DK149333B - Tripeptidderivater samt salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor i legemsvaeskerfra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter - Google Patents

Description

149333

Den foreliggende opfindelse angår tripeptidderivater samt salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombin-lignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor i legemsvæsker fra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter og i kirtelgifte fra koldblodede dyr ved fotonietriske, spektrofotome-triske eller fluorescensfotometriske metoder.

I tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.322.116 beskrives et syntetisk substrat, som er beregnet til kvantitativ bestemmelse af enzymer af gruppen E.c.3.4.2i., herunder thrombin og plasmin (enzymnomenklatur: "E.C." er forkortelsen for "International Union of Biochemistry"'s "Enzyme Committee"). Dette substrat har f.eks. en tripeptidkæde med formlen H - Phe - Val - Arg - OH, hvor den N-terminale aminosyre er blokeret med en acylgruppe, og den C-ter-minale aminosyre er substitueret med en chromogen eller fluorescerende gruppe, som fraspaltes under indvirkning af de nævnte enzymer.

Det herved dannede spaltningsprodukt kan bestemmes kvantitativt ved fotometri. På grundlag af den pr. tidsenhed frigjorte mængde chromogent spaltningsprodukt kan den enzymatiske aktivitet beregnes. Substratet kan også have andre tripeptidkæder. Således kan Phe f.eks. være erstattet med Ph.Gly, Tyr, 4-methoxy-Tyr eller 4-methy1-Phe, Val kan f.eks. være erstattet med Ile, Leu, nor-Val,

Ph.Gly eller Phe, og Arg kan f.eks. være erstattet med Lys, Homo-Arg eller Orn.

Det i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.322.116 beskrevne substrat indeholder i peptidkæden mindst to optisk aktive aminosyrefragmenter, som ved syntetisk opbygning af peptidkæden efter de i peptidkemien sædvanlige metoder har tilbøjelighed til at racemisere. Omfanget af denne racemisering er afhængig af de ved syntesen anvendte reaktionsbetingelser og varierer fra gang til gang, da det i praksis er udelukket altid at overholde nøjagtigt de samme reaktionsbetingelser. Dannelsen af ringe mængder af de tilsvarende D-aminosyrer fører til, at substratets evne til at kunne spaltes af enzymerne, især thrombin, er stærkt nedsat. Som L. Svendsen et al.

2 149333 [jfr. Thromb. Res. 1, 267 - 278 (1972)] har vist, nedsættes substratets spaltelighed med en faktor på 160, når L-phenylalanin erstattes med D-phenylalanin i tripeptidkæden. Allerede en racemiseringsgrad for den N-terminale aminosyre på kun 1% bevirker en reduktion i substratets spaltelighed på 1,6%. På grund af de dermed forbundne unøjagtigheder er dette kendte substrat uegnet til anvendelse i en standardiseret metode til enzymaktivitetsmåling.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes et substrat, som på den ene side spaltes i et større omfang pr. tidsenhed af enzymer af gruppen E.C.3.4.21. og på den anden side ikke udviser race-misering ved syntesen. Herved er dette hidtil ukendte substrat . egnet til anvendelse i en standardiseret metode til enzymaktivitetsmåling. Ved forhøjelsen af substratets spaltelighed er der endvidere opnået, at man ved enzymbestemmelsen kan klare sig med mindre prøvemængder af biologisk testmateriale, f.eks. blodprøver eller prøver af andre legemsvæsker. Dette er af praktisk betydning, da der ofte kun står meget ringe mængder prøvemateriale til rådighed, og da man ved udtagelsen af prøver, f.eks. blodprøver hos børn og ældre personer, lymfeprøver, vævsprøver osv., bestræber sig på at skåne disse mennesker så meget som muligt. Endvidere opnås en forenkling af teknikken ved den af sygehuspersonalet foretagne prøveudtagning og dermed en omkostningsbesparelse.

Opfindelsen bygger bl.a. på den erkendelse, at thrombin og thrombinlig-nende enzymer, f.eks. det fra slangegift fremstillede produkt Reptilase ®samt plasmin, spalter det frie a"A"-kædefragment fra humant fibrinogen under dannelse af hexadecapeptidet fibrinopeptid A og tripeptidet glycyl-prolyl-arginin [jfr. Birgit Hessel et al. FEBS LETTERS 18, nr. 2, side 318 - 32Q (1971)]. Heraf kan sluttes, at et tripeptid med nævnte struktur har en særlig susceptibilitet over for thrombin, thrombinlignende enzymer og plasmin. Man er endvidere gået ud fra den betragtning, at det af thrombin og thrombin-lignende enzymer fra a"A"-kædefragmentet fraspaltede tripeptid som N-terminal aminosyre indeholder det optisk inaktive glycin.

Denne aminosyre egner sig særlig godt til opbygning af peptidkæder, da den overhovedet ikke kan racemisere. Det nævnte tripeptid indeholder som midteraminosyre prolin, som ganske vist er optisk aktiv, men som på grund af den ejendommelighed i sin struktur, som består i, at det asymmetriske α-carbonatom via en propy- 3 U9333 lenbro er forbundet med α-aminogruppen til dannelse af en fem-ring, er stabiliseret således, at en racemisering kun kan finde sted under meget ekstreme betingelser, som ikke optræder ved de sædvanlige peptidsyntesemetoder.

Ved anvendelse af de i det ovennævnte tripeptid Gly-Pro-Arg indeholdte tre aminosyrer eller de i det strukturelt lignende tripeptid Gly-Pro-Lys indeholdte tre aminosyrer er det nu lykkedes at opbygge et syntetisk substrat, som fuldstændigt opfylder de ovenfor stillede krav.

Dette resultat var i sig selv overraskende, da man, som det fremgår af den videnskabelige litteratur, hidtil havde antaget, at et substrat nødvendigvis måtte indeholde en L-phenylalaningruppe i stilling 3 til en arginingruppe i stilling 1 i peptidkæden for at besidde maksimal susceptibilitet i forhold til thrombin [jfr.

L. Svendsen et al., Thrombosis Research .1, 276 (1972)J, Denne teori er underbygget af den kendsgerning, at fibri-nopeptid A af thrombin fraspaltes meget hurtigere fra humanfibri-nogen end tripeptidet Gly-Pro-Arg. Fibrinopeptid A indeholder en L-phenylalaningruppe i stilling 9 til arginingruppen i stilling 1.

Da imidlertid fibrinopeptid Α» som det almindeligt antages, danner en α-helix, er afstanden mellem L-phenylalaningruppen og arginingruppen praktisk taget den samme som i en strakt tripeptidkæde, som indeholder L-phenylalaningruppen i stilling 3 til arginingruppen i stilling 1 [jfr. Blombåck et al., Scand.J.Clin.Lab.Invest.

24, Suppl. 107, 59 (1969)].

Opfindelsen angår således tripeptidderivater samt salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor i legemsvæsker fra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter og i kirtelgifte fra koldblodede dyr ved fotometriske, spektrofotometriske eller fluorescensfotometriske metoder, hvilke tripeptidderivater er ejendommelige ved, at de har den almene formel I

R1 - Gly - Pro - X - NH - R2 I

4 149333 hvor R·*· betegner hydrogen eller en alkanoylgruppe med 2-8 car- bonatomer, en phenylalkanoylgruppe med 2-3 carbonatomer i alkanoyl- delen, en cyclohexylcarbonylgruppe, en alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer i alkoxydelen, en benzyloxycarbonylgruppe, en alkansulfonylgruppe med 1-2 carbonatomer eller en benzen-, 2 p-toluen- eller 2-naphthalensulfonylgruppe, R betegner en p-ni-trophenyl-, 2-naphthyl- eller 4-methoxy-2-naphthylgruppe, og X betegner en arginyl- eller lysylgruppe.

Saltene kan være salte med sådanne mineralsyrer som HCl, HBr, H2S04 eller HgPO^, eller med sådanne organiske syrer som myresyre, oxalsyre eller vinsyre.

Som substrater til anvendelse ved bestemmelse af proteolytiske enzymer kendes ganske vist fra svensk fremlæggelsesskrift nr. 4Q1.738 peptider indeholdende prolin bundet til arginin, der på sin side er bundet til en chromofor aromatisk amin, ligesom der fra Journal of Organic Chemistry 3_0 (1965) , 1781-1785, Archives of Biochemistry and Biophysics 108 (1964) 266-274, Chemical Abstracts 6£ (1968) 9270v saint de svenske fremlæggelsesskrifter nr. 380.257, 380.258 og 401.738 kendes peptider indeholdende glycin bundet til arginin eller lysin via en anden aminosyre, hvorhos argininet eller lysi-net er bundet til en chromofor aromatisk amin til anvendelse ved bestemmelse af proteolytiske enzymer. Tripeptiderivaterne ifølge opfindelsen, der skal anvendes som substrater til bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer samt plasmin og plasminlignende enzymer, adskiller sig imidlertid fra de kendte peptider ved, at de indeholder såvel glycin som prolin. Deres specielle egnethed til deres anvendelsesformål var ikke forventelig på baggrund af den kendte teknik, som enten viser, at peptider af den pågældende art kan anvendes til bestemmelse af trypsin (dette gælder Journal of Organic Chemistry 30 (1965), 1781-1785, Archives of Biochemistry and Biophysics 108 (1964), 266-274 og svensk fremlæggelsesskrift nr. 401.738), eller at visse peptider nok kan anvendes til bestemmelse af thrombin eller plasmin, men at de udviser en langt ringere følsomhed end tripeptiderne ifølge opfindélsen. Således er fx de substrater, der nævnes i publikationen Chemical Abstracts J59 (1968) 9270v ca. 50 gange mindre følsomme over for thrombins og plasmins proteolytiske virkning end tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen, ligesom de substrater, der er beskrevet i svensk 149333 5 fremlæggelsesskrift nr. 380.258, har thrombin- og plasminaktivi-teter, der er flere gange lavere end aktiviteterne hos tripep-tidderivaterne ifølge opfindelsen. Det ovennævnte svenske fremlæggelsesskrift nr. 380.257 svarer til det tidligere ovenfor omtalte tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.322.116; den overlegenhed, som tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen udviser i forhold til de substrater, der er beskrevet i dette fremlæggelsesskrift, fremgår af de sammenligningsforsøg, der er anført i nærværende beskrivelses eksperimentelle del.

Særlig foretrukne tripeptidderivater ifølge opfindelsen, især til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, er sådanne, i hvilke R1 betegner en alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatoraer, en benzyloxycarbonyl- gruppe eller en benzen-, p-toluen- eller 2-naphthalensulfonyl-2 gruppe, R betegner en p-nitrophenyl-, eller 2-naphthylgruppe, og X betegner en arginylgruppe.

Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af de ovenfor definerede tripeptidderivater eller saltene deraf som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, eca-rinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor, specielt de i krav 2 angivne tripeptidderivater som substratet til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, i legemsvæsker fra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter og i kirtelgifte fra koldblodede dyr.

Fremstillingen af tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen kan ske efter forskellige i og for sig kendte metoder.

2 1. Ved den første metode hænges de chromofore grupper (R i formel I) på den C-terminale aminosyregruppe. Disse grupper virker samtidig som C-terminale carboxylbeskyttelsesgrupper under den trinvise sammenknytning af aminosyrerne ved opbygningen af den ønskede peptidkæde. De øvrige beskyttelsesgrupper fraspaltes selektivt fra slutproduktet, uden at den chromofore gruppe påvirkes. Denne metode er f.eks. beskrevet i "Peptide Synthesis" af Miklos Bodanszki et al., Interscience Publishers, 1966, side 163 - 165.

6 149333 2. Ved den anden metode kobles den chromofore gruppe til det færdigt opbyggede peptidskelet, efter at man først har fraspaltet de øvrige beskyttelsesgrupper. Den C-terminale carboxylgruppe frigøres i dette tilfælde ved racemiseringsfri enzymatisk esterspaltning. De til dette formål anvendte esterspaltende enzymer kan enten være frie eller bundne til en matrix.

Til beskyttelse af Na-aminogrupperne under den trinvise opbygning af peptidkæderne kan anvendes de sædvanlige selektivt fraspaltelige aminobeskyttelsesgrupper. Disse er først og fremmest: Cbo, MeOCbo, N02Cbo, MCbo, BOC, TFA eller formyl. α-Carboxylgruppen i amino-syrerne kan gøres reaktionsdygtig efter forskellige kendte metoder, f.eks. ved fremstilling af p-nitrophenylesterderivaterne, trichlor-phenylesterderivaterne, pentachlorphenylesterderivaterne eller N-hy-droxysuccinimidesterderivaterne og isolering af disse derivater, eller ved fremstilling in situ af syreaziderne eller syreanhydrider-ne, som kan være enten symmetriske eller asymmetriske.

Aktiveringen af carboxylgruppen kan også ske ved hjælp af et carbo-diimid, f.eks. N,N'-dicyclohexylcarbodiimid.

Den C-terminale carboxylgruppe i peptidderivaterne kan under den trinvise opbygning af den Ønskede peptidkæde beskyttes af enten den chromofore amidgruppe eller af en methyl-, ethyl- eller isopropylestergruppe. De øvrige frie reaktionsdygtige grupper, som ikke tager del i opbygningen af peptidkæden, kan blokeres ved følgende specifikke foranstaltninger: δ-Guanidinogruppen i arginin beskyttes med N02,

Tos eller ved simpel protonisering, medens ε-aminogruppen i lysin beskyttes med Cbo, BOC eller Tos.

Ved syntesen af tripeptidkæden kan man først forsyne den N-terminale aminosyre med blokeringsgruppen (acyl- eller sulfonylgruppe), derefter aktivere den blokerede aminosyres carboxylgruppe og til sidst knytte det på denne måde vundne aktiverede aminosyrederivat til det til fuldstændiggørelse af peptidkæden nødvendige dipep-tidderivat.

Fremstillingen af tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen efter de ovenfor nævnte metoder er udførligere beskrevet i de følgende eksempler.

7 149333

Analysen af de ifølge eksemplerne fremstillede eluater og produkter er udført ved tyndtlagschromatografi, Til dette formål anvendes glasplader, som er overtrukket med siliciumdioxidgel F 254 (Merck).

Til udvikling af tyndtlagschromatogrammerne anvendes følgende opløsningsmiddelsystemer : A Chloroform/methanol (9:1) B n-propanol/eddikesyreethylester/vand i 7:1s 2) C n-butanol/eddikesyre/vand (3:1:1).

Chromatogrammerne udvikles først i UV-lys og derefter ved reaktion raéd chlor/toluidin (jfr. G. Pataki, "Dunnschichtchromatographie in der Aminosåure- und Peptidchemie", Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, side 125).

I den foreliggende beskrivelse med krav anvendes følgende forkortelser:

Arg = L-arginin

Gly = glycin

Lys = lysin

Pro = L-prolin

Ac = acetyl

AcOH = eddikesyre BOC = tert.butoxycarboxyl

Bz = benzoyl

Bzl = benzyl

Bz20 = benzoesyreanhydrid

Cbo = carbobenzoxy DMF = dimethylformamid DSC = tyndtlagschromatogram

Et3N = triethylamin HMPTA = Ν,Ν,Ν* ,N‘ ,N" ,Ν''-hexamethylphosphor- syretriamid LMS = opløsningsmiddelsystem

MeOH = methanol UA = naphthylamid OMe = methoxy

OpNP = p-nitrophenoxy pUA = p-nitroanilid 8 149333 2-ΝΑ = 2-naphthylamid

Smp. = smeltepunkt THF - tetrahydrofuran

Tos = p-toluensulfonyl.

Eksempel 1.

I. Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA·HCl. la. Cbo-Arg-pNAHCl· I en trehalset rundkolbe, der rummer 250 ml, opløses 16,0 g (47,0 miliimol) over P205 i vakuum tørret Cbo-Arg-OH.HCl i 90 ml absolut HMPTA under fugtighedsudelukkelse ved 20°C. Ved stuetemperatur sættes der til den resulterende opløsning portionsvis først en opløsning af 4,74 g (4-7,0 millimol) Et^N i 10 ml HMPTA og derefter 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenylisocyanat (100%'s overskud).

Efter en reaktionstid på 24 timer ved 20°C afdestilleres størstedelen af HMPTA i vakuum. Remanensen ekstraheres flere gange med 30%'s AcOH. Remanensen kasseres. De forenede eddikesyreekstrakter sættes til en yderligere rensning på en med 30%'s AcOH ækvilibre-ret "Sephadex G-15"-søjle og elueres med 30%'s AcOH. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres. Der fås 12,6 g af et amorft pulver, som i henhold til DSC i LMS C er ensartet.

Analyse:

Beregnet for C20H25N6°5C1: C 51,67 H 5,42 N 18,08 Cl 7,63

Fundet : c 51,29 H 5,48 N 17,92 Cl 7,50.

149333 9 I. Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl.

Under udelukkelse af fugtighed behandles 4,65 g (10 millimol) af forbindelsen la med 40 ml 2N HBr i iseddike i 1 time vinder omrøring ved 20°C. Peptidderivatet opløses herved under CC^-udvikling. Reaktionsopløsningen dryppes under intensiv omrøring til 250 ml absolut ether, hvorved der udfældes (2 HBr)H-Arg-pNA. Etherfasen fraskilles ved sugefiltrering, hvorpå den faste fase yderligere vaskes fire gange med hver gang 100 ml absolut ether til fjernelse af det som biprodukt dannede benzylbromid samt overskud af HBr og AcOH. Ved tørring i vakuum over NaOH-tabletter fås det afblokerede produkt i kvantitativt udbytte. Det tørre (2 HBr)·H-Arg-pNA opløses i 25 ml DMF. Til den til -10°C afkølede opløsning sættes 1,40 ml (10 millimol) Et^N.

Der dannes et bundfald af Et^N-HBr, som frafiltreres og vaskes med en ringe mængde koldt DMF. Til filtratet sættes 4,70 g (11 millimol) Cbo-Gly-Pro-OpNP ved -10°C. Efter nogle timers forløb er reaktionsopløsningens temperatur steget til 20°C. Opløsningen afkøles igen til -10°C og pufres med 0,35 ml (2,5 millimol) Et^N. Efter yderligere 16 timer tilsættes der igen 0,35 ml Et^N ved -10°C.

Efter yderligere 24 timer inddampes reaktionsopløsningen i vakuum ved 40°C til tørhed. Remanensen opløses i 50 ml MeOH. Efter tilsætning af 0,8 ml (10 millimol) koncentreret saltsyre inddampes opløsningen i vakuum ved 20°C til tørhed. Denne operation gentages tre gange til omdannelse af tripeptidhydrobromidet til hydrochloridet. Det rå tripeptidhydrochlorid opløses i 50 ml MeOH og forrenses ved gelfiltrering over en med MeOH ækvilibreret søjle af "Sephadex LH-20". Til yderligere rensning inddampes den fraktion af MeOH-eluatet, som ved trypsinbehandling kan spaltes under frigørelse af p-nitroani-lin, i vakuum. Remanensen opløses i 30%'s AcOH. Opløsningen renses ved gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret søjle af "Sephadex G-15". Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 0,80 ml (10 millimol) koncentreret HC1. Der fås 3,64 g (58,8% af det teoretiske) af et amorft let pulver, som i henhold til DSC i LMS C er ensartet.

Analyse:

Beregnet for C27H35N8°7Cl! C 52,38 H 5,70 N 18,10 Cl 5,73

Fundet : C 52,09 H 5,83 N 18,33 Cl 5,75.

ίο 149333

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

Eksempel 2.

II. H-Gly-Pro-Arg-pNA.2HC1.

61,91 g (0,1 mol) af den ifølge eksempel 1 fremstillede forbindelse I behandles under udelukkelse af fugtighed med 300 ml 3N HC1 i iseddike under omrøring i 2 timer ved 35°C. Peptidderivatet opløses herved under CC^-udvikling. Reaktionsopløsningen dryppes under intensiv omrøring til 2 liter absolut ether, hvorved der fremkommer et fnugagtigt bundfald af H-Gly-Pro-Arg-pNA.2HC1. Etherfasen fraskilles ved sugefiltrering, hvorpå den faste fase vaskes yderligere fire gange med hver gang 0,5 liter absolut ether til fjernelse af det som spaltningsprodukt dannede benzylchlorid samt overskud af HC1 og AcOH. Ved tørring i vakuum over NaOH-tabletter fås det afblokerede produkt i kvantitativt udbytte. Til yderligere rensning opløses det tørrede produkt i 900 ml 30%'s AcOH. Opløsningen renses ved gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Herved opdeles AcOH-eluatet i to fraktioner, som begge kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-ni-troanilin. Hovedfraktionen indeholder det ønskede produkt, og sidefraktionen indeholder det anvendte udgangsmateriale. Efter tilsætning af 8 ml (0,1 mol) koncentreret HC1 til hovedfraktionen fryse-tørres denne. Der fås 43,5 g (83,4% af det teoretiske) af et amorft pulver, som ved DSC i LMS C er ensartet.

Analyse:

Beregnet for cigH3oN8°5C^2: c 43,77 H 5,80 N 21,49 Cl 13,60

Fundet : C 43,38 H 5,88 Ν'21,72 Cl 13,41.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,95 - Gly: 1,00 - Pro: 0,94.

Eksempel 3.

III. Na-2-Phenylacetyl-Gly-Pro-Arg-pNA*HC1.

149333 11 2.09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) EtgN og straks derefter 1,13 g (4,4 millimol) phenyleddikesyre-p-nitrophenyl-ester (smeltepunkt 61,5 - 62°C). Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G15"-sØjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som ved trypsinbehand-ling kan spaltes under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 1,99 g (82,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C^H-^NgOgCl: C 53,77 H 5,85 N 18,58 Cl 5,88

Fundet : C 54,06 H 5,78 N 18,83 Cl 5,79.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,99 - Gly: 1,00 - Pro: 0,97,

Eksempel 4.

IV. Na-3-Phenylpropionyl-Gly-Pro-Arg-pNA*HCl.

2.09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) EtgN og straks derefter 1,19 g (4,4 millimol) 3-phenylpropionsyre-p-nitrophenyl-ester (smeltepunkt 97 - 98,5°C). Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetør-res efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HCl.

Udbytte: 2,06 g (83,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C28H37Ng06Cl: C 54,50 H 6,04 N 18,16 Cl 5,75

Fundet : C 54,25 H 5,98 N 18,29 Cl 5,63.

12 149333

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,02 - Gly: 1,00 - Pro: 0,98.

Eksempel 5.

V. Na-Cyclohexylcarbony1-Gly-Pro-Arg-pNA·HC1.

2.09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) EtgN og straks derefter 1,10 g (4,4 millimol) cyclohexyl-carbonyl-p-nitrophenyl-ester (smeltepunkt 49 - 50°C). Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 1,87 g (78,6% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for c26H39N806Cl: C 52,47 H 6,61 N 18,83 Cl 5,96

Fundet : C 52,70 H 6,72 N 19,03 Cl 5,83.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,96 - Gly: 1,0 - Pro: 0,96.

Eksempel 6.

VI. Na-Capryloyl-Gly-Pro-Arg-pNA*HCl.

2.09 g ( 4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) Et^N og straks derefter 1,17 g (4,4 millimol) caprylsyre-p-nitrophenyl-ester. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

149333 13

Rensnings Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin/ frysetørres efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HC1. Udbyttes 1/99 g (81/4% af det teoretiske) af et amorft pulver/ som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyses

Beregnet for C^H^NgOgCls C 53,06 H 7,09 N 18,34 Cl 5,80

Fundet s C 52,84 H 7,15 N 18,58 Cl 5,73.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forholds Args 0,95 - Glys 1,00 - Pros 0,99.

Eksempel 7.

VII. Na-Tos-Gly-Pro-Arg-pNAHC1.

2,09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) Et^N og straks derefter 840 mg (4,4 millimol) p-tolu-ensulfonsyrechlorid (tosylchlorid) (smeltepunkt 67 - 69°C). Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensnings Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HC1. Udbyttes 2,17 g (84,9% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyses

Beregnet for ^gHggNgO^SCl: C 48,86 H 5,52 N 17,53 S 5,02 Cl 5,55

Fundet s C 48,50 H 5,61 N 17,73 S 5,19 Cl 5,49.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forholds Args 0,99 - Glys 1,00 - Pros 0,93.

14 149333

Eksempel δ.

VIII. Na-Benzensulfonyl-Gly-Pro-Arg-pNA*HCl.

2.09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) Et3N og straks derefter 780 mg {4,42 millimol) benzen-sulfonsyrechlorid (smeltepunkt 16 - 17°C). Reaktionsproduktet vide-rebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 pi (4 millimol) koncentreret HCl. Udbytte: 1,95 g (78,0% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C25H33Ng07SCl: C 48,03 H 5,32 N 17,93 S 5,13 Cl 5,67

Fundet : C 47,79 H 5,40 N 18,11 S 5,06 Cl 5,61.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,01 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

Eksempel 9.

IX. Na-Methansulfony1-Gly-Pro-Arg-pNAHCl.

2.09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) EtgN og straks derefter 345 μΐ (4,44 millimol) methan-sulfonsyrechlorid. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HCl. Udbytte: 149333 15 1,70 g [75,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C2QH.j-1NgO.7SCl: C 42,66 H 5,55 N 19,90 S 5,70 Cl 6,30

Fundet : C 42,88 H 5,63 N 20,08 S 5,62 Cl 6,21.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,99 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

Eksempel 10.

X. Na-2-Naphthalensulfonyl-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl.

2,09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 yl.

(4 millimol) EtgN og straks derefter 1,0 g (4,41 millimol) naphtha-len-2-sulfonsyrechlorid (smeltepunkt 74 - 76°C). Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 jal (4 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 1,81 g (66,8% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C29H35Ng07SCl: C 51,59 H 5,23 N 16,60 S 4,75 Cl 5,25

Fundet : C 51,88 H 5,19 N 16,75 S 4,62 Cl 5,12.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,02 - Gly: 1,00 - Pro: 0,98.

Eksempel 11.

XI. Na-Isobutyloxycarbohyl-Gly-Pro-Arg-pNA·HC1.

16 149333 2,09 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 2 fremstillede forbindelse II opløses i 25 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 555 μΐ (4 millimol) Et^N og straks derefter 650 pi (5,0 millimol) chlor-myresyre-isobutylester. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 pi (4 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 1,71 g (73,1% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for: C24H37N807C1: C 49,27 H 6,37 N 19,15 Cl 6,06

Fundet : C 49,06 H 6,42 N 19,33 Cl 5,98.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,01 - Gly: 1,00 - Pro: 0,94.

Eksempel 12.

XII. Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-2-NA* HC1.

Xlla. Na-Cbo-Arg(N02)-2-NA.

3,53 g (10 millimol) godt tørret Cbo-Arg(N02)-OH opløses i 150 ml THF:DMF (3:1) under udelukkelse af fugtighed. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 1,39 ml (10 millimol) Et^N, og derefter tildryppes i løbet af 15 minutter en opløsning af 1,35 g (10 millimol) chlormyresyre-isobutylester i 20 ml THF, idet temperaturen holdes mellem -10°C og -5°C. Til den resulterende opløsning dryppes derefter en opløsning af 1,72 g (12 millimol) β-naphthylamin i 15 ml THF, idet den ovennævnte temperatur overholdes. Reaktionsblandingen henstår i 24 timer ved stuetemperatur. Efter afdestillation af opløsningsmidlet i vakuum digereres remanensen tre gange med destilleret vand, tre gange med 5%'s NaHCO^-opløsning og tre gange med destilleret vand i den anførte rækkefølge. Efter tørring i vakuum opløses råproduktet i MeOH og chromatograferes gennem en med 149333 17

MeOH ækvilibreret søjle af "Sephadex LH-20", Af en fraktion af eluatet fås 3,75 g af den krystallinske forbindelse Xlla (78,4% af det teoretiske) med smeltepunkt 173 - 174,5°C, hvilken forbindelse er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse!

Beregnet for C24**26N6®5: ^ H 5,48 N 16,72

Fundet : C 60,82 H 5,63 N 17,48.

XIIb. H-Arg-2-NA·HC1.

957 mg (2 millimol) af forbindelsen Xlla indvejes i reaktionsbeholderen i et Sakakibara-apparat. 15 ml tørret hydrogenfluoridgas kondenseres i reaktionsbeholderen. Efter en reaktionstid på 1 time ved 0°C fraspaltes under omrøring arginin-nitrobeskyttelsesgruppen samt carbobenzoxygruppen. Den kondenserede hydrogenfluoridgas af-destilleres i vakuum fra reaktionsblandingen, og remanensen opløses i DMF. Til omdannelse af aminosyrederivatet til HCl-saltet tilsættes 0,5 ml (ca. 6 millimol) koncentreret HC1, og opløsningen inddampes til tørhed. Efter to ganges gentagelse af denne procedure opløses remanensen i 50 ml 40%'s AcOH. Til rensning sættes AcOH-op-løsningen på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle og elueres med 30%'s AcOH. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 320 pi (4 millimol) koncentreret HC1. Odbytte: 473 mg (63,5% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C16H23N50C12: C 51,62 H 6,23 N 18,81 Cl 19,05

Fundet : C 51,82 H 6,18 N 17,08 Cl 18,75.

XII. Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-2-NA.HCl.

372 mg (1 millimol) af forbindelsen Xllb omsættes som beskrevet i eksempel 1 med 470 mg (1,1 millimol) Cbo-Gly-Pro-OpNP til dannelse af forbindelsen XII. Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, 18 149333 som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af Ø-naphthyl-amin, frysetørres efter tilsætning af 80 μΐ (1 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 425 mg (68,1% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C31H3gN705Cl: C 59,65 H 6,14 N 15,71 Cl 5,68

Fundet : C 60,11 H 6,25 N 16,07 Cl 5,59.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,98 - Gly: 1,00 - Pro: 0,97.

Eksempel 13.

XIII. Na-Tos-Gly-Pro-Arg-2-NA.HC1.

625 mg (1 millimol) af forbindelsen XII (eksempel 12) deblokeres som beskrevet i eksempel 2 og opløses i 8 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 140 μΐ (1 millimol) Et3N og straks derefter 210 mg (1,1 millimol) p-toluensulfonsyrechlorid (smeltepunkt 67 - 69°C). Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af β-naphthylarain, frysetørres efter tilsætning af 80 μΐ (1 millimol) koncentreret HC1.

Udbytte: 500 mg (77,6% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C3()H38N705SC1: C 55,93 H 5,95 N 15,22 S 4,98 Cl 5,50

Fundet : C 56,13 H 5,86 N 15,48 S 5,07 Cl 5,39.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,95 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

U9333 19

Eksempel 14.

XIV. Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-4-MeO-2-NA.HCl.

XIVa. Na-Cbo-Arg(N02)-4-MeO-2-NA.

3,53 g (10 millimol) Cbo-Arg(N02)-OH omsættes som beskrevet i eksempel 12, afsnit Xlla, med 2,17 g (12,5 millimol) 4-raethoxy-2--naphthylamin, hvorefter der oparbejdes . Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"-søjle. Fra en fraktion af eluatet fås 3,35 g (65,9% af det teoretiske) af den delvis krystallinske forbindelse XIVa, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for C25H28N6°6! c 59,05 H 5,55 N 16,23 Fundet : C 59,18 H 5,43 N 16,49.

XlVb. H-Arg-4-MeO-2-NA.2HC1.

1,02 g (2 millimol) af forbindelsen XIVa omsættes som beskrevet i eksempel 12, afsnit Xllb, til dannelse af forbindelsen XlVb.

Rensning:. Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex Gl-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthyl-amin, frysetørres efter tilsætning af 320 μΐ (4 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 570 mg (71,0% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C17H24N502C12: C 50,88 H 6,03 N 17,45 Cl 17,67

Fundet : C 51,08 H 5,98 N 17,75 Cl 17,55.

XIV. Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-4-MeO-2-NA.HC1.

402 mg (1 millimol) af forbindelsen XlVb omsættes som beskrevet i eksempel 1, afsnit I, med 470 mg (1,1 millimol) Cbo-Gly-Pro-OpNP til dannelse af forbindelsen XIV. Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse 20 149333 af 4-methoxy-2-naphthylamin, frysetørres efter tilsætning af 80 μΐ (1 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 493 mg (75,4% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C32H40N7°6C1: C 58,75 H 6,16 N 14,99 Cl 5,42

Fundet : C 59,01 H 6,10 N 15,19 Cl 5,35.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 1,02 - Gly: 1,00 - Pro: 0,95.

Eksempel 15.

XV. Na-Tos-Gly-Pro-Arg-4-MeO-2-NA.HC1.

655 mg (1 millimol) af den ifølge eksempel 14 fremstillede forbindelse XIV deblokeres som beskrevet i eksempel 2 og opløses i 8 ml DMF. Efter afkøling til -10°C tilsættes 140 ml (1 millimol) Et^N og straks derefter 210 mg (1,1 millimol) p-toluensulfonsyrechlorid. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1.

Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sepha-dex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthylamin, rfrysetørres efter tilsætning af 80 μΐ (1 millimol) koncentreret HCl. Udbytte: 465 mg (69,0% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C^jH^øN^OgSCl: C 55,22 H 5,98 N 14,54 S 4,76 Cl 5,26

Fundet : C 55,75 H 6,01 N 14,89 S 4,59 Cl 5,16.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Arg: 0,98 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

Eksempel 16.

XVI. Na-Tos-Gly-Pro-Lys-pNA-HCl· XVIa. Na-B0C-Ne-CbO-Lys-pNA.

149333 21 19,0 g (50 millimol) af forbindelsen Na-BOC-Ne-Cbo-Lys-OH opløses som beskrevet i eksempel 1, afsnit la, i 100 ml HMPTA, og der tilsættes 5,06 g (50 millimol) Et^N og derefter 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenylisocyanat. Efter 24 timers reaktionstid dryppes reaktionsopløsningen under omrøring til 1 liter 2%'s NaHCO^-opløsning.

Det udfældede produkt frafiltreres og vaskes tre gange med hver gang 0,5 liter 2%'s NaHCO^-opløsning, tre gange med hver gang 0,5 liter destilleret vand, tre gange med hver gang 0,5 liter 0,5N HC1 og til slut tre gange med hver gang 0,5 liter destilleret vand. Det på denne måde vundne produkt tørres i vakuum ved 40°C og ekstra-heres derefter to gange med hver gang 30 ml til 70°C opvarmet DMF, hvorved det ønskede produkt fuldstændigt går i opløsning, medens biproduktet, Ν,Ν'-bis-p-nitrophenylurinstof, forbliver tilbage i uopløst tilstand. DMF-Opløsningen inddampes i vakuum ved 40°C. Remanensen opløses i MeOH, og ved gelfiltrering over en med MeOH ækvilibreret søjle af "Sephadex LH-20" fås 18,85 g (75,3% af det teoretiske) af den krystallinske forbindelse XVIa med smeltepunkt 125 - 125,5°C, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for ^25^32^4^7: C 59,99 H 6,44 N 11,19 Fundet : C 60,49 H 6,35 N 11,48.

XVIb. Na-Tos-Gly-Pro-Lys-(ε-Cbo)-pNA.

1,5 g (3 millimol) af forbindelsen XVIa behandles under udelukkelse af fugtighed og under omrøring i 1 time ved 20°C med 20 ml trifluor-eddikesyre, hvorved aminosyrederivatet opløses under C02-udvikling. Reaktionsopløsningen dryppes under intensiv omrøring langsomt til 150 ml tørret ether, hvorved der udfælder Η-Lys(e-Cbo)-pNA.tri-fluoracetat. Etherfasen frasuges med en filterstav. Det tilbageblivende bundfald Vaskes fire gange med hver gang 50 ml tør ether til fjernelse af overskud af trifluoreddikesyre. Ved tørring i vakuum over NaOH-tabletter fås det afblokerede produkt i kvantitativt udbytte. Det tørre aminosyrederivat-trifluoracetatsalt opløses i 15 ml DMF. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 415 ul (3 millimol) EtgN til frigørelse af aminosyrederivatet fra trifluor-acetatet. Til reaktionsblandingen sættes 1,48 g (3,31 millimol) Tos-Gly-Pro-OpNP. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1, afsnit I. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvi- 22 149333 libreret "Sephadex LH-20"-søjle. Udbytte: 1,77 g (83,2% af det teoretiske) af et amorft stof, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for C34H4oN6°9S: C 57,61 H 5,69 N 11,86 S 4,52

Fundet : C 57,95 H 5,59 N 12,27 S 4,49.

XVI. Na-Tos-Gly-Pro-Lys-pNA«HCl.

1,42 g (2 millimol) af forbindelsen XVIb deblokeres som beskrevet i eksempel 2. Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvi-libreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres efter tilsætning af 160 yl (2 millimol) koncentreret HC1. Udbytte: 1040 mg (85,1% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for ^gH^gNgO^SCl: C 51,10 H 5,77 N 13,75 S 5,25 Cl 5,80

Fundet : C 50,76 H 5,68 N 13,98 S 5,19 Cl 5,68.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Lys: 0,99 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

Eksempel 17.

XVII. Na-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys-pNA·HC1.

XVIIa. Na-BOC-Gly-Pro-Lys(ε-Cbo)-pNA.

2,0 g (4 millimol) af den ifølge eksempel 16 fremstillede forbindelse XVIa deblokeres som beskrevet i eksempel 16, afsnit XVIb, og opløses i 20 ml DMF. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 555 yl (4 millimol) Et-jN og straks derefter 1,73 g (4,40 millimol) BOC-Gly--Pro-OpNP. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1, afsnit I. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"-søjle. Udbytte: 2,20 g (84,0% af det teoretiske) af en amorf substans, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

U9333 23

Analyse:

Beregnet for C32H42N6°9: c 58»70 H 6f47 N 12,84 Pundet : C 59,03 H 6,46 N 12,89.

XVIlb. Na-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys(ε-Cbo)-pNA.

1,31 g (2 millimol) af forbindelsen XVIIa deblokeres som beskrevet i eksempel 16, afsnit XVIb, og opløses i 12 ml DMF. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 280 yl (2 millimol) Et^N og straks derefter 285 yl (2,2 millimol) chlormyresyre-isobutylester. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1, afsnit I. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"--søjle. Udbytte: 1,15 g (87,8% af det teoretiske) af et amorft stof, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for C32H42N609: C 58,70 H 6,47 N 12,84

Fundet : C 58,01 H 6,40 N 12,99. · XVII. Na-Isobutoxycarbony1-Gly-Pro-Lys-pNA·HCl.

660 mg (1 millimol) af forbindelsen XVIIb deblokeres som beskrevet i eksempel 2. Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH aekvi-libreret "Sephadex G-15"-søjle, Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af p-nitroani-lin, frysetørres efter tilsætning af 80 yl (1 millimol) koncentreret HCl. Udbytte: 430 mg (77,2% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C26H33N6°6C1: C 51,75 H 6,70 N 15,09 Cl 6,36

Fundet : C 52,04 H 6,82 N 15,30 Cl 6,18.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Lys: 0,93 - Gly: 1,00 - Pro: 0,96.

Eksempel 18.

XVIII. Na-Tos-Gly-Pro-Lys-2-NAHCl.

XVUla. Na-BOC-Ne-Cbo-Lys-2-NA.

24 149333 1,90 g (5 millimol) af forbindelsen Na-BOC-Ns-Cbo-Lys-OH omsættes som beskrevet i eksempel 12, afsnit Xlla, til dannelse af forbindelsen XVIIIa. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibre-ret "Sephadex LH-20"-søjle. Udbytte: 1,60 g (63,3% af det teoretiske) af en amorf forbindelse, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse: .

Beregnet for C29H35N3°5: C 68,89 H 6,98 N 8,32 Fundet : C 68,08 H 7,03 N 8,59, XVIIIb. Na-Tos-Gly-Pro-Lys(ε-Cbo)-2-NA.

1,05 g (2 millimol) af forbindelsen XVIIIa deblokeres som beskrevet i eksempel 16, afsnit XVIb, og opløses i 20 ml DMF. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 280 yl (2 millimol) Et3N og straks derefter 985 mg (2,21 millimol) Tos-Gly-Pro-OpNP. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1, afsnit I. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"-søjle. Udbytte: 1,11 g (77,7% af det teoretiske) af et amorft stof, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for C^gH^N^O^S: C 63,94 H 6,07 N 9,81 S 4,49

Fundet : C 64,30 H 5,98 N 10,18 S 4,35.

XVIII. Na-Tos-Gly-Pro-Lys-2-NA·HC1.

715 mg (1 millimol) af forbindelsen XVIIIb deblokeres som beskrevet i eksempel 2. Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvilibreret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af 2-naphthyl-amin, frysetørres efter tilsætning af 80 μΐ (1 millimol) koncentreret HCl. Udbytte 470 mg (76,3% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C^H^NgOgSCl: C 58,48 H 6,22 N 11,37 S 5,20 Cl 5,75

Fundet : C 58,11 H 6,15 N 11,79 S 5,13 Cl 5,63.

149333 25

Arainosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forholdi Lys: 0,94 - Gly: 1,00 - Pro: 0,98.

Eksempel 19.

XIX. NTos-Gly-Pro-Lys-4-MeO-2-NA.HCl·

XlXa. Na-BOC-N ε-Cbo-Lys-4-MeO-2-NA.

1,90 g (5 millimol) af forbindelsen Na-BOC-N£-Cbo-Lys-OH omsættes som beskrevet i eksempel 12, afsnit Xlla, med 1,22 g (7 millimol) 4-methoxy-2-naphthylamin. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"-søjle. Udbytte: 1,82 g (68,0% af det teoretiske) af en amorf forbindelse, som er ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for C30H37N3O6: C 67,27 H 6,96 N 7,85 Fundet : C 68,05 H 8,83 N 9,10,

XlXb. Na-Tos-Gly-Pro-Lys(ε-Cbo)-4-MeO-2-NA.

1,07 g (2 millimol) af forbindelsen XlXa deblokeres som beskrevet i eksempel 16, afsnit XVIb, og opløses i 20 ml DMF. Efter afkøling til -10°C sættes til opløsningen 280 .yl (2 millimol) Et3N og straks derefter 985 mg (2,21 millimol) Tos-Gly-Pro-OpNP. Reaktionsproduktet viderebehandles som beskrevet i eksempel 1, afsnit I. Rensning: Gelfiltrering på en med MeOH ækvilibreret "Sephadex LH-20"-søjle. Udbytte: 895 mg (60,2% af det teoretiske) af et amorft stof, som er. ensartet ved DSC i LMS A og LMS B.

Analyse:

Beregnet for C39H45N5°gS: C 62,97 H 6,10 N. 9,42 S 4,31

Fundet : C 63,62 H 6,02 N 9,88 S 4,21, XIX. N0-Tos-Gly-Pro-Lys-4-MeO-2-Na.HCl.

745 mg (1 millimol) af forbindelsen XlXb deblokeres som beskrevet i eksempel 2. Rensning: Gelfiltrering på en med 30%'s AcOH ækvili- 26 149333 breret "Sephadex G-15"-søjle. Den fraktion af AcOH-eluatet, som kan spaltes ved trypsinbehandling under frigørelse af 4-methoxy--2-naphthylamin, frysetørres efter tilsætning af 80 yl (1 millimol) koncentreret HC1. Udbyttes 470 mg (72,7% af det teoretiske) af et amorft pulver, som er ensartet ved DSC i LMS C.

Analyse:

Beregnet for C3iH40N5°6SC1: C 57,62 H 6,24 N 10,84 S 4,96 Cl 5,49

Fundet : C 57,95 H 6,31 N 11,09 S 4,88 Cl 5,41.

Aminosyreanalysen giver de ventelige aminosyrer i det rigtige forhold: Lys: 1,03 - Gly: 1,00 - Pro: 0,97.

Tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen med den almene formel I skal anvendes til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombin-lignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor. Ved hjælp af tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen kan således på indirekte vis også proenzymer, f.eks. prothrombin og plasminogen, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer, f.eks. antithrombiner, især heparin-cofaktor (antithrombin III) og dermed også heparin og antiplasmin (c^-makroglobulin), bestemmes.

Ved den fuldstændige aktivering af proenzymer med aktivatorer eller aktivatorblandinger dannes den ækvivalente mængde enzym, der kan måles som sådan. Målingen af aktivatorkoncentrationen udføres indirekte på den måde, at man bestemmer hastigheden af enzymets dannelse ud fra proenzymet. Denne hastighed er proportional med aktivatorkoncentrationen.

Tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen, f.eks. det ifølge eksempel 1 fremstillede substrat, nemlig Na-Cbo-Gly-Pro-Arg.pNA.HCl, anvendes f.eks. til bestemmelse af de nævnte enzymer i blodplasma. Bestemmelsen sker efter det princip, at det ved den enzymatiske hydrolyse af substra- 2 tet dannede spaltningsprodukt NI^-R har et UV-spektrum, som er forskelligt fra substratets UV-spektrum, og som er forskudt mod højere bølgelængder. Således har substratet ifølge eksempel 1, dvs.

149333 27

Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA·HC1, et absorptionsmaksimum ved 302 nm og en molær ekstinktionskoefficient på 12920. Substratets absorption er praktisk taget 0 ved 405 nm. Det ved den enzymatiske hydrolyse 2 af substratet dannede spaltningsprodukt NI^R , dvs. p-nitroanilin, har et absorptionsmaksimum ved 380 nm og en molær ekstinktionskoefficient på 13200. Ved 405 nm falder ekstinktionskoefficienten kun lidt, dvs. til 9650.

Ved spektrofotometrisk måling ved 405 nm kan graden af enzymatisk hydrolyse af substratet, hvilken grad er proportional med mængden af fraspaltet p-nitroanilin, let bestemmes. Det i overskud tilstedeværende substrat forstyrrer således ikke målingen ved 405 nm. Forholdene er praktisk taget identiske for de andre tripeptidderivater ifølge opfindelsen, som indeholder en p-nitroanilinogruppe. Den spektrofotometriske måling udføres derfor i alle tilfælde ved 405 nm.

Den enzymatiske hydrolysereaktion kan skematisk vises på følgende måde: kl k3 E + S / * es«->ESf + chromofor P,

\ v_y I X

k ik4 E + P2 E = enzym S = substrat ES = enzym-substrat-complex P^ og P2 = produkter k^, k2/ k^ og = hastighedskonstanter

Dissociationskonstant for ES = —^ = K (Michaelis-konstant) k m 1 Når [S] >> [E] og k^<k3, gælder: K = HEJ - [ES]) - IS] Q) m [ES]

Een hastighed, ved hvilken Ρχ dannes, er: v = k3.[ES] k. . [E] . [S] v= V> is)- (2) m 1 1 Når e er fuldstændigt bundet til S, gælder; [ES] = [E] og 20 149333 v = Vmax = k3' tEl (3)

Lineweaver-Burk-ligningenί , K η i = —S— . ^ (4) v v [S] v K * max 1 J max

Af ligning 2 følger, at konstanterne Km og k^ bestemmer substratets aktivitet for et bestemt enzym. Til bestemmelse af disse konstanter kan anvendes følgende metode;

Man blander enzymet og substratet i en pufferopløsning og følger hydrolysereaktionen i 2 - 30 minutter. Substratets koncentration [S] varieres, medens enzymkoncentrationen holdes konstant. Når ekstinktionen (OD = optisk tæthed) optegnes i et koordinatsystem som funktion af tiden, fås en kurve, hvis tangent i nulpunktet svarer til det ideale forløb af hydrolysen. Ved hjælp af denne tangent kan man bestemme hydrolysens begyndelseshastighed. Når ^ tegnes som funktion af 75-,, fås et Lineweaver-

V lo I

-Burk-diagram (jfr. "Kurzes Lehrbuch der Biochemie", P. Karlson,

Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, side 70), af hvilket v

IUclX

og Km kan bestemmes grafisk, v

Km ^3 = bestemmes under anvendelse af N -Cbo-Gly-Pro-Arg- -pNA.HCl (substratet ifølge eksempel 1) for humant thrombin, humant plasmin og okse-trypsin. Ved hjælp af Lineweaver-Burk-ligningen bestemmes Km og vmax for de nævnte enzymer (Lineweaver-Burk-diågrara-met for humant thrombin er vist i fig. 6). Da den af humant thrombin forårsagede enzymatiske hydrolyse af substratet følger Michae-lis-Menton-loven, er det muligt at bestemme store variationer i throrabinmængden nøjagtigt. Efter samme princip bestemmes Km og vfflax for de andre enzymer. De resulterende værdier er sammenstillede i tabel III. Alle bestemmelser er udført i tris-imidazol-puffer ved en ionstyrke på 0,15 og en pH-værdi på 8,4 ved 37°C.

På tegningen er fig. 1-5 grafiske afbildninger, der viser den af den hydrolytiske virkning af humant thrombin, ecarin-thrombin, humant staphylo-thrombin, batroxobin (af gift fra Bothrops moojeni), og humant plasmin på substratet ifølge eksempel 1 fremkaldte ændring af den optiske densitet OD som funktion af 149333 29 tiden i et koordinatsystem. Til sammenligning er også indført den af virkningen af de nævnte enzymer på Na-Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl {substratet ifølge tysk offentliggørelsesskrift nr. 2,322.116) fremkaldte ændring af den optiske densitet som funktion af tiden. Alle bestemmelser er udført i tris-imidazol-puffer ved en ionstyrke på 0,15, en pH-værdi på 7,9 og ved 37°C. Opløsningerne af de to substrater har samme molære koncentration (l^umol/ml).

Fig. 6 viser Lineweaver-Burk-diagrammet for humant thrombin.

De målinger, hvis resultater er angivet i fig. 1-5, er udført på følgende måde: 0,25 ml enzymopløsning (0,56 NIH/ml humant thrombin, 0,28 NIH/ml humant ecarin-thrombin, 1,05 NIH/ml humant staphylo-thrombin, 4,0 NIH/ml batroxobin (moojeni) og 0,4 CU/ml humant plasmin sættes til 2,0 ml tris-imidazol-puffer (pH-værdi = 8,4, ionstyrke = 0,15). Blandingen præinkuberes i 2 minutter ved 37°C. Derefter sættes til blandingen 0,25 ml vandig substratopløsning (l^umol/ml af substratet ifølge eksempel 1 og af det kendte substrat Na-Bz~Phe-Val-Arg-pNA.HCl) ved 37°C. Absorptionens tiltagen måles spektrofotometrisk ved 4.05 nm og følges kontinuerligt ved hjælp af en skriver. De i tabellerne I og II sammenstillede måleresultater er opnået under de ovenfor angivne forsøgsbetingelser. Mængden af det dannede spaltningsprodukt er et mål for substraternes følsomhed over for enzymerne. Ved beregningen af den pr. minut dannede mængde (nmol) p-nitroanilin anvendes af forenklingsgrunde eh molær ekstinktionskoefficient på 10000 i stedet for 9620, da relationen mellem de forskellige substraters evne til at spaltes af enzymerne ikke ændres derved. Til beregning af den pr. minut dannede mængde (nmol) β-naphthylamin og 4-methoxy-p-naphthyl-amin (substraterne XII - XV, XVIII og XIX) bestråles prøven i et fluorescensfotometer med lys med en bølgelængde på 350 nm. Mængden af det dannede spaltningsprodukt konstateres ved måling af intensiteten af det ved 420 nm emitterede lys.

Af nedenstående tabel I ses susceptibiliteten af de ifølge eksemplerne 1-19 fremstillede substrater over for humant thrombin og humant plasmin .

jU

149333

Tabel I

Aktivitet af humant thrombin og humant plasmin, målt ved hjælp af substraterne ifølge opfindelsen ved konstant substrat-og enzymkoncentration. Til sammenligning de tilsvarende med N -Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl konstaterede værdier.

Substratkoncen- Mængde af det pr. minut af 1 NIH-enhed humant . . , n-4 thrombin eller 1 CU-enhed humant plasmin fra tration lu -m substraterne enzymatisk frigjorte spaltnings-_produkt ^2"^ i nanomol_>_

Substrater Humant thrombin Humant plasmin

Na-Bz-Phe-Val- -Arg-pNA.HCl 28,6 36,0 I 45,7 204,0 II 11,2 20,2 III 18,0 49,5 IV 21,3 60,8 V 2,4 33,8 VI 14,6 47,3 VII 73,8 195,5 VIII 65,8 111,0 IX 16,2 126,0 X 86,9 196,0 XI 43,8 93,5 XII 28,5 116,9 XIII 29,6 109,0 XIV 19,5 95,6 XV 25,9 125,0 XVI 0,9 192,6 XVII 0,85 150,8 XVIII 1,1 126,5 XIX 0,6 98,5

Af tabel I ses det, at de ifølge eksemplerne 1-19 fremstillede substrater, med undtagelse af substraterne II og V, over for humant plasmin har en signifikant og i de fleste tilfælde væsentlig større susceptibilitet end det kendte Na-Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl. Af tabel I kan det endvidere ses, at susceptibiliteten af den gruppe substrater, der omfatter I, VII, VIII, X og XI, over for humant thran-bin er meget større end det kendte substrats susceptibilitet.

3i 149333

Tabel II

Aktivitet af humant ecarin-thrombin, humant thrombinkoagulase og batroxobin (af gift fra Bothrops moojeni), målt ved hjælp af substratet I fra éksempel 1 ved konstant substrat- og enzymkoncentration.

Til sammenligning de tilsvarende med Na-Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl målte værdier.

Substratkoncentra- Mængden af det pr, minut af den til 1 NIH-enhed 1n~4 svarende mængde humant ecarin-thrombin, humant tion 1 -m thrombinkoagulase og batroxobin fra substratet enzymatisk fraspaltede p-nitroanilin i nanomol

Substrat Humant ecarin- Humant thrombin- Batroxobin -thrombin koagulase

Na-Bz-Phe-Val- -Arg-pNA.HCl 30,7 102 3,26 I 246,4 575 15,81

Tabel III

Km og vmax af forskelli9e enzymer, bestemt ved hjælp af de to tri- peptidderivater ifølge opfindelsen Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl (I) og

Na-Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl (VII) [bestemt grafisk ud fra Lineweaver--Burk-diagrammet (fig. 6)].

Enzym Km mol/liter jimol/minut

Substrat I Substrat VII Substrat I Substrat VII

Humant _ - thrombin 5,71-10 3 1,70-10-° 5,34-10- 7,57·10-ζ

pr. 1 NIH pr. 1 NIH

Humant “ ~ “ 1 I

plasmin 3,57-10-4 3,23-10-4 67,3-10-Z 61,8-10-^ _.__pr. 1 CU_pr. 1 CU_

Definitioner:

Thrombin-NIH-enheden er enheden ifølge "US National Institute of Health", og thrombinstandarden svarer til "US Standard Thrombin Lot B-3" (21,7 NIH/mg), udgivet 21,3.1973 af "Division of Biologies Standards, National Institute of Health, Bethesda, Maryland 20014, USA".

32 149333

Den til NIH-enheden svarende mængde humant ecarin-thrombin, humant thrombinkoagulase og batroxobin (moojeni) er den mængde af enzymet, som under standardbetingelser bringer en fibrinogenopløsning til koagulation på samme tid som 1 NIH-enhed standard-thrombin. Forsøgsbetingelser: En blanding af 0,2 ml af en opløsning af 1 NIH/ml "US Standard Thrombin Lot B-3" i albuminpuffer (pH-værdi 7,2) og 0,2 ml 0,4¾1s okse-fibrinogenopløsning i destilleret vand giver en koagulationshastighed på 20,2 sekunder.

Plasmin-CU-enheden er den casein-enhed, der måles på casein under standardbetingelser.

En enzymenhed er den mængde enzym, der hydrolyserer 1 jjmol substrat på 1 minut ved substratmætning og ved fastlagt temperatur, ionstyrke og pH-værdi. En tusindedel af denne enhed er en millienzymenhed (mU), som altså på tilsvarende vis hydrolyserer 1 nanomol substrat/ minut under de ovenfor nævnte betingelser.

En human-thrombin-enhed (1 D), målt med substratet I ifølge eksem- ti -4 pel 1 (N -Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl) ved en 1,5 x 10 molær substratkoncentration, en temperatur på 37°C, en ionstyrke på 0,15 og en pH-værdi på 8,4, svarer til mængden af 27,1 NIH-enheder humant thrombin (1 millienhed = 0,0271 NIH-enhed eller 1 NIH-en-hed = 36,9 millienhed).

Således er det muligt at bestemme mindre mængder af disse enzymer ved hjælp af trioeptidderivaterne ifølge opfindelsen end med det kendte substrat, hvilket er af største vigtighed i den kliniske praksis, hvor der ofte kun står små prøvemængder til rådighed, eller når prøvernes koncentration af de enzymer, proenzymer, proenzymaktivato-rer og enzyminhibitorer, der skal bestemmes, ved patologiske tilstande er ekstremt lille.

Tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen kan f.eks. også anvendes til bestemmelse af prothrombin og antithrombin, således som det vises i det følgende.

Til prothrombinbestemmelse sættes til 0,5 ml glycinpuffer med

pH-værdi 8,4 og en ionstyrke på 0,3 5 μΐ citratplasma (handelsprodukt TM

"Ci-TROL Normal" fra firmaet American Hospital Supply Corp·, 149333 33 DADE division, Miami). Blandingen præinkuberes i 30 sekunder ved 37°C. Derefter sættes til den præinkuberede blanding 100 pi vandig calciumthromboplastinopløsning (calciumthromboplastin er en af firmaet Boehringer, Mannheim forhandlet prothrombinaktiva-tor). Den resulterende blanding inkuberes ved 37°C. Efter 2 1/4 minuts inkubationstid er prothrombinaktiveringen fuldstændig.

Efter inkubationstider på mere end 5 minutter forsvandt en del af det dannede thrombin som følge af indvirkning af de i plasmaet tilstedeværende antithrombiner. Efter en inkubationstid på 4 minutter sættes til den nævnte blanding 1 ml glycinpuffer med pH-værdi 8,4, en ionstyrke på 0,3 og en temperatur på 37°C og -3 derefter 0,25 ml af en 1,5 x 10 molær vandig opløsning af substrat I. Forløbet af substratets hydrolyse følges ved fotometrisk måling af mængden af det pr. minut frigjorte p-nitroanilin ved 405 nm. Forøgelsen i optisk densitet er 0,162 pr. minut. Af denne værdi og den molære ekstinktionskoefficient på p-nitrophenylanilin ved 405 nm på 10.000 beregnes værdien 5,99 mU for det af prothrombin dannede thrombin pr. yl plasma. Deraf følger, at der er dannet 5,99 substrat I enheder thrombin pr. ml plasma af prothrombinet, hvilket svarer til 162,3 NIH-enheder thrombin pr. ral plasma.

Til antithrombinbestemmelsen sættes til 1 ml af en 3 USP-enheder heparin indeholdende glycinpuffer med pH-værdi 8,4 og en ionstyrke på 0,3 0,1 ml af en vandig thrombinopløsning med en koncentration på 25 - 40 NIH-enheder pr. ml ved 37°C. Til den resulterende blanding sættes mængder på 2,5 - 10 pi citratplasma, hvorpå blandingen inkuberes i 30 sekunder ved 37°C. Til den inkuberede blanding sættes straks 0,25 ml "Polybren"-opløsning (koncentration 1 mg "Poly-bren" pr. 1 ml 0,3-molær kogsaltopløsning) ("Polybren" er et af 1,5-dimethyl-l,5-diazaundecamethylen-polymethobromid bestående, af firmaet Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wisconsin, USA forhandlet produkt). Den resulterende blanding inkuberes i 30 sekunder ved 37°C. Derefter sættes til blandingen 0,5 ml af en 0,75 x 10~^ molær vandig substrat-I-opløsning. Forløbet af substratets hydrolyse forårsaget af det ikke af antithrombin neutraliserede thrombin følges ved fotometrisk måling af mængden af det pr. minut frigjorte p-nitroanilin ved 405 nm. Herved viste det sig, at den af forskellige mængder citratplasma forårsagede hæmning af det tilsatte thrombin er proportionalt med disse mængder.

Tabel IV

34 149333 mlU/ 1 plasma beregnet på grundlag af formindskelsen Λ OD/minut forårsaget af 10 yl plasma 6,14 6,60 6,51 6,42 Δ OD/minut med 10 yl plasma i inkubatet 0,505 0,405 0,305 0,180 mlU/yl plasma beregnet på grundlag af formindskelsen Δ OD/minut forårsaget af 7,5 yl plasma 6,22 6,69 6,56 6,32 Δ OD/minut med 7,5 yl plasma i inkubatet 0,584 0,490 0,390 0,270 mlU/yl plasma beregnet på grundlag af formindskelsen Δ OD/minut forårsaget af 5 yl plasma 6,31 6,38 6,31 6,38 Δ OD/minut med 5 yl plasma i inkubatet 0,665 0,588 0,485 0,353 mlU/yl plasma beregnet på grundlag af formindskelsen Λ OD/minut forårsaget af 2,5 yl plasma 6,30 6,59 6,45 6,22 Δ OD/minut med 2,5 yl plasma i inkubatet 0,750 0,671 0,568 0,441 Δ OD/minut af det tilsatte thrombin uden plasma 0,835 0,760 0,655 0,525

Tilsat thrombinmængde i NIH-en- heder i inkubatet 4,16 3,78 3,26 2,61 mlU = milli-inhibitorenheder

Af tabel IV fremgår det, at variationer i mængden af det i inkubationsblandingen indeholdte thrombin mellem 2,6 og 4,1 NIH-enheder ikke har nogen indflydelse på bestemmelsen af antithrombin, når plasmamængderne ligger mellem 2,5 og 10 yl. Der måles pr. yl plasma 6,40 - 4% substrat-I-milli-inhibitorenheder antithrombin, hvilket svarer til 6400 - 4% substrat-I-milli-inhibitorenheder pr. ml plasma. Dette betyder, at 1 ml plasma er i stand til at hæmme 173,4 - 4% NIH-enheder thrombin.

Na-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA*HCl (substratet ifølge eksempel 1)har iøvrigt den vigtige fordel, at det har en fire gange højere vandopløselighed ( >4 mg/ml) end det i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.322.116 beskrevne thrombinsubstrat Bz-phe-Val-Arg-pNA.HCl (ca. 1 mg/ml).

Denne højere vandopløselighed gør det muligt at udføre enzymbestem-

Claims (2)

149333 melser i et meget bredere koncentrationsområde. Ved standardiserede biologiske testmetoder er dette af afgørende betydningf fordi man netop i disse tilfælde nøjagtigt kan bestemme ekstreme værdier, uden at det er nødvendigt i forvejen at foretage en fortynding eller koncentrering af de biologiske prøver. Den herved opnåede tidsbesparelse er ofte udslaggivende, da man i klinisk praksis stræber efter hurtigst muligt at bestemme ekstreme værdier for diagnosen. Ved lavere substratopløselighed er det ikke muligt at opnå substratmætning i hele koncentrationsområdet. Når der ikke består substratmætning, afviger enzymbestemmelsens resultater fra en dosis/virk-ning-kurve, hvad der naturligvis er en stor ulempe ved en standardiseret biologisk testmetode,

1. Tripeptidderivater samt salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymakti-vatorer og enzyminhibitorer herfor i legemsvæsker fra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter og kirtelgifte fra koldblodede dyr ved fotometriske, spektrofotometriske eller fluor-escensfotometriske metoder, kendetegnet ved, at de har den almene formel I R1 - Gly - Pro - X - NH - R1 I hvor R^" betegner hydrogen eller en alkanoylgruppe med 2-8 carbon- atomer, en phenylalkanoylgruppe med 2-3 carbonatomer i alkanoylde- len, en cyclohexylcarbonylgruppe, en alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer i alkoxydelen, en benzyloxycarbonylgruppe, en alkan- sulfonylgruppe med 1-2 carbonatomer eller en benzen-, p-toluen- 2 eller 2-naphthalensulfonylgruppe, R betegner en p-nitrophenyl-, 2-naphthyl- eller 4-methoxy-2-naphthylgruppe, og X betegner en arginyl- eller lysylgruppe. Tripeptidderivater ifølge krav 1, især til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer,