Phe-Pro-Arg-Phe-pNa. HBr을 4ml의 트리플루오로아세트산에, 0.1ml의 아니솔을 가하며, 용해하고, 용액을 실온에서 45분 교반한다. 에테르로 생성물을 침전시키고, 원심 분리하고 에테르로 연마하고 수회원심 분리한다. 건조물을 NaHCO₃용액으르 연마하고, 혼합물을 n-부탄올로 추출하고 유기상을 K₂CO₃로 건조하고, 여과하고, 여액을 증발 건고시킨다. 고체잔사를 에테르로 연마하고 원심분리한다. 수율 : 320mg, 융점 : 156 내지 158℃

본 화합물은 트롬빈 및 트롬빈 억제제 측정기질로 적절하다.

[실시예 5]

Boc-D-Val-Leu-Lys-Leu-pNa

5.1 Z-Lys(Msc) -Leu-pNa

4g(10밀리몰)의 Z-Lys(Msc)-OH, 3.3g(10밀리몰)의 H-Leu-pNa. HBr 및 1.35g(10밀리몰)의 HOBt를 45ml의 디메틸포름아마이드에 0℃에서 용해하고, 2.06g(10밀리몰)의 디사클을로헥실카보디이마이드 및 2.5ml의 N-에틸모르폴린이 가한다. 20시간동안 실온에서 반응시킨 후, 석출된 침전을 여과하고 여액을 농축하고, 잔류 오일을 에틸 아세테이트에 녹이고, 혼합물을 3부의 인산염 완충액(pH7), 2부의 KHSO₄용액 및 2부의 물로 진탕 추출한다. 에틸 아세테이트상을 Na₂SO₄상에서 건조하고 증발시키고 잔사를 에테르로 연마하고 여과하여, 에틸 아세테이트로부터 재결정한다. 수율 : 4.85g(76%), 융점 : 159 내지 161℃(분해) : (α)_D ²²: 7.4°(C=1, 디메틸포름아마이드), C.H.N.S :보정.

5.2 H-Lys (Msc) -Leu-pNa. HBr

4g의(6.2밀리몰)의 Z-Lys(Msc)-Leu-pNa를 20ml의 에틸 아세테이트 및 12ml의 빙초산에 용해하고 용액을 8ml의 빙초산중 36% HBr과 함께 0℃에서 1시간, 실온에서 1시간 교반한다.

혼합물을 농축하고, 잔사를 에테르로 온침시키고 고체를 여과하고 에테르로 철저하게 세척하고 진공중 KOH상에서 건조한다. 수율 : 2.5g(67%), 융점 : 225 내지 228℃(α)_D ²²: +14.6°(C=1, 메탄올).

5.3 Boc-D-Val-Leu-OH

10.86g(50밀리몰)의 BOC-D-Val-OH, 9.08g(50밀리몰)의 H-Leu-OMe. HCl 및 6.75g(50밀리몰)의 HOBt를 200ml의 디메틸포름아마이드에 용해한다. 용액을 0℃로 냉각하고, 10.3g(50밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드 및 12.5ml의 N-에틸모르폴린을 가한다. 용액을 실온에서 20시간 교반하고, 침전을 여과하고, 여액을 증발 건고시킨다. 잔류 오일을 에테르 및 석유에테르로 처리하여 결정화한다. 수율 : 11.5g (66.7%), 융점 : 86 내지 88℃ (α)_D ²²: -15.4°(C=1, 디메틸포름아마이드).

11.4g(33밀리몰)의 Boc-D-Vol-Leu-OMe를 80ml의 디옥산 및 10ml의 물에 용해하고, 계산량의 1N NaOH를 소량씩 가하고 혼합물을 실온에서 2시간 교반한다. KHSO₄로 산성화하고, 300ml의 에틸 아세테이트를 가해, 진탕 추출한다.

에틸 아세테이트상을 Na₂SO₄상에서 건조하고, 농축하고, 석유 에테르를 가하여 생성물을 결정화한다. 수율 : 10.3(

94%), 융점 : 144 내지 146℃ ; (α)_D ²²: -9.8° (C=1, 디메틸포름아마이드).

5.4 Boc-D-Val-Leu -Lys (Msc) -Leu -pNa

0.68g(3.3밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드 및 0.8ml의 N-에틸모르폴린을 10ml의 디메틸포름아마이드중 1.93g(3.3밀리몰)의 H-Lys(Msc) -Leu-pNa. HBr, 1.06g(3.3밀리몰)의 Boc-D-Val-Leu-OH 및 0.45g(3.3밀리몰)의 HOBt에 0℃에서 가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 교반한다. 디사이클로헥실우레아를 여과한 후, 여액을 증발시키고, 잔사를 에틸아세테이트/n-부탄올(1 : 1, V/V)에 녹이고, pH7 완충액물, KHSO₄용액 및 물로 계속해 진탕추출하고, Na₂SO₄상에서 건조한다. 용매를 증발시키고 잔사를 에테르로 연마하고, 여과하고, 에테르로 세척하고, 진공중 P₂O₅상에서 건조한다. 수율 : 2.2g(

79%), 융점 : 188 내지 190℃(분해)·· (α)_D ²²: -7.2°(C=1, 디메틸포름아마이드).

5.5 Boc-D-Val-Leu-Lys- Leu-pNa. HCl

1.6g(1.9밀리몰)의 Boc-D-Val-Leu-Lys(Mse)-Leu-pNa를 4.0ml의 메탄올에 용해하고, 5분후 혼합물을 동량의 염산으로 중화한다.

용액을 증발 건고시키고, 메탄올로 잔사를 추출하고 메탄올 추출물을, 유동상으로 메탄올을 사용하여 LH 20상에서 크로마토그래프한다. 순수한 테트라펩타이드 분획을 모아 증발시키고 잔사를 에테르로 연마하고 여과한다. 수율 : 880mg(60%), 융점 : 210 내지 212℃(분해) : (α)_D ²²: -35.9°(C= 1, 메탄올).

Val :0.95; Leu : 2.0: Lys:0.95

본 화합물은 플라스민 또는 플라스민 억제제 측정기질로 적절하다.

[실시예 6]

Z-Ser-Arg-Leu-Phe-pNa

6.1 Z-Ser (O-But) -Arg-Leu-Phe-pNa. HBr

1.02g(1.8밀리몰)의 Z-Ser(O-But) -Arg-Leu-OH (Chem-Ber 107,215-231 (1974)의 방법에 따라 제조). 660mg(1.8밀리몰)의 H-Phe-pNa. HBr 및 243mg(1.8밀리몰)의 HOBt를 10ml의 디메틸포름아마이드에 0℃에서 용해하고, 370mg(1.8밀리몰)의 디사이클로헥실카보디이마이드 및 0.25ml의 N-에틸모르폴린을 용액에 가하고 반응 혼합물을 실온에서 16시간 교반한다. 석출된 침전을 분리하고 여액을 증발 건고시키고, 잔사를 소량의 메탄올에 녹이고 생성물을 에테르로 침전시킨다. 고체를 메탄올에 재용해하고 NaHCO₃용액으로 재침전시킨다. 최종적으로 침전을 메탄올에 용해하고 용액을 LH 20칼럼상에서 메탄올을 유동상으로 하여 크로마토그래프 한다. 정제된 테트라펩타이드-아닐라이드 분획을 모은다. 수율 : 868mg(53%) :(α)_D ²²-26.2°(C=1, 메탄올).

6.2 Z-Ser-Arg-Leu-Phe-pNa. HCl

100mg(0.11밀리몰)의 Z-Ser(O-But)-Arg-Leu-Phe-pNa·HBr을 빙초산중 5ml의 1N HCl에 용해하고, 용액을 실온에서 1시간 교반하고, 농축하고 에테르로 침전시킨다. 재용해한후 메탄올/에테르로부터 재침전시킨후, KOH 상에서 진공 건조시켜 72mg의 테트라펩타이드-아닐라이드를 수득한다.

(α)_D ²²: -21.6° (C=1, 메탄올) Ser : 0.88, Leu : 1.0, Phe : 0.95, Arg : 0.94

본 화합물은 응고인자 X의 측정 기질로 적절하다.

[실시예 7]

혈장 칼리크레인 측정

프리칼리크레인을 칼리크레인으로 활성화하는 응고인자 XII(Hageman 인자)의 체계적 활성화에 의해 혈장내 프리칼리크레인을 측정한다.

기질로는 Boc-Gly-Pro-Leu-Gly-Arg-Leu--pNa를 사용할 수 있으며, 칼리크레인의 효소적 측정을 위해 아미노펩티다제를 사용한다.

혈장 프리칼리크레인 측정의 시험배치 : 20㎕의 혈장, 700㎕의 완충액. 100㎕의 인자 XII활성화제^*, 37℃에서 60초 배양, 20㎕의 아미노펩티다제 및 200㎕의 기질(1.5밀리몰/ℓ) 결과 : ΔOD/분×5306.12=밀리-단위/혈장 ml=단위/혈장 ℓ

*PTT-시약, 투명, Messrs·Behring Werke AG 시판

[실시예 8]

혈장 프로트롬빈의 측정

혈장내 프로트롬빈양은, 조직 트롬보플라스틴(Thromborel^(R)Behring Werke)의 체계적 활성화에 의해 측정한다.

응고인자VII, X 및 V는 생리학적 조건하의 활성화와 유사하게 활성화 과정에 관여한다. 바람직한 근원의 프로트롬빈 (쿠마린유도프로트롬빈포함)은 에카린 (ecarin) (Eschiscarinatus Snake venom)으로 활성화된다는 문헌의 기술 내용과 비교할때, 이 경우의 시스템은 쿠마린 유도체 처리(경구 항응고제 요법)에 의해 생성된 변형 프로트롬빈을 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 기질의 특이성 때문에, 예를들어 FXa 등의 효소인자들은 측정을 방해하지 않는다. 사용할 수 있는 기질의 예 : H-D-Phe-Pre-Pro-Arg-Leu-pNa 또는 Meoc-D-Phe-Pro-Arg-Leu-pNa.

혈장프로트롬빈의 측정을 위한 시험배치 : 10㎕의 혈장, 200㎕의 조직 트롬보플라스틴, 37℃에서 3분 배양, 700㎕의 pH8.4 완충액 20㎕의 아미노펩티다제 및 150㎕의 기질(예(B) 3밀리몰/ℓ 결과 : ΔOD/분×5661.2=밀리-단위/혈장 ml=단위/혈장 ℓ.

Claims (1)

1. 다음 일반식(III)의 화합물을 다음 일반식(IV)의 펩타이드와 축합시키는 것을 특징으로하여 다음 일반식(II)의 화합물을 제조하는 방법.

   W-A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-A₆-B-X-NH-R (II)

   W′-A_(1-6)-OH (III)

   H-B-X-NH-R (IV)

   상기식에서 W는 수소원자, 아실그룹 또는 벤젠-또는 톨루엔-설포닐 그룹을 나타내며, W′는 아실그룹 또는 벤젠-또는 톨루엔-설포닐 그룹을 나타내고, A₁내지 A₆는 측쇄가 치환될 수 있는, 같거나 다른α-아미노산 또는α-이미노산 라디칼, 또는 화학적 본드를 나타내며, B는 알기닌, 리신, 페닐알라닌, 티로신 또는 호모알기닌을 나타내고, X는 단백질을 구성하며, 측쇄 그룹이 치환될 수 있는L-아미노산의 하나 또는 두개의 라디칼을 나타내며, 단, 일반식(III) 및 (IV)에서 아미노산 라디칼의 측쇄에 존재하는 아미노 및 카복실 그룹은 보호그룹으로 치환되며, R은 임의 치환된 방향족 탄화수소 라디칼을 나타내고, X-NH-R은 발색성 또는 형광성 그룹을 나타낸다.