JPH0244840B2 - - Google Patents

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JPH0244840B2
JPH0244840B2 JP62052241A JP5224187A JPH0244840B2 JP H0244840 B2 JPH0244840 B2 JP H0244840B2 JP 62052241 A JP62052241 A JP 62052241A JP 5224187 A JP5224187 A JP 5224187A JP H0244840 B2 JPH0244840 B2 JP H0244840B2
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JP
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acid
group
meoh
solution
lys
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JP62052241A
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JPS62294696A (ja
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Guntoro Suentosen Rarusu
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DSM Nutritional Products AG
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Pentapharm AG
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Publication date
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Publication of JPH0244840B2 publication Critical patent/JPH0244840B2/ja
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  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、蛋白分解酵素、特に酵素部類E.
C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、トロンピン及びプラズミンを定量分析するた
めの基質として有用な新規なトリペプチド誘導体
に関する。 所謂器官カリクレイン又は腺カリクレインは、
種々の器官及び腺、例えば分泌腺、唾液腺、腎
臓、消化管粘膜等によつて得られ、前酵素の形又
は活性形の分泌される。これらの器官又は腺カリ
クレインは、化学的及び生理学的に血漿カリクレ
インとは異なるものである。一定の病理学的条件
下で器官カリクレイン分泌物濃度は、正常値より
も低下するか又は正常値よりも上昇する。すなわ
ち、例えば尿のカリクレイン分泌は、腎臓疾病の
患者の正常値よりも実質的に減少する。腎臓硬化
症の患者においてカリクレイン分泌は、殆んど完
全に抑圧されている。特発性高血圧症の患者にお
いて、24時間―尿のカリクレイン分泌は、正常値
の50％平均として有効に減少されている（例え
ば、H.S・Margolius著、“Chemistry and
Biology、of the Kallikrein Kinin System in
Health and Disease”、1974年、第399〜409頁、
参照）。それ故、簡単な処理方法で器官カリクレ
インを迅速に定量分析することは重要である。例
えば、一定のアルギニンエステル、例えばトジル
―アルギニンメチルエステル（TAME）をエス
テル分解することによつて尿カリクレインを分析
することは、公知である。改善されたエステル分
解法では、三重水素で標識されたトジル―アルギ
ニンメチルエステルを使用し、エステル分解によ
つて放出されるメタノールの放射能を測定する。
しかし、これらのエステル分解法は、該方法がカ
リクレインがエステル分解によらずアミド分解に
より天然のペプチド鎖を分解する蛋白分解酵素で
ある程度に非生理学的であるという欠点を有す
る。更に、エステル基質は、該基質が多数の他の
酵素によつて分解されている、すなわちカリクレ
インによつて不明確に分解されているという欠点
を有する。三重水素で標識されたTAMEを用い
る方法は、三重水素で標識されたメタノールの放
射能測定よりも前に、エステル分解混合物中にな
お存在する三重水素で標識された残留TAMEが
測定を邪魔するのでメタノールをエステル分解混
合物から水と不混和性の液体で抽出しなければな
らない程度に複雑である。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2527932号明細書には、式： R1―Pro―Ｘ―Arg―NH―R2（但し、R1は保護
基を表わし、−NH―R2は発色団を表わし、Ｘは
フエニルアラニル基、β―シクロヘキシルアラニ
ル基、フエニルグリシル基又はチロシル基を表わ
す）で示される基質が記載されている。該基質
は、血漿カリクレインによつて極めて簡単に分解
され、有色の分解生成物R2―NH2を生じ、この
場合この分解生成物の量は、測光法、分光測光法
又は螢光測光法によつて測定することができる。
また、器官又は腺カリクレインを分析するために
該基質を使用することも試みられた。しかし、意
外なことに、該基質は、器官又は腺カリクレイン
に対して敏感でない、すなわち器官又は腺カリク
レインによつて分解されないか又は少量が分解さ
れるにすぎないことが判明した。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2629067号明細書には、特定の蛋白分解酵素、
例えば腺又は器官カリクレイン及びプラズミンを
分析するための基質として有用なトリペプチド誘
導体が記載されている。すなわち、Ｈ―Ｄ―バリ
ル―ロイシル―アルギニル―ｐ―ニトロアニリド
ジヒドロクロリド及びＨ―Ｄ―バリル―ロイシル
―リジル―ｐ―ニトロアニリドジヒドロクロリド
が２つの例として挙げられている。第１のトリペ
プチド誘導体は、腺カリクレインのための基質で
あり、第２のトリペプチド誘導体は、プラズミン
のための基質である。これら２つの化合物は、該
酵素によつて分解され、ｐ―ニトロアニリンを生
じ、この場合このｐ―ニトロアニリンの量は、測
光法又は分光測光法により測定することができ
る。しかしながら、Ｈ―Ｄ―バリル―ロイシル―
アルギニル―ｐ―ニトロアニリドジヒドロクロリ
ドの感受率は、濃縮されていない尿中の尿カリク
レインを正確に分析するのに必要な限界値に到達
する。しかし、該アミド基質を濃縮された尿中で
使用する場合には、ｐ―ニトロアニリンの測光法
による測定は、尿の独自の色によつて強固に阻止
される。 前記の西ドイツ国特許明細書に記載された２つ
のトリペプチド誘導体のトリペプチド鎖中の第１
の２つのアミノ酸は、α―又はβ位に阻水性イソ
プロピル基を有する。この阻水性を増大させ、そ
の後に腺カリクレインに対する感受性を増大させ
るために、ジペブチド鎖の基本構造を維持しなが
ら、イソプロピル基を芳香族基、例えばフエニル
基に代えることが試みられた。しかし、この試み
は失敗した。芳香族基を装入することによつて得
られるトリペプチド基質は、腺カリクレインによ
つて全く分解されないか又は多くの場合極めて少
量が分解されるにすぎない。しかし、芳香族基を
有するこれらのトリペプチド基質は、プラズミン
に対して驚異的に高い感受性を有する。更に意外
なことに、該トリペプチドプラズミン基質におけ
る芳香族基の水素添加は、器官又は腺カリクレイ
ンに対して驚異的に高い感受性を有する新規部類
のトリペプチド基質を生じることが見い出され
た。トリペプチド鎖を増加させるには、蛋白分解
酵素によつて分解される基質を得るために天然に
生じるアミノ酸だけを使用することができること
が判明していた。それ故、シクロヘキシル基を含
有しかつ天然に生じないアミノ酸を使用すること
により、器官又は腺カリクレイン及びその他の蛋
白分解酵素、例えば血漿カリクレインによつて簡
単に分解される発色団基質を得ることができるこ
とが見い出されたことは意外なことであつた。 本発明は、特定の蛋白分解酵素、特に酵素部類
E.C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、プラズミン及びトロンビンに対して高い感受
性を有し、したがつて該酵素を定量分析するため
の基質として有用な新規の発色団基質に関する。
該基質は、一般式： Ｈ―Ｄ―Ｘ―Ｙ―Lys―Ｒ ［式中、 Ｘはα―アミノブチリル基、ロイシル基、ノル
ロイシル基、イソロイシル基、バリル基又はノル
バリル基を表わし、Ｙはシクロヘキシルアラニル
基又はシクロヘキシルチロシル基を表わし、Ｒは
ｐ―ニトロフエニルアミノ基、２―ナフチルアミ
ノ基、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ基、４
―メチル―クマリル―７―アミノ基又は１，３―
ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―５―アミ
ノ基を表わす］で示されるトリペプチド誘導体又
は酸とのその塩である。 式中でＲによつて表わされる発色団は、例え
ばｐ―ニトロフエニルアミノ基、２―ナフチルア
ミノ基、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ基、
４―メチル―クマリル―(7)―アミノ基又は１，３
―ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―(5)―ア
ミノ基であることができる。 式のトリペプチド誘導体は、水性媒体に対し
て難溶性であり、したがつてその酸との塩の形
で、殊に鉱酸、例えばHCl、HBr、H2SO4、
H3PO4等、又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プ
ロピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、ト
リクロル―又はトリフルオル酢酸のようなハロゲ
ン化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、
クエン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族
酸、例えばトルイル酸、クロル―又はブロム安息
香酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、フ
タル酸等との塩の有利に使用される。該酸の性質
は、該酸が基質と酵素との間の反応に関与しない
ので重要ではない。 式の基質及びその酸との塩は、特定の蛋白分
解酵素、特に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素
（“Enzyme Nomenclature”、Elsevier Scientific
Publishing Company （Amsterdam）社刊、
1973年、第238頁以降、参照）、例えば器官カリク
レイン及び腺カリクレイン、プラズミン及びトロ
ンビンの作用によつて加水分解により分解され、
その結果式：Ｒ―NH2の有色性又は螢光性分解
生成物が形成され、この場合この分解生成物の量
は、測光法、分光測光法、螢光分光測光法又は電
気化学的方法によつて測定することができる。従
つて、この新規の基質は、蛋白分解酵素、殊にア
ルギニンないしはリジンのカルボキシル側鎖上の
天然のペプチド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.
の酵素、例えば器官又は腺カリクレイン、プラズ
ミン、血漿カリクレイン、トロンビンないしはそ
れらの抑制因子及び前酵素、ならびに該酵素の形
成又は抑御に関与するその他の因子を定量分析す
るのに有用である。 トリペプチド誘導体の優れた群は、 Ｙがシクロヘキシルアラニル基、シクロヘキシ
ルチロシル基、を表わし、 Ｘがα―アミノブチリル基、バリル基、ノルバ
リル基、ロイシル基、ノルロイシル基又はイソロ
イシル基又はプロリル基を表わす式の化合物か
らなる。 次の実施例７、８、９、10、11に記載のトリペ
プチド誘導体は、殊に尿カリクレインを分析する
ための基質として有用である。 ヒトの喀痰中のカリクレインを分析するには、
次の実施例８、９、10、11に記載のトリペプチド
誘導体を使用することができる。 次の実施例２、４、６、８、10、11及び12に記
載のトリペプチド誘導体は、プラズミンを分析す
るのに使用することができる１群の基質を構成す
る。 本発明によれば、蛋白分解酵素、殊にアルギニ
ンないしはリジンのカルボキシル側鎖上の天然の
ペプチド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の酵
素、例えば器官又は腺カリクレイン、プラズミン
及びトロンビンを定量分析する方法が記載され
る。本発明によれば、この方法は、前記酵素を含
有するか又は該酵素を形成又は消費する物質を、
式のトリペプチド誘導体と反応させ、このトリ
ペプチド誘導体における酵素の加水分解作用によ
つて形成される有色又は螢光分解生成物Ｒ―
NH2の量を、測光法、分光測光法、螢光分光測
光法又は電気化学的方法によつて測定することよ
りなる。本発明によれば、この方法は、例えば酵
素標本の酵素含量又はヒトの体液及び哺乳動物の
体液、例えば尿、膵液、、腸粘液、乳腺分泌物、
汗腺分泌物、喀痰及び血液中の酵素濃度を分析す
ることができる。本発明によれば、この方法は、
殊に前記体液中の器官又は腺カリクレイン及び血
漿カリクレインを定量分析するのに有用である。
この方法によれば、遊離器官カリクレイン及び粘
膜カリクレインないしプレカリクレインから形成
されたカリクレイン、さらにカリクレインの生理
学的又は非生理学的抑制因子及びプレカリクレイ
ンの生理学的又は非生理学的賦活体を分析するこ
とができる。 式のトリペプチド誘導体は、以下に記載した
方法により製造することができる： (1) 発色団Ｒを、Ｃ―末端リジンのカルボキシル
基に結合させ、その際にα―アミノ基を保護
基、例えばカルボベンゾキシ基又はｔ―ブトキ
シカルボニル基によつて保護し、リジンの場合
にはε―アミノ基を、カルボベンゾキシ基、又
はｐ―メチル―、ｐ―メトキシ―又はｐ―クロ
ルベンジルオキシカルボニル基、又はｔ―ブト
キシカルボニル基によつて保護する。また、Ｃ
―末端Ｒ―NH基は、ペプチド鎖を段階的に合
成する間保護基として役立つ。その他の保護基
は、必要な場合には所望のペプチド鎖が完全に
合成されるまで他のアミノ酸誘導体を結合させ
るために選択的に除去することができる。最後
に、残留する保護基を、Ｒ―NH―基を作用さ
せることなしに完全に分解する（例えば、
Miklos Bodansky他、“Peptide Synthesis”、
Interscience Publishers社刊、1966年、第163
〜165頁）。 (2) 第１にペプチド鎖を（Bodansky他による方
法、上記引用文中、により）合成するが、その
際にリジンのＣ―末端カルボキシル基を常用の
エステル基、例えばメトキシ基、エトキシ基又
はベンジルオキシ基（アルギニンの場合）、又
はｔ―ブトキシ基（リジンの場合）によつて保
護する。該エステル基は、トリフルオル酢酸に
より選択的に分解しなければならないｔ―ブト
キシ基を除いて、アルカリ加水分解によつて除
去することができる。アルギニンのδ―グアニ
ジル基をプロトン化する場合には、該エステル
基をトリプシンを用いて酵素により除去し、こ
の場合ラセミ化は起こらない。次に、発色団Ｒ
―NH―を結合させる。アルギニンのδ―グア
ニジノ基をニトロ基又はトシル基によつて保護
するか又はリジンのε―アミノ基をカルボベン
ゾキシ基又はｔ―ブトキシ基によつて保護し、
トリペプチド誘導体のＮ―末端α―アミノ基を
カルボベンゾキシ基又はｐ―メチル―、ｐ―メ
トキシ―又はｐ―クロルベンジルオキシカルボ
ニル基又はｔ―ブトキシ基によつて保護する場
合には、全ての保護基を同時に除去する。この
除去は、保護されているトリペプチド誘導体を
無水HFで室温で処理することによつて実施す
ることができ、したがつてこの場合にはアミノ
基及びδ―グアニジノ基の全ての前記保護基が
除去される。また、この除去は、保護されてい
るトリペプチド誘導体が保護ニトロ基又はトシ
ル基を含有しない場合、氷酢酸中の2N HBrで
室温で処理することによつて実施することもで
きる。 本発明によるトリペプチド誘導体の製造は、次
の実施例に詳記されている。 実施例によつて得られた溶出液及び生成物の分
析は、シリカゲルで被覆されたガラス板
（Merck社、F254）を用いて薄層クロマトグラフ
イーによつて行なわれた。薄層クロマトグラム
は、次の溶剤系によつて展開した： Ａ クロロホルム／メタノール（９：１） Ｂ ｎ―プロパノール／酢酸エチル／水（７：
１：２） Ｃ ｎ―ブタノール／酢酸／水（３：１：１） 次の略語を使用する： AcOH＝酢酸 Ala＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ―ブトキシカルボニル But＝α―アミノ酪酸 Cbo＝カルボベンゾキシ CHA＝シクロヘキシルアラニン CHG＝シクロヘキシルグリシン CHT＝シクロヘキシルチロシン＝
ｐ―ヒドロキシシクロヘキシルアラ
ニン DMF＝ジメチルホルムムアミド DPA＝１，３―ジ（メトキシカル
ボニル）―フエニル―(5)―アミド TLC＝薄層クロマトグラフイー Et3N＝トリエチルアミン HMPTA＝燐酸Ｎ，Ｎ，N′，N′，
N″，N″―ヘキサメチルトリアミド Ile＝イソロイシン Leu＝ロイシン SS＝溶剤系 Lys＝リジン MCA＝４―メチル―クマリル―(7)
―アミド MeOH＝メタノール ４―MeO―２―NA＝４―メトキシ―２―ナフチ
ルアミド Nleu＝ノルロイシン Nval＝ノルバリン OpNP＝ｐ―ニトロフエノキシ Phe＝フエニルアラニン Ph′Gly＝フエニルグリシン Pip＝ピペコリン酸 pNA＝ｐ―ニトロアニリド Pro＝プロリン THF＝テトラヒドロフラン Tyr＝チロシン Val＝バリン 特に記載しない限り、ペプチド鎖中のアミノ酸
はＬ―形を有する。 例 １（参考例） Ｈ―Ｄ―CHG―CHA―Arg―pNA.2HBr 1a Cbo―Arg―pNA.HCl 250mlの三首フラスコ中で（真空中でP2O5上
で乾燥した）Cbo―Arg―OH.HCl16.0ｇ（47.0
ミリモル）を20℃で無水HMPTA90mlに溶解
し、この場合フラスコ中の雰囲気は湿分を含ま
ないように保持した。得られた涼液に室温でま
ずHMPTA10ml中のEt3N4.74ｇ（47.0ミリモ
ル）の溶液を添加し、次に（100％過剰の）ｐ
―ニトロフエニルイソシアネート16.4ｇ（100
ミリモル）を滴加した。20℃での24時間の反応
時間後、HMPTAの大部分を真空中で蒸留す
ることによつて除去した。この残滓を30％
AcOHで数回抽出した。この残滓を廃棄した。
合した酢酸抽出液を30％AcOHで平衡させかつ
30％AcOHで溶離せしめる“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―15”（登録商標）のカラムを
通すことによつてさらに精製した。ｐ―ニトロ
アニリンの遊離下にトリプシンで処理すること
によつて分解されたAcOH溶出液の画分を凍結
乾燥した。こうして、TLCによつて示される
ようにSS Ｃ中で均一な無定形粉末12.6ｇが得
られた。元素分析及び実験式C20H25N6O5Clか
らの計算により次の値が得られた（実験式から
の値は括弧内のものである）：Ｃ＝51.29％
（51.67％）、Ｈ＝5.48％（5.42％）、Ｎ＝17.92％
（18.08％）、Cl＝7.50％（7.63％）。 1b 2HBr.H―Arg―pNA 化合物1a4.65ｇ（10ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr40mlで20℃で湿分の不在下に
45分間処理した。アミノ酸誘導体はCO2の発生
下に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無
水エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H―Arg―pNAの沈殿物を生じた。エー
テル相を吸引濾過し、その上固体相を副生成物
として形成された臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテ
ル100mlの量で４回洗浄した。この残滓をメタ
ノール50mlに溶解し、そのPHをEt3Nを添加す
ることによつて4.5に調節し、この溶液を真空
中で30℃で濃縮乾燥した。得られた生成物を
MeOH75mlに溶解し、MeOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”（架
橋デキストランゲル）のカラムを通した。この
溶出液の画分から、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物1b4.18ｇ
（理論値の91.6％）が得られた。元素分析及び
実験式C12H20N6O3Br2からの計算により次の
値が得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝
4.35％（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及び
Br＝34.81％（35.03％）。 1c Cbo―CHA―Arg―pNA.HBr 化合物1b4.56ｇ（10ミリモル）を新しく蒸留
したDMF30mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液に撹拌下でEt3N1.40ml
（10ミリモル）を添加した。形成したEt3N.
HBrを濾過することによつて除去し、冷たい
DMFの少量で洗浄した。この濾液に−10℃で
Cbo―CHA―OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を添
加し、反応を湿分の不在下に２〜３時間継続さ
せ、この場合反応溶液の温度は次第に約20℃に
到達した。この溶液を再び−10℃に冷却し、
Et3N0.70ml（５ミリモル）で緩衝し、−10℃で
約２時間反応させ、室温で約３時間反応させ
た。この方法をHt3N0.70mlを用いて繰り返し、
16時間この反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥
した。この残滓を50％AcOH75mlに溶解し、50
％AcOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―15”のカラムでゲル濾過する
ことによつて精製した。ｐ―ニトロアニリンの
遊離下でトリプシンで処理することによつて分
解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃
で濃縮乾燥した。この残滓をMeOH150mlに溶
解し、再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を
真空デシケーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
無定形化合物1c5.85ｇ（理論値の88.3％）を得
た。元素分析及び実験式C29H40N7O6Brからの
計算により次の値が得られた：Ｃ＝52.28％
（52.57％）、Ｈ＝6.16％（6.09％）、Ｎ＝15.09％
（14.80％）及びBr＝11.85％（12.06％）。 1d 2HBr.H―CHA―Arg―pNA 化合物1c5.30ｇ（８ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr32mlで20℃で40分間処理し
た。ジペプチド誘導体は、Co2の発生下に次第
に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無水
エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H―CHA―Arg―pNAの沈殿物を生じ
た。エーテル相を吸引濾過し、その上固体相を
副生成物として形成した臭化ベンジルならびに
過剰のHBr及びAcOHを除去するために無水
エーテル100mlの量で４回洗浄した。この残滓
をMeOH50mlに溶解した。PHをEt3Nを用いて
4.5に調節し、この溶液を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。得られた残滓をMeOH50mlに溶解
し、MeOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで精製した。
ｐ―ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られ
た残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上
で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ
中で均一な無定形化合物1d4.48ｇ（理論値の
91.9％）を得た。元素分析及び実験式
C21H35N7O4Brからの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝41.80％（41.39％）、Ｈ＝5.86％
（5.79％）、Ｎ＝16.31％（16.09％）及びBr＝
25.85％（26.23％）。 1e Cbo―Ｄ―CHG―CHA―Arg―pNA.HBr 化合物1d3.05ｇ（５ミリモル）を新しく蒸留
したDMF20mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液にEt3N0.70ml（５ミリモ
ル）を撹拌下で添加した。形成したEt3N.HBr
を濾過することによつて除去し、冷たいDMF
の少量で洗浄した。この濾液に−10℃でCbo―
Ｄ―CHG.OpNP2.27ｇ（5.5ミリモル）を撹拌
下で添加した。この反応混合物をを湿分の不在
下で２〜３時間反応させ、この場合この反応溶
液の温度は次第に約20℃に到達した。この溶液
を再び−10℃に冷却し、Et3N0.35ml（2.5ミリ
モル）で緩衝し、−10℃で約２時間反応させ、
室温でさらに３時間反応させた。この方法を
Et3N0.35mlを用いて繰り返し、16時間後この
反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥した。この
残滓を50％AcOH50mlに溶解し、50％AcOHで
平衝させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
―15”のカラムでゲル濾過することによつて精
製した。ｐ―ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解されたAcOH
溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。この残滓をMeOH100mlに溶解し、この溶
液を再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を真
空デシケーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
無定形化合物1e3.24ｇ（理論値の80.8％）を得
た。元素分析及び実験式C37H53N8O7Brからの
計算により次の値が得られた：Ｃ＝55.72％
（55.43％）、Ｈ＝6.73％（6.66％）、Ｎ＝14.25％
（13.98％）及びBr＝9.86％（9.97％）。 1f 2HBr.H―Ｄ―CHG―CHA―Arg―pNA 化合物1e2.41ｇ（３ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr12mlで20℃で湿分の不在下に
40分間処理した。トリペプチド誘導体は、脱カ
ルボキシル化下及びCO2の発生下で次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル120mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H―
Ｄ―CHG―CHA―Arg―pNAの沈殿物を生じ
た。エーテル相を濾過棒を通して吸引濾過し、
次に固体相を無水エーテル50mlの量で４回洗浄
した。得られた残滓をMeOH40mlに溶解した。
PHをEt3Nを用いて4.5に調節し、この溶液を真
空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH30mlに溶解し、MeOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”のカ
ラムで精製した。ｐ―ニトロアニリンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。後精製するために、予備精製された
残滓を33％AcOH30mlに溶解し、33％AcOHで
平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
―15”のカラムでゲル濾過することによつて精
製した。ｐ―ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解されたAcOH
溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。得られた残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物1f1.68ｇ
（理論値の74.8％）を得た。元素分析及び実験
式C29H48N8O5Br2からの計算により次の値が
得られた：Ｃ＝46.18％（46.53％）、Ｈ＝6.55％
（6.46％）、Ｎ＝15.18％（14.97％）及びBr＝
21.12％（21.35％）。Rf値：0.46 アミノ酸分析により次の正確な比率で所望の
アミノ酸の存在が確認された： Arg：1.00―CHA：0.96―Ｄ―CHG：0.98。 例 ２ 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―pNA 2a BOC―ys（ε―Cbo）―pNA 500mlの三首フラスコ中でBOC―Lys（ε―
Cbo）―OHの乾性油38.05ｇ（0.1モル）を無水
HMPTA150mlに20℃で湿分の不在下に溶解し
た。得られた溶液に室温でまずMPTA25ml中
のEt3N10.12ｇ（0.1モル）の溶液を添加し、次
に（50％過剰の）ｐ―ニトロフエニルイソシア
ネート24.62ｇ（0.15モル）を滴加し、この場
合そのつど強力なCO2の発生が起こつた。20℃
での24時間の反応時間後、HMPTAの大部分
を真空中で蒸留することによつて除去した。こ
の残滓を２％NaHCO3溶液で数回抽出し、次
に蒸留H2Oで浸漬した。得られた残滓を真空
中で40℃で乾燥し、次にこの残滓が難溶性副生
成物Ｎ，Ｎ―ビス（ｐ―ニトロフエニル）尿素
を殆んど含まなくなるまで熱いMeOHで数回
抽出した。このMeOH抽出液を濃縮して300ml
にし、この場合若干の不純物は、凝集沈殿物を
形成した。濾過後、濾液（330ml）をMeOHで
平衡させた（セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムムで精製した。MeOH溶出
液の主画分を真空中で30℃で濃縮して少量に
し、この場合針状物質が晶出した。得られた結
晶を濾別し、氷冷却したMeOH50mlで少量ず
つ洗浄した。真空デシケーター中で40℃で
P2O5上での乾燥後、TLCによつて示されるよ
うにSS Ａ及びＢ中で均一な結晶化合物2a31.1
ｇ（理論値の62.1％）が得られた。母液は、
TLOによつて示されるようにSS Ａ及びＢ中で
均一な物質2a5.8ｇ（理論値11.66％）の他の収
量を生じた。元素分析及び実験式C25H32N4O7
からの計算により次の値が得られた：Ｃ＝
60.23％（59.99％）、Ｈ＝6.50％（6.44％）及び
Ｎ＝11.3％（11.19％）。 2b CF3COOH.H―Lys（ε―Cbo）―pNA 化合物2a25.03ｇ（50ミリモル）を強力撹拌
下で新しく蒸留した無水トリフルオル酢酸50ml
で20℃で湿分の不在下で60分間処理した。
BOC基をCO2の発生下及びイソブチレンの遊
離下で選択的に分解した。この反応溶液を強力
撹拌下で無水エーテル750mlに滴加し、この場
合凝集CF3COOH.H―Lys（ε―Cbo）―pNA
が沈殿した。エーテル相を濾過棒を通して吸引
濾過した。固体相を無水エーテル100mlの量で
４回処理した。得られた残滓をMeOH200mlに
溶解した。PHをEt3Nを用いて4.5に調節し、こ
の溶液を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この残
滓をMeOH200mlに溶解し、MeOHで平衡させ
た“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”
のカラムで精製した。TLCによつて示される
ようにSS Ｃ中で均一なMeOH溶出液の主画分
を真空中で30℃で濃縮した。得られた残滓を真
空デシケーター中で40℃でP2O5上で乾燥し、
無定形化合物2b22.64ｇ（理論値の88.0％）を
得た。元素分析及び実験式C22H25N4O7F3から
の計算により次の値が得られた：Ｃ＝51.66％
（51.36％）、Ｈ＝4.88％（4.90％）及びＮ＝
11.08％（10.89％）。 2c BOC―CHA―Lys（ε―Cbo）―pNA 化合物2b7.72ｇ（15ミリモル）を新しく蒸留
したDMF50mlに溶解し、−10℃に冷却した。こ
の溶液に撹拌下でBOC―CHA―OpNP6.48ｇ
（16.5ミリモル）及びEt3N2.09ml（15ミリモル）
を添加した。この混合物を湿分の不在下で３時
間反応させ、この場合反応温度は、次第に室温
に到達した。この溶液を再び−10℃に冷却し、
Et3N1.05ml（7.5ミリモル）で緩衝した。５時
間の反応時間後、この方法をEt3N1.05mlを用
いて繰り返した。20℃での16時間の反応時間
後、この反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥し
た。この残滓をMeOH150mlに溶解し、MeOH
で平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムでゲル濾過することによつ
て精製した。TLCによつて示されるようにSS
Ａ及びＢ中で均一なMeOH溶出液の第１の主
画分を真空中で30℃で濃縮して少量にした。真
空デシケーター中で40℃でP2O5上での残留物
の乾燥後、TLCによつて示されるようにSS Ａ
及びＢ中で均一な無定形化合物2c7.99ｇ（理論
値の81.5％）が得られた。元素分析及び実験式
C34H47N5O8からの計算により次の値が得られ
た：Ｃ＝61.88％（62.46％）、Ｈ＝7.28％（7.25
％）及びＮ＝10.68％（10.7％）。 2d CF3COOH.H―CHA―Lys（ε―Cbo）―
pNA 化合物2c3.27ｇ（５ミリモル）を強力撹拌下
で新しく蒸留した無水トリフルオル酢酸10mlで
20℃で湿分の不在下に60分間処理した。この反
応溶液を強力撹拌下で無水エーテル100mlに滴
加し、その後に無定形CF3COOH.H―CHA―
Lys（ε―Cbo）―pNAが沈殿した。エーテル
相を吸引濾過した。固体残滓を３回無水エーテ
ル30mlの量で洗浄した。得られた残滓を
MeOH50mlに溶解した。PHをEt3Nを用いて4.5
に調節し、この溶液を真空中で30℃で濃縮乾燥
した。残滓をMeOH75mlに溶解し、この溶液
をMeOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで精製した。
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
MeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃縮
した。この残滓を真空デシケーター中で40℃で
P2O5上で乾燥した後、無定形化合物2d3.08ｇ
（理論値の98.3％）が得られた。元素分析及び
実験式C31H40N5O8F3からの計算により、次の
値が得られた：Ｃ＝55.39％（55.77％）、Ｈ＝
6.07％（6.04％）及びＮ＝10.52％（10.49％）。 2e Cbo―Ｄ―But―CHA―Lys（ε―Cbo）―
pNA 化合物2d2.00ｇ（３ミリモル）を新しく蒸留
したDMF15mlに溶解し、−10℃に冷却した。こ
の溶液に撹拌下でCbo―Ｄ―But―OpNP1.18
ｇ（3.3ミリモル）及びEt3N0.42ml（３ミリモ
ル）を添加した。この混合物を湿分の不在下で
３時間反応させ、その後に温度は次第に20℃に
到達した。この反応溶液を再び−10℃に冷却
し、Et3N0.21ml（1.5ミリモル）で緩衝した。−
10℃で５時間の反応時間後、この反応混合物の
温度は、次第に室温に到達した。この方法を
Et3N0.21mlを用いて繰り返し、その後に約16
時間反応させた。この反応混合物を真空中で50
℃で濃縮乾燥し、この残滓をMeOH50mlに溶
解し、この溶液をMeOHで平衡させた“セフ
アデツクス（Sephadex）LH―20”のカラム
でゲル濾過することによつて精製した。TLC
によつて示されるようにSS Ａ及びＢ中で均一
なMeOH溶出液の第１の主画分を真空中で30
℃濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター
中で40℃でP2O5上で乾燥し、部分的に結晶の
化合物2e1.96ｇ（理論値の84.5％）を得た。元
素分析及び実験式C41H52N6O9からの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝63.40％（63.71
％）、Ｈ＝6.82％（6.78％）及びＮ＝10.73％
（10.87％）。 2f 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―pNA 化合物2e1.55ｇ（２ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr12mlで20℃で湿分の不在下に
40分間処理した。トリペプチド誘導体が同時に
２つの保護基Cbo及びBOCの分解下及びCO2の
発生下に次第に溶解した。この反応溶液を強力
撹拌下で無水エーテル100mlに滴加し、その後
に絮状2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―pNA
が沈殿し。30分後、このエーテル相を吸引濾過
し、固体相を４回無水エーテル25mlの量で洗浄
した。得らた残滓をMeOH40mlに溶解した。
PHをEt3Nを用いて4.5に調節し、この溶液を真
空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH30mlに溶解し、この溶液をMeOHで平
衡させた“セフアデツクス（Sephadex）LH
―20”のカラムで精製した。ｐ―ニトロアニリ
ンの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたMeOH溶出液の主画分を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。更に、精製するため
に、予備精製された生成物を33％AcOH25mlに
溶解し、この溶液を33％AcOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラ
ムでゲル濾過することによつて精製した。ｐ―
ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されれたAcOH溶出液の画
分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。得られた残
滓を真空デシケーター中で４℃でP2O5上で乾
燥し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で
均一な無定形物質2f1.05ｇ（理論値の78.8％）
を得た。元素分析及び実験式C25H42N6O5Br2
からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
44.89％（45.5％）、Ｈ＝6.40％（6.35％）、Ｎ＝
12.37％（12.61％）及びBr＝23.55％（23.98
％）。Rf値：0.39 アミノ酸分析により、正確な比率で所望のア
ミノ酸の存在が確認された： DHA：0.98―Lys：0.99―Ｄ―But：1.00。 例 ３ 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―MCA 3a BOC―Lys（ε―Cbo）―MCA 無水BOC―Lys（ε―Cbo）―OH38.05ｇ
（0.1モル）を、1000mlの三首フラスコ中で新し
く蒸留した無水DMF50mlと無水THF300mlと
の混合物に20℃で溶解した。−10℃に冷却した
該溶液に、撹拌下でTHF75ml中のEt3N10.2ｇ
（0.1モル）の溶液を湿分の不在下で添加した。
更に、THF50ml中のクロル蟻酸イソブチル
13.65ｇ（0.1モル）の溶液を20分間で滴加し、
その後に反応温度は、−５℃を決して越えない
ようにした。−10℃〜−５℃の温度で約10分の
反応時間後、DMF75ml中の４―メチル―７―
アミノ―クマリン17.52ｇ（0.1モル）の溶液を
25分間で滴加し、その後に温度が−５℃を決し
て越えないようにした。次に、この反応混合物
を−５℃で１時間撹拌し、室温で１晩撹拌し、
さらに再び−10℃に冷却した。晶出したEt3N.
HClを濾別した。この濾液を真空中で50℃で濃
縮乾燥した。この残滓をMeOH500mlに溶解
し、この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムでゲル濾過することによつ
て精製した。所望の生成物BOC―Lys（ε―
Cbo）―MCA以外に、このMeOH溶出液は、
副生成物イソブチルＮ―〔４―メチル―クマリ
ル―(7)〕―カルバミネート及び開始剤組成物
BOC―Lys（ε―Cbo）―OH及び７―アミノ―
４―メチル―クマリンをそれぞれ含有する３種
類の他の画分を生じた。BOC―Lys（ε―Cbo）
―MCAを含有する画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で50
℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示される
ように“SS Ａ及びＢ中で均一な部分的に結晶
の化合物3a26.3ｇ（理論値の48.9％）を得た。
元素分析及び実験式C29H35N3O7からの計算に
より、次の値が得られた：Ｃ＝64.90％（64.79
％）、Ｈ＝6.52％（6.56％）及びＮ＝7.88％
（7.82％）。 3b CF3COOH.H―Lys（ε―Cbo）―MCA 化合物3a21.5ｇ（40ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸60mlを用いて例2bにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH250mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムでゲル濾過することによつ
て精製した。TLCによつて示されるようにSS
Ｃ中で均一なMeOH溶出液の第１の主画分を
真空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空
デシケーター中で40℃でP2O5上で乾燥し、無
定形化合物3b19.5ｇ（理論値の88.4％）を得
た。元素分析及び実験式C26H28N3O7F3からの
計算により、次の値が得られた：Ｃ＝57.02％
（56.62％）、Ｈ＝5.20％（5.12％）及びＮ＝7.58
％（7.62％）。 3c BOC―Phe―Lys（ε―Cbo）―MCA 化合物3b5.52ｇ（10ミリモル）を例2cにより
BOC―CHA―OpNP4.32ｇ（11ミリモル）と
反応させた。得られた粗製生成物をMeOH100
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムでゲル濾過す
ることによつて精製した。TLCによつて示さ
れるようにSS Ａ及びＢ中で均一なMeOH溶出
液の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。こ
の残滓を真空デシケーター中で50℃でP2O5上
で乾燥し、部分的に結晶の生成物3c6.11ｇ（理
論値の88.4％）を得た。元素分析及び実験式
C38H50N4O8からの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝65.87％（66.07％）、Ｈ＝7.32％
（7.30％）及びＮ＝8.00％（8.11％）。 3d CF3COOH.H―CHA―Lys（ε―Cbo）―
MCA 化合物3c3.4ｇ（５ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸15mlを用いて例2dにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH75mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムでゲル濾過することによつ
て精製した。TLCによつて示されるようにSS
Ｃ中で均一なMeOH溶出液の主画分を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケ
ーター中で40℃でP2O5上で乾燥し、無定形化
合物3d3.41ｇ（理論値の96.8％）を得た。元素
分析及び実験式C35H43N4O8F3からの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝59.73％（59.65
％）、Ｈ＝6.14％（6.15％）及びＮ＝7.82％
（7.05％）。 3e Cbo―Ｄ―But―CHA―Lys（ε―Cbo）―
MCA 化合物3d2.11ｇ（３ミリモル）を例2eにより
Cbo―Ｄ―But―OpNP1.18ｇ（3.3ミリモル）
と反応させた。得られた粗製生成物を
MeOH40mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムでゲ
ル濾過することによつて精製した。TLCによ
つて示されるようにSS Ａ及びＢ中で均一な
MeOH溶出液の第１の主画分を真空中で30℃
で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター
中で60℃でP2O5上で乾燥し、無定形化合物
3e2.12ｇ（理論値の82.4％）を得た。元素分析
及び実験式C45H55N5O9からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝66.41％（66.73％）、Ｈ
＝6.88％（6.84％）及びＮ＝8.43％（8.65％）。 3f 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―MCA 化合物3e1.62ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr12mlを用いて例2fにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH30mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムで精製した。４―メチル―
７―アミノ―クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。更に
精製するために、予備精製された生成物を50％
AcOH40mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムでゲル濾
過することによつて精製した。４―メチル―７
―アミノ―クマリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたAcOH溶出液の
主画分を真空で40℃で濃縮乾燥した。この残滓
を真空デシケーター中で40℃でP2O5上で乾燥
し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均
一な無定形化合物3f11.10ｇ（理論値の73.2％）
を得た。元素分析及び実験式C29H45N5O5Br2
からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
49.11％（49.51％）、Ｈ＝6.44％（6.45％）、Ｎ
＝9.73％（9.96％）及びBr＝22.52％（22.72
％）。Rf値0.43 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： CHA：1.0l―Lys：0.98―Ｄ―But：1.00。 例 ４ 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―DPA 4a BOC―Lys（ε―Cbo）―DPA 無水BOC―Lys（ε―Cbo）―OH38.05ｇ
（0.1モル）を1000mlの三首フラスコ中で新しく
蒸留した無水DMFと無水THF300mlとの混合
物に20℃で溶解した。−10℃に冷却した該溶液
に撹拌下でTHF75ml中のEt3N10.2ｇ（0.1モ
ル）の溶液を湿分の不在下で添加した。更に、
THF50ml中のクロム蟻酸イソブチル13.65ｇ
（0.1モル）の溶液を20分間で滴加し、その後に
反応温度は−５℃を越えないようにした。−10
℃〜−５℃で約10分の反応時間後、DMF75ml
中のジメチル５―アミノ―イソフタレート
20.92ｇ（0.1モル）の溶液を30分間で滴加し
た。更に、この反応混合物を例3aにより処理
した。得られた残滓をMeOH500mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムでゲル濾過することによつ
て精製した。所望の生成物BOC―Lys（ε―
Cboo）―DPA以外に、このMeOH溶出液は、
３種類の他の生成物、すなわち副生成物イソブ
チルＮ―〔１，３―ジメトキシカルボニル―フ
エニル―(5)〕―カルバミネートならびに２種類
の開始剤組成物BOC―Lys（ε―Cbo）―OH及
びジメチル５―アミノ―イソフタレートをそれ
ぞれ３種類の異なる画分として含有していた。
BOC―Lys（ε―Cbo）―DPAを含有する画分
を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を真
空デシケーター中で50℃でP2O5上で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSS Ａ及びＢ中で
均一な無定形化合物4a27.4ｇ（理論値の47.9
％）を得た。元素分析及び実験式C29H37N3O9
からの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
60.58％（60.93％）、Ｈ＝6.53％（6.52％）及び
Ｎ＝7.48％（7.35％）。 4b CF3COOH.H―Lys（ε―Cbo）―DPA 化合物4a22.87ｇ（40ミリモル）をトリフル
オル酢酸70mlを用いて例2bにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH250mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムでゲ
ル濾過することによつて精製した。TLCによ
つて示されるようにSS Ｃ中で均一なMeOH溶
出液の主画分を真空デシケーター中で40℃で
P2O5上で濃縮乾燥し、無定形化合物4b20.7ｇ
（理論値の88.4％）を得た。元素分析及び実験
式C26H30N3O9F3からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝52.77％（53.33％）、Ｈ＝5.25％
（5.16％）及びＮ＝7.02％（7.18％）。 4c BOC―CHA―Lys（ε―Cbo）―DPA 化合物4b5.86ｇ（10ミリモル）を例2cにより
BOC―CHA―OpNP4.32ｇ（11ミリモル）と
反応させた。普通の処理後に得られた粗製生成
物をMeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフ
アデツクス（Sephadex）LH―20”のカラム
でゲル濾過することによつて精製した。TLC
によつて示されるようにSS Ａ及びＢ中で均一
なMeOH溶出液の第１の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ーで50℃でP2O5上で乾燥し、結晶性化合物
4c6.03ｇ（理論値の83.2％）を得た。元素分析
及び実験式C38H53N4O10からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝62.66％（62.97％）、Ｈ
＝7.25％（7.23％）及びＮ＝7.69％（7.73％）。 4d CF3COOH.H―CHA―Lys（ε―Cbo）―
DPA 化合物4c3.62ｇ（５ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸15mlを用いて例2dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH60mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムでゲ
ル濾過することによつて精製した。TLCによ
つて示されるようにSS Ｃ中で均一なMeOH溶
出液の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。
この残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5
上で乾燥し、無定形化合物4d3.40ｇ（理論値の
92.8％）を得た。元素分析及び実験式
C35H45N4O10F3からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝56.60％（56.90％）、Ｈ＝6.18％
（6.14％）及びＮ＝7.41％（7.58％）。 4e Cbo―Ｄ―But―CHA―Lys（ε―Cbo）―
DPA 化合物4d2.22ｇ（３ミリモル）を例2eにより
Cbo―Ｄ―But―OpNP1.18ｇ（3.3ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物をMeOH60mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）LH―20”のカラ
ムでゲル濾過することによつて粗製した。
TLCによつて示されるようにSS Ａ及びＢ中で
均一なMeOH溶出液の第１の主画分を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケ
ーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、部分的に
結晶の化合物4e2.07ｇ（理論値の77.4％）を得
た。元素分析及び実験式C45H57N5O11からの計
算により、次の値が得られた：Ｃ＝63.75％
（64.04％）、Ｈ＝6.79％（6.81％）及びＮ＝8.15
％（8.30％）。 4f 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―DPA 化合物4e844mg（１ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr6mlを用いて例2fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH20mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで予
備精製した。ジメチル５―アミノ―イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたMeOH溶出液の分を30℃で濃
縮乾燥した。更に、粗禅するために、予備精製
された生成物を50％AcOH30mlに溶解し、この
溶液を“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”
のカラムでゲル濾過することによつて精製し
た。ジメチル５―アミノ―イソフタレートの遊
離下でトリプシンで処理することによつて分解
されたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で
濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中
で40℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示さ
れるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合物
4f572mg（理論値の77.6％）を得た。元素分析
及び実験式C29H47N5O7Br2からの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝47.01％（47.23％）、
Ｈ＝6.49％（6.42％）、Ｎ＝9.33％（9.50％）及
びBr＝21.24％（21.67％）。Rf値：0.45 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： CHA：0.97―Lys：1.02―Ｄ―But：1.00。 例 ５ 2HBr.H―Ｄ―CHG―Phe―Lys―２―NA 5a BOC.Lys（ε―Cbo）―２―NA BOC―Lys（ε―Cbo）―OH38.05ｇ（0.1モ
ル）を例3aにより２―ナフチルアミン14.32ｇ
（0.1モル）と反応させた。普通の処理後に得ら
れた残滓をMeOH500mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”のカ
ラムで精製した。所望の生成物BOC―Lys（ε
―Cbo）―２―NA以外に、MeOH溶出液は、
３種類の他の生成物、すなわち副生成物イソプ
チルＮ―〔１，３―ジメトキシ―フエニル―
(5)〕―カルバミネートならびに２種類の開始剤
組成物BOC―Lys（ε―Cbo）―OH及び２―ナ
フチルアミンをそれぞれ３種類の異なる画分と
して生じた。BOC―Lys（ε―Cbo）―２―NA
を含有する画分を真空中で30℃で濃縮した。こ
の残滓を真空デシケーター中で50℃でP2O5上
で乾燥した後、TLCによつて示されるように
SS Ａ及びＢ中で均一な結晶性化合物5a26.9ｇ
（理論値の53.2％）が得られた。元素分析及び
実験式C29H35N3O5からの計算により、次の値
が得られた：Ｃ＝68.23％（68.89％）、Ｈ＝7.07
％（6.98％）及びＮ＝8.52％（8.31％）。 5b CF3COOH.H―Lys（ε―Cbo）―２―NA 化合物5a20.22ｇ（40ミリモル）をトリフル
オル酢酸75mlを用いて例2bにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH250mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで精
製した。TLCによつて示されるようにSS Ｃ中
で均一なMeOH溶出液の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥した後、無定形化
合物5b18.29ｇ（理論値の88.0％）が得られた。
元素分析及び実験式C26H28N3O5F3からの計算
により、次の値が得られた：Ｃ＝59.70％
（6.11％）、Ｈ＝5.38％（5.43％）及びＮ＝8.26
％（8.09％）。 5c BOC―CHA―Lys（ε―Cbo）―２―NA 化合物5b5.20ｇ（10ミリモル）を例2cにより
BOC―CHA―OpNP4.32ｇ（11ミリモル）と
反応させた。普通の処理後に得られた粗製生成
物をMeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフ
アデツクス（Sephadex）LH―20”のカラム
で精製した。TLCによつて示されるようにSS
Ａ及びＢ中で均一なMeOH溶出液の第１の主
画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。こうして
部分的に結晶の化合物5c5.49ｇ（理論値の83.3
％）が得られた。元素分析及び実験式
C38H50N4O6からの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝68.98％（69.27％）、Ｈ＝7.63％
（7.65％）及びＮ＝8.41％（8.5％）。 5d CF3COOH.H―CHA―Lys（ε―Cbo）―２
―NA 化合物5c3.29ｇ（５ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸17mlを用いて例2dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH75mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで精
製した。TLCによつて示されるようにSS Ｃ中
で均一なMeOH溶出液の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥し、無定形化合物
5d3.12ｇ（理論値の92.8％）を得た。元素分析
及び実験式C35H43N4O6F3からの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝62.19％（62.49％）、
Ｈ＝6.48％（6.44％）及びＮ＝8.15％（8.33
％）。 5e Cbo―Ｄ―But―CHA―Lys（ε―Cbo）―２
―NA 化合物5d1.68ｇ（2.5ミリモル）を例2eによ
りCbo―Ｄ―But―OpNP1.14ｇ（2.76ミリモ
ル）と反応させた。普通の処理後に得られた粗
製生成物をMeOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”のカ
ラムで精製した。TLCによつて示されるよう
にSS Ａ及びＢ中で均一なMeOH溶出液の第１
の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥し。この残
滓を真空デシケーター中で60℃でP2O5上で乾
燥した。こうして無定形化合物5e1.58ｇ（理論
値の81.2％）が得られた。元素分析及び実験式
C45H55N5O7からの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝69.15％（69.47％）、Ｈ＝7.19％
（7.13％）及びＮ＝8.88％（9.00％）。 5f 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―２―NA 化合物5e1.17ｇ（1.5ミリモル）を氷酢酸中
の2N HBr9mlを用いて例2fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH25mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで予
備精製した。２―ナフチルアミンの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この予備精製された生成物を50％
AcOHに溶解し、この溶液をさらに“セフアデ
ツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムで精製
した。トリプシンの作用下で２―ナフチルアミ
ンを形成したAcOH溶出液の主画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を乾燥デシケー
ター中で40℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合
物5f805mg（理論値の74.6％）を得た。元素分
析及び実験式C2945N5O3Br2からの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝51.57％（51.87％）、
Ｈ＝6.79％（6.75％）、Ｎ＝10.25％（10.43％）
及びBr＝23.40％（23.80％）。Rf値：0.44 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： CHA：1.02―Lys：０・98―Ｄ―But：1.00。 例 ６ 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―４―MeO―
２―NA 6a BOC―Lys（ε―Cbo）―４―MeO―２―
NA BOC―Lys（ε―Cbo）―OH9.51ｇ（25ミリ
モル）を例3aにより４―メトキシ―２―ナフ
チルアミン4.33ｇ（25ミリモル）と反応させ
た。普通の処理後、この残滓をMeOH175mlに
溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH―2.0”のカラムで精製した。
所望の生成物BOC―Lys（ε―Cbo）―４―
MeO―２―NA以外に、このMeOH溶出液は、
３種類の他の生成物、すなわち副生成物イソブ
チルＮ―（４―メトキシ―２―ナフチル）―カ
ルバミネートならびに２種類の開始剤組成物
BOC―Lys（ε―Cbo）―OH及び４―メトキシ
―２―ナフチルアミンをそれぞれ３種類の異な
る画分として生じた。所望の生成物を含有する
画分を真空中で30℃で濃縮した。この残滓を真
空デシケーター中で50℃でP2O5上で乾燥した
後、TLCによつて示されるようにSS Ａ及びＢ
中で均一な部分的に結晶の化合物6a6.28ｇ（理
論値の46.9％）が得られた。元素分析及び実験
式C30H37N3O6からの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝66.83％（67.27％）、Ｈ＝7.04％
（6.96％）及びＮ＝8.09％（7.85％）。 6b CF3COOH.H―Lys（ε―Cbo）―４―MeO
―２―NA 化合物6a5.36ｇ（10ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸20mlを用いて例2bにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH75mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで精
製した。TLCによつて示されるようにSS Ｃ中
で均一なMeOH溶出液の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥した後、無定形化
合物6b5.10ｇ（理論値の92.8％）が得られた。
元素分析及び実験式C27H30N3O6Fからの計算
により、次の値が得られた：Ｃ＝58.66％
（59.01％）、Ｈ＝5.61％（5.50％）及びＮ＝7.92
％（7.65％）。 6c BOC―CHA―Lys（ε―Cbo）―４―MeO―
２―NA 化合物6b4.40ｇ（８ミリモル）を例2cにより
BOC―CHA―OpNP3.45ｇ（8.8ミリモル）と
反応させた。普通の処理後に得られた粗製生成
物をMeOH75mlに溶解し、この溶液を“セフ
アデツクス（Sephadex）LH―20”のカラム
で精製した。TLCによつて示されるようにSS
Ａ及びＢ中で均一なMeOH溶出液の第１の主
画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓
を真空デシケーター中で50℃でP2O5上で乾燥
した後、無定形化合物6c4.34ｇ（理論値の78.8
％）が得られた。元素分析及び実験式
C39H52N4O7からの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝67.6％（68.00％）、Ｈ＝7.59％
（7.61％）及びＮ＝8.01％（8.13％）。 6d CF3COOH.H―CHA―Lys（ε―Cbo）―４
―MeO―２―NA 化合物6c3.44ｇ（５ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸20mlを用いて例2dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH80mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで精
製した。TLCによつて示されるようにSS Ｃ中
で均一なMeOH溶出液の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥した後、無定形化
合物6d3.43ｇ（理論値の97.6％）が得られた。
元素分析及び実験式C36H45N4O7F3からの計算
により、次の値が得られた：Ｃ＝61.14％
（61.53％）、Ｈ＝6.48％（6.45％）及びＮ＝7.77
％（7.97％）。 6e Cbo―Ｄ―But―CHA―Lys（ε―Cbo）―４
―MeO―２―NA 化合物6d1.76ｇ（2.5ミリモル）を例2eによ
りCbo―Ｄ―But―OpNP0.99ｇ（2.76ミリモ
ル）と反応させた。普通の処理後に得られた粗
製生成物をMeOH6mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”のカ
ラムで精製した。TLCによつて示されるよう
にSS Ａ及びＢ中で均一なMeOH溶出液の第１
の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この
残滓を真空デシケーター中で60℃でP2O5上で
乾燥した後、無定形化合物6e1.69ｇ（理論値の
83.7）が得られた。元素分析及び実験式
C46H57N5O8からの計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝68.07％（68.38％）、Ｈ＝7.16％
（7.11％）及びＮ＝8.51％（8.67％）。 6f 2HBr.H―Ｄ―But―CHA―Lys―４―MeO
―２―NA 化合物6e808mg（１ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr6mlを用いて例2fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物をAcOH20
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで予備精製し
た。４―メトキシ―２―ナフチルアミンの遊離
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃
縮乾燥した。この予備精製された生成物を50％
AcOH30mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムで精製し
た。トリプシンの作用下で４―メトキシ―２―
ナフチルアミンを形成させるAcOH溶出液の主
画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓
を真空デシケーター中で40℃でP2O5上で乾燥
し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均
一な無定形化合物6f568mg（理論値の8.0％）を
得た。元素分析及び実験式C30H4N5O4Br2から
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝51.18
％（51.36％）、Ｈ＝6.79％（6.75％）、Ｎ＝
10.08％（9.98％）及びBr＝22.35％（22.78％）
Rf値：0.46 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： CHA：0.98―Lys：1.01―Ｄ―But：1.00。 一連の他のトリペプチド誘導体を前記実施例
に記載の方法により製造した。これらのトリペ
プチド誘導体は、次の第１表に纒められてい
る。 第１表に示したトリペプチド誘導体の製造に
使用されたジペプチド中間体及びトリペプチド
中間体は、第２表及び第３表に記載されてい
る。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】 例 14 2AcOH.H―Ｄ―Nval―CHA―Arg―pNA 2HBr.H―Ｄ―Nval―CHA―Arg―pNA（例２
により製造）7.09ｇ（10ミリモル）を60％MeOH
水溶液75mlに溶解した。この溶液を酢酸塩の形で
“アンバーライト（Amberlite）”（登録商標）
JRA―401のカラムに充填した。このカラムを60
％MeOH水溶液で溶離し、その後にHBrをイオ
ン交換することによつてAcOHに代えた。この溶
出液を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を
真空デシケーター中で40℃でP2O5上で乾燥した
後、臭化物不含の2AcOH.H―Ｄ―Nval―CHA
―Arg―pNA63.3ｇ（理論値の98.5％）が得られ
た。 上記方法によれば、有機酸、例えば蟻酸、プロ
ピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息
香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又はフタル酸
との他の塩は、前記のトリペプチド誘導体から製
造することができる。イオン交換体、例えば塩酸
塩の形の“アンバーライト（Amberlite）”JRA
―401を使用することができ、これは苛性ソーダ
液で処理することによつて該イオン交換体を塩基
性OH形に変換し、次に該塩基性イオン交換体を
60％MeOH水溶液中の所望の有機酸とそのナト
リウム塩との１：１混合物の溶液で処理すること
によつて所望の酸塩の形に変換することができ
る。 本発明によるトリペプチド基質を用いての酵素
の定量分析は、次のようにして実施することがで
きる： １ 尿カリクレイン分析： 尿１mlならびにPH7.9及びイオン強度1.0を有
するTRIS―イミダゾール緩衝液１mlを37℃で
５分間恒温保持し、次に沈殿物を除去するため
に遠心分離する。 37℃に加熱した蒸留水1.4mlと遠心分離物0.4
mlをプラスチツク製キユベツト中で充分に混合
する。この混合物に２×10-3モルの基質水溶液
0.2mlを添加し、成分を迅速に混合する。この
混合物を37℃で正確に15分間恒温保持する。次
に、この反応混合物を酵素反応を停止させるた
めに氷酢酸0.2mlと混合する。色を計測するた
めには、同じ成分からなるが、酵素反応を阻止
するための基質添加前に添加された氷酢酸を有
する空試料を使用する。次に、形成された有色
化合物Ｒ―NH2の量を空試料と試験試料との
差から405nmで測光法又は分光測光法により測
定する。得られる値から尿における尿カリクレ
イン活量を次式により測定する： △OD15分間×Ｖ×1000×Ｆ／15分間×ｖ×ε＝mU／尿の
ml数 △OD＝15分間の405nmでの光学濃度の増加
分 Ｖ＝試験混合物の全容量＝2.2ml 1000＝ＵをmUに変換するための変換係数 Ｆ＝尿(2)の稀釈係数 ｖ＝試料の容量＝0.4ml ε＝1000で割つた吸光係数＝10.4 尿における尿カリクレイン含量の計算は、形
成される生成物Ｒ―NH2（例えば、ｐ―ニトロ
アニリン）を連続的に測定することによつて実
施することもできる。この方法を喀痰中の腺カ
リクレインの分析に適用するように後記する。 尿カリクレイン以外に、尿も本発明による基
質を少量ではあるが分解することもできる蛋白
分解酵素としてのウロキナーゼを含有する。前
記分析方法においては、尿力リクレインとウロ
キナーゼとの活量の合計が測定される。尿カリ
クレイン活量の正確な値を得るためには、ウロ
キナーゼ活量は差し引かなければならない。こ
のウロキナーゼ活量は、比較試験において尿カ
リクレイン活量を完全に抑制するために緩衝液
１ml当りトリプシン抑制因子（牛の肺からのト
リプシン抑制因子）0.075単位を添加し、かつ
単独にウロキナーゼ活量を測定することによつ
て測定することができる。 ２ 喀痰における腺カリクレイン分析： 喀痰0.5mlをTRIS―イミダゾール緩衝液（イ
オン強度1.0）２mlと混合し、この混合物を37
℃で５分間予め恒温保持する。この恒温保持物
を遠心分離する。試験キユベツトトに37℃の蒸
留水1.5mlを充填し、これに遠心分離物0.25ml
を添加する。これらの成分を充分に混合する。
更に、２×10-3モルの基質水溶液0.2mlを添加
する。次に、405nmでの吸光変化を記録装置を
用いて５〜10分間連続的に追跡する。毎分の△
ODの測定値から喀痰１ml当りのカリクレイン
活量は、mUで次式により計算される： △OD毎分数×Ｖ×10×Ｆ／ｖ×ε＝喀痰のmU／ml数 Ｆ＝５ Ｖ＝1.95 ｖ＝0.25 lU（単位）＝PH、イオン強度、温度及び基質
濃度の最適条件下又は他に規定され
る条件下に１分間で基質１マイクロ
モルを分解することのできる酵素
量。 膵液において膵臓カリクレインは、主にプレ
カリクレインの形で存在し、活性化後でのみ、
例えばトリプシンを用いて分析することができ
る。カリクレインの活性後、トリプシンは、大
豆トリプシン抑制因子（SBTI）により抑制さ
れている。この活性化混合物中のカリクレイン
含量は、前記方法の１つによつて測定ることが
できる。 ３ プラズミン分析： TRIS―イミダゾール緩衝液（PH7.5、イオン
強度0.2）1.7mlを25％グリセロール中のプラズ
ミン溶液0.1mlと37℃で混合し、この混合物を
37℃で１分間恒温保持する。この混合物に37℃
の２×10-3モルの基質水溶液0.2mlを添加し、
成分を迅速に混合する。次に、単位時間当りの
基質から分離される分解生成物Ｒ―NH2の量
を連続的に測定する。試料１ml当りのプラズミ
ン活量は、毎分測定される値からmUで次式に
より計算される： △Ｅ／min.×Ｖ×1000／ｖ×ε＝試料のmU／ml数 △Ｅ＝毎分分離される分解生成物の量 Ｖ＝試験混合物の全容量 ｖ＝試料の容量 ε＝1000で割つた吸光係数 ４ ヒトの血漿における抗プラズミン分析： １：20の比率でTRIS―イミダゾール緩衝液
で稀釈された血漿0.1mlを、25％グリセロール
１ml当りのヒトプラズミン（AB Kabi
（Stockholm、Sweden）社製）1.25CU及びヒ
ルジン（Pentapharm A.G.（Basle、
Switzerland）社製）50ATUの溶液0.02mlと混
合する。この混合物を37℃で90秒間恒温保持す
る。この恒温保持物に37℃のTRIS―イミダゾ
ール緩衝液（PH7.5、イオン強度0.2）1.7mlを混
合し、さらに２×10-3モルの基質水溶液0.2ml
を混合する。次に、単位時間当りの基質から分
離される分解生成物Ｒ―NH2の量を連続的に
測定する。残留プラズミン活量は、測定値から
前記方法により計算される。 空試験では、血漿は緩衝液の相当量に代える
が、それ以外はこの試験は前記方法により実施
される。測定されるプラズミン活量は、開始プ
ラズミン量に相当する。抗プラズミン活量は、
空試験で測定されるプラズミン活量と、血漿を
用いる試験で測定される残留プラズミン活量と
の差から次式により計算される： （△Ｅ空試料−△Ｅ血漿試料）／min、×Ｖ×Ｆ×100
0／ｖ×ε＝血漿のmIU／ml量 Ｆ＝血漿（20）の稀釈係数。 本発明による基質は、血漿中に存在するプラ
ズミノジエンを緩衝系中のウロキナーゼ又はス
トレプトキナーゼを用いて変換しかつ形成され
るプラズミンの量を前記プラズミン分析法によ
り本発明による基質の１つを用いて測定するこ
とによつてヒトの血漿中のプラズミノジエンを
分析するのに使用することもできる。血漿中に
元来存在するプラズミノジエンの量は、活性下
でプラズミン１分子がプラズミノジエン１分子
から形成されるのでプラズミンに対する測定値
から誘導される。 次の第４表には、器管又は腺カリクレイン、プ
ラズミン及びトロンビンに対する本発明による若
干の基質の感受性が示されている。
【表】
【表】 基質の酵素加水分解によつて形成される分解生
成物Ｒ―NH2の測定は、この分解生成物が基質
の紫外スペクトルとは異なる紫外スペクトルを有
しかつより高い波長に向つて移動するという前提
条件に基づく。405nmにおける基質の吸収は、実
際に皆無である。分解生成物としてのｐ―ニトロ
アニリンは、380nmでの吸収最高及びモル吸光係
数13200を示す。しかし、該吸光係数は405nmで
僅かに低下する、すなわち9650になる。分離され
るｐ―ニトロアニリン量に比例する基質の酵素加
水分解による量は、405nmで分光測光法により測
定することによつて測定することができる。過剰
の基質の存在下であつても405nmにおける測定に
は支障がない。 分解生成物Ｒ―NH2の量は、２―ナフチルア
ミノ基、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ基、
４―メチル―クマリル―(7)―アミノ基又は１，３
―ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―(5)―ア
ミノ基を含有する基質を用いて螢光分光測光法に
より測定される。酵素、緩衝液及び基質からなる
試験系において、低エネルギー量の輻射線は、形
成された螢光性分解生成物が高エネルギー量の光
線によつて励起された後、400〜470nmで連続的
に測定される。単位時間当りに形成される分解生
成物の量は、存在する酵素活量に対して測定され
る。前記のように、毎分の分解生成物１ミクロン
モルは、所定の基質に基づく１酵素単位に相当す
る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： Ｈ―Ｄ―Ｘ―Ｙ―Lys―Ｒ ［式中、 Ｘはα―アミノブチリル基、ロイシル基、ノル
    ロイシル基、イソロイシル基、バリル基又はノル
    バリル基を表わし、 Ｙはシクロヘキシルアラニル基又はシクロヘキ
    シルチロシル基を表わし、 Ｒはｐ―ニトロフエニルアミノ基、２―ナフチ
    ルアミノ基、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ
    基、４―メチル―クマリル―７―アミノ基又は
    １，３―ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―
    ５―アミノ基を表わす］で示されるトリペプチド
    誘導体又は酸とのその塩。 ２ 鉱酸、例えばHCl、HBr、H2SO4又は
    H3PO4、又は有機酸、例えば、蟻酸、酢酸、プ
    ロピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、ト
    リクロル―又はトルフルオル酢酸のようなハロゲ
    ン化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、
    クエン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族
    酸、例えばトルイル酸、クロル―又はブロム安息
    香酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、又
    はフタル酸でプロトン化されている、特許請求の
    範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。
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