JPH0738799B2

JPH0738799B2 - 新規な酵素活性測定用基質

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Publication number: JPH0738799B2
Application number: JP17378888A
Authority: JP
Inventors: 勝昌黒岩; 秀一中津山; 勝博片山; 光二遠藤; 健長澤
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1995-05-01
Anticipated expiration: 2010-05-01
Also published as: JPH0223889A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、トリプシン、α_２−マクログロブリン−トリ
プシン複合体（以下α₂M−Tryと略す）などの酵素活性
を測定するのに有用な新規酵素活性測定用基質に関す
る。本発明の基質は、従来、報告されている基質に比し
て、極めて選択性、反応性に優れ、例えば、トリプシン
が形成、阻害又は消費される反応の研究、又はそれ等に
関与する因子の測定に利用できるとともに医療分野にお
いては、膵炎の診断に有用である。

従来の技術トリプシンなどの酵素活性を測定する方法として、酵素
と反応する基質を利用して酵素を測定する方法がある。

このような方法に用いる酵素活性測定用基質として、こ
れまで多くの基質が開発されている。例えばトリプシン
活性測定用基質としては、古くはゼラチン、ヘモグロビ
ン等の蛋白質が用いられていたが、膵液や十二脂腸液で
は他の蛋白質分解酵素、例えばキモトリプシン、エラス
ターゼ等が共存するため、この基質を用いて膵液や十二
脂腸液中のトリプシン活性を測定する方法は適当でな
い。

トリプシンが蛋白質分解作用の他にアミダーゼ、エステ
ラーゼ作用を有していることが、Bergmann等［J.Biol.C
hem.,130、81〜86（1939）］によつて報告されて以来、
多くの合成基質（例えばBz−Arg−NH₂、Tos−Arg−OM
e、Bz−D,L−Arg−pNA、Tos−Arg−pNA等）が開発され
てきたが、これらの多くの合成基質は、血清や腹水など
の検体中のセリンプロテイアーゼ、例えば、トロンビ
ン、Factorxa、補体、カリクレインなどの酵素活性の類
似する物質との交叉反応をおこし、また目的とするトリ
プシン自体との反応性も充分でなく測定に時間を要し、
再現性などにも問題があり、実用には耐えかねるもので
あつた。

近年、トリプシン用基質としてＺ−Val−Gly−Arg−pNA
（CHR−TRY、Pentapharm社、United States Patent N
o.4278762、patentd on Jul.14、1981）、Bz−Ile−Glu
（γ−OR）−Gly−Arg−pNA−HCl（Ｓ−2222、Kabi社、
J.Gastroent.、５、533（1970）Bergstrom,K）などのペ
プチド型のアルギニルアニリド誘導体が開発されたが、
選択性、反応性、溶解性等に問題があり、また高価格で
あるなどまだ充分とは言えない。

酵素活性測定用基質は、酵素に対する高感度及び特異
性、水あるいは緩衝液に対する良好な溶解性、及び分解
物の易検出性の４点を満足することが肝要であるが、以
上述べてきたようにこれらを満たすような例えばトリプ
シンなどの酵素活性測定用基質の開発は、まだ十分な状
態とは言えない。

発明が解決しようとする課題前記の点から既に明らかなとおり、トリプシン、α₂M−
Tryなどの酵素活性測定に使用することのできる基質は
膵炎などの診断に極めて有用であり、その必要性は依然
として存在する。その基質は前記の問題点を解決するも
のであるべきである。使用するトリプシン、α₂M−Try
などの酵素活性測定用基質は、溶解度が高く、基質阻害
もなく、測定用の反応は基質限定的でなく、かつ目的と
する酵素に対して選択性、反応性に優れ、合成法も容易
なものであるべきである。

しかして、本発明の目的は、これらの要求を具備する優
れた酵素活性測定用基質を提供することにある。

課題を解決するための手段本発明者は、或る種のアルギニルアニリドが例えばトリ
プシン、α₂M−Tryなどの酵素活性測定用の優れた基質
であることを見出した。

即ち、本発明は下記式Ａ−Ｂ−Arg−Ｘ［式中、ＡはpyroGlu基又はＤ−Glu（OR又はNR′Ｒ″）
基（OR及びNR′Ｒ″はグルタミン酸のγ−カルボキシ基
に結合する基であり、Ｒは水素原子、置換もしくは非置
換の炭素数１〜８のアルキル基又は置換もしくは非置換
の炭素数３〜８のシクロアルキル基、Ｒ′及びＲ″は同
じでも異なつていてもよく、水素原子、炭素数１〜７の
アルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル基、又は
Ｒ′とＲ″とが一緒になつて窒素原子を含む炭素数２〜
７のシクロアルキル基を示す。）であり;BはGly基、Pro
基、Pip基、Sar基又はAla基であり;Xはｐ−ニトロアニ
リン残基又はその誘導体残基である］で表わされる酵素
活性測定用基質及びその塩である。

本明細書において使用する略号の意味は以下の通りであ
る。

Arg＝アルギニン Gly＝グリシン Glu＝グルタミン酸 pyroGlu＝ピログルタミン酸 Pro＝プロリン Pip＝ピペコリン酸 Ala＝アラニン Sar＝サルコシン Val＝バリン Ile＝イソロイシン Phe＝フエニルアラニン −pNA＝ｐ−ニトロアニリド Boc＝第３ブチルオキシカルボニル Bzl＝ベンジル tBu＝第３ブチルＺ＝ベンジルオキシカルボニル WSC＝水溶性カルボジイミド DCC＝ジシクロヘキシルカルボジイミド TosOH＝ｐ−トルエンスルフオン酸 Tos＝ｐ−トルエンスルフオニル DMF＝ジメチルホルムアミド本発明の酵素活性測定用基質を表わす上記式において、
ＡはpyroGlu基又はＤ−Glu（OR又はNR′Ｒ″）基であ
り、好ましくはＤ−Glu（OR又はNR′Ｒ″）基である。
ここでＲは水素原子又は置換もしくは非置換の炭素数１
〜８のアルキル基又は置換もしくは非置換の炭素数３〜
８のシクロアルキル基（Ｒは水素原子以外の場合ORはエ
ステル基を形成する）である。かかるアルキル基として
は例えばメチル、ｎ−プロピル（nPr）、ｉ−プロピル
（iPr）、ｔ−ブチル（tBu）、ペンチル−３−イル、ｎ
−ヘキシル（nHex）、ヘプチル、オクチル（Oct）、オ
クチル−３−イル（30ct）などの非置換の炭素数１〜８
のアルキル基；シクロヘキシルメチルなどの炭素数３〜
６のシクロアルキル基で置換された炭素数１〜８のアル
キル基；ベンジル（Bzl）などの、フエニル基で置換さ
れた炭素数１〜８のアルキル基等が挙げられる。シクロ
アルキル基としては、シクロペンチル、シクロヘキシ
ル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどの非置換の炭
素数３〜８のシクロアルキル基;2−メチルシクロヘキシ
ル、３−メチルシクロヘキシル、４−メチルシクロヘキ
シルなどの炭素数１〜４のアルキル基で置換されたシク
ロヘキシル等が挙げられる。

Ｒ′及びＲ″は同じでも異なつていてもよく、水素原
子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数３〜７のシクロ
アルキル基、又はＲ′とＲ″とが一緒になつて窒素原子
を含む炭素数２〜７のシクロアルキル基（これらの場合
NR′Ｒ″はアミド基を形成する）である。かかるアルキ
ル基としては例えばメチル、エチル、ｉ−プロピル（iP
r）、ｎ−プロピル（nPr）、ｎ−ヘキシルなどが挙げら
れ、シクロアルキル基としては例えばシクロヘプチル、
シクロヘキシルなどが挙げられる。Ｒ′とＲ″とが一緒
になつて窒素原子を含む炭素数２〜７のシクロアルキル
基としては例えばピペリジノ、ピロリジノなどが挙げら
れる。

上記式においてＢはGly基、Pro基、Pip基、Sar基、又は
Ala基であり、好ましくはGly基である。

Ｘは発色基に相当する基であり、ｐ−ニトロアニリン残
基又はその誘導体残基を示す。かかる誘導体残基として
は、例えば３−カルボキシ−４−ニトロアニリン残基;3
−メトキシカルボニル−４−ニトロアニリン、３−エト
キシカルボニル−４−ニトロアニリンなどの３−C_1-6ア
ルコキシカルボニル−４−ニトロアニリン残基;3−ベン
ジルオキシカルボニル−４−ニトロアニリン残基;3−Ｎ
−メチルカルバモイル−４−ニトロアニリン、３−Ｎ−
エチルカルバモイル−４−ニトロアニリン、３−Ｎ−ブ
チルカルバモイル−４−ニトロアニリンなどの３−Ｎ−
C_1-6アルキルカルバモイル−４−ニトロアニリン残基等
が挙げられる。

上記式におけるアミノ酸残基は、ことわりのない限りＬ
体である。

本発明の基質は酸付加塩であつてもよく、かかる酸付加
塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、
硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸塩、リンゴ酸
塩、クエン酸塩、乳酸塩、ベンゼンスルホン酸塩などの
有機酸塩等が挙げられる。

本発明による好ましい基質の１例はである。

他の好ましい基質としては、例えば以後に示す実施例に
おいて記載された基質などが挙げられる。

上記式で表わされる本発明の基質は、ペプチド化学にお
いてよく知られる方法により合成される。即ち、基質合
成は、最初ｐ−ニトロアニリン又はその誘導体などの発
色基となる化合物をアルギニンに結合させ、次いで逐次
的にアミノ酸をカツプリングしていく方法により行なう
ことができる。或いはＮ−末端ジペプチドフラグメント
自体を最初に合成し、それに発色基を有するアルギニン
を結合させて合成することも可能である。

上記の反応を行なうに際しては、反応を行なうアミノ
酸、ジペプチドフラグメントなどの分子中に存在する反
応に直接関与しないアミノ基、カルボキシ基は、ペプチ
ド合成で通常使用される保護基で保護する。アミノ保護
基としては、カルボベンゾキシ、第３ブチルオキシカル
ボニル；それに関連する基、例えば、ｐ−メトキシ、ｐ
−ニトロ又はｐ−メトキシフエニルアゾールカルボベン
ゾキシ基；及びフタロイル基等を用いるのが、有利であ
る。カルボキシ保護基としては、ベンジル、ｔ−ブチル
などによるエステル基が有利である。

アルギニンを反応に用いるに際しては、通常アルギニン
のδ−グアニジノ基を保護する。かかる保護にはニトロ
基やプロトン化を用いるのが有利である。

以上に述べた保護基は、反応後、それ自体公知の方法に
よつて脱離することができる。

２個のアミノ酸のカツプリング、ジペプチドとアミノ酸
のカツプリング、発色基となる化合物とアルギニンのカ
ツプリング等は、ペプチド合成に通常使用される活性エ
ステル化法、混合酸無水物法あるいはカルボジイミド法
により行われる。活性エステル化法はα−カルボキシル
基の活性化により行なわれ、例えばＮ−ヒドロキシサク
シニツクイミド、ｐ−ニトロフエノール、トリクロロフ
エノール、4,6−ジメチルピリミジル−２−チオール等
を用いた活性エステル化法が有利である。混合酸無水物
法では、炭酸モノアルキルエステル塩化物、例えば、イ
ソブチルクロロホルメートを用いるのが有用である。

カルボジイミド法では、カルボジイミド、例えばN,N′
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の存在下で
行なうのが有利である。

上記式のＤ−Glu（OR又はNR′Ｒ″）基におけるグルタ
ミン酸のγ位のカルボキシ基のエステル化は、対応する
アルコールとの縮合、例えば酸触媒下の３−ペンタノー
ル、ベンジルアルコールなどとの脱水縮合、あるいはイ
ソブテンとの反応などによつて行うのが有利である。グ
ルタミン酸のγ位のアミド化は、対応するアミンとの縮
合、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）存
在下での例えばジイソプロピルアミンとの縮合によるの
が有利である。

発明の効果本発明の基質の特徴は、トリプシン、α₂M−Tryなどの
酵素に対して優れた基質特異性及び反応性を有し、水あ
るいは緩衝液に対する溶解性に優れていることにある。
例えば、新規基質： CHR−TRY（Pentapharm社、Ｚ−Val−Gly−Arg−pNA・HC
l）及びＳ−2222（Kabi社、Bz−Ile−Glu（OR）−Gly−
Arg−pNA・HCl;R＝ＨまたはCH₃）と、トリプシン、α₂M
−Try及び正常血清との相対反応性を、Ｓ−2222を1.0と
して示すと第８及び９表の如くなり、トリプシン及びα
₂M−Tryに対する反応性はほぼＳ−2222と同程度である
が、正常血清に対する反応性が著しく低下しており、選
択性の向上という点では著しい進歩であり無希釈検体
（例えば血清や腹水）を用いて検体中の微量のトリプシ
ン又はα₂M−Try活性を他酵素の妨害を受けずに測定す
ることが可能となる。またCHR−TRY、Ｓ−2222と比べて
水、及び緩衝液に対する溶解性に優れており、従来より
も高濃度の基質液の調製が可能となつた。

以上の通り本発明の基質は、トリプシン、α₂M−Try等
の酵素活性測定用基質として、従来のものに比べ非常に
優れていることが明らかであり、膵炎などの診断薬とし
て極めて有用である。

実施例本発明を以下実施例により詳細に説明するが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

本実施例の薄層クロマトグラフイー（TLC）分析は、シ
リカゲルF₂₅₄（メルク製）プレートを使用した。アミノ
酸は特にことわらなければＬ−体を示す。

実施例１（基質No.16）の合成 I.Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−OHの合成 Boc−Ｄ−Glu−OBzl6.74g（20m mol）を無水塩化メチレ
ン20mlに溶解し、氷冷下、４−ジメチル−アミノピリジ
ン244mg（2m mol）、WSC・HCl3.83g（20m mol）、３−
ペンタノール5.28g（60m mol）を加え、５分間、撹拌下
反応を行う。次いで、反応温度を室温まで上昇させ引き
続き撹拌下反応を３時間行ない、冷５％塩酸30ml×２、
飽和食塩水30ml×２、10％炭酸水素ナトリウム水溶液30
ml×２、飽和食塩水30ml×２にて洗浄後、無水硫酸マグ
ネシウムにて乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウムを濾
別し、減圧下溶媒を留去する。残渣をシリカゲルクロマ
トにより精製を行ない、酢酸エチル−ｎ−ヘキサンより
再結晶を行ない Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−OBzl6.51g（80％）
を得る。

Rf＝0.68（酢酸エチル:n−ヘキサン＝1:3）元素分析ＣＨＮ測定値 64.64％ 8.53％ 3.38％理論値 64.84％ 8.16％ 3.44％次いでBoc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−OBzl6.51g
（16mmol）をエタノール200mlに溶解後、パラジウム黒1
gを加え、室温下、水素気流中、１時間還元を行う。触
媒を濾別後、減圧下、溶媒を留去し残渣を酢酸エチル−
ｎ−ヘキサンより再結晶を行ない4.39g（87％）のBoc−
Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−OHを得る。

Rf＝0.55（CHCl₃:AcOH＝9.5:0.5）元素分析（Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−OH・1/4H₂O）測定値 C;56.07％ H;8.96％ N;4.38％理論値 C;55.97％ H;8.61％ N;4.35％ II.Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−Gly−OHの合成 Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−CH2.45g（7.73m mo
l）を酢酸エチル30mlに溶解後、4,6−ジメチル−ピリミ
ジル−２−チオール1.19g（8.50m mol）を加え、DCC1.5
9g（7.73m mol）を溶解した酢酸エチル溶液を氷冷下に
滴下し、次いで、室温下にて一晩撹拌下反応を行なう。

析出物を濾別後、濾液を10％炭酸水素ナトリウム水溶液
50ml×２、飽和食塩水50ml×２にて洗浄後、無水硫酸マ
グネシウムにて乾燥を行なう。乾燥剤を濾別後、減圧下
溶媒を留去すると3.16g（93％）の活性エステルが得ら
れる。

次に、Ｈ−Gly−OBzl・TosOH2.66g（11.6m mol）を酢酸
エチル100mlにけん濁させ、氷冷下Ｎ−エチル−モルホ
リン1.51ml（11.6m mol）を滴下し、５分間撹拌反応を
行ない、次いで先に調整した活性エステル3.16g（7.20m
mol）を溶解した酢酸エチル100ml溶液を氷冷下に加
え、一晩撹拌反応を行なう。

反応液を冷５％塩酸、150ml×２、飽和食塩水150ml×
２、10％炭酸水素ナトリウム水溶液150ml×２、飽和食
塩水150ml×２にて洗浄後、無水硫酸マグネシウム及び
活性炭にて脱色乾燥を行なう。

乾燥剤、活性炭を濾別し、減圧下溶媒を留去し、残渣を
シリカゲルクロマトにより精製を行ない、無色透明油状
の Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−Gly−OBzl2.84g（8
5％）を得る。

Rf＝0.65（酢酸エチル:n−ヘキサン＝1:1）元素分析測定値 C;61.64％ H;8.15％ N;5.96％理論値 C;62.05％ H;7.81％ N;6.03％次いでBoc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−OBzl2.84g
（6.12m mol）をエタノール200mlに溶解後、パラジウム
黒1gを加え、室温下、水素気流中、１時間還元を行う。

触媒を濾別後、減圧下、溶媒を留去し、2.09g（91％）
の油状の Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−Gly−OHを得る。

Rf＝0.1（クロロホルム：酢酸＝9.5:0.5）元素分析測定値 C;54.33％ H;8.29％ N;7.49％理論値 C;54.53％ H;8.08％ N;7.48％ III. の合成 Boc−Arg−OH・HCl・H₂O13.15g（40m mol）を無水ピリ
ジン80mlに溶解後、 9.53g（40m mol）を加え、次いで氷冷下DCC18.16g（88m
mol）を溶解したピリジン溶液を撹拌下滴下し、次いで
室温下にて一晩撹拌反応を行なう。

反応液に酢酸エチル160mlを加え、不溶物を濾別後、減
圧下、溶媒を留去し、残渣に酢酸エチル360mlを加える
と、結晶が析出するので、これを濾別し、減圧下五酸化
二リン上にて乾燥を行ない、18.47g（87％）のを得る。

Rf＝0.25（クロロホルム：メタノール：酢酸：水＝20:
5:0.5:0.5） mp.212−219℃（分解）元素分析測定値 C;49.26％ H;6.87％ N;15.89％理論値 C;49.76％ H;6.64％ N;15.83％次いで 7.97g（15m mol）をDMF9mlに溶解後、更に酢酸3mlを加
え、氷冷撹拌下に2N塩酸／酢酸溶液60ml（30m mol）を
滴下し、次いで15℃にて30分間撹拌下反応を行なう。

反応終了後、反応液に酢酸エチル36mlを加え、撹拌下エ
ーテル３中にこれを加え、析出物を濾別し、減圧下五
酸化二りん−水酸化カリウム上で乾燥すると、6.54g（9
3％）のが得られる。

Rf＝0.48（ｎ−ブチルアルコール：酢酸：水＝4:1:2） mp.65゜−95℃（分解）元素分析（C₁₇H₂₈N₆O₅Cl₂・1/2H₂O）測定値 C;42.77％ H;6.20％ N;17.60％理論値 C;42.86％ H;6.14％ N;17.64％ Boc−Ｄ−Glu（OCH・（C₂H₅）_２）−Gly−OH2.09g（5.5
9m mol）を酢酸エチル50mlに溶解後、4,6−ジメチル−
ピリミジル−２−チオール861mg（6.15m mol）を加え、
DCC1.15g（5.59m mol）を溶解した酢酸エチル溶液を氷
冷下に滴下し、次いで室温下にて一晩撹拌下反応を行な
う。

析出物を濾別後、濾液を10％炭酸水素ナトリウム水溶液
50ml×２、飽和食塩水50ml×２にて洗浄後、無水硫酸マ
グネシウムにて乾燥を行なう。

乾燥剤を濾別後、減圧下、溶媒を留去すると2.50g（90
％）の活性エステルが得られる。

次に 2.22g（4.75m mol）をDMF20mlに溶解後、氷冷下Ｎ−エ
チル−モルホリン0.62ml（4.75m mol）を滴下し、５分
間撹拌反応を行ない、次いで先に調整した活性エステル
2.14g（4.32m mol）を溶解したDMF20ml溶液を氷冷下に
加え、一晩撹拌反応を行なう。反応終了後、減圧下、溶
媒を留去し、残渣に酢酸エチル100mlを加え、冷５％HCl
50ml×２、飽和食塩水50ml×２、10％炭酸水素ナトリウ
ム水溶液50ml×２、飽和食塩水50ml×２にて洗浄を行な
い、無水硫酸マグネシウムにて乾燥を行なう。

乾燥剤を濾別後、減圧下、溶媒を留去し残渣をSephadex
LH−20クロマトにて精製を行ない、淡黄色フオーム状
の 2.68g（80％）を得る。

Rf＝0.78（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝20:
5:0.5:0.5）元素分析ＣＨＮ測定値 51.19％ 7.41％ 13.87％理論値 50.94％ 7.12％ 13.98％ 1.07g（1.36m mol）を酢酸5mlに溶解後、氷冷下2N塩酸
／酢酸溶液6.8ml（13.6m mol）を滴下し、30分間撹拌反
応を行ない、次いで、反応液をエーテル500ml中に撹拌
下に加え析出物を濾別する。

次いでこれをSephadexLX−20クロマトにより精製を行な
い、 820mg（90％）を得る。

Rf＝0.42（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝4:1:2） mp.108−147℃（分解） ▲［α］²⁰ _D▼＝−58゜（Ｃ＝1,H₂O）元素分析測定値 C;43.44％ H;6.17％ N;16.13％理論値 C;43.34％ H;6.23％ N;16.17％実施例２実施例１と同様な方法にて下記の表に示す新規基質の合
成を行つた。合成した新規基質の物性値を下記の表に示
した。

実施例３（Ａ）新規に合成した基質の特異性を各酵素と反応させ
ることにより試験した。

（１）基質液:10mM/ （２）緩衝液：緩衝種、NaClおよびそれらの濃度、pH
（25℃）は酵素により次の通りとした。

（３）使用酵素：使用した酵素及びそれらの起源等は次
の通りである。

（４）反応停止液:10％酢酸水溶液測定法：（ａ）トリプシン緩衝液0.5mlと基質液0.1mlをシリコン処理硬質ガラス製
試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃恒温槽
中にて10分間予加温する。次いで酵素試薬0.05mlを加え
て酵素反応を37℃10分間実施する。

正確に10分後、反応停止液2.5mlを加えて酵素反応を停
止後、37℃で10分間放置し、次いで405nmの吸光度を測
定する。

（ｂ）α₂M−Try 緩衝液0.5mlと基質液0.1mlをシリコン処理硬質ガラス製
試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃恒温槽
中にて５分間予加温する。

次いで酵素試薬0.05mlを加えて酵素反応を37℃、10分間
実施する。

正確に10分後、反応停止液1.0mlを加えて酵素反応を停
止後、37℃で10分間放置し、次いで405nmの吸光度を測
定する。

（ｃ）正常血清緩衝液0.5mlと基質液0.1mlをシリコン処理硬質ガラス製
試験管又はプラスチツク製試験管に採取し、37℃恒温槽
中にて５分間予加温する。次いで酵素試薬0.1mlを加え
て酵素反応を37℃５分間実施する。

正確に５分後、反応停止液2.0mlを加えて酵素反応を停
止後、37℃で10分間放置し、次いで405nmの吸光度を測
定する。

上記した測定法に従つて測定した結果は、下記の表に示
した通りである。下記の表中の値は、基質Ｓ−2222、10
mMの吸光度の測定値を1.0とした時の相対値を示してい
る。

（Ｂ）本発明の基質と従来の基質との水に対する溶解性
を調べた。結果は以下の通りである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式Ａ−Ｂ−Arg−Ｘ〔式中、ＡはpyroGlu基又はＤ−Glu（OR又はNR′Ｒ″）
基（ここでOR及びNR′Ｒ″はグルタミン酸のγ−カルボ
キシ基に結合する基であり、Ｒは水素原子、置換もしく
は非置換の炭素数１〜８のアルキル基又は置換もしくは
非置換の炭素数３〜８のシクロアルキル基、Ｒ′及び
Ｒ″は同じでも異なっていてもよく、水素原子、炭素数
１〜７のアルキル基、炭素数３〜７のシクロアルキル
基、又はＲ′とＲ″とが一緒になって窒素原子を含む炭
素数２〜７のシクロアルキル基を示す。）であり;BはGl
y基、Pro基、Pip基、Sar基又はAla基であり;Xはｐ−ニ
トロアニリン残基又はその誘導体残基である〕で表わさ
れるトリプシン及び／又はα_２−マクログロブリン−ト
リプシン複合体の酵素活性測定用基質及びその塩。