DK155051B - Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf - Google Patents

Description

i

DK 15505 1 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte tripeptidderivater, der er nyttige som substrater til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklassen E.C. 3.4.21, f.eks. organ- eller kirtelkalli-kreiner og plasmin.

5 Såkaldt organkallikrein eller kirtelkallikrein produceres af forskellige organer og kirtler, f.eks. bugspytkirtelen, spytkirtler, nyrer, tarmslimhinde osv. og udskilles i form af et proenzym eller i en aktiv form. Disse organ- eller kirtelkallikreiner afviger kemisk og fysiologisk fra plasmakallikrein. I visse patalogiske tilstande falder organ-10 kallikreinsekretionsniveauet til under eller stiger til over normalværdien. Således falder f.eks. kallikreinsekretionen i urin væsentligt under normalværdien hos patienter, der lider af nyresygdomme. Hos patienter, der lider af nyrecirrose er kallikreinsekretionen næsten fuldstændig undertrykt. Hos patienter, som lider af essentiel hyper-15 tension er kallikreinsekretionen i 24 timers urin signifikant reduceret i gennemsnit med 50% af normalværdien (jfr. f.eks. H.S. Margolius i "Chemistry and Biology of the Kallikrein-Kinin System in Health and Disease", 1974, side 399 - 409). Det er derfor vigtigt at have simple metoder til rådighed til et hurtigt kvantitativt assay for organkalli-20 krein. Det er kendt f.eks. at foretage assay af urinkallikrein ved esteroiyse af visse argininestere, f.eks. tosylargininmethylester (TAME). Ved en forbedret esterolytisk fremgangsmåde anvendes tosylargininmethylester markeret med tritium, og den ved esterolysen frigjorte methanols radioaktivtet måles. Disse esterolytiske fremgangs-25 måder har den ulempe, at de er ubiologiske, for så vidt som kalli-kreinerne er proteolytiske enzymer, der spalter naturlige peptidkæder amidolytisk, men ikke esterolytisk. Endvidere har estersubstrater den ulempe, at de spaltes af adskillige andre enzymer, dvs. spaltes uspecifikt af kallikrein. Fremgangsmåden med anvendelse af TAME marke-30 ret med tritium er complex, for så vidt som methanolen før målingen af det med tritium mærkede methanols radioaktivitet skal ekstraheres fra esterolyseblandingen med en væske, der ikke er blandbar med vand, da det tilbageværende TAME markeret med tritium, som stadig er tilbage i esterolyseblandingen, ellers vil inhibere målingen.

DK 155051 B i 2 i! .......... ' ji I offentliggjort tysk patentansøgning nr. 25.27.932 beskrives sub- 1 2 1 strater, som har formlen R -Pro-X-Arg-NH-R , hvor R betegner en 2 blokerende gruppe, -NH-R betegner en chromogengruppe og X betegner phenylalanyl, β-cyclohexylalanyl, phenylglycyl eller tyrosyl.

5 Disse substrater spaltes særdeles let af plasmakallikrein og giver et 2 . i farvet spaltningsprodukt R -Nl·^, hvis mængde kan måles ved fotometriske, spektrofotometriske eller fluorescensfotometriske metoder.

Der er gjort forsøg på også at anvende disse substrater til assay for i organ- eller kirtelkallikreiner. Det har imidlertid overraskende vist ! i 10 sig, at disse substrater ikke er følsomme over for organ- eller kirtel- j kallikrein, dvs. ikke spaltes eller kun spaltes i en lille udstrækning i af den sidstnævnte. ·

Dansk patentansøgning nr. 3126/76 og dansk patentansøgning nr.

2400/73 beskriver forskellige tripeptidderivater, som skal anvendes 15 som substrater ved assay for forskellige enzymer. De fra danske patentansøgning nr. 3126/76 kendte tripeptidderivater er imidlertid alle kendetegnet ved, at sidekæden i den N-terminale aminosyre indeholder en 6-leddet aromatisk ring. Tripeptidderivaterne ifølge den foreliggende opfindelse har derimod enten en hydrogeneret 6-leddet 20 ring i den N-terminale aminosyre eller i den midterste aminosyre, og som vist nedenfor har disse strukturforskelle givet årsag til en uventet høj spaltningshastighed hos tripeptidderivaterne.

Dansk patentansøgning nr. 2400/73 beskriver blandt andet forbindelser, der indeholder phenylalanin som den N-terminale aminosyre og 25 valin som den midterste aminosyre, medens de foreliggende forbindelser indeholder cyclohexylalanin eller 4-hydroxycyclohexylalanin som den midterste aminosyre, når den N-terminale aminosyre er phenylalanin.

Dansk patentansøgning nr. 3127/76, jfr. DK 146937B angår tripeptid-30 derivater, som er nyttige som substrater til bestemmelse af visse proteolytiske enzymer, især glandulære eller organkallikreiner og plasmin. Forbindelserne ifølge opfindelsen adskiller sig fra de fra dansk patentansøgning nr. 3127/76 kendte forbindelser ved, at den N-terminale aminosyre eller den midterste aminosyre ufravigeligt bærer

DK 155051B

3 en cyclohexyl-, cyclohexylmethyl-, 4-hydroxy-cyclohexylmethyl- eller phenylradikal på α-carbonatomet, medens de kendte forbindelser enten bærer valin, prolin eller Pip-radikaler i α-stillingen. Bl.a. kan fire forbindelser tages som eksempler, nemlig H-D-valyl-leucyl-arginyl-5 p-nitroaniliddihydrochlorid (forbindelse XVI) (kommercielt tilgængeligt under betegnelsen S-2266), H-D-valyl-leucyl-lysyl-p-nitro-aniliddihy-drochlorid (forbindelse XVIII) (kommercielt tilgængeligt under betegnelsen S-2251), H-D-prolyl-phenylalanyl-arginyl-p-nitroaniliddihydro-chlorid (forbindelse XL) (kommercielt tilgængelig under betegnelsen 10 S-2302) og H-D-pipeco-linyl-phenylalanyl-arginyl-p-nitroanilid-dihy-drochlorid (forbindelse XLI). Forbindelse XVI er et substrat for glandulær kallikrein, forbindelse XVIII er et substrat for plasmin, og forbindelserne XL og XLI er substrater for plasmin glandulær kallikrein og plasmakallikrein. Sammenligningstests har vist, at de fire 15 forbindelser opspaltes enzymatisk ved en given mængde af henholdsvis glandulær kallikrein eller plasmin ved en betydelig lavere hastighed end tripeptidderivaterne ifølge den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen angår i overensstemmelse hermed hidtil ukendte chromo-gene substrater, som har høj følsomhed over for visse proteolytiske 20 enzymer af klasse E.C. 3.4.21., især organ- eller kirtelkallikreiner og plasmin, og derfor er nyttige som substrater til kvantitativ analyse for disse enzymer. Tripeptidderivater ifølge opfindelsen har den almene formel I

H - D - X - Y -Z -R I

25 hvor a) X betegner alanyl, a-aminobutyryl (But), valyl, norvalyl, leucyl eller norleucyl, og Y betegner cyclohexylalanyl (CHA), cyclohexyltyrosyl (CHT) eller phenylglycyl (Ph'Gly), eller 30 b) X betegner phenylalanyl eller phenylglycyl, og Y betegner cyclohexylalanyl eller cyclohexylty rosy I,

DK 155051 B

!

J

4 i i Z betegner arginyl eller lysyl, og R betegner p-nitrophenylamino, 2-naphthylamino, 4-methoxy-2-naph- j j thylamino, 4-methyl-cumaryl-7-amino, 1,3-di(methoxycarbonyl)phen- j yl-5-amino, quinolyl-5-amino eller 8-nitroquinolyl-5-amino, j 5 og salte deraf med syrer, med det forbehold, at tripeptidderivatet I j ikke kan være | H-D-Val-CHA-Arg-4-methylcumaryl-7-amid, H-D-Val-CHA-Arg-1,3-di(methoxycarbonyI)phenyl-5-amid, H-D-Val-CHA-Arg-2-naphthylamid, H-D-Val-CHA-Arg-4-methoxy-2-naphthylamid, H-D-Val-CHA-Arg-p-10 nitroanilid, H-D-Val-CHA-Lys-p-nitroanilid eller H-D-Ph'-Gly-CHA-Arg-pNA.

Tripeptidderivaterne med formlen I er tungt opløselige i vandige medier og anvendes derfor fortrinsvis i form af deres salte med syrer, især deres salte med mineralsyrer, f.eks. saltsyre, brom-15 brintesyre, svovlsyre, phosphorsyre osv. eller organiske syrer, f.eks. myresyre, eddikesyre, propionsyre, trimethyleddikesyre, methoxyeddikesyre, halogenerede eddikesyrer såsom trichlor- eller trifluoreddikesyre, aminoeddikesyre, mælkesyre, oxalsyre, malonsyre, citronsyre, benzoesyre, i kernen substituerede aromatiske syrer 20 såsom toluensyrer, chlor- eller brombenzoesyrer, methoxybenzoesyrer eller aminobenzoesyrer eller phthalsyre. Syrens natur er ikke kritisk, da syren ikke deltager i reaktionen mellem substraterne og enzymerne.

Forbindelserne med formlen I og deres salte med syrer spaltes hydro-25 lytisk ved indvirkning af visse proteolytiske enzymer af klasse 3.4.21. (jfr. "Enzyme Nomenclature", Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam 1973, side 238 ff), især organ- eller kirtelkalli-kreiner og plasrrrin. Som et resultat dannes et farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt med formlen R-Nf^, hvis mængde kan måles 30 ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescensspektrofotometriske eller el ekt ro kern i ske metoder. De hidtil ukendte forbindelser er derfor nyttige til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklasse E.C. 3.4.21., som spalter naturlige peptidkæder på carboxy-siden af arginin og lysin, især organ- eller kirtelkallikreiner og 35 plasmin samt deres inhibitorer og proenzymer. ' i

DK 155051 B

5

Opfindelsen angår derfor også en fremgangsmåde til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklasse E.C. 3.4.21., som spalter naturlige peptidkæder på caroboxysiden af arginin og lysin, især organ- eller kirtelkallikreiner og plasmin. Fremgangsmåden ifølge 5 opfindelsen er ejendommelig ved, at mediet omsættes med et tripep-tidderivat med den almene formel I eller et salt deraf, og mængden af farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt R-Nl·^ dannet ved den hydrolytiske indvirkning af enzymet på tripeptidderivatet måles ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescensspektrofotometriske eller 10 elektrokemiske metoder. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen tillader f.eks. at analysere for enzymindholdet i enzympræparater eller enzymniveauet i menneskers eller pattedyrs legemsvæsker, f.eks. urin, bugspyt, tarmslimhinde, mælkekirtelsekretion, svedkirtelsekretion, sputum og blod. Ved hjælp af denne fremgangsmåde kan der udføres 15 assay for frie organkallikreiner og slimhindekallikreiner samt kalli-kreiner dannet ud fra prækallikreiner og endvidere fysiologiske eller ikke-fysiologiske inhibitorer for kallikreiner og fysiologiske eller ikke-fysiologiske aktivatorer for kallikreiner.

Tripeptidderivaterne med formlen I kan fremstilles ved de nedenfor 20 beskrevne fremgangsmåder: 1) Den chromogene gruppe R knyttes til carboxygruppen hos C-ter-minal arginin eller lysin, hvorhos α-aminogruppen beskyttes med en beskyttelsesgruppe, f.eks. en carbobenzoxy- eller tert.butoxycarbo-nylgruppe, idet δ-guanidylgruppen for arginins vedkommende be-25 skyttes ved proton i sering, f.eks. med HCI, nitrering eller tosylering, og ε-aminogruppen for Jysins vedkommende beskyttes med en carbo-benzoxygruppe, eller en p-methyl-, p-methoxy- eller p-chlorbenzyl-oxycarbonylgruppe eller en tert.butoxycarbonylgruppe. Den C-termi-nale R-NH-gruppe tjener også som en beskyttelsesgruppe under den 30 trinvise syntese af peptidkæden. De andre beskyttelsesgrupper kan fjernes selektivt som nødvendigt for at tilknytte yderligere aminosyre-derivater, indtil den ønskede peptidkæde er fuldstændig syntetiseret.

Til sidst spaltes de tilbageværende beskyttelsesgrupper fuldstændig af, uden at R-NH-gruppen påvirkes (jfr. f.eks. Miklos Bodansky et 35 al., "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966, side 163 -165).

DK 155051 B

6 i i 2) Først syntetiseres peptidkæden (ifølge Bodansky el al., loc.cit.), hvorhos den C-terminale carboxylgruppe i arginin eller lysin midlertidigt beskyttes under anvendelse af en sædvanlig estergruppe, f.eks. en methoxy-, ethoxy- eller benzyloxygruppe for arginins i 5 vedkommende eller en tert.butoxygruppe for lysins vedkommende. j

Estergrupperne kan fjernes ved alkalisk hydrolyse undtagen tert.bu- j toxygruppen, som må fraspaltes selektivt ved hjælp af trifluoreddike- j syre. Hvis δ-guanidylgruppen i arginin protoniseres, fjernes denne j estergruppe enzymatisk ved hjælp af trypsin, idet der ikke foregår 10 nogen racemisering. Derefter tilknyttes den chromogene R-NH-grup- ! pe. Når δ-guanidinogruppen i arginin er beskyttet med en nitro- eller ! tosylgruppe, eller ε-aminogruppe i lysin er beskyttet med en carbo-benzoxy- eller tert.butoxygruppe, og N-terminal-a-aminogruppen i tripeptidderivatet er beskyttet med en carbobenzoxygruppe eller en 15 p-methyl-, p-methoxy- eller p-chlorbenzyloxycarbonylgruppe eller en tert.butoxygruppe, fjernes alle beskyttelsesgrupper samtidigt. Fjernelsen kan udføres ved at behandle det beskyttede tripeptidderivat med vandfrit HF ved stuetemperatur, idet alle de nævnte beskyttelsesgrupper på amino- og δ-guanidinogrupperne således fjernes. Fjer-20 nelsen kan også udføres ved behandling med 2N brombrintesyre i iseddike ved stuetemperatur, hvis det beskyttede tripeptidderivat ikke indeholder nitro- eller tosylbeskyttelsesgrupper.

Fremstillingen af tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen beskrives detaljeret i de nedenstående eksempler.

25 Analyser af eluater og produkter, der er fremstillet i henhold til eksemplerne, udføres ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af glasplader overtrukket med silicagel (Merck, F 254). Tyndtlagschro-matogrammerne udvikles ved hjælp af følgende opløsningsmiddelsystemer: 30 A Chloroform/methanol (9:1).

B n-Propanol/ethylacetat/vand (7:1:2).

C n-Butanol/eddikesyre/vand (3:1:1).

DK 155051 B

7

Der anvendes følgende forkortelser:

AcOh = eddikesyre

Ala = alanin

Arg = arginin 5 BOC = tert.butoxycarbonyl

But = a-aminosmørsyre

Cbo = carbobenzoxy CHA = cyclohexylalanin CHG = cyclohexylglycin 10 CHT = cyclohexyltyrosin = p-hydroxycyclohexylalanin DMF = dimethylformamid TLC = tyndtlagschromatografi

EtgN = triethylamin HMPTA = phosphorsyre-N,N,N',N’,N",N"-hexamethyltriamid 15 Ile = isoleucin

Leu = leucin SS = opløsningsmiddelsystem/er

Lys = lysin

MeOH = methanol 20 Nleu = norleucin

Nval = norvalin

OpNP = p-nitrophenoxy

Phe = phenylalanin

Ph'Gly = phenylglycin 25 Pip = pipecolinsyre pNA = p-nitroanilid THF = tetrahyd rof uran

Tyr = tyrosin

Val = valin 30 Medmindre andet er angivet, har aminosyrerne i peptidkæderne L-form.

DK 155051 B

8

Eksempel 1.

H-D-But-CHA-Arg-pNA.2HBr.

la. Cbo-Arg-pNA.HCI.

I en 250 ml's trehalset kolbe opløses 16,0 g (47,0 millimol) Cbo-Arg-5 OH.HCI, som er tørret i vakuum over P20^, ' 90 ml absolut HMPTA

ved 20°C, medens atmosfæren i kolben holdes fugtfri. Til den resulterende opløsning sættes ved stuetemperatur først en opløsning af 4,74 g (47,0 millimol) Et^N i 10 ml HMPTA og derefter portionsvis 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenylisocyanat (100%'s overskud). Efter en 10 reaktionstid på 24 timer ved 20°C fjernes hoveddelen af HMPTA ved destillation i vakuum. Remanensen ekstraheres adskillige gange med 30%’s AcOH. Remanensen kasseres. De forenede eddikesyreekstrakter renses yderligere ved føre dem gennem en søjle af "Sephadex G-15" ækvilibreret med 30%'s AcOH og elueres med 30%'s AcOH. Den fraktion 15 af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres. Således fås 12,6 g af et amorft pulver, som er homogent i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.

Analyse: 20 Beregnet for C20H25N6°5CI: C 51,67 H 5,42 N 18,08 Cl 7,63.

Fundet: C 51,29 H 5,48 N 17,92 Cl 7,50.

lb. 2HBr.H-Arg-pNA.

4,65 g (10 millimol) af forbindelse la behandles under omrøring med 40 ml 2N HBr i iseddike i 45 minutter ved 20°C i fraværelse af fugt.

25 Aminosyrederivatet opløses under C02-udvikling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 250 ml absolut ether. Dette j resulterer i udfældning af 2HBr. H-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges, hvorefter den faste fase vaskes fire gange med 100 ml af absolut ether til fjernelse af benzylbromid, der er dannet som bipro-30 dukt, samt overskydende HBr og AcOH. Remanensen opløses i 50 ml methanol, pH-værdien indstilles til 4,5 ved tilsætning af Et^N, og j.

i;

DK 155051 B

9 opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Det resulterende produkt opløses i 75 ml MeOH og føres gennem en søjle af "Sephadex LH-20" (tværbundet dextrangel) ækvilibreret med MeOH. Fra en fraktion af eluatet fås 4,18 g (91,6% af det teoretiske) amorf forbin-5 delse Ib, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved tyndtlagschromatografi.

Analyse:

Beregnet for C12H20NgO3Br2: C 31,60 H 4,42 N 18,43 Br 35,03.

Fundet: C31,15 H 4,35 N 18,84 Br 34,81.

10 1c. Cbo-CHA-Arg-pNA.HBr.

4,56 g (10 millimol) af forbindelse Ib opløses i 30 ml friskt destilleret DMF, og opløsningen afkøles til -10°C. 1,40 ml (10 millimol) i EtgN sættes til opløsningen under omrøring. Det dannede Et^N.HBr fjernes ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt dimethylformamid.

15 4,69 g (11 millimol) Cbo-CHA-OpNP sættes ved -10°C til filtratet, og reaktionen lades forløbe i 2 - 3 timer i fraværelse af fugt, hvorved reaktionsopløsningens temperatur gradvis når ca. 20°C. Opløsningen afkøles atter til -10°C, puf res med 0,70 ml (5 millimol) EtgN og lades reagere i 2 timer ved -10°C og i ca. 3 timer ved stuetemperatur. Denne 20 procedure gentages med 0,70 ml Et^N, og efter 16 timer inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 75 ml 50% AcOH og renses ved gelfiltrering på en søjle af "Sephadex G-15"@ ækvilibreret med 50%'s AcOH. Hovedfraktionen af AcOH-eluatet, der spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitro-25 anilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen opløses i 150 ml MeOH og inddampes atter til tørhed. Den resulterende remanens tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over P205, hvorved fås 5,85 g (88,3% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 1c, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.

30 Analyse:

Beregnet for C29H4()N706Br: C 52,57 H 6,09 N 14,80 Br 12,06.

Fundet: 0 52,28 H 6,16 N 15,09 Br 11,85.

DK 155051 B

10 ld. 2HBr.H-CHA-Arg-pNA. j 5,30 g (8 millimol) af forbindelse 1c behandles under omrøring med 32 i j ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C. Peptidderivatet opløses i gradvis under (X^-udvikling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis 5 under kraftig omrøring til 250 ml absolut ether. Dette resulterer i j i udfældning af 2HBr.H-CHA-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges, j hvorefter den faste fase vaskes fire gange med 100 ml absolut ether til | fjernelse af benzylbromid, der er dannet som biprodukt, samt overskydende HBr og AcOH. Remanensen opløses i 50 ml MeOH. pH-Værdien 10 indstilles til 4,5 ved hjælp af Et^N, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Den resulterende remanens opløses i 50 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20" , der er ækvilibreret med

MeOH. Den fraktion af MeOH-eluatet, der spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum 15 ved 30°C. Den resulterende remanens tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5' hvorved fås 4,48 g (91,9% af det teoretiske) amorf forbindelse Id, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C.

Analyse:

Beregnet for C^H^N^Br: C 41,39 H 5,79 N 16,09 Br 26,23.

20 Fundet: C 41,80 H 5,86 N 16,31 Br 25,85.

le. Cbo-D-But-CHA-Arg-pNA.HBr.

3,05 g (5 millimol) forbindelse Id opløses i 20 ml friskt destilleret DMF, og opløsningen afkøles til -10°C. 0,70 ml (5 millimol) EtjN sættes til opløsningen under omrøring. Det dannede EtgN.HBr fjernes 25 ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt DMF. 1,97 g (5,5 millimol) Cbo-D-But.OpNP sættes ved -10°G under omrøring til filtra tet. Reaktronsblandingen lades reagere i 2 - 3 timer i fraværelse af fugt, hvorved reaktionsopløsningstemperaturen gradvis når ca. 20°C.

Opløsningen afkøles atter til -10°C, pufres med 0,35 ml (2,5 millimol) 30 EtgN og lades reagere i ca. 2 timer ved -10°C og i yderligere 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure gentages med 0,35 ml i Et^N, og efter 16 timer inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 50 ml 50%'s AcOH og renses ved

DK 155051 B

11 gelfiltrering på en søjle af "Sephadex G-15" ækvilibreret med 50%'s AcOH. Hovedfraktionen af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse, af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen opløses i 100 ml MeOH, og opløsningen 5 inddampes atter til tørhed. Den resulterende remanens tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over hvorved fås 3,27 g (87,5% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse le, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.

Analyse: 10 Beregnet for C33H4?N807Br: C 53,01 H 6,34 N 14,99 Br 10,69

Fundet: C 52,88 H 6,40 N 15,28 Br 10,53.

1f. 2HBr.H-D-But-CHA-Arg-pNA.

2,24 g (3 millimol) forbindelse le behandles under omrøring med 12 ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C i fraværelse af fugt. Tri-15 peptidderivatet opløses gradvis under decarboxylering og CC^-udvik-ling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 120 ml absolut ether. Dette resulterer i udfældning af 2HBr.H-D-But-CHA-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges gennem en filterstav, og derefter vaskes den faste fase fire gange med portioner på 50 ml 20 absolut ether. Den resulterende remanens opløses i 40 ml MeOH. pH-Værdien indstilles til 4,5 ved hjælp af EtgN, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen opløses i 30 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20" ækvilibreret med MeOH. Den fraktion af MeOH-eluatet, der spaltes ved behandling med 25 trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Til yderligere rensning opløses den forrensede remanens i 30 ml 33%'s AcOH og renses ved gelfiltrering på en søjle af "Sephadex G-15" ækvilibreret med 33% AcOH. Hovedfraktionen af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigø-30 relse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Den resulterende remanens tørres i vakuumexsiccator ved 40°C over Ρ303, hvorved fås 1,71 g (82,1% af det teoretiske) amorf forbindelse 1f, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.

i1 12

DK 155051 B

Analyse:

Beregnet for C25H47Ng05Br2: C 43,24 H 6,10 N 16,14 Br 23,01

Fundet: ~ C 43,18 H 6,16 N 16,27 Br 22,73.

i i

Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede amino-5 syrer i de korrekte forhold: Arg:1,01 - CHA:0,98 - D-But:1,00. j i i !

Eksempel 2.

2HBr. H-D-But-CHA-Lys-pNA. i 2a. BOC-Lys(e-Cbo)-pNA.

38,05 g (0,1 mol) tørret olie af BOC-Lys(s-Cbo)-OH opløses i en 500 10 ml's trehalset kolbe i 150 ml absolut HMPTA ved 20°C i fraværelse af fugt. Til den resulterende opløsning sættes ved stuetemperatur først en opløsning af 10,12 g (0,1 mol) Et^N i 25 ml HMPTA og derefter portionsvis 24,62 g (0,15 mol) p-nitrophenylisocyanat (50%'s overskud), hvorved der forekommer en kraftig C02-udvikling hver gang.

15 Efter en reaktionstid på 24 timer ved 20°C fjernes hovedandelen af HMPTA ved destillation i vakuum. Remanensen ekstraheres adskillige gange med 2%'s natriumhydrogencarbonatopiøsning og digereres derefter med destilleret vand. Den resulterende remanens tørres i vakuum ved 40°C og ekstraheres derefter adskillige gange med varmt MeOH, 20 indtil remanensen kun indeholder det tungt opløselige biprodukt N,N'-bis(p-nitrophenyl)urea. MeOH-Ekstrakterne inddampes til 300 ml, hvorved nogle urenheder danner et flokkulent bundfald. Efter filtre-ring renses filtratet (330 ml) på en søjle af "Sephadex LH-20" æk-vilibreret med MeOH. Hovedfraktionen af MeOH-eluatet inddampes i 25 vakuum ved 30°C til et lille volumen, hvorved et nålelignende stof krystalliserer. De vundne krystaller frafiltreres og vaskes portionsvis med 50 ml isafkølet MeOH. Efter tørring i en vakuumexsiccator ved 40°C over P20^ ^1,1 g (62,1% af det teoretiske) krystallinsk forbindelse 2a, smeltepunkt ......... hvilket er homogent i opløs- 30 ningsmiddelsystem A og B som vist ved TLC. Moderluden giver en

DK 155051 B

13 yderligere mængde på 5,8 g (11,6% af det teoretiske) af stof 2a, smeltepunkt ........ som er homogent i opløsningsmiddelsystem A og B som vist ved TLC.

Analyse: 5 Beregnet for ^25^32^4^7* ^ ^ 6,44 N 11,19.

Fundet: C 60,23 H 6,50 N 11,38.

2b. CFgCOOH.H-Lys(s-Cbo)-pNA.

25,03 g (50 millimol) forbindelse 2a behandles under kraftig omrøring med 50 ml friskt destilleret vandfrit trifluoreddikesyre ved 20°C i 60 10 minutter i fraværelse af fugtighed. BOC-Gruppen fraspaltes selektivt under CC^-udvikling og frigørelse af isobutylen. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 750 ml absolut ether, hvorved flokkulent CF^COOH.H-Lys(s-Cbo)-pNA udfældes. Den ethe-riske fase frasuges gennem en filterstav. Den faste fase behandles 15 fire gange med 100 ml's portioner absolut ether. Den resulterende remanens opløses i 200 ml MeOH. pH-Værdien indstilles til 4,5 ved hjælp af EtgN, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved

30°C. Remanensen opløses i 200 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20"® ækvilibreret med MeOH. Hovedfraktionen af MeOH-20 eluatet, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC

inddampes i vakuum ved 30°C. Den resulterende remanens tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over P2®5 hvorved fås 22,64 g (88,0% af det teoretiske) amorf forbindelse 2b.

Analyse: 25 Beregnet for ^22^25^4^7^ C 51,36 H 4,90 N 10,89.

Fundet: C 51,66 H 4,88 N 11,08.

2c. BOC-CHA-Lys(ε-Cbo)-pNA.

7,72 (15 millimol) forbindelse 2b opløses i 50 ml frisk destilleret DMF og afkøles til -10°C. Til opløsningen sættes under omrøring 6,48 g 30 (16,5 millimol) BOC-CHA-OpNP og 2,09 ml (15 millimol) EtgN. Blandingen lades reagere i 3 timer i fraværelse af fugtighed, hvorunder DK 155051 Β 14 ί reaktionstemperaturen gradvis når stuetemperatur. Opløsningen afkøles atter til -10°C og pufres med 1,05 mi (7,5 millimol) EtgN. Efter en ! reaktionstid på 5 timer gentages denne procedure med 1,05 ml Et~N. ,

ύ I

Efter en reaktionstid på 16 timer ved 20°C inddampes reaktionsopløs- j 5 ningen til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 150 ml

MeOH og renses ved gelfiltrering på en søjle "Sephadex LH-20" ækvilibreret med MeOH. Den første hovedfraktion af MeOH-eluatet, som er homogen i opløsningsmiddelsystem A og B som vist ved tyndt- j lagschromatografi, koncentreres til tørhed i vakuum ved 30°C. Efter j 10 tørring i en vakuumexsiccator ved 40°C over Ρ30^ 8,26 9 (84,2% ! af det teoretiske) amorf forbindelse 2c, som er homogent i opløs ningsmiddelsystem A og B som vist ved TLC.

Analyse:

Beregnet for C^H^yN^Og: C 62,46 H 7,25 N 10,71 15 Fundet: C 63,05 H 7,35 N 10,98.

2d. CFgCOOH.H-CHA-Lys(s-Cbo)-pNA.

3,27 g (5 millimol) forbindelse 2c behandles under kraftig omrøring med 10 ml friskt destilleret vandfri trifluoreddikesyre i 60 minutter ved 20°C i fraværelse af fugtighed. Reaktionsopløsningen sættes 20 dråbevis under kraftig omrøring til 100 ml absolut ether, hvorved amorft CFgCOOH. H-CHA-Lys(s-Cbo)-pNA udfældes. Den etheriske fase suges fra. Den faste remanens vaskes tre gange med portioner på 30 ml absolut ether. Den resulterende remanens opløses i 50 ml MeOH. pH-Værdien indstilles til 4,5 ved hjælp af Et^N, og opløsnin- 25 gen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen opløses i 75 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20" ækvilibreret med MeOH. Hovedfraktionen af MeOH-eluatet, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC, inddampes i vakuum ved 30°C. Efter tørring af remanensen i en vakuumexsiccator ved 40°C 30 over P£®5 fås 3,06 g (91,6% af det teoretiske) amorf forbindelse 2d.

Analyse:

Beregnet for C31H40N5O8F3: C 55,77 H 6,04 N 10,49

Fundet: C 56,08 H 6,15 N 11,01.

DK 155051 B

15 2e. Cbo-D-But-CHA-Lys(s-Cbo)-pNA.

2,00 g (3 mi I limol) forbindelse 2d opløses i 15 ml friskt destilleret DMF og afkøles til -10°C. Til opløsningen sættes under omrøring 1,18 g (3,3 millimol) Cbo-D-But-OpNP og 0,42 ml (3 millimol) EtjN.

5 Blandingen lades reagere i 3 timer i fraværelse af fugtighed, hvorved temperaturen gradvis når 20°C. Reaktionsopløsningen afkøles atter til -10°C og puf res med 0,21 ml (1,5 millimol) Et^N. Efter en reaktionstid på 5 timer ved -10°C når reaktionsblandingen gradvis stuetemperatur.

Denne procedure gentages med 0,21 ml Et^N, hvorhos reaktionen 10 tager 16 timer. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed i vakuum ved 50°C, og remanensen opløses i 50 ml MeOH og renses ved gelfil-trering på en søjle af "Sephadex LH-20" ækvilibreret med MeOH. Den første hovedfraktion af MeOH-eluatet, som er homogen i opløsningsmiddelsystem A og B som vist ved TLC, inddampes til tørhed i vaku-15 um ved 30°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over ^2^5' hvorved fås 2,12 g (91,4% af det teoretiske) af delvis krystallinsk forbindelse 2e.

Analyse:

Beregnet for C^H^NgOgt C 63,71 H 6,78 N 10,87 20 Fundet: C 63,48 H 6,82 N 10,99.

2f. 2HBr.H-D-But-CHA-Lys-pNA.

1,55 g (2 millimol) forbindelse 2e behandles under omrøring med 12 ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C i fraværelse af fugtighed. Tripeptidderivatet opløses gradvis under samtidig fraspaltning af de 25 to beskyttelsesgrupper Cbo og BOC og (X^-udvikling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 100 ml absolut ether, hvorved flokkulent 2HBr.H-D-But-CHA-Lys-pNA udfældes. Den etheriske fase frasuges efter 30 minutter, og den faste fase vaskes fire gange med portioner på 25 ml absolut ether. Den resulterende 30 remanens opløses i 40 ml MeOH. pH-Værdien indstilles til 4,5 ved hjælp EtgN, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen opløses i 30 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20" ækvilibreret med MeOH. Hovedfraktionen af MeOH-eluatet,

DK 155051 B

16 der spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Til yderligere rensning opløses det forrensede produkt i 25 ml 33%'s AcOH og renses ved gelfiltrering på en søjle af "Sephadex G-15" ækvilibreret med 33%'s 5 AcOH. Den fraktion af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Den resulterende remanens tørres i en vakuum-exsiccator ved 40°C over hvorved fås 0,99 g (74,3% af det teoretiske) amorft stof 2f, som er homogent i opløsningsmiddelsystem 10 C som vist ved TLC.

Analyse:

Beregnet for ^25^42^6^5^r2: ^ 45,05 H 6,35 N 12,61 Br 23,98

Fundet: C 44,75 H 6,39 N 12,67 Br 23,68.

Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede amino-15 syrer i de korrekte forhold: CHA:0,98 - Lys: 1,00 - D-But:1,02.

En serie af andre tripeptidderivater fremstilles ved de fremgangsmåder, der beskrives i ovenstående eksempler. Disse tripeptidderivater grupperes i nedenstående tabel I.

Dipeptid- og tripeptidmellemprodukterne, der anvendes til fremstilling af 20 de i tabel I viste derivater, er anført i tabellerne II og III.

17

Tabel I

DK 155051 B

Frem- Analyse

Udgangspro- gangs- Fundet Beregnet % dukter måde 5 Eksem- (mmol) (eks.) Aminosyreanalyse pel Slutprodukt Udbytte % 3 2AcOH.H-D-Val- 3e (0,75 mmol) (2f) 84,4 C 54,90 55,03 CHT-Lys-pNA 2N HBr/AcOH H 7,78 7,70 10 C30H50N6°10 N 13,05 12,84

Val:CHT: Lys 1,00:0,98:1,01 4 2HBr.H-D-Leu- 4e (1 mmol) (1f) 85,2 C 44,55 44,88 CHA-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,53 6,42 15 C27H46N8°5Br2 N 15,85 15,51

Br 21,92 22,12

Leu:CHA:Arg 1,00:0,98:0,99 5 2HBr.H-D-NIeu- 5e (1 mmol) (1f) 86,0 C 44,75 44,88 20 CHA-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,49 6,42 C27H46N8°5Br2 N 15,79 15,51

Br 21,82 22,12

Nleu:CHA: Arg 1,00:0,97:0,99 25 6 2HBr.H-D-Nval- 6e (1 mmol) (1f) 87,1 C 44,39 44,08 CHA-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,28 6,26 C26H44N8°5Br2 N 16,09 15,82

Br 22,33 22,56

NvahCHA: Arg 30 1,00:0,98:0,98 18 s 5

DK 15505 1 B

7 2HBr. H-D-Phe- 7e (1 mmol) Cif) 82,3 C 47,47 47,63 CHA-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 5,92 5,86 C30H44N8°5Br2 N 15,08 14,81

Br 20,85 21,12 5 Phe:CHA:Arg 1,00:0,98:1,01 8 2HBr.H-D-AIa- 8e (1 mmol) (1f) 86,0 C 41,97 42,36 CHA-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 5,92 5,93 C24H40N8°5Br2 N 16,59 16,47 10 Br 23,11 23,49

Ala:CHA: Arg 1,00:0,97:0,99 9 2HBr. H-D-Nval- 9e (1 mmol) (2f) 76,4 C 45,73 45,89 CHA-Lys-pNA 2N HBr/AcOH H 6,61 6,52 15 C26H44N6°5Br2 N 12,48 12,35

Br 23,18 23,49

Nval:CHA:Arg 1,00:0,98:0,99 10 2HBr.H-D-Leu- lOe Cl mmol) (2f) 78,0 C 46,39 46,69 20 CHA-Lys-pNA 2N HBr/AcOH H 6,63 6,68 C27H46N6°5Br2 N 12,27 12,10

Br 22,81 23,01

Leu: CHA: Lys 1,00:0,97:1,01 25 11 2HBr.H-D-NIeu- Ile (1 mmol) (2f) 77,6 C 46,88 46,69 CHA-Lys-pNA 2N HBr/AcOH H 6,72 6,68 C27H46N6°5Br2 N 12,33 12,10

Br 22,75 23,01

Nleu:CHA: Lys 30 0,99:0,97:1,00 19

Tabel 11

DK 155051 B

Frem-

Udgangspro- gangsmåde

Eksem- Dipeptid- dukter (eks.) Analyse 5 pel precursor (mmol) Udbytte % Fundet % Beregnet % 3c BOC-CHT-Lys- 2b (5 mmol) (2c) 84,3 C 60,48 60,97 (s-Cbo)-pNA BOC-CHT-OpNP H 7,11 7,07 C34H47N5°9 (5'5 mmol) N 10,76 10,46 10 3d CF3COOH.H-CHT- 4c (3 mmol) (2d) 90,8 C 54,08 54,46

Lys(s-Cbo)-pNA 6 ml CF3COOH H 6,00 5,90 C31H40N5°9F3 N 10,18 10,24

Tabel III

20

DK 155051 B

Frem-

Udgangspro- gangsmåde

Eksem- Tripeptid- dukter (eks.) Analyse 5 pel precursor (mmol) Udbytte % Fundet % Beregnet % 3e Cbo-D-Val-CHT- 3d (1,5 mmol) (2e) 77,9 C 62,80 62,83

Lys(e-Cbo)-pNA Cbo-D-Val-OpNP H 6,87 6,78 C42H54N6°10 (1,65 mmol) N 10,61 10,47 10 4e Cbo-D-Leu-CHA- Id (2 mmol) (le) 79,8 C 53,95 54,19

Arg-pNA. HBr Cbo-D-Leu- H 6,70 6,63 C35H51N8°7Br 0pNP (2,2 mmo,) N 14,66 14,45

Br 10,14 10,30 5e Cbo-D-Nleu-CHA- Id (2 mmol) (le) 80,4 C 54,08 54,19 15 Arg-pNA.HBr Cbo-D-NIeu- H 6,73 6,63 C35H5lN8°7Br 0pNP (2,2 mmol) N 14,58 14,45

Br 10,08 10,30 6e Cbo-D-Nval-CHA- 1d (2 mmol) (le) 82,6 C 53,28 53,61

Arg-pNA. HBr Cbo-D-Nval- H 6,55 6,48 20 C34H4gNg07Br OpNP (2,2 mmol) N 14,93 14,71

Br 10,25 10,49 7e Cbo-D-Phe-CHA- 1d (2 mmol) (le) 84,5 C 56,23 56,36

Arg-pNA.HBr Cbo-D-Phe- H 6,18 6,10 C38H49N8°7Br 0pNP (2,2 mmol) N 14,10 13,84 25 Br 9,75 9,87 8e Cbo-D-Ala-CHA- 1d (2 mmol) (le) 88,2 C 52,01 52,39

Arg-pNA.HBr Cbo-D-Ala- H 6,19 6,18 ^32^45^8^7Br OpNp (2,2 mmol) N 15,44 15,27

Br 10,62 10,89

DK 155051 B

21 9e Cbo-D-Nval- 2d (1,5 mmol) (2e) 90,6 C 63,90 64,10 CHA-Lys(e-Cbo)- Cbo-D-Nval- H 6,98 6,92 pNA OpNP (1,65 mmol) N 10,82 10,68 C42H54N6°9 5 10e Cbo-D-Leu-CHA- 2d (1,5 mmol) (2e) 88,5 C 64,28 64,48

Lys(s-Cbo)-pNA Cbo-D-Leu- H 7,11 7,05 C43H56N6°9 OpNP (1,65 mmol) N 10,75 10,49 11e Cbo-D-Nleu-CHA- 2d (1,5 mmol) (2e) 88,9 C 64,18 64,48

Lys(e-Cbo)-pNA Cbo-D-Nleu- H 7,08 7,05 10 C43H56N6°9 0pNP (1'65 mmol) N 10,60 10,49

Eksempel 12.

2AcOH. H-D-Nval-CHA-Arg-pNA.

7,09 g (10 millimol) 2HBr. H-D-Nval-CHA-Arg-pNA (fremstillet ifølge 15 eksempel 38) opløses i 75 ml 60%'s vandig MeOH. Opløsningen føres på (i) en søjle af "Amberlite" JRA-401 i acetatform. Søjlen elueres med 60%'s vandig MeOH, hvorved HBr erstattes med AcOH ved ionbytning.

Eluatet inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring i vakuumexsiccatoren ved 40°C over ^2^5 ^,33 9 bromidfrit 20 2AcOH.H-D-Nval-CHA-Arg-pNA (98,5% af det teoretiske).

De kvantitative enzymassays ved hjælp af tripeptidsubstraterne ifølge opfindelsen kan udføres som følger: 1. Assay for urinkallikrein.

1 ml urin og 1 ml TRIS-imidazolpuffer med en pH-værdi på 7,9 og en 25 ionstyrke på 1,0 inkuberes ved 37°C i 5 minutter og centrifugeres derefter til fjernelse af sedimenter.

DK 155051 B

22 1,4 ml destilleret vand opvarmet til 37°C og 0,4 ml af centrifugatet blandes godt i en plastcuvette. Til denne blanding sættes 0,2 ml af -3 en 2 x 10 M vandig substratopløsning, og bestanddelene blandes hurtigt. Denne blanding inkuberes i nøjagtig 15 minutter ved 37°C.

5 Reaktionsblandingen blandes derefter med 0,2 ml iseddike for at stoppe den enzymatiske reaktion. Til farvemåling anvendes en blindprøve, der består af samme bestanddele, men hvortil er sat iseddike før tilsætningen af substratet for at forhindre den enzymatiske reaktion. Den blandede mængde af den farvede forbindelse R-Nl·^ bestem-10 mes fotometrisk eller spektrofotometrisk ved 405 nm ud fra forskellen mellem blindprøven og testprøven. Ud fra den således fundne værdi bestemmes urinkallikreinaktiviteten i urin under anvendelse af nedenstående formel: AOD., c . x V x 1000 x F 15 min.

15 = mU/ml urin 15 min. x v x ε.

Δ OD = forøgelsen af den optiske densitet ved 405 nm i løbet af 15 minutter, V = total vol urnenet af testblandingen = 2,2 ml, 20 1000 = omdannelsesfaktor til omdannelse af U til mU, F = fortyndingsfaktor for urin (2), v = volumen af prøve = 0,4 ml, ε = ekstinktionskoefficient divideret med 1000 = 10,4.

Beregningen af urinkallikreinindholdet i urin kan også udføres ved 25 kontinuerlig måling af produktet R-Nl·^ (f.eks. p-nitroanilin) som dannes. Denne metode beskrives nedenfor til anvendelse til assay for kirtel kali i krein i sputum.

Ud over urinkallikrein indeholder urin også urokinase som en pro-teolytisk enzym, der også kan spalte substratet ifølge opfindelsen, om 30 end i mindre udstrækning. I den ovenfor beskrevne assaymetode måles summen af aktiviteterne af urinkallikrein og urokinase. For at få et nøjagtigt tal for urinkallikreinaktiviteten må urokinaseaktiviteten fraregnes. Den sidstnævnte kan bestemmes i et sammenligningsforsøg

DK 155051 B

23 ved at tilsætte 0,075 enheder trypsininhibitor (trypsininhibitor fra bovin lunge) pr. ml puffer for fuldstændigt at inhibere urinkallikre-inaktiviteten og kun måle urokinaseaktiviteten.

2. Assay for kirtelkallikrein i sputum: 5 0,5 ml sputum blandes med 2 ml TRIS-imidazol puffer (ionstyrke 1,0), og blandingen forinkuberes ved 37°C i 5 minutter. Inkubatet centrifugeres. I en testcuvette anbringes 1,5 ml destilleret vand ved 37°C og 0,25 ml af centrifugatet tilsættes. Bestanddelene blandes godt.

_3

Derefter tilblandes 0,2 ml af en 2 x 10 M vandig substratopløsning.

10 Ændringen i ekstinktionen ved 405 nm måles derefter kontinuerligt i fra 5 til 10 minutter ved hjælp af en skriver. Ud fra den bestemte værdi for AOD pr. minut beregnes kallikreinaktiviteten pr. ml sputum i mU ved hjælp af nedenstående ligning: AOD . x V x 1000 x F min.

15 = mU/ml sputum v x ε.

F = 5 V = 1,95 v = 0,25 20 1 U (enhed) = enzymmængde, der er i stand til at spalte 1ymol sub strat på 1 minut under optimale eller på anden måde definerede pH-betingelser, ionstyrke, temperatur og substratkoncentration.

I bugspyt er pancreatisk kallikrein til stede hovedsageligt i form af prækallikrein, som der kun kan udføres assay for efter aktivering, 25 f.eks. ved hjælp af trypsin. Efter aktivering af prækallikrein inhibe-res trypsin ved hjælp af sojabønnetrypsininhibitor (SBTI). Kallikre-inindholdet i denne aktiverede blanding kan bestemmes ved en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder.

3. Assay for plasmin: 30 1,7 ml TRIS-imidazolpuffer (pH-værdi 7,5, ionstyrke 0,2) blandes med 0,1 ml af en opløsning af plasmin i 25%'s glycerol ved 37°C, og bian- ! 24

DK 155051 B

_2 dingen inkuberes ved 37°C i 1 minut. 0,2 ml af en vandig 2 x 10 M substratopløsning ved 37°C sættes til blandingen, og bestanddelene blandes hurtigt. Mængden af spaltningsproduktet R-Nl·^, som frigøres fra substratet pr. tidsenhed, måles derefter kontinuerligt. Ud fra 5 værdien bestemt pr. minut beregnes plasminaktiviteten pr. ml prøve i mU ud fra følgende ligning: ΔΕ/min. x V x 1000 - = mU/ml prøve v x ε.

10 ΔΕ = mængden af spaltningsprodukt frigjort pr. minut, V = totalvolumen af testblanding, v = volumen af prøve, ε = ekstinktionskoefficient divideret med 1000.

4. Assay for antiplasmin i humant plasma: 15 0,1 ml plasma fortyndet med TRIS-imidazolpuffer i forholdet 1:20 blandes med 0,02 ml af en opløsning af 1,25 CU humant plasmin (præparat fra firmaet AB Kabi, Stockholm, Sverige) og 50 ATU hirudin (præparat fra firmaet Pentapharm A.G., Basel, Schweiz) pr. ml i 25%'s glycerol. Blandingen inkuberes i 90 sekunder ved 37°C. Inku-20 batet blandes med 1,7 ml TRIS-imidazolpuffer (pH-værdi 7,5, ionstyrke 0,2) ved 37°C og derefter med 0,2 ml af en 2 x 10 ^ M vandig substratopløsning. Mængden af spaltningsproduktet R-Nl·^ frigjort fra substratet pr. tidsenhed måles derefter kontinuerligt. Ud fra den bestemte værdi beregnes den tilbageværende plasminaktivitet på den 25 ovenfor beskrevne måde.

I et blindforsøg erstattes plasmaet med den tilsvarende mængde puffer, men ellers udføres testen på den ovenfor beskrevne måde. Den bestemte plasminaktivitet svarer til udgangsplasminaktiviteten. Anti-plasminaktiviteten beregnes ud fra forskellen mellem plasminaktiviteten 30 bestemt i blindprøven og den tilbageværende plasminaktivitet bestemt i testen under anvendelse af plasma ifølge nedenstående formel: . 25

DK 15505TB

(4Eblindprøve - 4Eplasmaprøve)/min· x V x F x 1000 = mlU/ml v x ε plasma F = fortyndingsfaktor for plasma (20).

5 Substraterne ifølge opfindelsen kan også anvendes til assay for plasminogen i humant plasma ved at omdanne plasminogen, der er til stede i plasmaet, ved hjælp af urokinase eller streptokinase i et puffersystem og bestemme mængden af det dannede plasmin ved hjælp af et af substraterne ifølge opfindelsen i overensstemmelse med den ovenfor 10 beskrevne plasmin-assay-metode. Mængden af plasminogen, der oprindeligt er til stede i plasmaet, afledes af den værdi, der bestemmes for plasmin, da der efter aktivering dannes ét molekylplasmin ud fra ét molekyleplasminogen.

I nedenstående tabel IV er følsomheden for nogle af substraterne 15 ifølge opfindelsen over for organ- eller kirtelkallikrein og plasmin angivet.

Tabel IV

Urinkallikreinaktivitet i 1 ml human urin0, submandibularis kallikrein i 1 ml sputum, humant plasmin og human NIH-thrombin, målt ved hjælp 20 af substraterne ifølge opfindelsen ved konstante substrat- og enzymkoncentrationer. Til sammenligning er de tilsvarende værdier for de kendte substrater 2HCI.H-D-Val-Leu-Arg-pNA (A), 2HCI.H-D-Val-Leu-Lys-pNA (B), H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (C) og H-D-Pip-Phe-Arg- pNA (D) (jfr. dansk patentansøgning nr. 3127/76) også angivet.

-4 25 Substratkoncentration: 2 x 10 M.

DK 155051 B

26 Mængde i nanomol af spaftningsproduktet R-Nl·^ frigjort på 1 minut af henholdsvis 1 ml human urin, 1 ml human sputum og 1 CU-enhed humant plasmin.

5 Urin- Submandibula- Humant kallikrein ris kallikrein plasmin A 0,90 12,2 83 B 0,30 5,7 347 10 C 0,81 - 451 D 1,08 - 401

Substrater ifølge 15 eksempel 1 2,99 31,2 623 2 2,22 21,0 532 3 1,40 16,5 532 20 4 3,11 35,9 1069 5 2,08 28,1 1179 6 3,12 41,3 969 7 2,14 28,5 814 8 1,73 22,4 433 25 9 1,87 18,04 655 10 1,73 19,3 778 11 0,77 8,4 695 ° Urinprøve fremkommet ved at blande 100 ml portioner morgenurin fra raske personer.

30 _ Målingen af spaltningsproduktet R-N^ dannet ved den enzymatiske hydrolyse af substratet bygger på den forudsætning, at spaltnings-

Claims (6)

10 Med substrater, som indeholder en 2-naphthylamino-, 4-methoxy-2-naphthylamino, 4-methyl-cumaryl-(7)-amino eller 1,3-di(methoxycarbo-nyl)pheny!-(5)-aminogruppe måles mængden af spaltningsproduktet R-NH2 ved fluorescensspektrofotometri. I et testsystem bestående af enzym, puffer og substrat måles det emitterede lys med lavere energi 15 ved 400 - 470 nm efter at det dannede fluorescerende spaltningsprodukt er exciteret med lys af højere energi. Mængden af spaltningsprodukt dannet pr. tidsenhed måles for den den eksisterende enzymaktivitet. Som defineret svarer 1 ymol spaltningsprodukt pr. minut til 1 enzymenhed, beregnet på et givet substrat. 20 PATENTKRAV

1. Tripeptidderivater med den almene formel I H - D - X - V -Z -R I hvor a) X betegner alanyl, a-aminobutyryl (But), valyl, norvalyl, 25 leucyl eller norleucyl, og Y betegner cyclohexylalanyl (CHA), cyclohexyltyrosyl (CHT) eller phenylglycyl (Ph'Gly), eller b) X betegner phenylalanyl eller phenylglycyl, og Y betegner cyclohexylalanyl eller cyclohexyltyrosyl, .· DK 155051 B Z betegner arginyl eller lysyl, og R betegner p-nitrophenylamino, 2-naphthylamino, 4-methoxy-2-naph-thylamino, 4-methyl-cumaryl-7-amino, 1,3-di (methoxycarbonyl)phen-yl-5-amino, quinolyl-5-amino eller 8-nitroquinoly!-5-amino, 5 og salte deraf med syrer, med det forbehold, at tripeptidderivatet I ikke kan være H-D-Val-CHA-Arg-4-methylcumaryl-7-amid, H-D-Val-CHA-Arg-1,3-di(methoxycarbonyl)phenyl-5-amid, H-D-Val-CHA-Arg-2-naphthylamid, H-D-Val-CHA-Arg-4-methoxy-2-naphthylamid, H-D-Val-CHA-Arg-p-10 nitroanilid, H-D-Val-CHA-Lys-p-nitroanilid eller H-D-Ph'Gly-CHA-Arg-p-nitroanilid.

2. Tripeptidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dipeptidfragmentet knyttet til Arg eller Lys er Ala-CHA, Ala-Ph'Gly, But-CHA, Val-CHA, Val-CHT,

15 Nval-CHA, Nval-Ph'Gly, Leu-CHA, Leu-Ph’Gly, Nleu-CHA, Phe-CHA, Ph’Gly-CHA eller Ph’Gly,-CHT.

3. Tripeptidderivater ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at de er protoniseret med en mineralsyre, f.eks. saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre eller phosphorsyre, 20 eller en organisk syre, f.eks. myresyre, eddikesyre, propionsyre, trimethyleddikesyre, methoxyeddikesyre, halogenerede eddikesyrer såsom trichlor- eller trifluoreddikesyrer, aminoeddikesyre, mælkesyre, oxalsyre, malonsyre, citronsyre, benzoesyre, i kernen substituerede aromatiske syrer såsom toluensyrer, chlor- eller brombenzoesyrer, 25 methoxybenzoesyrer eller aminobenzoesyrer, eller phthalsyre.

4. Fremgangsmåde til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklasse E.C. 3.4.21., som spalter naturlige peptid kæder på carboxylsiden af arginin og lysin, i medier, som indeholder enzymerne, 30 kendetegnet ved, at mediet omsættes med et tripeptidde-rivat med formlen I eller et salt deraf ifølge krav 1 eller 2, og mængden af farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt R-Nl·^ dannet ved den hydrolytiske virkning af enzymet på tripeptidderivatet måles DK 155051 B ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescensspektrofotometriske eller elektrokemiske metoder.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der analyseres for organ- eller kir-5 telkallikreiner i humane legemsvæsker, f.eks. urin, bugspyt, tarmslimhinde, mælkekirtelsekretion, svedkirtelsekretion, sputum eller blod.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der analyseres for plasmin i blod eller 10 blodplasma.