JPS63173600A - プロテア−ゼの定量方法およびそれに使用する試薬 - Google Patents

プロテア−ゼの定量方法およびそれに使用する試薬

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JPS63173600A
JPS63173600A JP62204293A JP20429387A JPS63173600A JP S63173600 A JPS63173600 A JP S63173600A JP 62204293 A JP62204293 A JP 62204293A JP 20429387 A JP20429387 A JP 20429387A JP S63173600 A JPS63173600 A JP S63173600A
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クレソン，カール　ゲラン
アウレル，レイフ　エリク
シモンソン，レイフ　ロゲル
アリエリー，サロ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はセリンプロテアーゼおよびＳｌｌ−プロテアー
ゼを定量する方法およびそれに直接使用する試薬に関す
る。
〔背景技術〕
最近多数の合成ペプチド基質が記載されている。これら
の大部分はそのＮ−末端アミノ酸のアミノ基がアシル基
により封鎖されているか、または遊離であるが、その場
合にはＤ一配装を有するトリペブヂド鎖として存在する
。Ｃ−末端アミノ酸は発色性または蛍光性の基により封
鎖されていて、それは酵素の基質との反応において解裂
せしめられる。このようにして生成し且つ遊離した発色
性または蛍光性の基は分光法または蛍光分光法により定
量的に測定することができる。酵素活性は単位時間あた
り遊離した解裂生成物の量を測定することにより計算す
ることができろ。
〔発明の開示〕
短いベプヂド鎖は基質の酵素に対する親和性に関して重
要である。この点においてＮ−末端アミノ酸はＬ一型で
アシル化されたアミノ基を有するか、またはＤ一型で遊
離のアミノ基を有することが必須であるように思われる
。今や、Ｎ−末端ピログルタミン酸を有する基質は多種
のセリンプロテアーゼにより極めて容易に解裂せしめら
れることが本発明者により確認された。
遊離型ではなく閉環することによりアシル化されたα−
アミノ基を有するピログルタミン酸すなわちグルタミン
酸のラクタムは、酵素を定量する際に基質として使用す
ることを目的としたべブチドにおいて以前には使用され
たことがない。本発明による新規な発色性の基質または
その塩はつぎの一般式 ％式％ 〔ただし式中、Ｒ１は水素または保護基好ましくは第３
級ブヂルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボ
ニルであり、＾１はアミノ酸ＧＩＦ。
Ａｌａ，　Ｖａｔ，　Ｌｅｕｓ　　ｌｌｅＳＳｃｒ、Ｔ
ｈｒＳＰｒｏ，　ｒ’ｉｐ。
Ｔ’ｈｅまたはＴｙｒから選ばれ、Ａ，はＡｒｇまたは
Ｌｙｓであり、Ｒｔは芳書族の（おそらくは置換されて
いる）炭化水素基であり、そして−Ｈ１−Ｒ．は物理化
学的に測定しうる基好ましくは発色性または蛍光性の基
を構成し、それは上記の酵素により解裂せしめられて式
１１．Ｎ−Ｒ，の解裂生成物を生成しそしてそのｍを定
量することができる〕により表わされる。
本発明による新規な基質を合成する際には、ペプチド化
学においてよく知られている通常の保護基およびカップ
リングの方法が使用される。
合成の原理は最初に結合された測定可能な基（上記の式
によれば一１１Ｎｚ−Ｒｔであり、それはカップリング
の際にカルボキシルの保護基として役立つ）を有するか
、または除去しうるカルボキシルの保護基を宵するＣ−
末端アルギニルまたはリジル基へのアミノ酸の段階的カ
ップリングであり、後者の場合測定可能な基は保護され
たトリペプチド誘導体に結合せしめられるか、またはＮ
−末端が保護されたジペプチド部分が別々に合成され、
そして次に前記の方法により測定可能な基を有するかま
たは有しないアルギニルまたはリジル基に結合せしめら
れる。
これらの合成経路のいずれが選ばれるにせよ、中間およ
び最終生成物は再結晶および／またはゲルか過クロマト
グラフィーにより精製される。
本発明を以下の実施例により説明する。
溶出物よｊよび生成物の薄層クロマトグラフィーによる
分析においては、シリカゲルＦ＊ｓ＊（メルク社製）を
コーティングしたガラスプレートが吸着媒体として使用
される。使用される溶媒系は以下に示される。
Δ：ｎ−ブタノール：酢酸：水 （３：２：１（容量比）〕 Ｐｌ：クロロホルム：メタノール （９：Ｉ（容量比）〕 薄層クロマトグラフィーを行なったのち、それらのプレ
ートは最初にＵＶ先（２５４ｎｉ）で検討される。つぎ
にニンヒドリンを噴霧し、そしてつぎにジカルボキシジ
ン／クロラインで処理する。記載されたＲｒ値は単一の
クロマトグラフから得られた結果である。
以下において使用される略号はつぎのとおりである。
略号はアミノ酸残基を表わす。遊離のアミノ酸またはペ
プチドはアミノ基の場合には１１−で、そしてカルボキ
シル基の場合には一０１ｌで示される。アミノ基は常に
左側に、そしてカルボキシル基は右側に示される。
特に記載しない限りすべてのアミノ酸はＬ−配置を有す
るが、ただしＧｌｙは例外である。
Ａｌａ＝ｌミニアラニン　　　　Ｐｈｅ＝フェニルアラ
ニンＡｒｇ＝アルギニン　　　　　　Ｐ−ｉ　ｐ　＝ピ
ペコール酸ｃｔｙ＝グリシン　　　　　　　Ｐｒｏ＝プ
ロリン１１ｅ＝イソロイシン　　　　　５ｅｔ＝セリン
Ｌｅｕ　＝ロイシン　　　　　　　Ｔｈｒ＝スレオニン
Ｌｙｓ　＝リジン　　　　　　　　Ｔｙｒ＝チロシンｐ
−ＧＩｕ＝ピログルタミン酸　　Ｖａｌ＝バリンさらに
以下の略号が使用される。
１１０Ａｃ　＝酢　酸 Ｂｚ　　　＝ベンゾイル Ｃｂｏ　　＝カルボベンゾキシ ＤＣＣＩ　　＝　ジシクロへキシルカルボジイミドＰＣ
Ｑ３−三塩化燐 ＤＭＰ　　＝　　ジメチルホルムアミドＥｔ、ｉｌｌ　
　＝　　トリエチルアミン１１０ｎＴ　　＝　ヒドロキ
シベンゾトリアゾールＤＣＩＩＡ　　＝　ジシクロヘキ
シルアミンＤＣｔｌ　　＝　ジシクロヘキシル尿素Ｅｔ
ＯＩｌ　　＝エタノール ＭｅＯＩＩ　　＝メタノール ＥＬＯＡｃ　＝酢酸エチル ０ｐＮＰ　　−ｐ−ニトロフェノキシ ｐＮＡ＝ｐ−ニトロアニリド ＴＦＡ＝）リフルオロ酢酸 β−ＮＡ　　＝β−ナフチルアミド ４−ＭｅＯ−β−ＮＡ＝４−メトキシ−β−ナフチルア
ミド７−Ａ−４−Ｍ−Ｃ＝　７−アミノ−４−メチルー
クマリン実施例Ｉ　　Ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−人ｒｇ−Ｐ
ＮＡ１１Ｃ１２（ｍｙｗ、−４９８，９）Ｉ　ａ　　Ｃ
ｂｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｎｏｔ）ｐＮＡ　　（ｍ、ｖ、
＝５３０．５）濃１１０Ａｃ　１７！Ｍ！および＋１０
　Ａ　Ｃ中の５．６Ｍ　ｌｌＢｒ　１０５ｉ＆をＣｂｏ
−Ａｒｇ（Ｎｏｗ）−ｐＮＡ　３１（０，０７４モル）
に加える。
この混合物を反応せしめ、そしてその反応溶液が透明に
なったのちに３０分間撹拌する。つぎにこの混合物を急
激に撹拌しながら無水エーテル約２Ｑに注ぐ。生成した
沈澱をが過し、そして無水エーテルで洗浄し、つぎに水
酸化ナトリウム上で真空乾燥する。得られたＩＩ−Ａｒ
ｇ（ＮＯｔ）−ｐＮＡの臭化水素酸塩を蒸留した無水の
ＤＭＦ　１５０ｍ１２に溶解し、そして湿らせたｐＨ試
験紙をその反応混合物の上にかざした際に弱塩基性を示
すようになるまでＥｔＪを用いて低温（−１０℃）で中
和する（通常ＨＢｒの約１．５当量が中和のために使用
される）。生成したＥｔ、ＮｌｌＢｒを炉別する。冷却
状態でこの反応混合物にＣｂｏ−Ｇｌｙ−ＯｐＮＰ　　
２６．８ｉＦＣ０，８１モル、１．１当量）を加え、３
０分後にさらを室温で一夜反応仕しめ、その後真空下に
蒸発させると油状物が得られる。この油状物を２％水性
炭酸水素ナトリウム溶液中で摩砕し、つぎに熱メタノー
ルに溶解し、そして撹拌且つ冷却下に結晶化する。生成
した結晶を炉別し、そして冷メタノールで洗浄する。Ｔ
ＬＣによりごく少量１の不純物が示されるので、その生
成物を同一の溶媒から再結晶する。これによりＴＬＣ上
で純粋な白色結晶が得られる。
収量　　Ｉａ３４ｇ＜８６％） Ｒ＋＝０．２０（ｈ） （ｆｆ）ｉ？　　３５．４°（ｃ　Ｏ，３、Ｍ　ｃ　Ｏ
ＩＩ　）ｌ　ｂ’　　Ｃｂｏ−ｐ−Ｇｌｕ−０１１（ｍ
、ｗ、＝　２６３．３）Ｃｂｏ−Ｇｌｕ−ＯＨ５６，３
ｇ（０，２０モル）をＥｔＯＡｃ　４０Ｇｍ（１に溶解
し、ＥｔＯＡｃ　６０　ＭＱに溶解したＤＣＣ’＋　４
９．４ｇ（０，２４モル）を加え、そして水浴中で撹拌
する。
２時間後に生成したＣ　ＣＵ　’ｅ　ｐ過し、そして残
留している溶液を蒸発乾固する。生成物（Ｃｂｏ−Ｇｌ
ｕの酸無水物）をＥｔＯＡｃおよび石油エーテルから結
晶化する。この酸無水物をジオキサン１２０綬およびエ
ーテル２６０順に溶解し、そしてつぎ１：　ＤＣＩＩＡ
　４８　ｘＱをエーテルニ溶解し容量　１００　ｍＱに
した溶液を加える。しばらくするとＣｂｏ−１）−ＧＩ
ｕ−ＤＣＩＩＡが沈澱する。それを約１時間撹拌し、つ
ぎに生成したＤＣＩＩＡ塩を炉別し、そしてエーテルお
よびＥｔＯＡｃで洗浄する。このＤ　ＣＩＩ　Ａ塩をＥ
ｔＯＡｃに懸濁し、水に溶解した硫酸水素カリウム２５
９（０，１８モル）とともに振盪するとこのようにして
生成したＣｂｏ−ｐ−Ｇｌｕ−０１１はＥｔＯＡｃ相に
移行する。
そのＥｔＯＡｃ相を水中のｌＯ％塩化ナトリウムで洗浄
し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥する（その際生成物
が沈澱する危険性がある）。
ＩＥｔＯＡｃ相を少量になるまで蒸発させ、そして石油
エーテルで沈澱させる。これによりＩｂ′が重い結晶と
して得られ、それはＴＬＣによれば純粋である。
収量　　ｌ　ｂ’　３６．９９　（８０％）Ｒｒ＝　０
．４５（Ａ） （ａ　）％；　　−３０，３”　（ｃ　１．０、ｈｌｅ
ｏｌｌ）Ｉ　　ｂ　　　Ｃｂｏ−ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ（Ｎｏｔ）ｐＮＡ（ｍ、ｗ、６４Ｌ、６）Ｉａに
記載された操作によりＩＩ　Ｂ　ｒを用いてＣｂｏ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ（ＮＯｔ）ＰＮＡから保護基を除去するこ
とにより得られたｌＩ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（Ｎｌｌｔ）
ｐＮａｌｌＢｒ　　ｌｏ、２５ｇ（１８，３ミリモル）
を無水ＤＭＦ３５ａ＋１２に溶解し、そして湿ったｐｉ
試験紙が塩基性を示すまでＩＥｔＪを用いて低温（−！
０６Ｃ）で中和する。生成した１：　Ｌ　Ｎ　！ｌ　Ｉ
３　ｒ　ｆ−が別する。その反応混合物に１ＩＯＵＴ２
．４７ｙ（１８，３ミリモル）およびＣｂｏ−Ｐ−Ｇｌ
ｕ−０１１（ｒ　ｂ’）５．２６ｇ（２０ミリモル）を
加え、その後少量のＤＭＦに溶解したＤＣＣＩ　４．５
３ｇ（２２ミリモル）を低温で加えろ。この混合物を室
温で一夜反応ｔ）Ｌめ、つぎにその反応溶液を蒸発させ
ると油状物が得られる。この油状物を水中の２％炭酸水
素ナトリウムおよび純粋な水で摩砕する。得られた固体
状化合物を少量のアセトンに溶解し、そしてつぎに熱メ
タノールおよび少量の水を加える。
冷却し且つ撹拌すると生成物は結晶化し、そして生成し
た結晶を炉別する。得られたＩｂはＴＬＣによれば純粋
である。注意深く真空乾燥したのちＩ　ｂ　８．９０９
（７６％）が得られる。
Ｒｒ＝　０．０６（Ｐ＋） （ｆｆ）”ｏ　−２１，５°（ｃ　Ｏ，８、ＤＭＦ）ｌ
。
ｒ　ｂ　　ｏ、ｇｙ（１，ｚｓミリモル）をアニソール
０　、６　ｍＱの存在下に０℃で１時間　ＩＩＦ３０ｍ
（で処理して保護基を除去する。真空下に蒸発させたの
ちその生成物を２％ＩＩ　ＯＡ　ｃ約３０１７２に溶解
し、そして少量のエーテルで洗浄する。２％　１１０　
Ａ　ｃ中セファデックスＧ−１５（ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ社製）のカラムを用いて水相をクロマ
トグラフィーに付し、同一の媒質を用いて溶する。純粋
なｌのアセテートを含む部分を凍結乾燥し、そしてエタ
ノール−水（１：　１）を用いてクロリド型のＱＡＥ−
２５（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）のカ
ラムでイオン交換を行ない同一媒質で溶出する。
純粋なＩの塩酸塩を含む部分を凍結乾燥する。
収量　　１　４８５ｘｙ（７８％） ＴＬＣ（Ｉ＜、＝　０．２９（Ａ　））　１個のスポッ
トを示すだけである。
Ｃａ　克−５４，１”（ｃ　１．０．５０％　１１０＾
ｃ／ＩＩｔＯ）表Ｉに記載された実施例■〜店は原則と
して上記の実施例と同様の方法で行なイつれる。従って
物理的データ、収率ならびにカップリングおよび精製の
方法だけがこの表に記載される。
実施例ＸｆＶ　　ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−Ｍ
ｅＯ−β−Ｎ＾−１１ｃ１２（ａ、ｗ、　５３４．０） Ｗａ　　ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｏｌｌ−１ｌＣ
Ｃ（ｍ、ｗ、　３７８．８）トリプシン（ノボ社製、１
ｍＭ　ｌＩＣＩ２１　ｘ（ｌＩ６り’）トリプシン２　
、０　ｍｇを含む溶液４００成）を０．１Ｍ水性炭酸水
素ナトリウム１００　ｍＱ中ｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡｉｌＣ９（Ｓ−２４４４）　２５０１９　（
０，０５ミリモル）の溶液に加える。ｐＮＡの遊離は分
光光度計により４０５ｎＩ１１において追跡される。そ
の遊離は約４５分後に完了し、その後この溶液を■ＯＡ
ｃでｐＨ〜４まで酸性にする。つぎにそれを蒸発乾固し
、メタノールに溶解し、そしてメタノール中Ｌｌｌ−２
０（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）のカラ
ムを用いてクロマトグラフィーに付し同一の媒質で溶出
する。純粋な酸ＸＩＶａを含む部分を蒸発させ、水に溶
解し、そして凍結乾燥する。
ＸＩＶａの収量は１６７１９（８８９）であり、それは
ＴＬＣによれば純粋である。
Ｒｒ＝　０．０８（Ａ） 無水ピリジン４５０Ｊｉ中ＰＣＱ３２７　ｕｌ（０，２
５ミリモル）の溶液を湿気を含まない状態でそして水浴
中で無水ピリジン２．２５村中４−ＭｅＯ−β−！ｌＡ
　１０５ｍｇ（０，０５ミリモル）の溶液に加える。室
温で約４５分間放置したのち、前記の操作により生成さ
れたＭＶａを全部加える。反応が終わった時点で（約１
時間後）その反応混合物を（減圧下で）蒸発させろと暗
赤色油状物が得られる。この油状物を少量のエタノール
−水（１：１）に溶解し、そしてエタノール−水（１：
１）中クロリド型のＱＡＥ−２５（ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ社製）のカラムに加え同一媒質で溶出
する。殆ど純粋な窟の塩酸塩を含む部分を蒸発させ、再
び少量のエタノール−水（１：１）に溶解し、そしてそ
の操作をくり返す。このようにして得られた窟の塩酸塩
は純粋であり、そしてすべてのアルコールを蒸発させた
のちにそれを凍結乾燥する。
収ｆｆｉ　　Ｗ　８５１９（３６％） ＴＬＣ（Ｒｒ＝　０．２４次ｙ　（Ａ））により１個の
スポットだけが示される。
（１２）％Ｆ　−４５，７°（ｃ　Ｏ，６，５０％ＩＩ
　ＯＡ　ｃ　／　ＩＩ　ｘ　Ｏ）（＋ａ、ｗ、セ５３６
．０） 実施例麓と同様の操作で行なうが、ただしアミンとして
４−ＭｅＯ−β−１１Ａ−１１Ｃｆ２の代わり（こ７−
Ａ−４−ＩＡ−Ｃ８８ｘｙ（０，５０ミリモル）を使用
する。
収量　ＸＶ８４所（３２％） ＴＬＣ（Ｒ，＝　０．２５（Ａ））により１個のスポッ
トだけが示される。
（α）Ｔ−５１，５°（ｃｌ、５０％１ｌＯＡｃ／ＩＩ
ｔＯ）実施例１〜店と同様にして化合物）ｌＶＩ（ｐ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−ｐＮＡ）およびＭ（ｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ｐＮ＾）を製造した。
表　　ＩＡ 方法 物質番号 ｌ　　　　ＨＦ、アニン−＃、　Ｇ−１５２％ＨＯＡｃ
ｌｚ　　　０ｐＮＰ、　ＭｅＯＨから結晶化Ｈ，ＨＯＢ
Ｔ、　ＤＣＣＩ、　ＭａＯＥＥから結晶化−−―−−−
閘噂−−−−−−−−＋＋−一一一一一一一一一＋−−
−＋−軸−―−−−−−−−−―１１　　　　ＨＦ、ア
ニソール、　Ｇ−１５２チＨＯＡｃ１１ａ　　　ＨＯＢ
Ｔ、ＤＣＣＩ、エーテルから結晶化１１１）　　　ＨＯ
ＢＴ、　ＤＣＣＩ、　ＥｔＯＨ＋Ｆ１２０から結晶化１
［［ＨＩＦ、アニソール、　Ｇ−１５２嗟Ｅ［ＯＡＣｍ
ａＨＯＢＴＩＤＣＣＩ、　ＦｉｔＯＡｃから結晶化１［
１）　　　ＨＯＢＴ、ＤＣＣＩ、　ＫｔＯＡｃ＋石油エ
ーテルから結晶化ＶＥｔ？、アニソール、　Ｇ−１５２
憾ＨＯＡｃ■ａＯｐＮＰ；　ＤＭＦ、　ＭｅＯＨ＋エー
テルから結晶化１１／ｂＨＯＢＴ、ＤＣＣＩ、　ＥｔＯ
Ｈ＋Ｈ２０から結晶化ｙ　　　　ＨＦ、７二７−ル、Ｇ
−１５２４ＨＯＡｃＶ！Ｌ　　　０ｐＮＰ、　ＤＭＦ、
　ＭｅＯＨ＋ｚ−チルから結晶化■ｂＨＯＢＴＩＤＣＣ
工、アセトン−）−ＭｅＯＥｌから結晶化■　　　ＨＦ
、アニソール、　ＱＡＩ！−２５９５４ＭａＯＨ■Ａ　
　　０ｐＮＰ、　ＫｔＯＡｃ＋エーテルから結晶化１１
１１１）　　　ＨＯＢＴ、ＤＣＣＩ、　ＤＭＦ　＋　Ｋ
ｔＯＡｃから結晶化■　　ＨＦ、アニソール、　Ｇ−１
５２％ＨＯＡｃ■ａ　　０ｐＮＰ、　ＭｅＯＨ−）−Ｈ
２Ｏから結晶化■ｌ）　　　１ｉ０ＢＴ、ＤＣＣＩ、ア
セトン−１−ＭｅＯＨ＋Ｈ２０から結晶化ＶＩ　　　Ｈ
Ｆ、　７＝７−ｈ、　Ｇ−１５Ｍ　ＨＯＡｃ■ａ　　０
ｐＮＰ、　ＭｅＯＨから結晶化■ｂ　　ＨＯＢＴ、ＤＣ
ＣＩ、　ＭｅＯＨ＋Ｈ２０から結晶化Ｋ　　　ＩＦ、ア
ニソール、　Ｇ−１５２憾ＨＯＡｃＫａ　　０１）ＮＰ
、　ＫｔＯＡｃ＋エーテルから結晶化■ｂ　　ＨＯＢＴ
、　ＤＣＣＩ、　ＭｅＯＨ＋Ｈ２０から結晶化Ｘ　　　
　ＨＢｒ／ＨＯＡｃ、ＱＡＫ　２５　５０％　ＥｔＯＨ
Ｘａ　　０ｐＮＰ、　ＭｅＯＨ＋Ｈ２０から結晶化Ｘｂ
　　ＨＯＢＴ、　ＤＣＣＩ、　ＭｅＯＨ＋ＥＩ２０から
結晶化ＸＩ　　　　ＨＢｒ／ＨＯＡｃ、Ｑ、ＡＩ！−２
５５０４ＥｔＯＨＸＪａＯｐＮＰ、　ＭｅＯＨ＋Ｈ２０
から結晶化Ｘ１ｂＨＯＢＴ、　　ＤＣＣＩ、アセトン＋
ＭｅＯＨか６ａ晶化Ｘｌｌ　　　ＨＯＢＴ、ＤＣＣＩ、
　５０１　ＥｔＯＨカら結晶化Ｘ１ｌａ　　　ＨＦＩ　
アニ７−に、Ｇ−１５２％　ＨＯＡｃＸＩＩ［ＨＦ’、
アｓ−７−ル、　Ｇ−１５１１Ｍ　ＨＯＡＣＸｎ［ａ　
　０ｐＮＰ、　ｚｔｏＡｃ＋ｚｔｏｇｔから結晶化ＸＩ
［［ｂ　　ｌｌ０ＢＴ、　ＤＣ（Ｊ、　ｃＨｃｔ、から
結晶化ＸＦ／　　　　４−ＭａＯ−β−ＮＡ＋ＰＣ４５
（ピリジン）十酸ＸＩＶａ　　　ｐＮＡ−誘導体＋トリ
プシンによるＸＶ　　　　７−Ａ４−Ｍ−Ｃ＋ＰＣＪｔ
５（ピリジン）十酸ＸＶＩ　　　　ＨＦ、アニソール、
Ｇ−１５１０’％ＨＯＡｃ、ＱＡＥ２５５０％ＥｔＯＨ
ＸＶＩａ　　　０ｐＮＰ、ＥｔＯＡｃ＋ＥｔＯＥｔから
結晶化Ｘ■ｂ　　　ＨＯＢＴ　、　ＤＣＣＩ　、ＭｅＯ
Ｈ＋Ｈ２０から結晶化Ｘ■　　　ＨＦ、アニノーｋ　、
　０−１５１０％ＨＯＡｃ　、　ＱＡＥ２５５０％Ｅｔ
ＯＨＸＶＩａ　　　０ｐＮＰ、ＤＭＦ＋ＥｔＯＡｃ＋Ｅ
ｔＯＥｔ、から結晶化ＸＶｔｂ　　　０ｐＮＰ　、　Ｅ
ｔＯＨ＋　Ｈ２Ｏから結晶比表■ Ｓ−２２５１−Ｈ−Ｄ−ＶａＱ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮ
Ａ、　Ｓ　−２１６０＝　Ｂｚ−Ｐｈｅ−Ｖａｆｆ−Ａ
ｒｇ−ｐＨＡ、　Ｓ　−２２２２−Ｂｚ−ＨＦｅ　−Ｇ
１！ｕ　−ＧＱｙ　−Ａｒｇ　−ｐＮＡ（すべてカビ・
ディアグノステイカ社製、ストックホルム、スエーデン
）ｓ　ＰＱｉｓｗプラスミン、Ｔｒｙｍ）リプシン、Ｆ
Ｘａａ＋凝集因千Ｘａ、ＵＫ舅ラウロキナーゼＴＡ−プ
ラスミノーゲン組織活性剤。
間圧の酵素に対する参照基質の感受性：プラスミン　　
Ｓ　−２２５１０，０４０トリプシン　　Ｓ　−２１６
００，１５０Ｆ　Ｘａ　　　　　Ｓ−２２２２０，２０
０ウロキナーゼ　Ｉ　　　　　’　　　　０．０４Ｇ組
織活性剤　　１　　　　　　　０．０４０参考までに、
前記化合物ｖ１■、■、およびＸにおけるピログルタミ
ン（ｐ−ｆＪｕ）をグルタミン（ＩＩ−ＧＩ２ｕ）で置
き換えたベプタイドＡ、Ｂ、ＣおよびＤの相対的反応速
度は表■のとおりであった。
表　　　　■ Ａ　：　Ｈ−ＧＱｕ−Ａ２ａ−＾ｒｇ−ｐＮＡＢ：　Ｉ
（−Ｇｌｌｕ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−ｐＮＡＣ：　ｌｌ−Ｇ
ｌｌｕ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−ｐＮ＾Ｄ　：　Ｉｔ−Ｇｌｌ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ表■および表■から、Ｎ−
末端ピログルタミン酸を有する本発明の基質はＮ−末端
グルタミン酸を有する相当する基質に比較してプラスミ
ンおよび（または）トリプシンに対する相対的反応速度
が高いことが明らかである。
さらに前記化合物■および■ならびに前記化合物！にお
けるピログルタミン（ｐ−Ｇｌｌｕ）をグルタミン（Ｇ
ｌｌｕ）およびベンゾイルグルタミンＣＢｚ　−Ｇｌｌ
ｕ）でそれぞれ置き換えたベブタイドＥおよびＦのＸ因
子（ＰＸａ）およびウロキナーゼ（ＵＫ）に対する相対
的反応速度は表■のとおりであった。
表　　　■ Ｅ：夏−１−Ｇｌｌｕ−ＧＱｙ−＾ｒｇ−ｐ！ＩＡＰ　
：　Ｂｚ−Ｇｌｌｕ−ＧＱｙ−Ａｒｇ−ｐ！ＩＡ表■か
らＮ−末端ピログルタミン酸またはカルボベンゾキシビ
ログルタンミン酸を存する本発明の基質はＮ−末端グル
タミン酸またはＮ−末端ベンゾイルグルタミン酸を有す
る相当する基質に比較してＸ因子およびウロキナーゼに
対する相対的反応速度が高いことが明らかである。
前記の実施例により生成された基質はっぎの方法で種々
の酵素を定量する際に使用される。
測定の原理は酵素的加水分解により得られる解裂生成物
はもとの基質のスペクトルとは本質的に異なるＵＶスペ
クトルを与えるという事実に基づいている。従ってたと
えば本発明によるすべてのｐ−ニトロアニリド基質は３
１０ｎｍｌこ吸収極大を有し、モル吸光係数は１１１２
００Ｇである。４０５ｎｌにおいてはこれらの基質の吸
収はほぼ完全に消失する。酵素的加水分解においてそれ
らの基質から遊離せしめられたｐ−ニトロアニリンは３
ｇ０ｎ−に吸収極大をｆｆシ、モル吸光係数は１３２０
０であり、それは４０５ａｍにおいてはわずか９６２Ｇ
にまで誠少する。従って分光光学的に４０５ａ−におけ
る吸収を測定することにより生成したｐ−ニトロアニリ
ンの量を追跡することは容易であり、その生成ｍは酵素
的加水分解の速度に比例しており、つぎにその値から酵
素の活性量が決定される。
生成した蛍光性アミンの爪を測定するためには、蛍光光
度計を用いて励起波＆（β−ナフチルアミンおよび４−
メトキシ−β−ナフチルアミンに対しては約３５０ｎａ
であり、モして７−アミノ−４−メヂルークマリンに対
しては３ｇ０ｎｍである）をｆｆする光がその試料に照
射され、そしてつぎに蛍光（β−ナフチルアミンおよび
４−メトキシ−β−ナフチルアミンに対しては約４２０
ｎ−であり、モして７−アミノ−４−メチル−クマリン
に対しては４４０ｎ＊である）を測定すること５二上り
解裂生成物の量が決定される。
表■には合成基質の種々の酵素との反応速度が示される
。その反応速度は各酵素に対する参照基質に関連して（
すなわちその反応速度を１００として）表わされる。参
冊基質のあるものはすでに知られており、そして市場で
入手可能である。
本発明による新規な物質の有用性および現在までシこ入
手可能な基質よりも迅速に種々の酵素により加水分解さ
れるという事実はこの表■から明白である。
特許出願人　　カビ　アクチェボラーグ外１名

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）一般式 Ｒ＿１−ｐ−Ｇｌｕ−Ａ＿１−Ａ＿２−ＮＨ−Ｒ＿２〔
    ただし式中、Ｒ＿１は水素または保護基であり、Ａ＿１
    はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、、Ｉｌｅ、　Ｓｅ
    ｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｉｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであ
    り、Ａ＿２はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｒ＿２は置換
    されていてもよい芳香族炭化水素基であり、そして−Ｎ
    Ｈ−Ｒ＿２は物理化学的に測定しうる基であり、それは
    存在する酵素により解裂せしめられて式Ｈ＿２Ｎ−Ｒ＿
    ２の解裂生成物を生成し、そしてその量を定量すること
    ができる基である〕を有する化合物を基質として使用す
    ることを特徴とするプロテアーゼの定量方法。 ２）−ＮＨ−Ｒ＿２が発色性または蛍光性のある基であ
    ることを特徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の定
    量方法。 ３）−ＮＨ−Ｒ＿２がｐ−ニトロアニリド、β−ナフチ
    ルアミド、４−メトキシ−β−ナフチルアミドまたは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の７−アミノ−４−メチル−クマリン残基であることを
    特徴とする前記特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 ４）Ｒ＿１が第３級ブチルオキシカルボニルまたはベン
    ジルオキシカルボニルであることを特徴とする前記特許
    請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項に記載の
    定量方法。 ５）一般式 Ｒ＿１−ｐ−Ｇｌｕ−Ａ＿１−Ａ＿２−ＮＨ−Ｒ＿２〔
    ただし式中、Ｒ＿１は水素または保護基であり、Ａ＿１
    はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、
    Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｉｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒであり、
    Ａ＿２はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｒ＿２は置換され
    ていてもよい芳香族炭化水素基であり、そして−ＮＨ−
    Ｒ＿２は物理化学的に測定しうる基であり、それは存在
    する酵素により解裂せしめられて式Ｈ＿２Ｎ−Ｒ＿２の
    解裂生成物を生成し、そしてその量を定量することがで
    きる基である〕を有する化合物を含有することを特徴と
    するプロテアーゼを定量するための試薬。 ６）−ＮＨ−Ｒ＿２が発色性または蛍光性のある基であ
    ることを特徴とする前記特許請求の範囲第５項記載の試
    薬。 ７）−ＮＨ−Ｒ＿２がｐ−ニトロアニリド、β−ナフチ
    ルアミド、４−メトキシ−β−ナフチルアミドまたは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の７−アミノ−４−メチル−クマリン残基であることを
    特徴とする前記特許請求の範囲第５項記載の試薬。 ８）Ｒ＿１が第３級ブチルオキシカルボニルまたはベン
    ジルオキシカルボニルであることを特徴とする前記特許
    請求の範囲第５項ないし第７項のいずれかの項に記載の
    試薬。
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