JPS6345397B2 - - Google Patents

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JPS6345397B2
JPS6345397B2 JP54500302A JP50030279A JPS6345397B2 JP S6345397 B2 JPS6345397 B2 JP S6345397B2 JP 54500302 A JP54500302 A JP 54500302A JP 50030279 A JP50030279 A JP 50030279A JP S6345397 B2 JPS6345397 B2 JP S6345397B2
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JP
Japan
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glu
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arg
group
amino
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JP54500302A
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Kaaru Geran Kureson
Reifu Eriku Aureru
Reifu Rogeru Shimonson
Saro Arierii
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Phadia AB
Original Assignee
Kabi AB
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Publication date
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Publication of JPS55500076A publication Critical patent/JPS55500076A/ja
Publication of JPS6345397B2 publication Critical patent/JPS6345397B2/ja
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    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
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Description

請求の範囲 １ 一般式 R1―ｐ―Glu―A1―A2―NH―R2 ［ただし式中、R1は水素または保護基であり、
A1はGly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，
Pro，Pip，PheまたはTyrであり、A2はArgまた
はLysであり、R2はフエニル、ナフチルまたはク
マリル基であり、これらの基はニトロ、低級アル
キルもしくは低級アルコキシで置換されていても
よく、そして―NH―R2は物理化学的に測定しう
る基であり、それは存在する酵素により解裂せし
められて式H2N―R2の解裂生成物を生成し、そ
してその量を定量することができる基である］ を特徴とするプロテアーゼを定量するための容易
に解裂する酵素基質。 ２ ―NH―R2が発色性または蛍光性のある基で
あることを特徴とする前記第１項記載の酵素基
質。 ３ ―NH―R2がｐ―ニトロアニリド、β―ナフ
チルアミド、４―メトキシ―β―ナフチルアミド
または式 の７―アミノ―４―メチル―クマリン残基である
ことを特徴とする前記第１項記載の酵素基質。 ４ R1が第３級ブチルオキシカルボニルまたは
ベンジルオキシカルボニルであることを特徴とす
る前記第１項記載の酵素基質。 ５ 一般式 R1―ｐ―Glu―A1―A2―NH―R2 ［ただし式中、R1は水素または保護基であり、
A1はGly，Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，
Pro，Pip，PheまたはTyrであり、A2はArgまた
はLysであり、R2はフエニル、ナフチルまたはク
マリル基であり、これらの基はニトロ、低級アル
キルもしくは低級アルコキシで置換されていても
よく、そして―NH―R2は物理化学的に測定しう
る基であり、それは存在する酵素により解裂せし
められて式H2N―R2の解裂生成物を生成し、そ
してその量を定量することができる基である］ を有するプロテアーゼのための容易に解裂する酵
素基質を製造するにあたり、式Ｈ―A1―A2―
NH―R2（式中A1，A2およびR2は前述したものと
同一である）を有する化合物を式R1―ｐ―Glu―
OH（式中R1は前述したものと同一である）を有
する化合物と反応させ、所望により、生成物にお
ける―NH―R2を酵素分解により除去し、次いで
他の―NH―R2を該生成物に結合させることを特
徴とする、前記の式を有するプロテアーゼのため
の容易に解裂する酵素基質の製造法。 ６ ―NH―R2が発色性または蛍光性のある基で
あることを特徴とする前記第５項記載の酵素基質
の製造法。 ７ ―NH―R2がｐ―ニトロアニリド、β―ナフ
チルアミド、４―メトキシ―β―ナフチルアミド
または式 の７―アミノ―４―メチル―クマリン残基である
ことを特徴とする前記第５項記載の酵素基質の製
造法。 ８ R1が第３級ブチルオキシカルボニルまたは
ベンジルオキシカルボニルであることを特徴とす
る前記第５項ないし第７項のいずれかの項に記載
の酵素基質の製造法。 技術分野 本発明はセリンプロテアーゼおよびSH―プロ
テアーゼを定量する際にか、またはセリンプロテ
アーゼが生成されるか、阻害されるか、または消
費される反応を研究する際にか、またはそのよう
な反応に影響を及ぼすか、またはそれに関与する
因子を決定する際に試薬として使用することを目
的とした新規な容易に解裂する基質に関する。 背景技術 最近多数の合成ペプチド基質が記載されてい
る。これらの大部分はそのＮ―末端アミノ酸のア
ミノ基がアシル基により封鎖されているか、また
は遊離であるが、その場合にはＤ―配置を有する
ペプチド鎖として存在する。Ｃ―末端アミノ酸は
発色性または螢光性の基により封鎖されていて、
それは酵素の基質との反応において解裂せしめら
れる。このようにして生成し且つ遊離した発色性
または螢光性の基は分光法または螢光分光法によ
り定量的に測定することができる。酵素活性は単
位時間あたり遊離した解裂生成物の量を測定する
ことにより計算することができる。 発明の開示 短いペプチド鎖は基質の酵素に対する親和性に
関して重要である。この点においてＮ―末端アミ
ノ酸はＬ―型でアシル化されたアミノ基を有する
か、またはＤ―型で遊離のアミノ基を有すること
が必須であるように思われる。今や、Ｎ―末端ピ
ログルタミン酸を有する基質は多種のセリンプロ
テアーゼにより極めて容易に解裂せしめられるこ
とが本発明者により確認された。遊離型ではなく
閉環することによりアシル化されたα―アミノ基
を有するピログルタミン酸すなわちグルタミン酸
のラクタムは、酵素を定量する際に基質として使
用することを目的としたペプチドにおいて以前に
は使用されたことがない。本発明による新規な発
色性の基質またはその塩はつぎの一般式 R1―ｐ―Glu―A1―A2―NH―R2 〔ただし式中、R1は水素または保護基好まし
くは第３級ブチルオキシカルボニルまたはベンジ
ルオキシカルボニルであり、A1はアミノ酸Gly，
Ala，Val，Leu，Ile，Ser，Thr，Pro，Pip，
PheまたはTyrから選ばれ、A2はArgまたはLys
であり、R2はフエニル、ナフチルまたはクマリ
ル基であり、これらの基はニトロ、低級アルキル
もしくは低級アルコキシで置換されていてもよ
く、そして―NH―R2は物理化学的に測定しうる
基好ましくは発色性または螢光性の基を構成し、
それは上記の酵素により解裂せしめられて式
H2N―R2の解裂生成物を生成しそしてこの量を
定量することができる〕により表わされる。 本発明による新規な基質を合成する際には、ペ
プチド化学においてよく知られている通常の保護
基およびカツプリングの方法が使用される。 合成の原理は最初に結合された測定可能な基
（上記の式によれば―HN2―R2であり、それはカ
ツプリングの際にカルボキシルの保護基として役
立つ）を有するか、または除去しうるカルボキシ
ルの保護基を有するＣ―末端アルギニルまたはリ
ジル基へのアミノ酸の段階的カツプリングであ
り、後者の場合測定可能な基は保護されたトリペ
プチド誘導体に結合せしめられるか、またはＮ―
末端が保護されたジペプチド部分が別々に合成さ
れ、そしてつぎに前記の方法により測定可能な基
を有するかまたは有しないアルギニルまたはリジ
ル基に結合せしめられる。 本発明によれば、前記酵素基質は、式Ｈ―A1
―A2―NH―R2（式中A1，A2およびR2は前述し
たものと同一である）を有する化合物を式R1―
ｐ―Glu―OH（式中R1は前述したものと同一であ
る）を有する化合物と反応させ、所望により、生
成物における―NH―R2を酵素分解により除去
し、次いで他の―NH―R2を該生成物に結合させ
ることにより製造される。 これらの合成経路のいずれが選ばれるにせよ、
中間および最終生成物は再結晶および／またはゲ
ル過クロマトグラフイーにより精製される。 本発明を以下の実施例により説明する。 溶出物および生成物の薄層クロマトグラフイー
による分析においては、シリカゲルF254（メルク
社製）をコーテイングしたガラスプレートが吸着
媒体として使用される。使用される溶媒系は以下
に示される。 Ａ：ｎ―ブタノール：酢酸：水〔３：２：１
（容量比）〕 P1：クロロホルム：メタノール〔９：１（容量
比）〕 薄層クロマトグラフイーを行なつたのち、それ
らのプレートは最初にUV光（254nm）で検討さ
れる。つぎにニンヒドリンを噴霧し、そしてつぎ
にジカルボキシジン／クロラインで処理する。記
載されたRf値は単一のクロマトグラフから得ら
れた結果である。 以下において使用される略号はつぎのとおりで
ある。 略号はアミノ酸残基を表わす。遊離のアミノ酸
またはペプチドはアミノ基の場合にはＨ―で、そ
してカルボキシル基の場合には―OHで示され
る。アミノ基は常に左側に、そしてカルボキシル
基は右側に示される。 特に記載しない限りすべてのアミノ酸はＬ―配
置を有するが、ただしGlyは例外である。 Ala＝アラニン Phe＝フエニルアラニン Arg＝アルギニン Pip＝ピペコール酸 Gly＝グリシン Pro＝プロリン Ile＝イソロイシン Ser＝セリン Leu＝ロイシン Thr＝スレオニン Lys＝リジン Thr＝チロシン ｐ―Glu＝ピログルタミン酸 Val＝バリン さらに以下の略号が使用される。 HOAc＝酢 酸 Bz＝ベンゾイル Cbo＝カルボベンゾキシ DCCI＝ジシクロヘキシルカルボジ
イミド PCl3＝三塩化燐 DMF＝ジメチルホルムアミド Et3N＝トリエチルアミン HOBT＝ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール DCHA＝ジシクロヘキシルアミン DCU＝ジシクロヘキシル尿素 EtOH＝エタノール MeOH＝メタノール EtOAc＝酢酸エチル OpNP＝ｐ―ニトロフエノキシ pNA＝ｐ―ニトロアニリド TFM＝トリフルオロ酢酸 β―NA＝β―ナフチルアミド ４―MeO―β―NA＝４―メトキシ―β―ナフチ
ルアミド ７―Ａ―４―Ｍ―Ｃ＝７―アミノ―４―メチル―
クマリン 実施例 ｐ―Glu―Gly―Arg―PNA・HCl（m.
w.＝498.9） ａ Cbo―Gly―Arg（NO2）PNA （m.
w.530.5） 濃HOAc175mlおよびHOAc中の5.6M HBr105
mlをCbo―Arg（NO2）―pNA35ｇ（0.074モル）
に加える。この混合物を反応せしめ、そしてその
反応溶液が透明になつたのちに30分間撹拌する。
つぎにこの混合物を急激に撹拌しながら無水エー
テル約２に注ぐ。生成した沈澱を過し、そし
て無水エーテルで洗浄し、つぎに水酸化ナトリウ
ム上で真空乾燥する。得られたＨ―Arg（NO2）
―pNAの臭化水素酸塩を蒸留した無水の
DMF150mlに溶解し、そして湿らせたPH試験紙を
その反応混合物の上にかざした際に弱塩基性を示
すようになるまでEt3Nを用いて低温（−10℃）
で中和する（通常HBrの約1.5当量が中和のため
に使用される）。生成したEt3NHBrを別する。
冷却状態でこの反応混合物にCbo―Gly―
OpNP26.8ｇ（0.81モル、1.1当量）を加え、30分
後にさらにEt3N5.2ml（1/2当量）を加える。こ
の混合物を室温で一夜反応せしめ、その後真空下
に蒸発させると油状物が得られる。この油状物を
２％水性炭酸水素ナトリウム溶液中で摩砕し、つ
ぎに熱メタノールに溶解し、そして撹拌且つ冷却
下に結晶化する。生成した結晶を別し、そして
冷メタノールで洗浄する。TLCによりごく少量
の不純物が示されるので、その生成物を同一の溶
媒から再結晶する。これによりTLC上で純粋な
白色結晶が得られる。 収量 Ia 34ｇ（86％） Rf＝0.20（P1） 〔α〕23 D−35.4゜（c0.3、MeOH） Ib′ Cbo−ｐ−Glu−OH（m.w.＝263.3） CbO−Glu−OH56.3ｇ（0.20モル）を
EtOAc400mlに溶解し、HtOAc60mlに溶解した
DCCI49.4ｇ（0.24モル）を加え、そして氷浴中
で撹拌する。２時間後に生成したDCUを過し、
そして残留している溶液を蒸発乾固する。生成物
（Cbo―Gluの酸無水物）をEtOAcおよび石油エ
ーテルから結晶化する。この酸無水物をジオキサ
ン120mlおよびエーテル260mlに溶解し、そしてつ
ぎにDCHA48mlをエーテルに溶解し容量100mlに
した溶液を加える。しばらくするとCbo―ｐ―
Glu・DCHAが沈澱する。それを約１時間撹拌
し、つぎに生成したDCHA塩を別し、そして
エーテルおよびEtOAcで洗浄する。このDCHA
塩をEtOAcに懸濁し、水に溶解した硫酸水素カ
リウム25ｇ（0.18モル）とともに振盪するとこの
ようにして生成したCbo―ｐ―Glu―OHは
EtOAc相に移行する。そのEtOAc相を水中の10
％塩化ナトリウムで洗浄し、そして硫酸ナトリウ
ム上で乾燥する（その際生成物が沈澱する危険性
がある）。EtOAc相を少量になるまで蒸発させ、
そして石油エーテルで沈澱させる。これにより
Ib′が重い結晶として得られ、それはTLCによれ
ば純粋である。 収量 Ib′ 36.9ｇ（80％） Rf＝0.45(A) 〔α〕24 D−30.3゜（c1.0 MeOH） Ib Cbo−ｐ−Glu―GIy−Arg（NO2）pNA（m.
w.641.6） Iaに記載された操作によりHBrを用いてCbo―
Gly―Arg（NO2）pNAから保護基を除去するこ
とにより得られたＨ―Gly―Arg―（NH2）
pNaHBr10.25ｇ（18.3ミリモル）を無水DMF35
mlに溶解し、そして湿つたPH試験紙が塩基性を示
すまでEt3Nを用いて低温（−10℃）で中和する。
生成したEtNHBrを別する。その反応混合物
にHOBT2.47ｇ（18.3ミリモル）およびCbo―ｐ
―Glu―OH（Ib′）5.26ｇ（20ミリモル）を加え、
その後少量のDMFに溶解したDCCI4.53ｇ（22ミ
リモル）を低温で加える。この混合物を室温で一
夜反応せしめ、つぎにその反応溶液を蒸発させる
と油状物が得られる。この油状物を水中の２％炭
酸水素ナトリウムおよび純粋な水で摩砕する。得
られた固体状化合物を少量のアセトンに溶解し、
そしてつぎに熱メタノールおよび少量の水を加え
る。冷却し且つ撹拌すると生成物は結晶化し、そ
して生成した結晶を別する。得られたIbは
TLCによれば純粋である。注意深く真空乾燥し
たのちIb8.90ｇ（76％）が得られる。 Rf＝0.06（P1） 〔α〕21 D−21.5゜（c0.8DMF） Ｉ Ib0.8ｇ（1.25ミリモル）をアニソール0.6mlの
存在下に０℃で１時間HF30mlで処理して保護基
を除去する。真空下に蒸発させたのちその生成物
を２％HOAc約30mlに溶解し、そして少量のエー
テルで洗浄する。２％HOAc中セフアデツクスＧ
―15（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）
のカラムを用いて水相をクロマトグラフイーに付
し、同一の媒質を用いて溶出する。純粋なＩのア
セテートを含む部分を凍結乾燥し、そしてエタノ
ール―水（１：１）を用いてクロリド型のQAE
―25（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）
のカラムでイオン交換を行ない同一媒質で溶出す
る。 純粋なＩの塩酸塩を含む部分を凍結乾燥する。 収量 Ｉ 485mg（78％） TLC〔Rf＝0.29(A)〕１個のスポツトを示すだけ
である。 〔α〕24 D−54.1゜（c1.0、50％HOAc／H2O） 表Ｉに記載された実施例〜は原則として
上記の実施例と同様の方法で行なわれる。従つて
物理的データ、収率ならびにカツプリングおよび
精製の方法だけがこの表に記載される。 実施例 ｐ―Glu―GIy―Arg―４―MeO―
β―NA.HCl（m.w.534.0） ａ ｐ―Glu―Gly―Arg―OH・HCl（m.
w.378.8） トリプシン（ノボ社製、1mM HCl1mlあたり
トリプシン2.0mgを含む溶液400μ）を0.1M水性
炭酸水素ナトリウム100ml中ｐ―Glu―Gly―Arg
―PNA・HCl（Ｓ―2444）250mg（0.50ミリモル）
の溶液に加える。pNAの遊離は分光光度計によ
り405nmにおいて追跡される。その遊離は約45分
後に完了し、その後この溶液をHOAcでPH〜４ま
で酸性にする。つぎにそれを蒸発乾固し、メタノ
ールに溶解し、そしてメタノール中LH―20（フ
アルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）のカラ
ムを用いてクロマトグラフイーに付し同一の媒質
で溶出する。純粋な酸ａを含む部分を蒸発さ
せ、水に溶解し、そして凍結乾燥する。ａの
収量は167mg（88％）であり、それはTLCによれ
ば純粋である。 Rf＝0.08(A) 無水ピリジン450μl中PCl3 27μl（0.25ミリモル）
の溶液を湿気を含まない状態でそして氷浴中で無
水ピリジン2.25ml中４―MeO―β―NA105mg
（0.50ミリモル）の溶液に加える。室温で約45分
間放置したのち、前記の操作により生成された
ａを全部加える。反応が終わつた時点で（約１
時間後）その反応混合物を（減圧下で）蒸発させ
ると暗赤色油状物が得られる。この油状物を少量
のエタノール―水（１：１）に溶解し、そしてエ
タノール―水（１：１）中クロリド型のQAE―
25（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社製）
のカラムに加え同一媒質で溶出する。殆んど純粋
なの塩酸塩を含む部分を蒸発させ、再び少量
のエタノール―水（１：１）に溶解し、そしてそ
の操作をくり返す。このようにして得られた
の塩酸塩は純粋であり、そしてすべてのアルコー
ルを蒸発させたのちにそれを凍結乾燥する。 収量 85mg（36％） TLC〔Rf＝0.24mg(A)〕により１個のスポツトだ
けが示される。 〔α〕22 D−45.7゜（c0.6、50％HOAc／H2O） 実施例 実施例と同様の操作で行なうが、ただしア
ミンとして４―MeO―β―NA・HClの代わりに
７―Ａ―４―Ｍ―C88ml（0.50ミリモル）を使用
する。 収量 84mg（32％） TLC〔Rf＝0.25(A)〕により１個のスポツトだけ
が示される。 〔α〕25 D―51.5゜（c1、50％HOAc／H2O） 実施例〜と同様にして化合物（ｐ―
Glu―Leu―Arg―pNA）および（ｐ―Glu
―Tyr―Arg―pNA）を製造した。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】 問題の酸素に対する参照基質の感受性：
【表】 参考までに、前記化合物、、、および
におけるピログルタミン（ｐ―Glu）をグルタミ
ン（Ｈ―Glu）で置き換えたペプタイドＡ、Ｂ、
ＣおよびＤの相対的反応速度は表のとおりであ
つた。
【表】 表および表から、Ｎ―末端ピログルタミン
酸を有する本発明の基質はＮ―末端グルタミン酸
を有する相当する基質に比較してプラスミンおよ
び（または）トリプシンに対する相対的反応速度
が高いことが明らかである。 さらに前記化合物およびXIIならびに前記化合
物におけるピログルタミン（ｐ―Glu）をグル
タミン（Glu）およびベンゾイルグルタミン（Bz
―Glu）でそれぞれ置き換えたペプタイドＥおよ
びＦのＸ因子（FXa）およびウロキナーゼ
（UK）に対する相対的反応速度は表のとおり
であつた。
【表】 表からＮ―末端ピログルタミン酸またはカル
ボベンゾキシピログルタミン酸を有する本発明の
基質はＮ―末端グルタミン酸またはＮ―末端ベン
ゾイルグルタミン酸を有する相当する基質に比較
してＸ因子およびウロキナーゼに対する相対的反
応速度が高いことが明らかである。 除去することができそして物理化学的に測定する
ことができる基を有する基質を用いてプロテアー
ゼの定量 前記の実施例により生成された基質はつぎの方
法で種々の酵素を定量する際に使用される。 測定の原理は酵素的加水分解により得られる解
裂生成物はもとの基質のスペクトルとは本質的に
異なるUVスペクトルを与えるという事実に基づ
いている。従つてたとえば本発明によるすべての
ｐ―ニトロアニリド基質は310nmに吸収極大を有
し、モル吸光係数は約12000である。405nmにお
いてはこれらの基質の吸収はほぼ完全に消失す
る。酵素的加水分解においてそれらの基質から遊
離せしめられたｐ―ニトロアニリンは380nmに吸
収極大を有し、モル吸光係数は13200であり、そ
れは405nmにおいてはわずか9620にまで減少す
る。従つて分光光学的に405nmにおける吸収を測
定することにより生成したｐ―ニトロアニリンの
量は追跡することは容易であり、その生成量は酵
素的加水分解の速度に比例しており、つぎにその
値から酵素の活性量が決定される。 生成した螢光性アミンの量を測定するために
は、螢光光度計を用いて励起波長（β―ナフチル
アミンおよび４―メトキシ―β―ナフチルアミン
に対しては約350nmであり、そして７―アミノ―
４―メチル―クマリンに対しては380nmである）
を有する光がその試料に照射され、そしてつぎに
螢光（β―ナフチルアミンおよび４―メトキシ―
β―ナフチルアミンに対しては約420nmであり、
そして７―アミノ―４―メチル―クマリンに対し
ては440nmである）を測定することにより解裂生
成物の量が決定される。 表には合成基質の種々の酵素との反応速度が
示される。その反応速度は各酵素に対する参照基
質に関連して（すなわちその反応速度を100とし
て）表わされる。参照基質のあるものはすでに知
られており、そして市場で入手可能である。 本発明による新規な物質の有用性および現在ま
でに入手可能な基質よりも迅速に種々の酵素によ
り加水分解されるという事実はこの表から明白
である。
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