DE2661080C2

DE2661080C2 -

Info

Publication number: DE2661080C2
Application number: DE2661080A
Authority: DE
Inventors: Lars Gundro Reinach Ch Svendsen
Original assignee: Pentapharm AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 1975-06-23
Filing date: 1976-06-22
Publication date: 1990-03-22
Anticipated expiration: 1996-06-23
Also published as: DK149333C; BE843245A; SE7607173L; ATA453876A; FR2315695B1; FR2315695A1; IT1070002B; JPS5622519B2; NO147213C; AT349154B; IL49774A0; CA1079167A; NL183038C; CH622286A5; JPS523494A; DK149333B; AU511716B2; NO147213B; SU1099839A3; GB1553272A

Description

Die Erfindung betrifft Tripeptide und deren Verwendung gemäß den voranstehenden Ansprüchen. Die erfindungsgemäßen Tripeptide sind chromogene bzw. fluor eszierende Substrate, die als Reagentien zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C.3.4.4., welche Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie in Drüsengiften von Kaltblütlern durch photometrische, spektrophotometrische und fluoreszenzphotometrische Methoden verwendbar sind.

In der DE-OS 23 22 116 ist ein synthetisches Substrat beschrieben, das zur quantitativen Bestimmung von Enzymen der Gruppe E.C.3.4.4., u. a. Thrombin, Plasmin und Trypsin, vorgesehen ist (Enzymnomenklatur: "E.C." ist die Abkürzung für "Enzyme Committee" der "International Union of Biochemistry"). Dieses Substrat weist eine Tripeptidkette der Formel

H-Phe-Val-Arg-OH

auf, in welcher die N-terminale Aminosäure durch eine Acylgruppe blockiert und die C-terminale Aminosäure durch eine chromogene bzw. fluoreszierende Gruppe substituiert ist, die unter der Einwirkung der genannten Enzyme abgespalten wird. Das dabei gebildete Spaltprodukt kann photometrisch quantitativ bestimmt werden. Aus der pro Zeiteinheit freigesetzten Menge an chromogenem Spaltprodukt kann die enzymatische Aktivität ermittelt werden. In der Tripeptidkette können Phe z. B. durch Ph.Gly, Tyr, 4-Methoxy-Tyr oder 4-Methyl- Phe, Val z. B. durch Ile, Leu, nor-Val, Ph.Gly oder Phe und Arg z. B. durch Lys, Homo-Arg oder Orn ersetzt sein.

Das in der DE-OS 23 22 116 beschriebene Substrat enthält in der Peptidkette mindestens zwei optisch aktive Aminosäurefragmente, die beim synthetischen Aufbau der Peptidkette nach den in der Peptidchemie üblichen Methoden zur Racemisierung neigen. Das Ausmaß dieser Racemisierung ist von den bei der Synthese angewendeten Reaktionsbedingungen abhängig und schwankt von Ansatz zu Ansatz, da es praktisch ausgeschlossen ist, genau die gleichen Reaktionsbedingungen einzuhalten. Die Bildung geringer Mengen der entsprechenden D-Aminosäuren hat zur Folge, daß die Spaltbarkeit des Substrates durch die Enzyme, insbesondere Thrombin, stark herabgesetzt ist. Wie L. Svendsen et al. [siehe Thromb. Res. 1, 267-278 (1972)] gezeigt haben, wird durch das Ersetzen des L-Phenylalanins durch D-Phenylalanin in der Tripeptidkette die Spaltbarkeit des Substrates um das 160fache herabgesetzt. Schon ein Racemisierungsgrad der N-terminalen Aminosäure von nur 1% bewirkt eine Verminderung der Spaltbarkeit des Substrates von 1,6%. Aus diesem Grund ist dieses bekannte Substrat für Zwecke der Enzymstandardisierung ungeeignet.

In Enzyme 12, 311-321 (1971) ist ein Tripeptidderivat, nämlich N-Carbobenzoxy-diglycyl-L-arginin-2-naphthylamid, beschrieben, welches durch Trypsin gespalten wird, und deshalb zur Bestimmung des letzteren geeignet ist. Dieses Tripeptidderivat wird jedoch durch Thrombin nicht und durch Plasmin in einem zur Bestimmung des letzteren völlig unzureichenden Ausmaß gespalten.

Die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand darin, ein Substrat zu synthetisieren, das einerseits eine höhere Spaltbarkeit pro Zeiteinheit durch Enzyme der Gruppe E.C.3.4.4. und andererseits bei der Synthese keine Racemisierung aufweisen sollte. Dadurch sollte das neue Substrat zur Enzymstandardisierung geeignet gemacht werden. Durch die Erhöhung der Spaltbarkeit des Substrates sollte ferner erwirkt werden, daß man für die Enzymbestimmung mit kleineren Probemengen an biologischem Testmaterial, z. B. Blutproben oder Proben anderer Körperflüssigkeiten, auskommen sollte. Es ist dies von praktischer Wichtigkeit, da oft nur sehr geringe Mengen an Probematerial zur Verfügung stehen und man darauf bedacht ist, bei der Entnahme von Proben, z. B. Blutproben bei Kindern und älteren Personen, Lymphproben oder Gewebeproben, die menschlichen Subjekte möglichst zu schonen. Ein weiteres Ziel, das man zu erreichen suchte, war die Vereinfachung der Technik der Probeentnahme durch das Krankenhauspersonal und damit eine Kosteneinsparung.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe wurde von der Erkenntnis ausgegangen, daß Thrombin und thrombinähnliche Enzyme, z. B. das aus Schlangengift hergestellte Produkt Reptilase® sowie Plasmin, das freie a "A"-Kettenfragment aus Humanfibrinogen unter Bildung des Hexadecapeptids Fibrinopeptid A und des Tripeptids Glycyl-prolyl-arginin spalten [s. Birgit Hessel et al. FEBS LETTERS 18, Nr. 2, S. 318-320 (1971)]. Daraus kann geschlossen werden, daß Thrombin, thrombinähnliche Enzyme und Plasmin gegenüber der Struktur des genannten Tripeptids eine besondere Empfindlichkeit aufweisen. Es wurde ferner von der Überlegung ausgegangen, daß das durch Thrombin und thrombinähnliche Enzyme aus dem α "A"-Kettenfragment abgespaltene Tripeptid als N-terminale Aminosäure das optisch inaktive Glycin enthält. Diese Aminosäure eignet sich besonders gut für den Aufbau von Peptidketten, da sie überhaupt nicht racemisieren kann. Das genannte Tripeptid enthält als mittlere Aminosäure Prolin, das zwar optisch aktiv ist, aber durch die Besonderheit seiner Struktur, die darin besteht, daß das asymmetrische α-Kohlenstoffatom über eine Propylenbrücke mit der α-Aminogruppe zu einem Fünfring verbunden ist, derart stabilisiert ist, daß eine Racemisierung nur unter sehr extremen Bedingungen, die bei den üblichen Peptidsynthesemethoden nie auftreten, stattfinden kann.

Durch Verwendung der im obengenannten Tripeptid Gly-Pro-Arg enthaltenen drei Aminosäuren ist es nun gelungen, ein synthetisches Substrat aufzubauen, welches den oben gestellten Forderungen vollständig entspricht.

Dieses Resultat war an sich überraschend, da man, wie aus der wissenschaftlichen Literatur hervorgeht, bis dahin angenommen hatte, daß ein Substrat zwangsläufig eine L- Phenylalaningruppe in Stellung 3 zu einer Arginingruppe in Stellung 1 in der Peptidkette aufweisen müsse, um gegenüber Thrombin eine maximale Empfindlichkeit zu besitzen [s. L. Svendsen et al., Thrombosis Research 1, 276 (1972)]. Diese Theorie ist andererseits durch die Tatsache untermauert, daß Fibrinopeptid A durch Thrombin aus Humanfibrinogen viel schneller abgespalten wird als das Tripeptid Gly-Pro-Arg. Fibrinopeptid A enthält eine L-Phenylalaningruppe in der Stellung 9 zur Arginingruppe in Stellung 1. Da jedoch das Fibrinopeptid A, wie allgemein angenommen wird, eine α-Helix bildet, ist der Abstand zwischen der L-Phenylalaningruppe und der Arginingruppe praktisch gleich wie in einer gestreckten Tripeptidkette, die die L-Phenylalaningruppe in Stellung 3 zu der Arginingruppe in Stellung 1 enthält [siehe Blombäck et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 24, Suppl. 107, 59 (1969)].

Die erfindungsgemäßen Tripeptide besitzen die Eigenschaft, unter der Einwirkung der genannten Enzyme ein Spaltprodukt der Formel NH₂-R² abzugeben, dessen Menge durch photometrische, spektrophotometrische oder fluoreszenzphotometrische Methoden quantitativ meßbar ist.

Die erfindungsgemäßen Tripeptide können mit einer Mineralsäure, z. B. HCl, HBr, H₂SO₄ oder H₃PO₄, oder einer organischen Säure, z. B. Ameisensäure, Oxalsäure oder Weinsäure, protonisiert sein.

Die in der Formel I durch R¹ bezeichnete Acylgruppe kann durch die folgende Partialformel dargestellt werden:

R³-CO- (II)

wobei R³ insbesondere eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe, wie Methyl, Äthyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl; eine Benzyl-, 2-Phenyläthyl-, 3-Phenylpropyl-, bis 11-Phenylundecylgruppe, eine Cyclohexyl- oder eine Benzyloxygruppe bezeichnen kann.

Sofern die in der Formel I mit R¹ bezeichnete Gruppe eine Sulfonylgruppe ist, kann diese eine Methan- oder Äthansulfonylgruppe, eine Benzolsulfonyl- oder Naphthalinsulfonylgruppe, sein.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der oben definierten Tripeptide als neue Substrate zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C.3.4.4., die Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, z. B. von Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen Ecarin-Thrombin, Plasmin und plasminähnlichen Enzymen, und indiret von Proenzymen, Enzymaktivatoren und Enzyminhibitoren, in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie in tierischen Zellextrakten und Drüsengiften von Kaltblütlern.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Tripeptide kann nach verschiedenen, z. T. bekannten Methoden, erfolgen.

1. Bei der ersten Methode werden die chromophoren Gruppen (R² in Formel I) an der C-terminalen Aminosäuregruppe angehängt. Diese Gruppen üben gleichzeitig die Funktion von C-terminalen Carboxylschutzgruppen während der stufenweisen Verknüpfung der Aminosäuren beim Aufbau der gewünschten Peptidkette aus. Die übrigen Schutzgruppen werden vom Endprodukt selektiv abgespalten, ohne daß die chromophore Gruppe beeinflußt wird. Diese Methode ist z. B. in "Peptide Synthesis" von Miklos BODANSZKI et al., Interscience Publishers, 1966, Seiten 163-165, beschrieben.
2. Bei der zweiten Methode wird die chromophore Gruppe an das fertig aufgebaute Peptidgerüst angekuppelt, nachdem zuvor die übrigen Schutzgruppen abgespalten worden sind. Die C-terminale Carboxylgruppe wird in diesem Fall durch racemisierungsfreie enzymatische Esterspaltung freigesetzt. Die zu diesem Zweck verwendeten esterspaltenden Enzyme können entweder frei oder an eine Matrix gebunden sein.

Zum Schutz der N^α-Aminogruppen während des stufenweisen Aufbaus der Peptidketten können die üblichen selektiv abspaltbaren Aminoschutzgruppen verwendet werden. Es handelt sich in erste Linie um Cbo, MeOCbo, NO₂Cbo, MCbo, BOC, TFA oder Formyl. Die α-Carboxylgruppe der Aminosäuren kann nach verschiedenen bekannten Methoden reaktionsfähig gemacht werden, z. B. durch Herstellung der p-Nitrophenylesterderivate, Trichlor phenylesterderivate, Pentachlorphenylesterderivate, N-Hydroxy succinimidesterderivate und Isolierung dieser Derivate, oder durch Herstellung in situ der Säureazide oder Säureanhydride, die entweder symmetrisch oder asymmetrisch sein können.

Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann auch mittels eines Carbodiimids, wie N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid, erfolgen.

Die C-terminale Carboxylgruppe der Peptidderivate kann während des stufenweisen Aufbaus der gewünschten Peptidkette entweder durch die chromophore Amidgruppe oder durch eine Methyl-, Äthyl- oder Isopropylestergruppe geschützt werden. Die übrigen freien reaktionsfähigen Gruppen, die nicht am Aufbau der Peptidkette beteiligt sind, können durch folgende spezielle Maßnahmen blockiert werden: die δ-Guanidinogruppe des Arginins wird durch NO₂, Tos oder durch einfache Protonisierung geschützt, während die ε-Aminogruppe des Lysins durch Cbo, BOC oder Tos geschützt wird.

Bei der Synthese der Tripeptidkette kann man zuerst die N-terminale Aminosäure mit der Blockierungsgruppe (Acyl- oder Sulfonylgruppe) versehen, dann die Carboxylgruppe der blockierten Aminosäure aktivieren und schließlich das so erhaltene aktivierte Aminsoäurederivat an das zur Vervollständigung der Peptidkette benötigte Dipeptidderivat anknüpfen.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Substrats nach den obengenannten Methoden ist in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben.

Die Analyse der gemäß den Beispielen erhaltenen Eluate und Produkte wurde durch Dünnschichtchromatographie ausgeführt. Zu diesem Zweck wurden mit Siliciumdioxydgel überzogene Glasplatten verwendet. Zur Entwicklung der Dünnschichtchromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet:
A Chloroform/Methanol (9 : 1)
B n-Propanol/Essigsäureäthylester/Wasser (7 : 1 : 2)
C n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3 : 1 : 1).

Die Chromatogramme wurden zuerst im UV-Licht und dann durch Reaktion mit Chlor/Toluidin (s. G. PATAKI, "Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptid- Chemie", Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, S. 125) entwickelt.

Eine Untergruppe der durch die Formel I definierten Tripeptide entspricht der Formel III

R¹-Gly-Pro-Arg-R²

in welcher R¹ eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Benzyloxycarbonylgruppe, Alkansulfonylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Benzol- oder Naphthalinsulfonylgruppe oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen und R² eine p-Nitrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy- 2-naphthylgruppe darstellen, und deren Salze, wobei Pro und Arg die L-Konfiguration aufweisen.

In der vorliegenden Beschreibung (einschließlich Patentansprüchen) werden folgende Abkürzungen verwendet:

Arg
=L-Arginin
Gly	=Glycin
Lys	=L-Lysin
Pro	=L-Prolin
Ac	=Acetyl
AcOH	=Essigsäure
BOC	=tert.-Butoxycarboxyl
Bz	=Benzoyl
Bzl	=Benzyl
Bz₂O	=Benzoesäureanhydrid
Cbo	=Carbobenzoxy
DMF	=Dimethylformamid
DSC	=Dünnschichtchromatogramm
Et₃N	=Triäthylamin
HMPTA	=N,N,N′,N′,N″,N″-Hexamethylphosphorsäuretriamid
LMS	=Lösungsmittelsystem
MeOH	=Methanol
NA	=Naphthylamid
OMe	=Methoxy
OpNP	=p-Nitrophenoxy
pNA	=p-Nitroanilid
2-NA	=2-Naphthylamid
Smp	=Schmelzpunkt
THF	=Tetrahydrofuran
Tos	=p-Toluolsulfonyl

Die erfindungsgemäßen Tripeptide der Formel I eignen sich allgemein zur Bestimmung von Enzymen der Gruppe E.C.3.4.4., welche Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten. Zu dieser Gruppe von Enzymen gehören insbesondere Thrombin und thrombinähnliche Enzyme, Ecarinthrombin und Plasmin. Mittels der erfindungsgemäßen Substrate können auf indirektem Wege auch Proenzyme, z. B. Prothrombin und Plasminogen, Enzymaktivatoren und Enzyminhibitoren, z. B. Antithrombine, insbesondere Heparin-Cofaktor (Antithrombin III) und dadurch auch Heparin, ferner Antiplasmin ( α₂-Makroglobulin), Aprotinin, und Plasmininhibitoren, bestimmt werden.

Bei der vollständigen Aktivierung von Proenzymen durch Aktivatoren oder Aktivatorgemische entsteht die äquivalente Menge Enzym, die als solche gemessen werden kann. Die Messung der Aktivatorenkonzentration wird indirekt so durchgeführt, daß man die Geschwindigkeit der Bildung des Enzyms aus dem Proenzym bestimmt. Diese Geschwindigkeit ist der Aktivatorkonzentration proportional.

Die erfindungsgemäßen Substrate, z. B. das gemäß Beispiel 1 erhaltene Substrat, nämlich N-Cbo-Gly-Pro- Arg-pNA · HCl, wurden zur Bestimmung verschiedener Enzyme in Blutplasma verwendet. Die Bestimmung erfolgte nach dem Prinzip, daß das durch die enzymatische Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt NH₂-R² ein UV-Spektrum aufweist, das von demjenigen des Substrates verschieden und nach höheren Wellenlängen verschoben ist. So weist das Substrat gemäß Beispiel 1, d. h. N-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl, ein Absorptionsmaximum bei 302 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 12 920 auf. Die Absorption des Substrates ist bei 405 nm praktisch Null. Das bei der enzymatischen Hydrolyse des Substrates gebildete Spaltprodukt NH₂R², d. h. p-Nitroanilin, weist ein Absorptions maximum bei 380 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13 200 auf. Bei 405 nm sinkt der Extinktionskoeffizient nur wenig, d. h. auf 9650.

Durch spektrophotometrische Messung bei 405 nm läßt sich der Grad der enzymatischen Hydrolyse des Substrates, welcher der Menge an abgespaltenem p-Nitroanilin proportional ist, leicht bestimmen. Das im Überschuß vorhandene Substrat stört somit die Messung bei 405 nm nicht. Die Verhältnisse sind für die anderen erfindungsgemäßen Substrate, die eine p-Nitroanilinogruppe enthalten, praktisch identisch. Die spektrophotometrische Messung wurde deshalb in allen Fällen bei 405 nm durchgeführt.

Das N-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl (Substrat gemäß Beispiel 1) besitzt den wichtigen Vorteil, daß es eine viermal höhere Wasserlöslichkeit (<4 mg/ml) aufweist als das in der DE-OS 23 22 116 beschriebene Thrombinsubstrat Bz-Phe-Val-Arg-pNA · HCl (ungefähr 1 mg/ml). Diese höhere Wasserlöslichkeit ermöglicht es, Enzymbestimmungen in einem viel breiteren Konzentrationsbereich auszuführen. Bei standardisierten biologischen Prüfverfahren ist dies von maßgebender Bedeutung, weil gerade in diesen Fällen Extremwerte genau bestimmt werden können, ohne daß die biologischen Proben vorher verdünnt bzw. konzentriert werden müssen. Der dadurch erzielte Zeitgewinn ist oft ausschlaggebend, da man in der klinischen Praxis danach strebt, Extremwerte für die Diagnose möglichst schnell zu bestimmen. Bei niedriger Substratlöslichkeit ist es nicht möglich, im ganzen Konzentrationsbereich Substratsättigung zu erzielen. Wenn keine Substratsättigung besteht, weichen die Resultate der Enzymbestimmung von der Dosis/Wirkungs-Kurve ab, was bei einem standardisierten biologischen Prüfverfahren von großem Nachteil ist.

Die enzymatische Hydrolysereaktion kann schematisch folgendermaßen dargestellt werden:

E=Enzym
S=Substrat
ES=Enzym-Substrat-Komplex
P₁ und P₂=Produkte
k₁, k₂, k₃ und k₄=GeschwindigkeitskonstantenDissoziationskonstante für ES = = K _m (Michaelis-Konstante)

Wenn [S]»[E] und k₄«k₃, gilt:

Die Geschwindigkeitskonstante, bei welcher P₁ gebildet wird, ist:

v = k₃ · [ES]

Wenn E vollständig an S gebunden ist, so gilt:

[ES]=[E] und

v = v _max = k₃ · [E] (3)

Lineweaver-Burk-Gleichung:

Aus der Gleichung (2) folgt, daß die Kontanten K _m und k₃ die Wirksamkeit des Substrats für ein gegebenes Enzym bestimmen. Zur Bestimmung dieser Konstanten wendet man die folgende Methode an:

Man mischt das Enzym und das Substrat in einer Pufferlösung und verfolgt die Hydrolysereaktion während 2 bis 30 Minuten. Die Konzentration des Substrates [S] wird variiert, während die Enzymkonzentration konstant gehalten wird. Wenn die Extinktion (OD/Min=Änderung der optischen Dichte pro Minute) in einem Koordinatensystem als Funktion der Zeit aufgetragen wird, erhält man eine Kurve, deren Tangente im Nullpunkt dem idealen Verlauf der Hydrolyse entspricht. Mit Hilfe dieser Tangente kann man die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse ermitteln. Wenn als Funktion von aufgetragen wird, erhält man ein Lineweaver-Burk-Diagramm (siehe "Kurzes Lehrbuch der Biochemie", P. KARLSON, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, S. 70), aus welchem sich v _max und K _m graphisch ermitteln lassen.

K _m und k₃ = wurden unter Verwendung von N- Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl (Substrat gemäß Beispiel 1) für Human-Thrombin und Human-Plasmin bestimmt. Mittels der Lineweaver-Burk-Gleichung wurden K _m und v _max für die genannten Enzyme ermittelt (das Lineweaver-Burk-Diagramm für Human-Thrombin ist in Fig. 6 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt). Da die enzymatische Hydrolyse des Substrats durch Human-Thrombin dem Michaelis-Menton-Gesetz folgt, ist es möglich, große Variationen in der Thrombinmenge genau zu bestimmen. Nach demselben Prinzip wurden K _m und v _max für die anderen Enzyme ermittelt. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Alle Bestimmungen wurden in Tris-Imidazol-Puffer bei einer Ionenstärke von 0,15 und einem pH von 8,4 bei 37°C ausgeführt.

In den beigefügten Zeichnungen sind die Fig. 1 bis 5 graphische Darstellungen, in welchen die durch die hydrolytische Wirkung von Human-Thrombin, Ecarin-Thrombin, Human- Staphylo-Thrombin, Batroxobin (aus Gift von Bothrops moojeni) und Human-Plasmin auf das Substrat gemäß Beispiel 1 hervorgerufene Änderung der optischen Dichte Δ OD als Funktion der Zeit in einem Koordinatensystem aufgetragen ist. Zum Vergleich ist auch die durch die Wirkung der genannten Enzyme auf N-Bz-Phe-Val-Arg-pNA · HCl (Substrat gemäß DE-OS 23 22 116) hervorgerufene Änderung der optischen Dichte aufgetragen. Alle Bestimmungen wurden ausgeführt in Tris-Imidazol-Puffer bei einer Ionenstärke von 0,15, einem pH von 7,9 und bei 37°C. Die Lösungen der beiden Substrate wiesen die gleiche molare Konzentration (1 µMol/ml) auf.

Fig. 6 stellt das Lineweaver-Burk-Diagramm für Human-Thrombin dar.

Die Messungen, der Resultate in den Fig. 1 bis 5 aufgezeichnet sind, wurden wie folgt durchgeführt:

0,25 ml Enzymlösung (0,56 NIH/ml Human-Thrombin, 0,28 NIH/ml Human-Ecarin-Thrombin, 1,05 NIH/ml Human-Staphylo- Thrombin, 4,0 NIH/ml Batroxobin (moojeni), 0,4 CU/ml Human- Plasmin wurden zu 2,0 ml Tris- Imidazol-Puffer (pH=8,4, Ionenstärke=0,15) gegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten bei 37°C präinkubiert. Dann wurde dem Gemisch 0,25 ml wäßrige Substratlösung (1 µMol/ml des Substrats gemäß Beispiel 1 bzw. des vorbekannten Substrats N-Bz- Phe-Val-Arg-pNA · HCl) bei 37°C zugegeben. Die Zunahme der Absorption wurde spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen und mittels eines Schreibers kontinuierlich verfolgt. Die in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellten Meßresultate wurden unter den oben definierten Testbedingungen ermittelt. Die Menge des gebildeten Spaltproduktes ist ein Maß für die Empfindlichkeit (Spaltbarkeit) der Substrate gegenüber den Enzymen. Bei der Berechnung der pro Minute gebildeten Menge (Nmol) p-Nitroanilin wurde einfachheitshalber ein molarer Extinktionskoeffizient von 10 000 statt 9620 verwendet, da die Relation zwischen den Spaltbarkeiten der verschiedenen Substrate durch die Enzyme dadurch nicht geändert wird. Zur Berechnung der pro Minute gebildeten Menge (Nmol) β-Naphthylamin bzw. 4-Methoxy-β-naphthylamin (Substrate XI und XII) wurde die Probe in einem Fluoreszenzphotometer mit Licht einer Wellenlänge von 350 nm bestrahlt. Die Menge des gebildeten Spaltproduktes wurde durch Messung der Intensität des bei 420 nm emittierten Lichtes ermittelt. Aus der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Empfindlichkeit der gemäß den Beispielen 1 bis 13 erhaltenen Substrate gegenüber Human-Thrombin und Human-Plasmin ersichtlich.

Tabelle 1

Aktivität von Human-Thrombin und Human-Plasmin, gemessen mittels der erfindungsgemäßen Substrate bei konstanter Substrat- und Enzymkonzentration. Zum Vergleich die entsprechenden mit N-Bz-Phe-Val-Arg-pNA · HCl ermittelten Werte.

Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die gemäß den Beispielen 1 bis 13 erhaltenen Substrate, mit Ausnahme der Substrate II und V, gegenüber Human-Plasmin eine signifikant und in den meisten Fällen wesentlich größere Empfindlichkeit aufweisen als das bekannte N-Bz-Phe-Val-Arg- pNA · NCl.

Aus der Tabelle 1 ist ferner ersichtlich, daß die Empfindlichkeit der aus I, VII, IX und X gebildeten Gruppe von Substraten gegenüber Humanthrombin viel größer ist als diejenige des bekannten Substrats.

Tabelle 2

Aktivität von Human-Ecarin-Thrombin, Human-Thrombinkoagulase und Batroxobin (aus Gift von Bothrops moojeni), gemessen mittels des erfindungsgemäßen Substrates I bei konstanter Substrat- und Enzymkonzentration. Zum Vergleich die entsprechenden mit N-Bz-Phe-Val-Arg-pNA · HCl gemessenen Werte.

Tabelle 3

K _m und v _max von verschiedenen Enzymen, bestimmt mittels des erfindungsgemäßen Substrates N-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl (I) [graphisch ermittelt aus dem Bineweaver-Burk-Diagramm (Fig. 6)]

Definitionen

Die Thrombin-NIH-Einheit ist diejenige des "US National Institute of Health", und der Thrombinstandard entspricht dem "US Standard Thrombin Lot B-3" (21,7 NIH/mg), herausgegeben am 21.3.1973 von der "Division of Biologics Standards, National Institute of Health, Bethesda, Maryland 20 014, USA".

Die der NIH-Einheit entsprechende Menge Human- Ecarin-Thrombin, Human-Thrombinkoagulase und Batroxobin (moojeni) ist diejenige Menge des Enzyms, die eine Fibrinogenlösung unter Standardbedingungen in der gleichen Zeit zur Gerinnung bringt wie 1 NIH-Einheit Standard-Thrombin. Testbedingungen: Das Gemisch von 0,2 ml einer Lösung von 1 NIH/ml "US Standard Thrombin Lot B-3" in Albuminpuffer (pH=7,2) und 0,2 ml 0,4%iger Rinderfibrinogenlösung in destilliertem Wasser ergibt eine Gerinnungszeit von 20,2 Sekunden.

Die Plasmin CU-Einheit ist die Casein-Einheit, die am Casein unter Standardbedingungen gemessen wird.

Eine Enzymeinheit ist diejenige Menge Enzym, die 1 µMol Substrat in einer Minute bei Substratsättigung und bei festgelegter Temperatur, Ionenstärke und pH hydrolisiert. Ein Tausendstel dieser Einheit ist eine Milli-Enzymeinheit (mU), die entsprechend 1 Nanomol Substrat pro Minute unter den oben genannten Bedingungen hydrolysiert.

Eine Human-Thrombin-Einheit (1 U), gemessen mit dem erfindungsgemäßen Substrat I (N-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl) bei einer 1,5 × 10^-4-molaren Substratkonzentration, einer Temperatur von 37°C, einer Ionenstärke von 0,15 und einem pH von 8,4, entspricht der Menge von 27,1 NIH-Einheiten Human-Thrombin (1 Millieinheit=0,027 l NIH-Einheit oder 1 NIH-Einheit=36,9 Millieinheiten).

Dadurch ist es möglich, kleinere Mengen dieser Enzyme mittels der erfindungsgemäßen Substrate zu bestimmen als mit dem vorbekannten Substrat, was in der klinischen Praxis von größter Wichtigkeit ist, wo oft nur kleine Probemengen zur Verfügung stehen oder wenn die Konzentration der Proben der zu bestimmenden Enzyme, Proenzyme, Proenzymaktivatoren und Enzyminhibitoren bei pathologischen Zuständen extrem gering ist.

Die erfindungsgemäßen Substrate können auch zur Bestimmung von Prothrombin und Antithrombin verwendet werden, wie im folgenden gezeigt wird.

Zur Prothrombinbestimmung wurden zu 0,5 ml Glycinpuffer mit pH 8,4 und einer Ionenstärke von 0,3 5 µl Citratplasma (Markenprodukt "Ci-TROL^TM Normal®" der Firma American Hospital Supply Corp., DADE division, Miami) zugegeben. Die Mischung wurde während 30 Sekunden bei 37°C präinkubiert. Dann wurden der präinkubierten Mischung 100 µl wäßriger Calcium Thromboplastinlösung zugesetzt (Calciumthromboplastin ist ein von der Firma Boehringer, Mannheim, kommerzialisierter Prothrombinaktivator). Die erhaltene Mischung wurde bei 37°C inkubiert. Nach 2 1/4 Minuten Inkubationszeit war die Prothrombinaktivierung vollständig. Nach Inkubationszeiten von mehr als 5 Minuten verschwand ein Teil des aktivierten Thrombins als Folge der Einwirkung der im Plasma enthaltenen Antithrombine. Nach einer Inkubationszeit von 4 Minuten wurden der genannten Mischung 1 ml Glycinpuffer mit pH 8,4, einer Ionenstärke von 0,3 und einer Temperatur von 37°C und anschließend 0,25 ml einer 1,5 × 10^-3-molaren wäßrigen Lösung des Substrates I zugesetzt. Der Verlauf der Hydrolyse des Substrates wurde durch photometrische Messung der Menge des pro Minute freigesetzten p-Nitroanilins bei 405 nm verfolgt. Die Zunahme der optischen Dichte betrug 0,162 pro Minute. Aus diesem Wert und dem molaren Extinktionskoeffizienten des p-Nitrophenylanilins bei 405 nm von 10 000 wurde der Wert von 5,99 mU des aus Prothrombin gebildeten Thrombins pro µl Plasma errechnet. Daraus folgte, daß 5,99 Einheiten Substrat I Thrombin pro ml Plasma aus dem Prothrombin gebildet worden waren, was 162,3 NIH-Einheiten Thrombin pro ml Plasma entspricht.

Zur Antithrombinbestimmung wurde zu 1 ml eines 3 USP- Einheiten Heparin enthaltenden Glycinpuffers mit pH 8,4 und einer Ionenstärke von 0,3 0,1 ml einer wäßrigen Thrombinlösung mit einer Konzentration von 25 bis 40 NIH-Einheiten pro ml bei 37°C zugesetzt. Der erhaltenen Mischung wurden Mengen von 2,5 bis 10 µl Citratplasma zugesezt, worauf die Mischung während 30 Sekunden bei 37°C inkubiert wurde. Der inkubierten Mischung wurde sofort 0,25 ml "Polybren®"-Lösung (Konzentration 1 mg "Polybren" pro 1 ml 0,3molarer Kochsalzlösung) zugesetzt ("Polybren" ist ein aus 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylen polymethobromid bestehendes, von der Firma Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wisconsin, USA, vertriebenes Produkt). Die erhaltene Mischung wurde während 30 Sekunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde der Mischung 0,5 ml einer 0,75 × 10^-3-molaren wäßrigen Substrat-I-Lösung zugesetzt. Der Verlauf der Hydrolyse des Substrats durch das von Antithrombin nicht neutralisierte Thrombin wurde durch photometrische Messung der Menge des pro Minute freigesetzten p-Nitroanilins bei 405 nm verfolgt. Dabei zeigte sich, daß die Hemmung des eingesetzten Thrombins durch verschiedene Mengen Citratplasma diesen Mengen proportional war.

Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, daß Variationen in der Menge des in der Inkubationsmischung enthaltenen Thrombins zwischen 2,6 und 4,1 NIH-Einheiten keinen Einfluß auf die Bestimmung des Antithrombins ausüben, wenn die Plasmamengen zwischen 2,5 und 10 µl liegen. Es wurden pro µl Plasma 6,40±4% Substrat-I-Milli-Inhibitoreinheiten Antithrombin gemessen, was 6400±4% Substrat-I-Milli- Inhibitoreinheiten pro ml Plasma entspricht. Dies bedeutet, daß 1 ml Plasma 173,4±4% NIH-Einheiten Thrombin zu hemmen vermag.

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Lys: 0,93-Gly:1,00-Pro: 0,96.

Beispiel 1 I. N-Cbo-Gly-PrO-Arg-pNA · HCl Ia. Cbo-Arg-pNA · HCl

In einem Dreihalsrundkolben von 250 ml Inhalt wurden 16,0 g (47,0 mMol) über P₂O₅ im Vakuum getrocknetes Cbo-Arg-OH · HCl in 90 ml absolutem HMPTA unter Feuchtigkeitsausschluß bei 20°C gelöst. Bei Zimmertemperatur wurden der erhaltenen Lösung zuerst eine Lösung von 4,74 g (47,0 mMol) Et₃N in 10 ml HMPTA und dann 16,4 g (100 mMol) p-Nitrophenylisocyanat (100%iger Überschuß) portionenweise zugesetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit bei 20°C wurde das HMPTA im Vakuum größtenteils abdestilliert. Der Rückstand wurde mehrmals mit 30%iger AcOH extrahiert. Der Rückstand wurde verworfen. Die vereinigten Essigsäureextrakte wurden zur weiteren Reinigung auf eine mit 30%iger AcOH äquilibrierte Säule eines handelsüblichen Anionenaustauschers auf Dextranbasis ("Sephadex® G-15") aufgetragen und mit 30%iger AcOH eluiert. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 12,6 g eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₀H₂₅N₆O₅Cl ergaben die folgenden Werte:
C=51,29% (51,67%), H=5,48% (5,42%), N=17,92% (18,08%), Cl=7,50% (7,63%).

Ib. N-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

Unter Feuchtigkeitsausschluß wurden 4,65 g (10 mMol) der Verbindung Ia mit 40 ml 2n HBr in Eisessig unter Rühren eine Stunde bei 20°C behandelt. Das Peptidderivat löste sich dabei unter CO₂-Entwicklung. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 250 ml absolutem Äther zugetropft, wobei (2 HBr) · H-Arg-pNA ausfiel. Die Ätherphase wurde abgesaugt, worauf die feste Phase noch viermal mit je 100 ml absolutem Äther gewaschen wurde, um das als Nebenprodukt gebildete Benzylbromid sowie den Überschuß an HBr und AcOH zu entfernen. Durch Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. Das trockene (2 HBr) · H-Arg-pNA wurde in 25 ml DMF gelöst. Der auf -10°C gekühlten Lösung wurden 1,40 ml (10 mMol) Et₃N zugesetzt. Es bildete sich ein Niederschlag von Et₃N · HBr, der abfiltriert und mit wenig kaltem DMF nachgewaschen wurde. Dem Filtrat wurden 4,70 g (11 mMol) Cbo-Gly-Pro-OpNP bei -10°C zugesetzt. Nach einigen Stunden war die Temperatur der Reaktionslösung auf 20°C gestiegen. Die Lösung wurde wieder auf -10°C gekühlt und mit 0,35 ml (2,5 mMol) Et₃N gepuffert. Nach weiteren 16 Stunden wurden nochmals 0,35 ml Et₃N bei -10°C zugesetzt. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 40°C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst. Nach Zugabe von 0,8 ml (10 mMol) konzentrierter Salzsäure wurde die Lösung im Vakuum bei 20°C zur Trockne eingeengt. Diese Operation wurde dreimal wiederholt, um das Tripeptidhydrobromid in das Hydrochlorid überzuführen. Das rohe Tripeptid hydrochlorid wurde in 50 ml MeOH gelöst und durch Gelfiltration über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von "Sephadex® LH-20" (eines handelsüblichen Anionenaustauschers auf Dextranbasis) vorgereinigt. Zur weiteren Reinigung wurde diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 30%iger AcOH gelöst. Die Lösung wurde durch Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten Säule von "Sephadex® G-15" gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 0,80 ml (10 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Man erhielt 3,64 g (58,8% der Theorie) eines amorphen leichten Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₇H₃₅N₈O₇Cl ergaben die folgenden Werte (die aus der Bruttoformel ermittelten Werte sind in Klammern gesetzt):
C=52,09% (52,38%), H=5,83% (5,70%), N=18,33% (18,10%), Cl=5,75% (5,73%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,96-Gly: 1,00-Pro: 0,96.

Beispiel 2 II. H-Gly-Pro-Arg-pNA · 2 HCl

61,91 g (0,1 mMol) der gemäß Beispiel 1 hergestellten Verbindung I wurden unter Feuchtigkeitsausschluß mit 300 ml 3n HCl in Eisessig unter Rühren zwei Stunden bei 35°C behandelt. Das Peptidderivat löste sich dabei unter CO₂- Entwicklung. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 2 Liter absolutem Äther zugetropft, wobei H-Gly- Pro-Arg-pNA · 2 HCl flockig ausfiel. Die Ätherphase wurde abgesaugt, worauf die feste Phase noch viermal mit je 0,5 Liter absolutem Äther gewaschen wurde, um das als Spaltprodukt gebildete Benzylchlorid sowie den Überschuß an HCl und AcOH zu entfernen. Durch Trocknen imVakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in quantitiver Ausbeute erhalten. Zur weiteren Reinigung wurde das getrocknete Produkt in 900 ml 30%iger AcOH gelöst. Die Lösung wurde durch Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule gereinigt. Dabei wurde das AcOH-Eluat in zwei Fraktionen aufgeteilt, die sich beide durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließen. Die Hauptfraktion enthielt das gewünschte Produkt und die Nebenfraktion das eingesetzte Ausgangsmaterial. Nach Zugae von 8 ml (0,1 Mol) konz. HCl zur Hauptfraktion wurde diese gefriergetrocknet. Man erhielt 43,5 g (83,4% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₁₉H₃₀N₈O₅Cl₂ ergaben die folgenden Werte:
C=43,38% (43,77%), H=5,88% (5,80%), N=21,72% (21,49%), Cl=13,41% (13,60%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,95-Gly: 1,00-Pro: 0,94.

Beispiel 3 III. N-2-Phenylacetyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 1,13 g (4,4 mMol) Phenylessigsäure-p-nitrophenyl-ester (Smp. 61,5-62°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,99 g (82,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₇H₃₅N₈O₆Cl ergaben die folgenden Werte:
C=54,06% (53,77%), H=5,78% (5,85%), N=18,83% (18,58%), Cl=5,79% (5,88%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,99-Gly: 1,00-Pro: 0,97.

Beispiel 4 IV. N-3-Phenylpropionyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 1,19 g (4,4 mMol) 3-Phenylpropionsäure-p-nitrophenyl-ester (Smp. 97-98,5°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 2,06 g (83,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₈H₃₇N₈O₆Cl ergaben die folgenden Werte:
C=54,25% (54,50%), H=5,98% (6,04%), N=18,29% (18,16%), Cl=5,63% (5,75%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,02-Gly: 1,00-Pro: 0,98.

Beispiel 5 V. N-Cyclohexylcarbonyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 1,10 g (4,4 mMol) Cyclohexylcarbonyl-p-nitrophenyl-ester (Smp. 49-50°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,87 g (78,6% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₆H₃₉N₈O₆Cl ergaben die folgenden Werte:
C=52,70% (52,47%), H=6,72% (6,61%), N=19,03% (18,83%), Cl=5,83% (5,96%).

Beispiel 6 VI. N-Caproyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 1,17 g (4,4 mMol) Caprylsäure-p-nitrophenyl-ester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,99 g (81,4% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₇H₄₃N₈O₆Cl ergaben die folgenden Werte:
C=52,84% (53,06%), H=7,15% (7,09%), N=18,58% (18,34%), Cl=5,73% (5,80%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,95-Gly: 1,00-Pro: 0,99.

Beispiel 7 . VII. N-Benzolsulfonyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 780 mg (4,42 mMol) Benzolsulfonsäurechlorid (Smp. 16-17°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,95 g (78,0% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₅H₃₃N₈O₇SCl ergaben die folgenden Werte:
C=47,79% (48,03%), H=5,40% (5,32%), N=18,11% (17,93%), S=5,06% (5,13%), Cl=5,61% (5,67%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,01-Gly: 1,00-Pro: 0,96.

Beispiel 8 VIII. N-Methansulfonyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 345 µl (4,44 mMol) Methansulfonsäurechlorid zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,70 g (75,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₀H₃₁N₈O₇SCl ergaben die folgenden Werte:
C=42,88% (42,66%), H=5,63% (5,55%), N=20,08% (19,90%), S=5,62% (5,70%), Cl=6,21% (6,30%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,99-Gly: 1,00-Pro: 0,96.

Beispiel 9 IX. N-2-Naphthalinsulfonyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 1,0 g (4,41 mMol) Naphthalin-2-sulfonsäurechlorid (Smp. 74-76°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,81 g (66,8% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₉H₃₅N₈O₇SCl ergaben die folgenden Werte:
C=51,88% (51,59%), H=5,19% (5,23%), N=16,75% (16,60%), S=4,62% (4,75%), Cl=5,12% (5,25%).

Beispiel 10 X. N-Isobutyloxycarbonyl-Gly-Pro-Arg-pNA · HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäß Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10°C wurden 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 650 µl (5,0 mMol) Chlorameisensäure-isobutylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,71 g (73,1% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₄H₃₇N₈O₇Cl ergaben die folgenden Werte:
C=49,06% (49,27%), H=6,42% (6,37%), N=19,33% (19,15%), Cl=5,98% (6,06%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,01-Gly: 1,00-Pro: 0,94.

Beispiel 11 XI. N-Cbo-Gly-Pro-Arg-2-NA · HCl XIa. N-Cbo-Arg(NO₂)-2-NA

3,53 g (10 mMol) gut getrocknetes Cbo-Arg(NO₂)-OH wurden in 150 ml THF : DMF (3 : 1) unter Feuchtigkeitsausschluß gelöst. Nach Abkühlung auf -10°C wurden der Lösung 1,39 ml (10 mMol) Et₃N zugesetzt und dann eine Lösung von 1,35 g (10 mMol) Chlorameisensäure-isobutylester in 20 ml THF innerhalb von 15 Minuten zugetropft, wobei die Temperatur zwischen -10°C und -5°C gehalten wurde. Der erhaltenen Lösung wurde dann eine Lösung von 1,72 (12 mMol) β-Naphthylamin in 15 ml THF zugetropft, wobei die obengenannte Temperatur eingehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden stehen gelassen. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand nacheinander je dreimal mit destilliertem Wasser, dreimal mit 5%iger NaHCO₃-Lösung und wiederum dreimal mit destilliertem Wasser digeriert. Nach dem Trocknen im Vakuum wurde das Rohprodukt in MeOH gelöst und durch eine mit MeOH äquilibrierte Säule von "Sephadex® LH-20" chromatographiert. Aus einer Fraktion des Eluats erhielt man 3,75 g der kristallinen Verbindung XIa (78,4% der Theorie) mit Smp. 173-174,5°C, die im DSC in dem LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₄H₂₆N₆O₅ ergaben die folgenden Werte:
C=60,82% (60,24%), H=5,63% (5,48%), N=17,48% (16,72%).

XIb. H-Arg-2-NA · HCl

957 mg (2 mMol) der Verbindung XIa wurden im Reaktionsgefäß eines Sakakibara-Apparates eingewogen. 15 ml getrocknetes Fluorwasserstoffgas wurden im Reaktionsgefäß kondensiert. Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 0°C wurden unter Rühren der Arginin-Nitroschutzgruppe sowie die Carbobenzoxygruppe abgespalten. Das kondensierte Fluorwasserstoffgas wurde im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert und der Rückstand in DMF gelöst. Um das Aminosäurederivat in das HCl-Salz überzuführen, wurde 0,5 ml (∼6 mMol) konz. HCl zugesetzt und die Lösung zur Trockne eingeengt. Nach zweimaligem Wiederholen dieses Vorganges wurde der Rückstand in 50 ml 40%iger AcOH gelöst. Zur Reinigung wurde die AcOH-Lösung auf eine mit 30%iger AcOH äquilibrierte "Sephadex® G-15"-Säule aufgetragen und mit 30%iger AcOH eluiert. Diejenige Fraktion des AcOH- Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 473 mg (63,5% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₁₆H₂₃N₅OCl₂ ergaben die folgenden Werte:
C=51,82% (51,62%), H=6,18% (6,23%), N=17,08% (18,81%), Cl=18,75% (19,05%).

N-Cbo-Gly-Pro-Arg-2-NA · HCl

372 mg (1 mMol) der Verbindung XIb wurden gemäß Beispiel 1 mit 470 mg (1,1 mMol) Cbo-Gly-Pro-OpNP zu der Verbindung XI umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von β-Naphthylamin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 80 µl (1 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 425 mg (68,1% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₃₁H₃₈N₇O₅Cl ergaben die folgenden Werte:
C=60,11% (59,65%), H=6,25% (6,14%), N=16,07% (15,71%), Cl=5,59% (5,68%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,98-Gly: 1,00-Pro: 0,97.

Beispiel 12 XII. N-Cbo-Gly-Pro-Arg-4-MeO-2-NA · HCl XIIa. N-Cbo-Arg(NO₂)-4-MeO-2-NA

3,53 g (10 mMol) Cbo-Arg(NO₂)-OH wurden gemäß Beispiel 11, Absatz XIa, mit 2,17 g (12,5 mMol) 4-Methoxy-2- naphthylamin umgesetzt und aufgearbeitet. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex® LH-20"-Säule. Aus einer Fraktion des Eluates erhielt man 3,35 g 65,9% der Theorie) der teilweise kristallinen Verbindung XIIa, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₅H₂₈N₆O₆ ergaben die folgenden Werte:
C=59,18% (59,05%), H=5,43% (5,55%), N=16,49% (16,23%).

XIIb. H-Arg-4-MeO-2-NA · 2 HCl

1,02 g (2 mMol) der Verbindung XIIa wurden gemäß Beispiel 11, Absatz XIb zu der Verbindung XIVb umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH- Eluates, die sich durch Behandlung mit Trypsin unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 320 µl (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 570 mg (71,0% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₁₇H₂₄N₅O₂Cl₂ ergaben die folgenden Werte:
C=51,08% (50,88%), H=5,98% (6,03%), N=17,75% (17,45%), Cl=17,55% (17,67%).

XII. N-Cbo-Gly-Pro-Arg-4-MeO-2-NA · HCl

402 mg (1 mMol) der Verbindung XIIb wurden gemäß Beispiel 1, Absatz I, mit 470 mg (1,1 mMol) Cbo-Gly-Pro-OpNP zu der Verbindung XII umgsetzt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 80 µl (1 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 493 mg (75,4% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₃₂H₄₀N₇O₆Cl ergaben die folgenden Werte:
C=59,01% (58,75%), H=6,10% (6,16%), N=15,19% (14,99%), Cl=5,35% (5,42%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,02-Gly: 1,00-Pro: 0,95.

Beispiel 13 XIII. N-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys-pNA · HCl XIIIa. N-BOC-N ^ε-Cbo-Lys-pNA

19,0 g (50 mMol) der Verbindung N-BOC-N ^ε-Cbo-Lys-OH wurden gemäß Beispiel 1, Absatz Ia, in 100 ml HMPTA gelöst und mit 5,06 g (50 mMol) Et₃N und dann mit 16,4 (100 mMol) p-Nitrophenylisocyanat versetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit wurde die Reaktionslösung unter Rühren zu 1 Liter 2%iger NaHCO₃- Lösung zugetropft. Das ausgefallene Produkt wurde abfiltriert und dreimal mit je 0,5 Liter 2%iger NaHCO₃-Lösung, dreimal mit je 0,5 Liter dest. Wasser, dreimal mit je 0,5 Liter 0,5-n HCl und schließlich dreimal mit je 0,5 Liter dest. Wasser gewaschen. Das derart gewonnene Produkt wurde im Vakuum bei 40°C getrocknet und hierauf zweimal mit je 30 ml auf 70°C erhitztem DMF extrahiert, wobei das gewünschte Produkt vollständig herausgelöst wurde, während das Nebenprodukt, N,N′-bis-p-Nitrophenylharnstoff, ungelöst zurückblieb. Die DMF-Lösung wurde im Vakuum bei 40°C eingeengt. Der Rückstand wurd in MeOH gelöst, und durch Gelfiltration über einer MeOH äquilibrierten Säule von "Sephadex® LH-20" erhielt man 18,85 g (75,3% der Theorie) der kristallinen Verbindung XIIIa mit Smp. 125-125,5°C, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₅H₃₂N₄O₇ ergaben die folgenden Werte:
C=60,49% (59,99%), H=6,35% (6,44%), N=11,48% (11,19%).

XIIIb. N-BOC-Gly-Pro-Lys( ε-Cbo)-p-NA

2 g (4 mMol) der Verbindung XIIIa wurde unter Feuchtigkeitsausschluß und unter Rühren 1 Stunde bei 20°C mit 27 ml Trifluoressigsäure behandelt, wobei sich das Aminosäurederivat unter CO₂-Entwicklung löste. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 200 ml getrocknetem Äther langsam zugetropft, wobei H-Lys( ε-Cbo)-pNA · Trifluoracetat ausfiel. Die Ätherphase wurde mit einem Filtrierstab abgesaugt. Der verbleibende Niederschlag wurde noch viermal mit je 65 ml trockenem Äther gewaschen, um die überschüssige Trifluoressigsäure zu entfernen. Durch Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. Das trockene Aminosäurederivat-Trifluoracetatsalz wurde in 20 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10°C wurden der Lösung 555 µl (4 mMol) Et₃N und gleich anschließend 1,73 g (4,40 mMol) BOC-Gly-Pro-OpNP zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1, Absatz I, weiterbehandelt.
Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex® LH-20"-Säule. Ausbeute: 2,20 g (84,0% der Theorie) einer amorphen Substanz, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₃₂H₄₂N₆O₉ ergaben die folgenden Werte:
C=59,03% (58,70%), H=6,46% (6,47%), N=12,89% (12,84%).

XIIIc. N-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys( ε-Cbo)-pNA

1,31 g (2 mMol) der Verbindung XIIIb wurden wie oben beschrieben, deblockiert und in 12 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10°C wurden der Lösung 280 µl (2 mMol) Et₃N und gleich anschließend 285 µl (2,2 mMol) Chlorameisensäure- isobutylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäß Beispiel 1, Absatz I, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex® LH-20"-Säule. Ausbeute: 1,15 g (87,8% der Theorie) einer amorphen Substanz, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₃₂H₄₂N₆O₉ ergaben die folgenden Werte:
C=58,01% (58,70%), H=6,40% (6,47%), N=12,99% (12,84%).

XIIId. N-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys-pNA · HCl

660 mg (1 mMol) der Verbindung XIIIc wurden gemäß Beispiel 2 deblockiert. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex® G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten ließ, wurde nach Zugabe von 80 µl (1 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 430 mg (77,2% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₆H₃₃N₆O₆Cl ergaben die folgenden Werte:
C=52,04% (51,75%), H=6,82% (6,70%), N=15,30% (15,09%), Cl=6,18% (6,36%).

Claims

1. Tripeptide der allgemeinen Formel R¹-Gly-Pro-X-NH-R² (I)in welcher R¹ Wasserstoff, eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 9 Kohlenstoffatomen, Benzoyl, eine omega-Phenylalkanoylgruppe mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen im Alkanoylrest, eine Cyclohexylcarbonylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine Alkansulfonylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Benzol- oder Naphthalinsulfonylgruppe, R² eine p-Nitrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy-2-naphthylgruppe und X eine Arginyl- oder Lysylgruppe darstellen, und deren Salze, wobei die Aminosäurereste die L-Konfiguration aufweisen.

2. N-2-Naphthalinsulfonyl-glycyl-prolyl-arginin-p-nitroanilid- hydrochlorid.

3. N-Benzolsulfonyl-glycyl-prolyl-arginin-p-nitroanilid-hydrochlorid.

4. N-Benzyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-arginin-p-nitroanilid- hydrochlorid.

5. N-Isobutyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-arginin-p-nitroanilid- hydrochlorid.

6. Verwendung der Tripeptide gemäß Ansprüchen 1 bis 5 bei der Bestimmung von Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen, Ecarinthrombin, Plasmin und plasminähnlichen Enzymen, Batroxobin sowie Prothrombin und Antithrombin.