JPH0360837B2 - - Google Patents
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Description
産業上の利用分野
人間の血液中にはC1−エステラーゼプロ酵素
という名前で知られている作用物質が含まれ、こ
れは抗体と抗原との結合作用下に活性酵素C1−
エステラーゼに活性化される。この酵素は補体系
でカスケード状に他のプロ酵素を活性酵素に活性
化する。これらの活性化された酵素は細菌又は死
滅した赤血球の細胞膜を溶解し、それ故免疫学的
な防御の際に重要な役割を果たす。血しようは
C1−エステラーゼを抑制しかつC1−エステラー
ゼインヒビターと呼ばれる重要なインヒビターも
含有する。炎症の場合、C1−エステラーゼが活
性化され、その際に血液のエステラーゼインヒビ
ター濃度に応じて補体系は迅速に又は緩慢に活性
化される。臨床の立場からは、そのような場合に
血液中のC1−エステラーゼ濃度もC1−エステラ
ーゼインヒター濃度も測定することが望ましい。 従来の技術 現在この測定は煩雑で殆んど正確ではない免疫
学的及び滴定による方法で実施される〔W.J.
Canady及びその他共著、“Immunochemistry”、
13巻、229〜233頁(1976年):D.Ogston及びその
他共著、“Thrombosis Research”、9巻、217〜
222頁(1976年)参照〕。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題はC1−エステラーゼの測定をよ
り迅速にかつ正確に実施することである。 問題点を解決するための手段 ところで、本発明の目的である一定の簡単なペ
プチド誘導体を基質として使用する場合に、前記
の課題が解決されることが判明した。 本発明は、式: 〔式中 R1は酵素加水分解により着色又は螢光化合物
の形成下に脱離可能であり、芳香族基又はヘテロ
環式基で置換されている色素形成アミノ基を表わ
し、 R2は水素を表わすか又は a 炭素原子2〜6個を有する直鎖状又は分枝鎖
状のアルカノイル基、 b シクロヘキシルカルボニル基、 c アルカノイル中に炭素原子2〜4個を有する
ω−カルボキシル−、ω−メトキシカルボニル
−又はω−エトキシカルボニル−アルカノイル
基、 d アルコキシ中に炭素原子1〜4個を有する直
鎖状又は分枝鎖状のアルコキシカルボニル基、 e アルキル中に炭素原子1又は2個を有するア
ルキルスルホニル基もしくはフエニル−又はp
−トルイル−スルホニル基、 f 置換されていないか又は置換されているベン
ゾイル基、又は g 核が置換されていないか又は置換されている
ベンジルオキシカルボニル基を表わし、 R3は核が置換されていないか又は置換されて
いるベンジル基を表わし、 Xはグリシル基又はアラニル基を表わし、 Yは単結合であるか又は式:
という名前で知られている作用物質が含まれ、こ
れは抗体と抗原との結合作用下に活性酵素C1−
エステラーゼに活性化される。この酵素は補体系
でカスケード状に他のプロ酵素を活性酵素に活性
化する。これらの活性化された酵素は細菌又は死
滅した赤血球の細胞膜を溶解し、それ故免疫学的
な防御の際に重要な役割を果たす。血しようは
C1−エステラーゼを抑制しかつC1−エステラー
ゼインヒビターと呼ばれる重要なインヒビターも
含有する。炎症の場合、C1−エステラーゼが活
性化され、その際に血液のエステラーゼインヒビ
ター濃度に応じて補体系は迅速に又は緩慢に活性
化される。臨床の立場からは、そのような場合に
血液中のC1−エステラーゼ濃度もC1−エステラ
ーゼインヒター濃度も測定することが望ましい。 従来の技術 現在この測定は煩雑で殆んど正確ではない免疫
学的及び滴定による方法で実施される〔W.J.
Canady及びその他共著、“Immunochemistry”、
13巻、229〜233頁(1976年):D.Ogston及びその
他共著、“Thrombosis Research”、9巻、217〜
222頁(1976年)参照〕。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題はC1−エステラーゼの測定をよ
り迅速にかつ正確に実施することである。 問題点を解決するための手段 ところで、本発明の目的である一定の簡単なペ
プチド誘導体を基質として使用する場合に、前記
の課題が解決されることが判明した。 本発明は、式: 〔式中 R1は酵素加水分解により着色又は螢光化合物
の形成下に脱離可能であり、芳香族基又はヘテロ
環式基で置換されている色素形成アミノ基を表わ
し、 R2は水素を表わすか又は a 炭素原子2〜6個を有する直鎖状又は分枝鎖
状のアルカノイル基、 b シクロヘキシルカルボニル基、 c アルカノイル中に炭素原子2〜4個を有する
ω−カルボキシル−、ω−メトキシカルボニル
−又はω−エトキシカルボニル−アルカノイル
基、 d アルコキシ中に炭素原子1〜4個を有する直
鎖状又は分枝鎖状のアルコキシカルボニル基、 e アルキル中に炭素原子1又は2個を有するア
ルキルスルホニル基もしくはフエニル−又はp
−トルイル−スルホニル基、 f 置換されていないか又は置換されているベン
ゾイル基、又は g 核が置換されていないか又は置換されている
ベンジルオキシカルボニル基を表わし、 R3は核が置換されていないか又は置換されて
いるベンジル基を表わし、 Xはグリシル基又はアラニル基を表わし、 Yは単結合であるか又は式:
【式】(式中R4はベン
ジル基、フエニル基、シクロヘキシル基、シクロ
ヘキシルメチル基、4−ヒドロキシベンジル基、
4−ヒドロキシシクロヘキシルメチル基を表わし
かつmは数値ゼロでありかつYにより定義される
アミノ酸はL−又はD−配置を有するかあるいは
R4は水素を表わしかつmは数値0,1又は2を
表わす)の基を表わす〕のペプチド誘導体もしく
は鉱酸又は有機酸とのその塩に関するが、ただし
C2H5CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNAを除
く。 例えばR1はp−ニトロフエニルアミノ基、1
−又は2−ナフチルアミノ基、4−メトキシ−2
−ナフチルアミノ基、4−メチル−7−クマリル
アミノ基又は1,3−ジ(メトキシカルボニル)
−5−フエニルアミノ基であつてよい。 例えばR3はベンジル基、4−メチルベンジル
基、4−メトキシベンジル基、もしくは2−、3
−又は4−クロルベンジル基であつてよい。 R2が炭素原子2〜6個を有するアルカノイル
基又は炭素原子数1〜4個を有するアルコキシカ
ルボニル基を表わしかつYが単結合を表わし、 R3がベンジル基を表わしかつR1及びXが前記
のものを表わすペプチド誘導体がC1−エステラ
ーゼに対して特に高い敏感さを有する。 前記の一般式のペプチド誘導体の例として次の
化合物が挙げられる: BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH,2AcOH.H−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg
−pNA,Ac−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−
pNA.AcOH,CH3OCO−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH,C2H5OCO−Lys(ε−Cbo)
−Gly−Arg−pNA.AcOH,iso−ButOCO−Lys
(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,
CH3CH2CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH,CH3(CH2)2CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH,CH3CH2OCO−CH2−CO−
Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,BOC
−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−pNA.AcOH,H
−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−
pNA.2CF3COOH,Ac−Lys(ε−Cbo)−Ala−
Arg−pNA.AcOH,CH3OCO−Lys(ε−Cbo)−
Ala−Arg−pNA.AcOH,BOC−Gly−Lys(ε
−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,2CF3COOH.
H−Gly−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA,
CH3O−CO−GlyLys(ε−Cbo)−Gly−Arg−
pNA.AcOH,CH3−CH2−CO−Gly(ε−Cbo)
−Gly−Arg−pNA.AcOH。 本発明によるペプチド誘導体はペプチド合成で
常用の方法で、例えば次に記載の方法により製造
することができる: 1 色素形成基R1をC−末端アルギニンのカル
ボキシ基に結合させ、その際にアルギニンのα
−アミノ基は保護基、例えばカルボベンゾキシ
基又はt−ブトキシカルボニル基により及びア
ルギニンのδ−グアニジル基は例えばHClによ
るプロトン化、ニトロ化又はトシル化により保
護する。C−末端基R1も段階的なペプチド鎖
の形成の際に保護基として有用である。他の保
護基は、所望のペプチド鎖が完全に構成される
まで他のアミノ酸誘導体を結合させるために必
要に応じて選択的に脱離することができる。最
後に、R1に作用を及ぼさずに、残留している
保護基を完全に脱離することができる〔例えば
Miklos及びその他共著、“Peptide
Synthesis”、163〜165頁(1966年)、
Interscience Publishers出版参照〕。 2 初めにペプチド鎖(Bodanskyによる前記文
献)を構成するが、その際アルギニンのC−末
端カルボキシル基を常用のエステル基、例えば
メトキシ基、エトキシ基又はベンジルオキシ基
で保護する。エステル基はアルカリ性加水分解
により脱離することができ、但しt−ブトキシ
基は選択的にトリフルオロ酢酸を用いて脱離し
なければならない。アルギニンのδ−グアニジ
ル基がプロトン化されている場合には、前記の
エステル基はトリプシンにより脱離し、その際
ラセミ化は起らない。これに次いで、色素形成
基R1を結合させる。アルギニンのδ−グアニ
ジノ基がニトロ基又はトシル基により及びペプ
チド誘導体のN−末端α−アミノ基がカルボベ
ンゾキシ基、p−メチル−、p−メトキシ−又
はp−クロルベンジルオキシカルボニル基もし
くはt−ブトキシ基により保護されている場合
これらの保護基も同時に脱離する。脱離は保護
されたペプチド誘導体を室温で無水HFで処理
することにより実施することができ、その際に
前記のすべてのアミノ−もしくはδ−グアニジ
ノ保護基は脱離する。脱離は、保護されたペプ
チド誘導体がニトロ−又はトシル保護基を含ま
ない場合には、氷酢酸中の2N−HBrを用いて
室温で処理しても実施することができる。 実施例 次の実施例で本発明によるペプチド誘導体の製
造を詳説する。温度はセツ氏である。 実施例で得られた溶出液及び生成物の分析は二
酸化珪素ゲルで塗布したガラス板(Merck社、
F254)を使つて薄層クロマトグラフイにより行
なつた。薄層クロマトグラムは次の溶剤系で展開
させた:n−ブタノール/酢酸/水(3:1:
1)。 次の略語を使つた: Ac=アセチル AC2O=アセトアンヒドリド AcOH=酢酸 Ala=L−アラニン β−Ala=β−アラニン Arg=L−アルギニン BOC=t−ブトキシカルボニル γ−But=4−アミノ酪酸 BZ=ベンゾイル BZ2O=無水安息香酸 CHA=L−3−シクロヘキシルアラニン CHG=L−2−シクロヘキシルグリシン D−CHG=D−2−シクロヘキシルグリシン CHT=L−3−(4−トビロキシシクロヘキシ
ル)アラニン=核水素化チロシン Cbo=カルボベンゾキシ DMF=ジメチルホルムアミド DPA=5−アミド−イソフタル酸−ジメチルエ
ステル DSC=薄層クロマトグラムもしくは−グラフイ Et=エチル EtO=エトキシ Et3N=トリエチルアミン Gly=グリシン HMPTA=N,N,N′,N′,N″,N″−ヘキシ
ルメチルリン酸トリアミド iso−BuO=イソブトキシ LMS=溶剤系 Lys=L−リジン MCA=7−アミド−4−メチルクマリン MeO=メトキシ MeOH=メタノール NA=ナフチルアミド OpNP=p−ニトロフエノキシ pNA=p−ニトロアニリド Ph′Gly=L−2−フエニルグリシン Phe=L−フエニルアラニン D−Phe=D−フエニルアラニン Suc=スクシニル THF=テトラヒドロフラン Tos=p−トルエンスルホニル 特に記載のない限りアミノ酸はL形である。 例 1 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH 1a Cbo−Arg−pNA.HCl 内容積250mlの三首丸底フラスコ中で、P2O5上
で真空乾燥させた、無水HMPTA90ml中のCbo−
Arg−OH.HCl16.0g(47.0ミリモル)を湿気の
遮断下に20゜で溶解した。室温で得られた溶液に
初めにHMPTA10ml中のEt3N4.74g(47.0ミリ
モル)の溶液を、次にp−ニトロフエニルイソシ
アネート(100%の過剰)16.4g(100ミリモル)
を少量ずつ添加した。20℃で24時間の反応後に
HMPTAを真空中で殆んど留去させた。残渣を
数回30%−AcOHで抽出した。残渣を廃棄した。
合したAcOH抽出物を更に精製するために30%−
AcOHで平衡化した“セフアデツクス”−G−15
−カラム上に施しかつ30%−AcOHで溶離した。
トリプシン処理によりp−ニトロアニリンの遊離
下に脱離し得るAcOH溶出液の画分を凍結乾燥さ
せた。無定形粉末12.6gが得られ、これはDSCに
おいてLMS中で均一であつた。元素分析及び実
験式C20H25N6O5Clからの計算により次の数値が
得られた:C=51.29%(51.67%)、H=5.48%
(5.42%)、N=17.92%(18.08%)、Cl=7.50%
(7.63%)。カツコ内の数値は計算値である。 1b 2HBr.H−Arg−pNA 湿分の遮断下に化合物1a4.65g(10ミリモル)
を氷酢酸中の2N−HBr40mlで20゜45分間撹拌下に
処理した。その際に、アミノ酸誘導体はCO2発生
下に溶解した。反応溶液を激しい撹拌下に無水エ
ーテル250mlに滴加した。その際に2HBr.H−
Arg−pNAが沈殿した。エーテル相を吸引濾別
し、次に固相を1回当り100mlの無水エーテルで
4回洗浄して、副生成物として形成した臭化ベン
ジル並びに過剰分のHBr及びAcOHを除去した。
残渣をMeOH50ml中に溶かし、Et3NでPH4.5に調
節しかつ真空中30℃で濃縮乾固した。そのように
して得られた生成物をMeOH75ml中に溶かしか
つMeOHで平衡化した“セフアデツクス”LH−
20(架橋デキストランゲル)カラム中を流動させ
た。溶出液の1つの画分から、DSCにおいて
LMS中で均一であつた無定形化合物1b4.18g
(理論量の91.6%)が得られた。元素分析及び実
験式:C12H20N6O3Br2からの計算から次の数値
が得られた:C=31.15%(31.60%)、H=4.35%
(4.42%)、N=18.84%(18.43%)、Br=34.81%
(35.03%) 1c Cbo−Gly−Arg−pNA.HBr 化合物1b4.5g(10ミリモル)を新しく蒸留し
たDMF30ml中に溶解しかつ−10゜に冷却後撹拌下
にEt3N1.40ml(10ミリモル)を加えた。形成し
たEt3N.HBrを濾取しかつ少量の冷いDMFで洗
つた。濾液に撹拌下に−10でCbo−Gly−
OpNP3.65g(11ミリモル)を添加しかつこの混
合物を水分の遮断下に2〜3時間反応させた。そ
の際反応溶液の温度は徐々に約20に上昇した。こ
の溶液を再び−10に冷却しかつEt3N0.70ml(5
ミリモル)で緩衝させた。反応溶液を−10゜で約
2時間及び室温で3時間反応させた。この処理を
もう一度Et3N0.70mlで繰返し、更に16時間後に
反応溶液を真空中50゜で濃縮乾固させた。残渣を
50%−酢酸75ml中に溶かしかつ50%−AcOHで平
衡化した“セフアデツクス”G−15のカラム上で
ゲル濾過により精製した。トリプシン処理により
p−ニトロアニリンの遊離下に分離するAcOH溶
出液の画分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を
MeOH150ml中に溶かしかつ再び濃縮乾固した。
得られた残渣を真空乾燥箱中でP2O5上で60゜で乾
燥後、DSCにおいてLMS中で均一であつた無定
形化合物1c5.85g(理論量の88.3%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C22H28N7O6Brからの
計算により次の数値が得られた:C=46.33%
(46.65%)、H=5.04%(4.98%)、N=17.88%
(17.31%)及びBr=14.20%(14.11%) 1d 2HBr.H−Gly−Arg−pNA 化合物1c4.56g(8ミリモル)を水分遮断下に
2N−HBr32mlと氷酢酸32ml中で撹拌下に40分間
20゜で処理した。その際に、このペプチド誘導体
は徐々にCO2発生下に溶けた。反応溶液を激しい
撹拌下に無水エーテル250mlに滴加すると、
2HBr.H−Gly−Arg−pNAが沈殿した。エーテ
ル相を吸引濾別し、次いで固相を無水エーテル1
回当り100mlで4回洗浄して、副生成物として形
成した臭化ベンジル並びに過剰分のHBr及び
AcOHを殆んど除去した。残渣をMeOH50ml中
に溶解した。Et3NでPH4.5に調節後、溶液を真空
中30゜で濃縮乾固した。このようにして得られた
残渣をMeOH50ml中に溶解しかつMeOHで平衡
化した“セフアデツクス”LH−20のカラム上で
精製した。トリプシン処理によりp−ニトロアニ
リンの遊離下に分離するMeOH溶出液の画分を
真空中30゜で濃縮乾固した。得られた残渣を真空
乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいてLMS
中均一である無定形化合物1d3.78g(理論量の
92.1%)が得られた。元素分析及び実験式:
C14H23N7O4Br2からの計算により次の数値が得
られた:C=32.31%(32.77%)、H=4.59%
(4.52%)、N=19.47%(19.11%)及びBr=30.78
%(31.14%)。 1e BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
HBr 化合物1d2.57g(5ミリモル)を新しく蒸留し
たDMF20ml中に溶解しかつ−10゜に冷却後撹拌下
にEt3N0.70ml(5ミリモル)を加えた。形成し
たEt3N.HBrを濾取しかつ冷い少量DMFで後洗
浄した。濾液に−10゜で撹拌下にBOC−Lys(ε−
Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモル)を添加した。
反応混合物を水分遮断下に2〜3時間反応させ、
次いで反応溶液の温度が徐々に約20゜に上昇した。
この溶液を再び−10゜に冷却しかつEt3N0.35ml
(2.5ミリモル)で緩衝させた。反応溶液を−20゜
で2時間及び室温で3時間反応させた。この処理
を再度Et3N0.35mlで繰返し、更に16時間後に反
応溶液を真空中50℃で濃縮乾固した。残渣を50%
−AcOH50ml中に溶かしかつ50%−AcOHで平衡
化した“セフアデツクス”G−15のカラム上でゲ
ル濾過により精製した。トリプシン処理によりp
−ニトロアニリンの遊離下に分離するAcOH溶出
液の画分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を
MeOH100ml中に溶かし、次いでこの溶液を再度
濃縮乾固した。得られた残渣を真空乾燥箱中
P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均一
である無定形化合物1e3.57g(理論量の89.8%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C33H48N9O9Brからの計算により次の数値が得ら
れた:C=49.38%(49.87%)、H=6.00%(6.09
%)、N=16.03%(15.86%)及びBr=9.85%
(10.05%)。 アミノ酸分析により所期のアミノ酸が正しい比
で得られた: Gly1.00:Lys0.99:Arg0.97 1f BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH 1eにより製造したBOC−Lys(ε−Cbo)−Gly
−Arg−pNA.HBr7.95g(10ミリモル)を60%
−水性MeOH75ml中に溶解した。この溶液をア
セテート型の“アンバーライト”JRA−401のカ
ラム上に加えた。カラムを60%−水性MeOHを
用いて溶離すると、イオン交換によりHBrが
AcOHに代えられた。溶出液を真空中40゜で濃縮
乾固した。真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後に、
臭化物を含まないBOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH7.58g(理論量の97.9%)が得
られた。 この方法により、前記のトリペプチド誘導体か
ら有機酸、例えばギ酸、プロピオン酸、シユウ
酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息香酸、クロロ
安息香酸、サリチル酸又はフタル酸で他の塩を製
造することができる。イオン交換体として例えば
ヒドロクロリド型の“アンバーライト”JRA−
401を使用し、かつ前記のイオン交換体をカセイ
ソーダで処理して塩基性OH型に変換し、その後
で60%−水性MeOH中の所望の有機酸とそのナ
トリウム塩との1:1混合物の溶液で処理するこ
とにより所望の酸塩形に変換することができる。 例 2 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−MCA.AcOH 2b 2HBr.H−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA.HCl13.0g(25.9ミリ
モル)を例1bにより氷酢酸中の2N−HBr溶液
104ml(208ミリモル)で脱ブロツクした。乾燥残
渣をMeOH400ml中に溶解しかつ“セフアデツク
ス”LH−20のカラム上で精製した。トリプシン
処理により4−メチル−7−アミノ−クマリンの
遊離下に分離したMeOH溶出液の画分を真空中
30゜で濃縮乾固した。得られた残渣を真空乾燥箱
中P2O5上40で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均
一な無定形化合物2bが得られた。元素分析及び
実験式:C16H23N5O3Br2からの計算から次の数
値が得られた:C=39.40%(38.96%)、H=4.61
%(4.70%)、N=14.48%(14.20%)及びBr=
31.90%(32.40%) 2c Cbo−Gly−Arg−MCA.HBr 化合物2bとCbo−Gly−OpNP3.65g(11ミリ
モル)を新しく蒸留したDMF75mlに添加した。−
10゜に冷却後、撹拌下にEt3Nを初めに1.40ml(10
ミリモル)、次いで0.70ml(5ミリモル)を添加
した。混合物を水分の遮断下に初めに−10゜で3
時間、次に室温で4時間反応させた。反応溶液を
再び−10゜に冷却し、Et3N0.70mlで緩衝しかつ一
晩20℃で撹拌した。反応混合物を真空中50℃で濃
縮乾固し、次に残渣を50%−AcOH200ml中に溶
解しかつ“セフアデツクス”G−15のカラム上で
精製した。トリプシン処理により4−メチル−7
−アミノ−クマリンの遊離下に分離したAcOH溶
出液の画分を真空中40゜で濃縮乾固した。得られ
た残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSC
においてLMS中で均一であつた無定形化合物
2c4.98g(理論量の82.5%)が得られた。元素分
析及び実験式:C26H31N6O6Brからの計算により
次の数値が得られた:C=51.48%(51.75%)、
H=5.24%(5.18%)、N=13.70%(13.93%)及
びBr=13.14%(13.24%) 2d 2HBr.H−Gly−Arg−MCA 化合物2c4.83g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中2N−HBr32mlで脱ブロツクした。得られ
た粗製生成物をMeOH100ml中に溶かしかつ“セ
フアデツクス”LH−20のカラム上で精製した。
トリプシン処理により4−メチル−7−アミノ−
クマリンの遊離下に分離するMeOH溶出液の画
分を真空中30゜で濃縮乾固した。得られた残渣を
真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいて
LMS中で均一であつた無定形化合物2d4.05g
(理論量の92.0%)が得られた。元素分析及び実
験式:C10H26N6O4Br2からの計算により次の数
値が明らかになつた:C=39.02%(39.29%)、
H=4.78%(4.76%)、N=15.39%(15.27%)及
びBr=28.72%(29.04%) 2e Boc−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−MCA.
HBr 化合物2d2.75g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys−(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリ
モル)と反応させた。得られた粗製生成物を50%
−AcOH75ml中に溶かしかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より4−メチル−7−アミノ−クマリンの遊離下
に分離したAcOH溶出液の画分を真空中40゜で濃
縮乾固した。残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾
燥後、DSCにおいてLMS中で均一であつた無定
形化合物2e3.41g(理論量の82.0%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C37H51N8O9Brからの
計算により次の数値が明らかとなつた:C=
53.13%(53.43%)、H=6.24%(6.18%)、N=
13.76%(13.47%)及びBr=9.45%(9.61%) アミノ酸分析により所期のアミノ酸が正しい比
で得られた: Gly1.00:Lys1.02:Arg0.98 2f Boc−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−MCA.
AcOH 化合物2e8.32g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。該生成物7.95g
(理論量の98.0%)が得られた。 例 3 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−DPA.AcOH 3a Cbo−Arg−DPA.HCl 内容積1000mlの三首丸底フラスコ中で乾燥Cbo
−Arg−OH.HCl34.48g(0.1モル)を新しく蒸
留した無水DMF150ml及び無水THF300mlの混合
物中に20゜で溶解した。−10゜に冷却した溶液を撹
拌及び水分遮断下にEt3N10.2g(0.1モル)を添
加した。その後、この混合物に20分間でTHF50
ml中のクロル蟻酸イソブチルエステル13.65g
(0.1モル)の溶液を、反応温度が−5゜を上廻らな
いように滴加した。更に−10〜−5゜で10分間反応
させた後で、反応混合物にDMF75ml中の5−ア
ミノ−イソフタル酸−ジメチルエステル20.92g
(0.1モル)の溶液を30分間で滴加し、その際に反
応温度は常に−5゜を下廻るようにした。反応混合
物を−5゜で更に1時間反応させた。その後、20゜
で一晩撹拌し、次に−15゜に冷却してEt3N.HClを
結晶させた。形成したEt3N.HClを濾取しかつ冷
い少量のDMFで後洗浄した。濾液を洗浄溶液と
一縮に真空中50゜で濃縮乾固した。残渣を50%−
AcOH1000ml中に溶かしかつ50%−AcOHで平衡
化した“セフアデツクス”G−15のカラム上でゲ
ル濾過することにより精製した。トリプシン処理
により5−アミノ−イソフタル酸−ジメチルエス
テルの遊離下に分離したAcOH溶出液の画分を真
空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱中
P2O5上50゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均一
な無定形化合物3a24.6g(理論量の45.9%)が得
られた。元素分析及び実験式:C24H30N5O7Clか
らの計算により次の数値が明らかになつた:C=
53.21%(53.78%)、H=5.71%(5.64%)、N=
13.20%(13.07%)及びCl=6.52%(6.62%) 3b 2HBr.H−Arg−DPA 化合物3a21.44g(40ミリモル)を例1bにより
脱ブロツクした。後処理後、得られた粗製生成物
をMeOH250ml中に溶解しかつ“セフアデツク
ス”LH−20のカラム上でゲル濾過することによ
り精製した。トリプシン処理により5−アミノ−
イソフタル酸−ジメチルエステルの遊離下に分離
したMeOH溶出液の画分を真空中で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
3b19.63g(理論量の93.1%)が得られた。元素
分析及び実験式:C16H25N5O5Br2からの計算に
より次の数値が明らかになつた:C=36.82%
(36.45%)、H=4.67%(4.78%)、N=13.45%
(13.28%)及びBr=29.85%(30.31%) 3c Cbo−Gly−Arg−DPA.HBr 化合物3b5.27g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Gly−OpNP3.65g(11ミリモル)と反応
させた。後処理後に得られた粗製生成物を50%−
AcOH200ml中に溶解しかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より5−アミノ−イソフタル酸−ジメチルエステ
ルの遊離下に分離したAcOH溶出液の画分を真空
中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱中P2O5
上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均一な無
定形化合物3c5.29g(理論量の83.0%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C26H33N6O8Brからの
計算により次の数値が得られた:C=48.50%
(48.99%)、H=5.28%(5.22%)、N=12.92%
(13.18%)及びBr=12.33%(12.53%) 3d 2HBr.H−Gly−Arg−DPA 化合物3c5.10g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr32mlで脱ブロツクした。得ら
れた粗製生成物の後処理後、MeOH100ml中に溶
解しかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により5−アミノ−
イソフタル酸−ジメチルエステルの遊離下に分離
したMeOH溶出液の画分を真空中30゜で濃縮乾固
した。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一であつた無定形化合
物3d4.25g(理論量の90.9%)が得られた。元素
分析及び実験式:C18H28N6O6Br2からの計算に
より次の数値が明らかになつた:C=36.85%
(37.00%)、H=4.90%(4.83%)、N=14.72%
(14.38%)及びBr=26.95%(27.35%) 3e BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−DPA.
HBr 化合物3d2.92g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させ、後処理後に得られた粗製生成物
を50%−AcOH100ml中に溶かしかつ“セフアデ
ツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプシ
ン処理により5−アミノ−イソフタル酸−ジメチ
ルエステルの遊離下に分離したAcOH溶出液の画
分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥
箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で
均一な無定形化合物3e3.64g(理論量の84.1%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C37H53N8O11Brからの計算により次の数値が得
られた:C=51.05%(51.33%)、H=6.25%
(6.17%)、N=13.26%(12.94%)及びBr=9.10
%(9.23%) アミノ酸分析により正しい比の所期のアミノ酸
が認められた: Gly1.00:Lys1.00:Arg0.97 3f BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−DPA.
AcOH 化合物3e8.66g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。生成物8.24g
(理論量の97.5%)が得られた。 例 4 BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−2−NA.
AcOH 4b 2HBr.H−Arg−2−NA 市販のCbo−Arg−2−NA.HCl9.40g(20ミ
リモル)を例1bにより氷酢酸中の2N−HBr80ml
の溶液で脱ブロツクした。後処理後に得られた生
成物をMeOH150ml中に溶かしかつ“セフアデツ
クス”LH−20のカラム上で精製した。トリプシ
ン処理により2−ナフチルアミンの遊離下に分離
したMeOH溶出液の画分を真空中30゜で濃縮乾固
した。残渣を真空乾燥箱P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
4b8.60g(理論量の93.2%)が得られた。元素分
析及び実験式:C16H23N5OBr2からの計算から次
の数値が明らかになつた:C=42.08%(41.67
%)、H=5.12%(5.03%)、N=14.68%(15.19
%)及びBr=33.96%(34.65%)。 4c Cbo−Ala−Arg−2−NA.HBr 化合物4d4.6g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Ala−OpNP3.80g(11ミリモル)と反応
させた。後処理後得られた粗製生成物を50%−
AcOH150ml中に溶かしかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より2−ナフチルアミンの遊離下に分離した
AcOH溶出液の画分を真空中40℃で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾燥後DSC
においてLMS中で均一な無定形化合物4c4.95g
(理論量の84.5%)が得られた。実験式:元素分
析及びC27H33N6O4Brからの計算から次の数値が
明らかになつた:C=55.72%(55.39%)、H=
6.73%(5.68%)、N=14.68%(14.35%)及びBr
=13.42%(13.65%)。 4d 2HBr.H−Ala−Arg−2−NA 化合物4c4.68g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr28mlで脱ブロツクした。後処
理して得られた精製生成物をMeOH100ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により2−ナフチル
アミンの遊離下に分離したMeOH溶出液の画分
を真空中30゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱
中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均
一な無定形化合物4d4.08g(理論量の95.8%)が
得られた。元素分析及び実験式:
C19H28N6O2Br2からの計算から次の数値が明ら
かになつた:C=43.9%(42.87%)、H=5.32%
(5.30%)、N=16.02%(15.79%)及びBr=29.68
%(30.02%) 4o BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−2−
NA.HBr 化合物4d2.66g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させた。後処理して得られた粗製生成
物を50%−AcOH100ml中に溶かしかつ“セフア
デツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプ
シン処理により2−ナフチルアミンの遊離下に分
離したAcOH溶出液の最初の主要主画分を真空中
40゜で濃縮乾固し、その後真空乾燥箱中P2O5上60゜
で乾燥させた。DSCにおいてLMS中で均一な無
定形の化合物4e3.45g(理論量の84.8%)が得ら
れた。元素分析及び実験式:C38H53N8O7Brから
の計算により次の数値が得られた:C=55.88%
(56.08%)、H=6.63%(6.56%)、N=14.02%
(13.77%)及びBr=9.80%(9.82%) アミノ酸分析により正しい比の所期のアミノ酸
が認められた: Ala1.00、Lys1.02、Arg0.97 4fBOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−2NA.
AcOH 化合物4e8.14g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。この生成物7.65
g(理論量の96.5%)が得られた。 例 5 BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−1−Na.
AcOH 5a Cbo−Arg−1−NA.HCl 十分に乾燥したCbo−Arg−OH.HCl3.45g
(10ミリモル)を乾燥HMPTA100ml中で水分遮
断下に溶解した。−10゜に冷却後、Et3N1.39ml(10
ミリモル)をその溶液に溶かしかつその後で
HMPTA20ml中のクロル蟻酸イソブチルエステ
ル1.35g(10ミリモル)を15分間滴加し、その際
温度は−10〜−5゜に保持した。その後、得られた
溶液にHMPTA15ml中の1−ナフチルアミン1.72
g(12ミリモル)を滴加し、その際前記の温度を
保持した。反応混合物を80゜で真空中で濃縮乾固
した。残渣をMeOH100ml中に溶かしかつMeOH
中の“セフアデツクス”LH−20のカラムでゲル
濾過することにより精製した。トリプシン処理に
より1−ナフチルアミンの遊離下に分離した溶出
液の画分がDSCにおいてLMS中で均一であるこ
とが明らかになつた。この画分を濃縮乾固した。
無定形化合物5a2.82g(理論量の60.1%)が得ら
れた。 元素分析及び実験式:C24H28N5O3Clからの計
算により次の数値が明らかになつた:C=61.07
%(61.33%)、H=6.10%(6.01%)、N=15.05
%(14.90%)及びCl=7.38%(7.54%) 5b 2HBr.H−Arg−1−NA 化合物5a9.40g(20ミリモル)を例1bにより氷
酢酸中の2N−HBr80mlの溶液で脱ブロツクした。
後処理して得られた生成物をMeOH150ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により1−ナフチル
アミンの遊離下に分離した。MeOH溶出液の画
分を真空中30゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥
箱中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で
均一な無定形化合物5b8.40g(理論量の90.8%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C16H23N5OBr2からの計算により次の数値が明ら
かになつた:C=42.20%(41.67%)、H=5.08%
(5.03%)、N=15.33%(15.19%)及びBr=34.10
%(34.65%)。 5c Cbo−Ala−Arg−1−NA.HBr 化合物5b4.6g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Ala−OpNP3.80g(11ミリモル)と反応
させた。後処理して得られた粗製生成物を50%−
AcOH150ml中に溶かしかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より1−ナフチルアミンの遊離下に分離した
AcOH−溶出液の画分を真空中40゜で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾燥後に、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
5c4.80g(理論量の82.1%)が得られた。元素分
析及び実験式:C27H33N6O4Brからの計算により
次の数値が得られた:C=55.62%(55.39%)、
H=6.70%(5.68%)、N=14.63%(14.35%)及
びBr=13.35%(13.65%)。 5d 2HBr.H−Ala−Arg−1−NA 化合物5c4.68g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr28mlで脱ブロツクした。後処
理して得られた粗製生成物をMeOH100ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により1−ナフチル
アミンの遊離下に分離したMeOH溶出液の画分
を真空中30゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱
中P2O5上40゜で乾燥後にDSCにおいてLMS中で均
一な無定形化合物5dが得られた。実験式:元素
分析及びC19H28N6O2Br2からの計算により次の
数値が得られた:C=43.09%(42.87%)、H=
5.38%(5.30%)、N=16.10%(15.79%)及びBr
=29.80%(30.02%) 5e BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−1−
NA.HBr 化合物5d2.66g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させた。後処理して得られた粗製生成
物を50%−AcOH100ml中に溶解しかつ“セフア
デツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプ
シン処理により1−ナフチルアミンの遊離下に分
離したAcOH溶出液の最初の主要画分を真空中
40゜で濃縮乾固し、その後真空乾燥箱中P2O5上60゜
で乾燥させた。DSCにおいてLMS中で均一な無
定形化合物5e3.46g(理論量の85%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C38H53N8O7Brからの
計算により次の数値が得られた:C=55.98%
(56.08%)、H=6.68%(6.56%)、N=13.02%
(13.77%)及びBr=9.80%(9.82%)。 アミノ酸分析により正しい比の所期のアミノ酸
が得られた: Ala1.00:Lys1.01:Arg0.97 5f BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−1−
NA.AcOH 化合物5e8.14g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。この生成物7.77
g(理論量の98.0%)が得られた。 例 6 BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−4−MeO−
2−NA.HBr 6b 2HBr.H−Arg−4−MeO−2−NA 市販のCbo−Arg−4−MeO−2−NA.
HCl10.0g(20ミリモル)を例1bにより氷酢酸中
の2N−HBr80mlで脱ブロツクした。後処理して
得られた粗製生成物をMeOH150ml中に溶解しか
つ“セフアデツクス”LH−20のカラム上で精製
した。トリプシン処理により4−メトキシ−2−
ナフチルアミンの遊離下に分離したMeOH溶出
液の主要フラクシヨンを真空中30゜で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
6b8.98g(理論量の91.4%)が得られた。元素分
析及び実験式:C17H25N5O2Br2からの計算によ
り次の数値が得られた:C=41.22%(41.57%)、
H=5.19%(5.13%)、N=14.40%(14.26%)及
びBr=32.01%(32.53%) 6c Cbo−Ala−Arg−4−MeO−2−NA.HBr 化合物6b4.91g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Ala−OpNP3.80g(11ミリモル)と反応
させた。後処理後、得られた粗製生成物を50%−
AcOH150ml中に溶解しかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より4−メトキシ−2−ナフチルアミンの遊離下
に分離したAcOH溶出液の最初の主要フラクシヨ
ンを真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥
箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で
均一な無定形化合物6c4.86g(理論量の79.0%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C28H35N6O5Brからの計算により次の数値が明ら
かになつた:C=54.38%(54.64%)、H=5.81%
(5.73%)、N=13.93%(13.65%)及びBr=12.75
%(12.98%) 6d 2HBr.H−Ala−Arg−4−MeO−2−NA 化合物6c4.31g(7ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr28mlで脱ブロツクした。後処
理して得られた粗製生成物をMeOH100ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により4−メトキシ
−2−ナフチルアミンの形成下に分離した
MeOH溶出液の主要画分を真空中30゜で濃縮乾固
した。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
6b3.74g(理論量の95.0%)が得られた。元素分
析及び実験式:C20H30N6O3Br2からの計算によ
り次の数値が明らかになつた:C=43.01%
(42.72%)、H=5.44%(5.38%)、N=15.25%
(14.95%)及びBr=28.03%(28.42%) 6e BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−4−
MeO−2−NA.HBr 化合物6d2.81g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させた。後処理して得られた粗製生成
物を50%−AcOH125ml中に溶かしかつ“セフア
デツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプ
シン処理により4−メトキシ−2−ナフチルアミ
ンの遊離下に分離したAcOH溶出液の最初の主要
画分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾
燥箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中
で均一な無定形化合物6e3.31g(理論量の78.5
%)が得られた。元素分析及び実験式:
C39H55N8O8Brからの計算により次の数値が得ら
れた:C=55.05%(55.51%)、H=6.63%(6.57
%)、N=13.40%(13.28%)及びBr=9.30%
(9.47%) 6f BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−4−
MeO−2−NA.AcOH 化合物6e8.44g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。この生成物8.05
g(理論量の97.8%)が得られた。
ヘキシルメチル基、4−ヒドロキシベンジル基、
4−ヒドロキシシクロヘキシルメチル基を表わし
かつmは数値ゼロでありかつYにより定義される
アミノ酸はL−又はD−配置を有するかあるいは
R4は水素を表わしかつmは数値0,1又は2を
表わす)の基を表わす〕のペプチド誘導体もしく
は鉱酸又は有機酸とのその塩に関するが、ただし
C2H5CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNAを除
く。 例えばR1はp−ニトロフエニルアミノ基、1
−又は2−ナフチルアミノ基、4−メトキシ−2
−ナフチルアミノ基、4−メチル−7−クマリル
アミノ基又は1,3−ジ(メトキシカルボニル)
−5−フエニルアミノ基であつてよい。 例えばR3はベンジル基、4−メチルベンジル
基、4−メトキシベンジル基、もしくは2−、3
−又は4−クロルベンジル基であつてよい。 R2が炭素原子2〜6個を有するアルカノイル
基又は炭素原子数1〜4個を有するアルコキシカ
ルボニル基を表わしかつYが単結合を表わし、 R3がベンジル基を表わしかつR1及びXが前記
のものを表わすペプチド誘導体がC1−エステラ
ーゼに対して特に高い敏感さを有する。 前記の一般式のペプチド誘導体の例として次の
化合物が挙げられる: BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH,2AcOH.H−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg
−pNA,Ac−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−
pNA.AcOH,CH3OCO−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH,C2H5OCO−Lys(ε−Cbo)
−Gly−Arg−pNA.AcOH,iso−ButOCO−Lys
(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,
CH3CH2CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH,CH3(CH2)2CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH,CH3CH2OCO−CH2−CO−
Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,BOC
−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−pNA.AcOH,H
−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−
pNA.2CF3COOH,Ac−Lys(ε−Cbo)−Ala−
Arg−pNA.AcOH,CH3OCO−Lys(ε−Cbo)−
Ala−Arg−pNA.AcOH,BOC−Gly−Lys(ε
−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,2CF3COOH.
H−Gly−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA,
CH3O−CO−GlyLys(ε−Cbo)−Gly−Arg−
pNA.AcOH,CH3−CH2−CO−Gly(ε−Cbo)
−Gly−Arg−pNA.AcOH。 本発明によるペプチド誘導体はペプチド合成で
常用の方法で、例えば次に記載の方法により製造
することができる: 1 色素形成基R1をC−末端アルギニンのカル
ボキシ基に結合させ、その際にアルギニンのα
−アミノ基は保護基、例えばカルボベンゾキシ
基又はt−ブトキシカルボニル基により及びア
ルギニンのδ−グアニジル基は例えばHClによ
るプロトン化、ニトロ化又はトシル化により保
護する。C−末端基R1も段階的なペプチド鎖
の形成の際に保護基として有用である。他の保
護基は、所望のペプチド鎖が完全に構成される
まで他のアミノ酸誘導体を結合させるために必
要に応じて選択的に脱離することができる。最
後に、R1に作用を及ぼさずに、残留している
保護基を完全に脱離することができる〔例えば
Miklos及びその他共著、“Peptide
Synthesis”、163〜165頁(1966年)、
Interscience Publishers出版参照〕。 2 初めにペプチド鎖(Bodanskyによる前記文
献)を構成するが、その際アルギニンのC−末
端カルボキシル基を常用のエステル基、例えば
メトキシ基、エトキシ基又はベンジルオキシ基
で保護する。エステル基はアルカリ性加水分解
により脱離することができ、但しt−ブトキシ
基は選択的にトリフルオロ酢酸を用いて脱離し
なければならない。アルギニンのδ−グアニジ
ル基がプロトン化されている場合には、前記の
エステル基はトリプシンにより脱離し、その際
ラセミ化は起らない。これに次いで、色素形成
基R1を結合させる。アルギニンのδ−グアニ
ジノ基がニトロ基又はトシル基により及びペプ
チド誘導体のN−末端α−アミノ基がカルボベ
ンゾキシ基、p−メチル−、p−メトキシ−又
はp−クロルベンジルオキシカルボニル基もし
くはt−ブトキシ基により保護されている場合
これらの保護基も同時に脱離する。脱離は保護
されたペプチド誘導体を室温で無水HFで処理
することにより実施することができ、その際に
前記のすべてのアミノ−もしくはδ−グアニジ
ノ保護基は脱離する。脱離は、保護されたペプ
チド誘導体がニトロ−又はトシル保護基を含ま
ない場合には、氷酢酸中の2N−HBrを用いて
室温で処理しても実施することができる。 実施例 次の実施例で本発明によるペプチド誘導体の製
造を詳説する。温度はセツ氏である。 実施例で得られた溶出液及び生成物の分析は二
酸化珪素ゲルで塗布したガラス板(Merck社、
F254)を使つて薄層クロマトグラフイにより行
なつた。薄層クロマトグラムは次の溶剤系で展開
させた:n−ブタノール/酢酸/水(3:1:
1)。 次の略語を使つた: Ac=アセチル AC2O=アセトアンヒドリド AcOH=酢酸 Ala=L−アラニン β−Ala=β−アラニン Arg=L−アルギニン BOC=t−ブトキシカルボニル γ−But=4−アミノ酪酸 BZ=ベンゾイル BZ2O=無水安息香酸 CHA=L−3−シクロヘキシルアラニン CHG=L−2−シクロヘキシルグリシン D−CHG=D−2−シクロヘキシルグリシン CHT=L−3−(4−トビロキシシクロヘキシ
ル)アラニン=核水素化チロシン Cbo=カルボベンゾキシ DMF=ジメチルホルムアミド DPA=5−アミド−イソフタル酸−ジメチルエ
ステル DSC=薄層クロマトグラムもしくは−グラフイ Et=エチル EtO=エトキシ Et3N=トリエチルアミン Gly=グリシン HMPTA=N,N,N′,N′,N″,N″−ヘキシ
ルメチルリン酸トリアミド iso−BuO=イソブトキシ LMS=溶剤系 Lys=L−リジン MCA=7−アミド−4−メチルクマリン MeO=メトキシ MeOH=メタノール NA=ナフチルアミド OpNP=p−ニトロフエノキシ pNA=p−ニトロアニリド Ph′Gly=L−2−フエニルグリシン Phe=L−フエニルアラニン D−Phe=D−フエニルアラニン Suc=スクシニル THF=テトラヒドロフラン Tos=p−トルエンスルホニル 特に記載のない限りアミノ酸はL形である。 例 1 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH 1a Cbo−Arg−pNA.HCl 内容積250mlの三首丸底フラスコ中で、P2O5上
で真空乾燥させた、無水HMPTA90ml中のCbo−
Arg−OH.HCl16.0g(47.0ミリモル)を湿気の
遮断下に20゜で溶解した。室温で得られた溶液に
初めにHMPTA10ml中のEt3N4.74g(47.0ミリ
モル)の溶液を、次にp−ニトロフエニルイソシ
アネート(100%の過剰)16.4g(100ミリモル)
を少量ずつ添加した。20℃で24時間の反応後に
HMPTAを真空中で殆んど留去させた。残渣を
数回30%−AcOHで抽出した。残渣を廃棄した。
合したAcOH抽出物を更に精製するために30%−
AcOHで平衡化した“セフアデツクス”−G−15
−カラム上に施しかつ30%−AcOHで溶離した。
トリプシン処理によりp−ニトロアニリンの遊離
下に脱離し得るAcOH溶出液の画分を凍結乾燥さ
せた。無定形粉末12.6gが得られ、これはDSCに
おいてLMS中で均一であつた。元素分析及び実
験式C20H25N6O5Clからの計算により次の数値が
得られた:C=51.29%(51.67%)、H=5.48%
(5.42%)、N=17.92%(18.08%)、Cl=7.50%
(7.63%)。カツコ内の数値は計算値である。 1b 2HBr.H−Arg−pNA 湿分の遮断下に化合物1a4.65g(10ミリモル)
を氷酢酸中の2N−HBr40mlで20゜45分間撹拌下に
処理した。その際に、アミノ酸誘導体はCO2発生
下に溶解した。反応溶液を激しい撹拌下に無水エ
ーテル250mlに滴加した。その際に2HBr.H−
Arg−pNAが沈殿した。エーテル相を吸引濾別
し、次に固相を1回当り100mlの無水エーテルで
4回洗浄して、副生成物として形成した臭化ベン
ジル並びに過剰分のHBr及びAcOHを除去した。
残渣をMeOH50ml中に溶かし、Et3NでPH4.5に調
節しかつ真空中30℃で濃縮乾固した。そのように
して得られた生成物をMeOH75ml中に溶かしか
つMeOHで平衡化した“セフアデツクス”LH−
20(架橋デキストランゲル)カラム中を流動させ
た。溶出液の1つの画分から、DSCにおいて
LMS中で均一であつた無定形化合物1b4.18g
(理論量の91.6%)が得られた。元素分析及び実
験式:C12H20N6O3Br2からの計算から次の数値
が得られた:C=31.15%(31.60%)、H=4.35%
(4.42%)、N=18.84%(18.43%)、Br=34.81%
(35.03%) 1c Cbo−Gly−Arg−pNA.HBr 化合物1b4.5g(10ミリモル)を新しく蒸留し
たDMF30ml中に溶解しかつ−10゜に冷却後撹拌下
にEt3N1.40ml(10ミリモル)を加えた。形成し
たEt3N.HBrを濾取しかつ少量の冷いDMFで洗
つた。濾液に撹拌下に−10でCbo−Gly−
OpNP3.65g(11ミリモル)を添加しかつこの混
合物を水分の遮断下に2〜3時間反応させた。そ
の際反応溶液の温度は徐々に約20に上昇した。こ
の溶液を再び−10に冷却しかつEt3N0.70ml(5
ミリモル)で緩衝させた。反応溶液を−10゜で約
2時間及び室温で3時間反応させた。この処理を
もう一度Et3N0.70mlで繰返し、更に16時間後に
反応溶液を真空中50゜で濃縮乾固させた。残渣を
50%−酢酸75ml中に溶かしかつ50%−AcOHで平
衡化した“セフアデツクス”G−15のカラム上で
ゲル濾過により精製した。トリプシン処理により
p−ニトロアニリンの遊離下に分離するAcOH溶
出液の画分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を
MeOH150ml中に溶かしかつ再び濃縮乾固した。
得られた残渣を真空乾燥箱中でP2O5上で60゜で乾
燥後、DSCにおいてLMS中で均一であつた無定
形化合物1c5.85g(理論量の88.3%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C22H28N7O6Brからの
計算により次の数値が得られた:C=46.33%
(46.65%)、H=5.04%(4.98%)、N=17.88%
(17.31%)及びBr=14.20%(14.11%) 1d 2HBr.H−Gly−Arg−pNA 化合物1c4.56g(8ミリモル)を水分遮断下に
2N−HBr32mlと氷酢酸32ml中で撹拌下に40分間
20゜で処理した。その際に、このペプチド誘導体
は徐々にCO2発生下に溶けた。反応溶液を激しい
撹拌下に無水エーテル250mlに滴加すると、
2HBr.H−Gly−Arg−pNAが沈殿した。エーテ
ル相を吸引濾別し、次いで固相を無水エーテル1
回当り100mlで4回洗浄して、副生成物として形
成した臭化ベンジル並びに過剰分のHBr及び
AcOHを殆んど除去した。残渣をMeOH50ml中
に溶解した。Et3NでPH4.5に調節後、溶液を真空
中30゜で濃縮乾固した。このようにして得られた
残渣をMeOH50ml中に溶解しかつMeOHで平衡
化した“セフアデツクス”LH−20のカラム上で
精製した。トリプシン処理によりp−ニトロアニ
リンの遊離下に分離するMeOH溶出液の画分を
真空中30゜で濃縮乾固した。得られた残渣を真空
乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいてLMS
中均一である無定形化合物1d3.78g(理論量の
92.1%)が得られた。元素分析及び実験式:
C14H23N7O4Br2からの計算により次の数値が得
られた:C=32.31%(32.77%)、H=4.59%
(4.52%)、N=19.47%(19.11%)及びBr=30.78
%(31.14%)。 1e BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
HBr 化合物1d2.57g(5ミリモル)を新しく蒸留し
たDMF20ml中に溶解しかつ−10゜に冷却後撹拌下
にEt3N0.70ml(5ミリモル)を加えた。形成し
たEt3N.HBrを濾取しかつ冷い少量DMFで後洗
浄した。濾液に−10゜で撹拌下にBOC−Lys(ε−
Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモル)を添加した。
反応混合物を水分遮断下に2〜3時間反応させ、
次いで反応溶液の温度が徐々に約20゜に上昇した。
この溶液を再び−10゜に冷却しかつEt3N0.35ml
(2.5ミリモル)で緩衝させた。反応溶液を−20゜
で2時間及び室温で3時間反応させた。この処理
を再度Et3N0.35mlで繰返し、更に16時間後に反
応溶液を真空中50℃で濃縮乾固した。残渣を50%
−AcOH50ml中に溶かしかつ50%−AcOHで平衡
化した“セフアデツクス”G−15のカラム上でゲ
ル濾過により精製した。トリプシン処理によりp
−ニトロアニリンの遊離下に分離するAcOH溶出
液の画分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を
MeOH100ml中に溶かし、次いでこの溶液を再度
濃縮乾固した。得られた残渣を真空乾燥箱中
P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均一
である無定形化合物1e3.57g(理論量の89.8%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C33H48N9O9Brからの計算により次の数値が得ら
れた:C=49.38%(49.87%)、H=6.00%(6.09
%)、N=16.03%(15.86%)及びBr=9.85%
(10.05%)。 アミノ酸分析により所期のアミノ酸が正しい比
で得られた: Gly1.00:Lys0.99:Arg0.97 1f BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH 1eにより製造したBOC−Lys(ε−Cbo)−Gly
−Arg−pNA.HBr7.95g(10ミリモル)を60%
−水性MeOH75ml中に溶解した。この溶液をア
セテート型の“アンバーライト”JRA−401のカ
ラム上に加えた。カラムを60%−水性MeOHを
用いて溶離すると、イオン交換によりHBrが
AcOHに代えられた。溶出液を真空中40゜で濃縮
乾固した。真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後に、
臭化物を含まないBOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH7.58g(理論量の97.9%)が得
られた。 この方法により、前記のトリペプチド誘導体か
ら有機酸、例えばギ酸、プロピオン酸、シユウ
酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息香酸、クロロ
安息香酸、サリチル酸又はフタル酸で他の塩を製
造することができる。イオン交換体として例えば
ヒドロクロリド型の“アンバーライト”JRA−
401を使用し、かつ前記のイオン交換体をカセイ
ソーダで処理して塩基性OH型に変換し、その後
で60%−水性MeOH中の所望の有機酸とそのナ
トリウム塩との1:1混合物の溶液で処理するこ
とにより所望の酸塩形に変換することができる。 例 2 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−MCA.AcOH 2b 2HBr.H−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA.HCl13.0g(25.9ミリ
モル)を例1bにより氷酢酸中の2N−HBr溶液
104ml(208ミリモル)で脱ブロツクした。乾燥残
渣をMeOH400ml中に溶解しかつ“セフアデツク
ス”LH−20のカラム上で精製した。トリプシン
処理により4−メチル−7−アミノ−クマリンの
遊離下に分離したMeOH溶出液の画分を真空中
30゜で濃縮乾固した。得られた残渣を真空乾燥箱
中P2O5上40で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均
一な無定形化合物2bが得られた。元素分析及び
実験式:C16H23N5O3Br2からの計算から次の数
値が得られた:C=39.40%(38.96%)、H=4.61
%(4.70%)、N=14.48%(14.20%)及びBr=
31.90%(32.40%) 2c Cbo−Gly−Arg−MCA.HBr 化合物2bとCbo−Gly−OpNP3.65g(11ミリ
モル)を新しく蒸留したDMF75mlに添加した。−
10゜に冷却後、撹拌下にEt3Nを初めに1.40ml(10
ミリモル)、次いで0.70ml(5ミリモル)を添加
した。混合物を水分の遮断下に初めに−10゜で3
時間、次に室温で4時間反応させた。反応溶液を
再び−10゜に冷却し、Et3N0.70mlで緩衝しかつ一
晩20℃で撹拌した。反応混合物を真空中50℃で濃
縮乾固し、次に残渣を50%−AcOH200ml中に溶
解しかつ“セフアデツクス”G−15のカラム上で
精製した。トリプシン処理により4−メチル−7
−アミノ−クマリンの遊離下に分離したAcOH溶
出液の画分を真空中40゜で濃縮乾固した。得られ
た残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSC
においてLMS中で均一であつた無定形化合物
2c4.98g(理論量の82.5%)が得られた。元素分
析及び実験式:C26H31N6O6Brからの計算により
次の数値が得られた:C=51.48%(51.75%)、
H=5.24%(5.18%)、N=13.70%(13.93%)及
びBr=13.14%(13.24%) 2d 2HBr.H−Gly−Arg−MCA 化合物2c4.83g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中2N−HBr32mlで脱ブロツクした。得られ
た粗製生成物をMeOH100ml中に溶かしかつ“セ
フアデツクス”LH−20のカラム上で精製した。
トリプシン処理により4−メチル−7−アミノ−
クマリンの遊離下に分離するMeOH溶出液の画
分を真空中30゜で濃縮乾固した。得られた残渣を
真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいて
LMS中で均一であつた無定形化合物2d4.05g
(理論量の92.0%)が得られた。元素分析及び実
験式:C10H26N6O4Br2からの計算により次の数
値が明らかになつた:C=39.02%(39.29%)、
H=4.78%(4.76%)、N=15.39%(15.27%)及
びBr=28.72%(29.04%) 2e Boc−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−MCA.
HBr 化合物2d2.75g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys−(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリ
モル)と反応させた。得られた粗製生成物を50%
−AcOH75ml中に溶かしかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より4−メチル−7−アミノ−クマリンの遊離下
に分離したAcOH溶出液の画分を真空中40゜で濃
縮乾固した。残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾
燥後、DSCにおいてLMS中で均一であつた無定
形化合物2e3.41g(理論量の82.0%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C37H51N8O9Brからの
計算により次の数値が明らかとなつた:C=
53.13%(53.43%)、H=6.24%(6.18%)、N=
13.76%(13.47%)及びBr=9.45%(9.61%) アミノ酸分析により所期のアミノ酸が正しい比
で得られた: Gly1.00:Lys1.02:Arg0.98 2f Boc−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−MCA.
AcOH 化合物2e8.32g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。該生成物7.95g
(理論量の98.0%)が得られた。 例 3 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−DPA.AcOH 3a Cbo−Arg−DPA.HCl 内容積1000mlの三首丸底フラスコ中で乾燥Cbo
−Arg−OH.HCl34.48g(0.1モル)を新しく蒸
留した無水DMF150ml及び無水THF300mlの混合
物中に20゜で溶解した。−10゜に冷却した溶液を撹
拌及び水分遮断下にEt3N10.2g(0.1モル)を添
加した。その後、この混合物に20分間でTHF50
ml中のクロル蟻酸イソブチルエステル13.65g
(0.1モル)の溶液を、反応温度が−5゜を上廻らな
いように滴加した。更に−10〜−5゜で10分間反応
させた後で、反応混合物にDMF75ml中の5−ア
ミノ−イソフタル酸−ジメチルエステル20.92g
(0.1モル)の溶液を30分間で滴加し、その際に反
応温度は常に−5゜を下廻るようにした。反応混合
物を−5゜で更に1時間反応させた。その後、20゜
で一晩撹拌し、次に−15゜に冷却してEt3N.HClを
結晶させた。形成したEt3N.HClを濾取しかつ冷
い少量のDMFで後洗浄した。濾液を洗浄溶液と
一縮に真空中50゜で濃縮乾固した。残渣を50%−
AcOH1000ml中に溶かしかつ50%−AcOHで平衡
化した“セフアデツクス”G−15のカラム上でゲ
ル濾過することにより精製した。トリプシン処理
により5−アミノ−イソフタル酸−ジメチルエス
テルの遊離下に分離したAcOH溶出液の画分を真
空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱中
P2O5上50゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均一
な無定形化合物3a24.6g(理論量の45.9%)が得
られた。元素分析及び実験式:C24H30N5O7Clか
らの計算により次の数値が明らかになつた:C=
53.21%(53.78%)、H=5.71%(5.64%)、N=
13.20%(13.07%)及びCl=6.52%(6.62%) 3b 2HBr.H−Arg−DPA 化合物3a21.44g(40ミリモル)を例1bにより
脱ブロツクした。後処理後、得られた粗製生成物
をMeOH250ml中に溶解しかつ“セフアデツク
ス”LH−20のカラム上でゲル濾過することによ
り精製した。トリプシン処理により5−アミノ−
イソフタル酸−ジメチルエステルの遊離下に分離
したMeOH溶出液の画分を真空中で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
3b19.63g(理論量の93.1%)が得られた。元素
分析及び実験式:C16H25N5O5Br2からの計算に
より次の数値が明らかになつた:C=36.82%
(36.45%)、H=4.67%(4.78%)、N=13.45%
(13.28%)及びBr=29.85%(30.31%) 3c Cbo−Gly−Arg−DPA.HBr 化合物3b5.27g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Gly−OpNP3.65g(11ミリモル)と反応
させた。後処理後に得られた粗製生成物を50%−
AcOH200ml中に溶解しかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より5−アミノ−イソフタル酸−ジメチルエステ
ルの遊離下に分離したAcOH溶出液の画分を真空
中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱中P2O5
上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均一な無
定形化合物3c5.29g(理論量の83.0%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C26H33N6O8Brからの
計算により次の数値が得られた:C=48.50%
(48.99%)、H=5.28%(5.22%)、N=12.92%
(13.18%)及びBr=12.33%(12.53%) 3d 2HBr.H−Gly−Arg−DPA 化合物3c5.10g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr32mlで脱ブロツクした。得ら
れた粗製生成物の後処理後、MeOH100ml中に溶
解しかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により5−アミノ−
イソフタル酸−ジメチルエステルの遊離下に分離
したMeOH溶出液の画分を真空中30゜で濃縮乾固
した。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一であつた無定形化合
物3d4.25g(理論量の90.9%)が得られた。元素
分析及び実験式:C18H28N6O6Br2からの計算に
より次の数値が明らかになつた:C=36.85%
(37.00%)、H=4.90%(4.83%)、N=14.72%
(14.38%)及びBr=26.95%(27.35%) 3e BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−DPA.
HBr 化合物3d2.92g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させ、後処理後に得られた粗製生成物
を50%−AcOH100ml中に溶かしかつ“セフアデ
ツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプシ
ン処理により5−アミノ−イソフタル酸−ジメチ
ルエステルの遊離下に分離したAcOH溶出液の画
分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥
箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で
均一な無定形化合物3e3.64g(理論量の84.1%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C37H53N8O11Brからの計算により次の数値が得
られた:C=51.05%(51.33%)、H=6.25%
(6.17%)、N=13.26%(12.94%)及びBr=9.10
%(9.23%) アミノ酸分析により正しい比の所期のアミノ酸
が認められた: Gly1.00:Lys1.00:Arg0.97 3f BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−DPA.
AcOH 化合物3e8.66g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。生成物8.24g
(理論量の97.5%)が得られた。 例 4 BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−2−NA.
AcOH 4b 2HBr.H−Arg−2−NA 市販のCbo−Arg−2−NA.HCl9.40g(20ミ
リモル)を例1bにより氷酢酸中の2N−HBr80ml
の溶液で脱ブロツクした。後処理後に得られた生
成物をMeOH150ml中に溶かしかつ“セフアデツ
クス”LH−20のカラム上で精製した。トリプシ
ン処理により2−ナフチルアミンの遊離下に分離
したMeOH溶出液の画分を真空中30゜で濃縮乾固
した。残渣を真空乾燥箱P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
4b8.60g(理論量の93.2%)が得られた。元素分
析及び実験式:C16H23N5OBr2からの計算から次
の数値が明らかになつた:C=42.08%(41.67
%)、H=5.12%(5.03%)、N=14.68%(15.19
%)及びBr=33.96%(34.65%)。 4c Cbo−Ala−Arg−2−NA.HBr 化合物4d4.6g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Ala−OpNP3.80g(11ミリモル)と反応
させた。後処理後得られた粗製生成物を50%−
AcOH150ml中に溶かしかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より2−ナフチルアミンの遊離下に分離した
AcOH溶出液の画分を真空中40℃で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾燥後DSC
においてLMS中で均一な無定形化合物4c4.95g
(理論量の84.5%)が得られた。実験式:元素分
析及びC27H33N6O4Brからの計算から次の数値が
明らかになつた:C=55.72%(55.39%)、H=
6.73%(5.68%)、N=14.68%(14.35%)及びBr
=13.42%(13.65%)。 4d 2HBr.H−Ala−Arg−2−NA 化合物4c4.68g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr28mlで脱ブロツクした。後処
理して得られた精製生成物をMeOH100ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により2−ナフチル
アミンの遊離下に分離したMeOH溶出液の画分
を真空中30゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱
中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で均
一な無定形化合物4d4.08g(理論量の95.8%)が
得られた。元素分析及び実験式:
C19H28N6O2Br2からの計算から次の数値が明ら
かになつた:C=43.9%(42.87%)、H=5.32%
(5.30%)、N=16.02%(15.79%)及びBr=29.68
%(30.02%) 4o BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−2−
NA.HBr 化合物4d2.66g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させた。後処理して得られた粗製生成
物を50%−AcOH100ml中に溶かしかつ“セフア
デツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプ
シン処理により2−ナフチルアミンの遊離下に分
離したAcOH溶出液の最初の主要主画分を真空中
40゜で濃縮乾固し、その後真空乾燥箱中P2O5上60゜
で乾燥させた。DSCにおいてLMS中で均一な無
定形の化合物4e3.45g(理論量の84.8%)が得ら
れた。元素分析及び実験式:C38H53N8O7Brから
の計算により次の数値が得られた:C=55.88%
(56.08%)、H=6.63%(6.56%)、N=14.02%
(13.77%)及びBr=9.80%(9.82%) アミノ酸分析により正しい比の所期のアミノ酸
が認められた: Ala1.00、Lys1.02、Arg0.97 4fBOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−2NA.
AcOH 化合物4e8.14g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。この生成物7.65
g(理論量の96.5%)が得られた。 例 5 BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−1−Na.
AcOH 5a Cbo−Arg−1−NA.HCl 十分に乾燥したCbo−Arg−OH.HCl3.45g
(10ミリモル)を乾燥HMPTA100ml中で水分遮
断下に溶解した。−10゜に冷却後、Et3N1.39ml(10
ミリモル)をその溶液に溶かしかつその後で
HMPTA20ml中のクロル蟻酸イソブチルエステ
ル1.35g(10ミリモル)を15分間滴加し、その際
温度は−10〜−5゜に保持した。その後、得られた
溶液にHMPTA15ml中の1−ナフチルアミン1.72
g(12ミリモル)を滴加し、その際前記の温度を
保持した。反応混合物を80゜で真空中で濃縮乾固
した。残渣をMeOH100ml中に溶かしかつMeOH
中の“セフアデツクス”LH−20のカラムでゲル
濾過することにより精製した。トリプシン処理に
より1−ナフチルアミンの遊離下に分離した溶出
液の画分がDSCにおいてLMS中で均一であるこ
とが明らかになつた。この画分を濃縮乾固した。
無定形化合物5a2.82g(理論量の60.1%)が得ら
れた。 元素分析及び実験式:C24H28N5O3Clからの計
算により次の数値が明らかになつた:C=61.07
%(61.33%)、H=6.10%(6.01%)、N=15.05
%(14.90%)及びCl=7.38%(7.54%) 5b 2HBr.H−Arg−1−NA 化合物5a9.40g(20ミリモル)を例1bにより氷
酢酸中の2N−HBr80mlの溶液で脱ブロツクした。
後処理して得られた生成物をMeOH150ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により1−ナフチル
アミンの遊離下に分離した。MeOH溶出液の画
分を真空中30゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥
箱中P2O5上40゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で
均一な無定形化合物5b8.40g(理論量の90.8%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C16H23N5OBr2からの計算により次の数値が明ら
かになつた:C=42.20%(41.67%)、H=5.08%
(5.03%)、N=15.33%(15.19%)及びBr=34.10
%(34.65%)。 5c Cbo−Ala−Arg−1−NA.HBr 化合物5b4.6g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Ala−OpNP3.80g(11ミリモル)と反応
させた。後処理して得られた粗製生成物を50%−
AcOH150ml中に溶かしかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より1−ナフチルアミンの遊離下に分離した
AcOH−溶出液の画分を真空中40゜で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上60゜で乾燥後に、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
5c4.80g(理論量の82.1%)が得られた。元素分
析及び実験式:C27H33N6O4Brからの計算により
次の数値が得られた:C=55.62%(55.39%)、
H=6.70%(5.68%)、N=14.63%(14.35%)及
びBr=13.35%(13.65%)。 5d 2HBr.H−Ala−Arg−1−NA 化合物5c4.68g(8ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr28mlで脱ブロツクした。後処
理して得られた粗製生成物をMeOH100ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により1−ナフチル
アミンの遊離下に分離したMeOH溶出液の画分
を真空中30゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥箱
中P2O5上40゜で乾燥後にDSCにおいてLMS中で均
一な無定形化合物5dが得られた。実験式:元素
分析及びC19H28N6O2Br2からの計算により次の
数値が得られた:C=43.09%(42.87%)、H=
5.38%(5.30%)、N=16.10%(15.79%)及びBr
=29.80%(30.02%) 5e BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−1−
NA.HBr 化合物5d2.66g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させた。後処理して得られた粗製生成
物を50%−AcOH100ml中に溶解しかつ“セフア
デツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプ
シン処理により1−ナフチルアミンの遊離下に分
離したAcOH溶出液の最初の主要画分を真空中
40゜で濃縮乾固し、その後真空乾燥箱中P2O5上60゜
で乾燥させた。DSCにおいてLMS中で均一な無
定形化合物5e3.46g(理論量の85%)が得られ
た。元素分析及び実験式:C38H53N8O7Brからの
計算により次の数値が得られた:C=55.98%
(56.08%)、H=6.68%(6.56%)、N=13.02%
(13.77%)及びBr=9.80%(9.82%)。 アミノ酸分析により正しい比の所期のアミノ酸
が得られた: Ala1.00:Lys1.01:Arg0.97 5f BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−1−
NA.AcOH 化合物5e8.14g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。この生成物7.77
g(理論量の98.0%)が得られた。 例 6 BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−4−MeO−
2−NA.HBr 6b 2HBr.H−Arg−4−MeO−2−NA 市販のCbo−Arg−4−MeO−2−NA.
HCl10.0g(20ミリモル)を例1bにより氷酢酸中
の2N−HBr80mlで脱ブロツクした。後処理して
得られた粗製生成物をMeOH150ml中に溶解しか
つ“セフアデツクス”LH−20のカラム上で精製
した。トリプシン処理により4−メトキシ−2−
ナフチルアミンの遊離下に分離したMeOH溶出
液の主要フラクシヨンを真空中30゜で濃縮乾固し
た。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
6b8.98g(理論量の91.4%)が得られた。元素分
析及び実験式:C17H25N5O2Br2からの計算によ
り次の数値が得られた:C=41.22%(41.57%)、
H=5.19%(5.13%)、N=14.40%(14.26%)及
びBr=32.01%(32.53%) 6c Cbo−Ala−Arg−4−MeO−2−NA.HBr 化合物6b4.91g(10ミリモル)を例1cにより
Cbo−Ala−OpNP3.80g(11ミリモル)と反応
させた。後処理後、得られた粗製生成物を50%−
AcOH150ml中に溶解しかつ“セフアデツクス”
G−15のカラム上で精製した。トリプシン処理に
より4−メトキシ−2−ナフチルアミンの遊離下
に分離したAcOH溶出液の最初の主要フラクシヨ
ンを真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾燥
箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中で
均一な無定形化合物6c4.86g(理論量の79.0%)
が得られた。元素分析及び実験式:
C28H35N6O5Brからの計算により次の数値が明ら
かになつた:C=54.38%(54.64%)、H=5.81%
(5.73%)、N=13.93%(13.65%)及びBr=12.75
%(12.98%) 6d 2HBr.H−Ala−Arg−4−MeO−2−NA 化合物6c4.31g(7ミリモル)を例1dにより氷
酢酸中の2N−HBr28mlで脱ブロツクした。後処
理して得られた粗製生成物をMeOH100ml中に溶
かしかつ“セフアデツクス”LH−20のカラム上
で精製した。トリプシン処理により4−メトキシ
−2−ナフチルアミンの形成下に分離した
MeOH溶出液の主要画分を真空中30゜で濃縮乾固
した。残渣を真空乾燥箱中P2O5上40゜で乾燥後、
DSCにおいてLMS中で均一な無定形化合物
6b3.74g(理論量の95.0%)が得られた。元素分
析及び実験式:C20H30N6O3Br2からの計算によ
り次の数値が明らかになつた:C=43.01%
(42.72%)、H=5.44%(5.38%)、N=15.25%
(14.95%)及びBr=28.03%(28.42%) 6e BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−4−
MeO−2−NA.HBr 化合物6d2.81g(5ミリモル)を例1eにより
BOC−Lys(ε−Cbo)−OpNP2.76g(5.5ミリモ
ル)と反応させた。後処理して得られた粗製生成
物を50%−AcOH125ml中に溶かしかつ“セフア
デツクス”G−15のカラム上で精製した。トリプ
シン処理により4−メトキシ−2−ナフチルアミ
ンの遊離下に分離したAcOH溶出液の最初の主要
画分を真空中40゜で濃縮乾固した。残渣を真空乾
燥箱中P2O5上60゜で乾燥後、DSCにおいてLMS中
で均一な無定形化合物6e3.31g(理論量の78.5
%)が得られた。元素分析及び実験式:
C39H55N8O8Brからの計算により次の数値が得ら
れた:C=55.05%(55.51%)、H=6.63%(6.57
%)、N=13.40%(13.28%)及びBr=9.30%
(9.47%) 6f BOC−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−4−
MeO−2−NA.AcOH 化合物6e8.44g(10ミリモル)を例1fにより相
応するアセテート塩に変換した。この生成物8.05
g(理論量の97.8%)が得られた。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
次表には、本発明によるペプチド誘導体のC1
−エステラーゼによる分解性についての数値デー
タが掲載されている。記載の数値は次のように測
定した:トリスイミダゾール緩衝液1.8mlと、溶
液1ml当り800トシルチロシンエチルエステル単
位(TTEE)C1−エステラーゼを含有する溶液
0.015mlの混合物に、2×10-3モルのペプチド誘
導体溶液0.2mlを37゜で添加した。その後、ペプチ
ド誘導体の分解の際に生成する脱離生成物(例え
ばp−ニトロアニリン、4−メトキシ−2−ナフ
チルアミン又は4−メチル−7−アミノクマリ
ン)により5分間の短時間で惹起された光学密度
△ODの増加を405nmで測定した。螢光性脱離生
成物(例えば1−又は2−ナフチルアミン又は
1,3−ジ(メトキシカルボニル)−5−アミノ
−ベンゼン)の場合、光学密度の増加は相応する
発光波長で測定した。単位時間当りの光学密度の
増加の測定値からモル吸光係数に基いて1分間当
りに1TTEE単位C1−エステラーゼにより形成さ
れた分解生成物の量をナノモルで計算する。
−エステラーゼによる分解性についての数値デー
タが掲載されている。記載の数値は次のように測
定した:トリスイミダゾール緩衝液1.8mlと、溶
液1ml当り800トシルチロシンエチルエステル単
位(TTEE)C1−エステラーゼを含有する溶液
0.015mlの混合物に、2×10-3モルのペプチド誘
導体溶液0.2mlを37゜で添加した。その後、ペプチ
ド誘導体の分解の際に生成する脱離生成物(例え
ばp−ニトロアニリン、4−メトキシ−2−ナフ
チルアミン又は4−メチル−7−アミノクマリ
ン)により5分間の短時間で惹起された光学密度
△ODの増加を405nmで測定した。螢光性脱離生
成物(例えば1−又は2−ナフチルアミン又は
1,3−ジ(メトキシカルボニル)−5−アミノ
−ベンゼン)の場合、光学密度の増加は相応する
発光波長で測定した。単位時間当りの光学密度の
増加の測定値からモル吸光係数に基いて1分間当
りに1TTEE単位C1−エステラーゼにより形成さ
れた分解生成物の量をナノモルで計算する。
【表】
【表】
この分解性は1分間当りに1TTEEC1−エステ
ラーゼにより形成された分解生成物(ナノモル)
で表わす。 血しよう中のC1−エステラーゼインヒビター
濃度の測定は次のように実施することができる:
PH7.4、イオン濃度0.2のトリスイミダゾール緩衝
液1.6ml及びチトレート血しよう0.1mlの混合物を
精製C1−エステラーゼ0.1mlと37゜で4分間恒温保
持する。培養物に本発明による基質の2×10-3モ
ルの水溶液0.2mlを添加した。基質が色原体の基
(R1)としてp−ニトロアニリノ基を有する場
合、1分間当りに遊離する分解生成物p−ニトロ
アニリン(R1−H)の量を405nmで分光光度法
により測定する。血しようを含有しないが、その
他は同じ組成の試験系で1分間当りに遊離するp
−ニトロアニリンの量を前記のように測定する。
両者の測定値の差から血しようのC1−エステラ
ーゼインヒビター濃度が計算される。
ラーゼにより形成された分解生成物(ナノモル)
で表わす。 血しよう中のC1−エステラーゼインヒビター
濃度の測定は次のように実施することができる:
PH7.4、イオン濃度0.2のトリスイミダゾール緩衝
液1.6ml及びチトレート血しよう0.1mlの混合物を
精製C1−エステラーゼ0.1mlと37゜で4分間恒温保
持する。培養物に本発明による基質の2×10-3モ
ルの水溶液0.2mlを添加した。基質が色原体の基
(R1)としてp−ニトロアニリノ基を有する場
合、1分間当りに遊離する分解生成物p−ニトロ
アニリン(R1−H)の量を405nmで分光光度法
により測定する。血しようを含有しないが、その
他は同じ組成の試験系で1分間当りに遊離するp
−ニトロアニリンの量を前記のように測定する。
両者の測定値の差から血しようのC1−エステラ
ーゼインヒビター濃度が計算される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 式: 〔式中 R1は酵素加水分解により着色又は螢光化合物
の形成下に脱離可能であり、芳香族基又はヘテロ
環式基で置換されている色素形成アミノ基を表わ
し、 R2は水素を表わすか又は a 炭素原子2〜6個を有する直鎖状又は分枝鎖
状のアルカノイル基、 b シクロヘキシルカルボニル基、 c アルカノイル中に炭素原子2〜4個を有する
ω−カルボキシル−、ω−メトキシカルボニル
−又はω−エトキシカルボニル−アルカノイル
基、 d アルコキシ中に炭素原子1〜4個を有する直
鎖状又は分枝鎖状のアルコキシカルボニル基、 e アルキル中に炭素原子1〜2個を有するアル
キルスルホニル基もしくはフエニル−又はp−
トルイル−スルホニル基、 f 置換されていないか又は置換されているベン
ゾイル基、又は g 核が置換されていないか又は置換されている
ベンジルオキシカルボニル基を表わし、 R3は核が置換されていないか又は置換されて
いるベンジル基を表わし、 Xはグリシル基又はアラニル基を表わし、Yは
単結合であるか又は式:
【式】(式中R4はベン ジル基、フエニル基、シクロヘキシル基、シクロ
ヘキシルメチル基、4−ヒドロキシベンジル基、
4−ヒドロキシシクロヘキシルメチル基を表わし
かつmは数値ゼロでありかつYにより定義される
アミノ酸はL−又はD−配置を有するかあるいは
R4は水素を表わしかつmは数値0,1又は2を
表わす)の基を表わす〕のペプチド誘導体(ただ
しC2H5CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNAを
除く)もしくは鉱酸又は有機酸とのその塩。 2 R1がp−ニトロフエニルアミノ基、1−又
は2−ナフチルアミノ基、4−メトキシ−2−ナ
フチルアミノ基、4−メチル−7−クマリルアミ
ノ基又は1,3−ジ(メトキシカルボニル)−5
−フエニルアミノ基である特許請求の範囲第1項
記載の誘導体。 3 R3がベンジル基、4−メチルベンジル基、
4−メトキシベンジル基、もしくは2−,3−又
は4−クロルベンジル基である特許請求の範囲第
1項又は第2項記載の誘導体。 4 R2が炭素原子2〜6個を有するアルカノイ
ル基又はアルコキシ中に炭素原子1〜4個を有す
るアルコキシカルボニル基を表わしかつYが単結
合を表わしかつR3がベンジル基を表わす〕特許
請求の範囲第1項又は第2項記載の誘導体。 5 BOC−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH,2AcOH.H−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg
−pNA,Ac−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−
pNA.AcOH,CH3OCO−Lys(ε−Cbo)−Gly−
Arg−pNA.AcOH,C2H5OCO−Lys(ε−Cbo)
−Gly−Arg−pNA.AcOH,iso−ButOCO−Lys
(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,CH3
(CH2)2CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.
AcOH,CH3CH2OCO−CH2−CO−Lys(ε−
Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,BOC−Lys(ε
−Cbo)−Ala−Arg−pNA.AcOH,H−Lys(ε
−Cbo)−Ala−Arg−pNA.2CF3COOH,Ac−
Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−pNA.AcOH,
CH3OCO−Lys(ε−Cbo)−Ala−Arg−pNA.
AcOH,BOC−Gly−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg
−pNA.AcOH,2CF3COOH.H−Gly−Lys(ε−
Cbo)−Gly−Arg−pNA,CH3O−CO−Gly−
Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNA.AcOH,CH3
−CH2−CO−Gly−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−
pNA.AcOHである特許請求の範囲第1項から第
4項までのいずれか1項に記載の誘導体。 6 酵素C1−エステラーゼを含有する培地か又
は中で前記酵素が生成するか又は消費されるその
培地中の前記酵素を定量測定する方法において、
前記培地を式: 〔式中 R1は酵素加水分解により着色又は螢光化合物
の形成下に脱離可能であり、芳香族基又はヘテロ
環式基で置換されている色素形成アミノ基を表わ
し、 R2は水素を表わすか又は a 炭素原子2〜6個を有する直鎖状又は分枝鎖
状のアルカノイル基、 b シクロヘキシルカルボニル基、 c アルカノイル中に炭素原子2〜4個を有する
ω−カルボキシル−、ω−メトキシカルボニル
−又はω−エトキシカルボニル−アルカノイル
基、 d アルコキシ中に炭素原子1〜4個を有する直
鎖状又は分枝鎖状のアルコキシカルボニル基、 e アルキル中に炭素原子1又は2個を有するア
ルキルスルホニル基もしくはフエニル−又はp
−トルイル−スルホニル基、 f 置換されていないか又は置換されているベン
ゾイル基、又は g 核が置換されていないか又は置換されている
ベンジルオキシカルボニル基を表わし、 R3は核が置換されていないか又は置換されて
いるベンジル基を表わし、 Xはグリシル基又はアラニル基を表わし、Yは
単結合であるか又は式:
【式】(式中R4はベン ジル基、フエニル基、シクロヘキシル基、シクロ
ヘキシルメチル基、4−ヒドロキシベンジル基、
4−ヒドロキシシクロヘキシルメチル基を表わし
かつmは数値ゼロでありかつYにより定義される
アミノ酸はL−又はD−配置を有するかあるいは
R4は水素を表わしかつmは数値0,1又は2を
表わす)の基を表わす〕のペプチド誘導体(ただ
しC2H5CO−Lys(ε−Cbo)−Gly−Arg−pNAを
除く)と反応させかつ前記酵素のペプチド誘導体
への接触的加水分解作用により単位時間当りに遊
離する脱離生成物R1−Hの量を測光法、分光測
光法、螢光分光測光法又は電気化学的方法により
測定することを特徴とする酵素C1−エステラー
ゼ測定法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH3051/83-3 | 1983-06-03 | ||
CH3051/83A CH653688A5 (en) | 1983-06-03 | 1983-06-03 | Peptide derivatives and their use as substrates for quantitative determination of enzymes |
CH2214/84-7 | 1984-05-07 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6034992A JPS6034992A (ja) | 1985-02-22 |
JPH0360837B2 true JPH0360837B2 (ja) | 1991-09-17 |
Family
ID=4247510
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59111098A Granted JPS6034992A (ja) | 1983-06-03 | 1984-06-01 | ペプチド誘導体及び酵素c↓1―エステラーゼの測定法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6034992A (ja) |
CH (1) | CH653688A5 (ja) |
ZA (1) | ZA844063B (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07238244A (ja) * | 1994-02-25 | 1995-09-12 | Fuji Xerox Co Ltd | 熱インクジェット記録方法 |
US7241333B2 (en) | 2003-12-12 | 2007-07-10 | Canon Kabushiki Kaisha | Ink-jet recording method, ink-jet ink, ink-jet recording unit, ink cartridge for ink-jet recording and ink-jet recording apparatus |
US20070197685A1 (en) | 2006-01-18 | 2007-08-23 | Tamotsu Aruga | Recording ink as well as ink media set, ink cartridge, ink recorded matter, inkjet recording apparatus and inkjet recording method |
EP2064296B1 (en) | 2006-09-19 | 2012-11-21 | Ricoh Company, Ltd. | Recording ink, ink media set, ink cartridge, ink recorded matter, inkjet recording apparatus, and inkjet recording method |
EP2097270B1 (en) | 2006-12-27 | 2015-04-22 | Ricoh Company, Ltd. | Ink-media set, ink composition, ink cartridge, inkjet recording method, inkjet recording apparatus, and ink recorded matter |
JP5224092B2 (ja) | 2007-09-14 | 2013-07-03 | 株式会社リコー | 記録用インク、並びにインクメディアセット、インクカートリッジ、インク記録物、インクジェット記録装置、及びインクジェット記録方法 |
-
1983
- 1983-06-03 CH CH3051/83A patent/CH653688A5/de not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-05-29 ZA ZA844063A patent/ZA844063B/xx unknown
- 1984-06-01 JP JP59111098A patent/JPS6034992A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SEMIN THROMB.HEMOSTASIS=1983 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CH653688A5 (en) | 1986-01-15 |
JPS6034992A (ja) | 1985-02-22 |
ZA844063B (en) | 1985-01-30 |
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