DE2627925A1

DE2627925A1 - Chromogenes bzw. fluoreszierendes substrat

Info

Publication number: DE2627925A1
Application number: DE19762627925
Authority: DE
Inventors: Lars Gundro Svendsen
Original assignee: Pentapharm AG
Current assignee: DSM Nutritional Products AG
Priority date: 1975-06-23
Filing date: 1976-06-22
Publication date: 1976-12-30
Also published as: NL183038C; BE843245A; SU1099839A3; JPS5622519B2; AT349154B; AU1495276A; IT1070002B; LU75212A1; IL49774A; SE7607173L; GB1553272A; DE2627925C2; US4070245A; NO762163L; DE2661080C2; NL183038B; JPS523494A; CA1079167A; DK149333B; SU673165A3

Description

PATENTANWÄLTE

dr. W.Schalk · dipl.-ing.P. Wirth · dipl.-ing.G. Dannenberg

DR. V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. WEINHOLD · DR. D. GUDEL

6 FRANKFURTAM MAIN

CR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

PENTAPHARM A.G.
Engelgasse 109,
Basel, Schweiz

Chromogenes bzw. fluoreszierendes Substrat.

Die Erfindung betrifft ein chromogenes bzw. fluoreszierendes Substrat, das als Reagens zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C. 3.4.4., welche Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, in Körperflüssigkeiten des

Menschen und der Säugetiere sowie in Drüsengiften von Kaltblütlern durch photometrische, spektrophotometrisehe und fluoreszenzphotometris ehe Methoden verwendbar ist. ,

In der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2.322.116 ist ein synthetisches Substrat beschrieben, das zur quantitativen Bestimmung von Enzymen der Gruppe E.C.3.4.4., u.a. Thrombin, Plasmin und Trypsin, vorgesehen ist (Enzymnomenklatur: "E.C." ist die Abkürzung für "Enzyme Committee" der "International Union of Biochemistry"). Dieses Substrat weist

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eine Tripeptidkette der Formel

H - Phe - VaI - Arg - OH

auf, in welcher die N-terminale Aminosäure durch eine Acylgruppe blockiert und die C-terminale Aminosäure durch eine chromogene bzw. fluoreszierende Gruppe substituiert ist, die unter der Einwirkung der genannten Enzyme abgespalten wird. Das dabei gebildete Spaltprodukt kann photometrisch quantitativ bestimmt werden. Aus der pro Zeiteinheit freigesetzten Menge an chromogenem Spaltprodukt kann die enzymatis ehe Aktivität ermittelt werden. In der Tripeptidkette können Phe z.B. durch Ph.GIy, Tyr, 4-Methoxy-Tyr oder 4-Methyl-Phe, VaI z.B. durch He, Leu, nor-VaI, Ph.GIy oder Phe und Arg z.B . durch Lys, Homo-Arg oder Orn ersetzt sein.

Das in der detitschen Offenlegungsschrift Nr. 2.322.116 beschriebene Substrat enthält in der Peptidkette mindestens zwei optisch aktive Aminosäurefragmente, die beim synthetischen Aufbau der Peptidkette nach den in der Peptidchemie üblichen Methoden zur Racemisierung neigen. Das Ausmass dieser Racemisierung ist von den bei der Synthese angewendeten Reaktionsbedingungen abhängig und schwankt von Ansatz zu Ansatz, da es praktisch ausgeschlossen ist, genau die gleichen Reaktionsbedingungen einzuhalten. Die Bildung geringer Mengen der entsprechenden D-Aminosäuren hat zur Folge, dass die Spaltbarkeit des Substrates durch die Enzyme, insbesondere Thrombin, stark herabgesetzt ist. Wie L. Svendsen et al. [siehe Thromb. Res. I₁, 267-278 (1972) J gezeigt haben, wird durch das Ersetzen des L-Phenylalanins durch D-Phenylalanin in der Tripeptidkette

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die Spaltbarkeit des Substrates um das 160-fache herabgesetzt. Schon ein Racemisierungsgrad der N-terminalen Aminosäure von nur ifo bewirkt eine Verminderung der Spaltbarkeit des Substrates von 1,6$. Aus diesem Grund ist'dieses bekannte Substrat für Zwecke der Enzymstandardisierung ungeeignet.

Die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bestand nun darin, ein Substrat zu synthetisieren, das einerseits eine höhere Spaltbarkeit pro Zeiteinheit durch Enzyme der Gruppe E.C.3.4.4. und andererseits bei der Synthese keine Racemisierung aufweisen sollte. Dadurch sollte das neue Substrat zur Enzymstandardisierung geeignet gemacht werden. Durch die Erhöhung der Spaltbarkeit des Substrates sollte ferner erwirkt werden, dass man für die Enzymbestimmung mit kleineren Probemengen an biologischem Testmaterial, z.B. Blutproben oder Proben anderer Körperflüssigkeiten, auskommen sollte. Es ist dies von praktischer Wichtigkeit , da oft nur sehr geringe Mengen an Probematerial zur Verfügung stehen und mai darauf bedacht ist, bei der Entnahme von Proben, z.B. Blutproben bei Kindern und älteren Personen, Lymphproben, Gewebeproben, etc., die menschlichen Subjekte möglichst zu schonen. Ein weiteres Ziel, das man zu erreichen suchte, war die Vereinfachung der Technik der Probeentnahme durch das Krankenhauspersonal und damit eine Kosteneinsparung.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe wurde von der Erkenntnis ausgegangen, dass Thrombin und thrombinähnliche Enzyme, z.B. das aus Schlangengift hergestellte Produkt Reptilase^-

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sowie Plasmin, das freiß α"A"-Kettenfragment aus Humanfibrinogen unter Bildung des Hexadecapeptids Fibrinopeptid A und des Tripeptids Glycyl-prolyl-arginin spalten [s. Birgit Hessel et al. FEBS LETTERS 18, Nr. 2, S. 318-320 (197I)J. Daraus kann geschlossen werden, dass Thrombin, thrombinähnliche Enzyme ^l und Plasmin gegenüber der Struktur des genannten Tripeptids eine besondere Suszeptibilität aufweisen. Es wurde ferner von der Ueberlegung ausgegangen, dass das durch Thrombin und thrombinähnliche Enzyme aus dem α"Α"-Kettenfragment abgespaltene Tripeptid als N-terminale Aminosäure das optisch inaktive Glycin enthält. Diese Aminosäure eignet sich besonders gut für den Aufbau von Peptidketten, da sie überhaupt nicht racemisieren kann. Das genannte Tripeptid enthält als mittlere Aminosäure Prolin, das zwar optisch aktiv ist, aber durch die Besonderheit seiner Struktur, die darin besteht, dass das asymmetrische α-Kohlenstoff atom über eine Propylenbrücke mit der oc-Aminogruppe zu einem Fünfring verbunden ist, derart stabilisiert ist, dass eine Racemisierung nur unter sehr extremen Bedingungen die bei den üblichen Peptidsynthesemethoden nie auftreten, stattfinden kann.

Durch Verwendung der im oben genannten Tripeptid Gly-Pro-Arg enthaltenen drei Aminosäuren bzw. anderen racemisierungsfreien, strukturell ähnlichen Aminosäuren ist es nun gelungen, ein synthetisches Substrat aufzubauen, welches den oben gestellten Forderungen vollständig entspricht.

Dieses Resultat war an sich überraschend, da man, wie aus der wissenschaftlichen Literatur hervorgeht, bis anhin

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angenommen hatte, dass ein Substrat zwangsläufig eine L-Phenylalaningruppe in Stellung 3 zu einer Arginingruppe in Stellung 1 in der Peptidkette aufweisen müsse, um gegenüber Thrombin eine maximale Suszeptibilität zu besitzen [s. L. Svendsen et al., Thrombosis Research 1_, 276 (1972) J. Diese Theorie ist andererseits durch die Tatsache untermauert, dass Fibrinopeptid A durch Thrombin aus Humanfibrinogen viel schneller abgespalten wird als das Tripeptid Gly-Pro-Arg. Fibrinopeptid A enthält eine L-Phcnylalaningruppe in der Stellung 9 zur Arginingruppe in Stellung 1. Da jedoch das Fibrinopeptid A, wie allgemein angenommen wird, eine α-Helix bildet, ist der Abstand zwischen der L-Phenylalaningruppe und der Arginingruppe praktisch gleich wie in einer gestreckten Tripeptidkette, die die L-Phenylalaningruppe in Stellung 3 zu der Arginingruppe in Stellung 1 enthält [siehe ßlombäck et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2±, Suppl. 107, 59 (1969)].

Die Erfindung betrifft ein chromogenes bzw. fluoreszierendes Substrat, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgende Struktur aufweist:

R¹ - GIy - Pro - X - NH - R² I,

worin R ein Wasserstoffatom oder eine blockierende Acyl-

p
oder SuIfonylgruppe, R einen gegebenenfalls Substituenten tragenden aromatischen Kohlenwasserstoffrest und X eine

ρ Arginyl- oder Lysylgruppe darstellen, wobei -NH-R eine chromophore bzw. fluoreszierende Gruppe bezeichnet, und dass es die Eigenschaft besitzt, unter der Einwirkung der

genannten Enzyme ein Spaltprodukt der Formel NH„-R abzugeben,

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dessen Menge durch photometrische, spektrophotometrische oder fluoreszenzphotometrische Methoden quantitativ messbar ist.

Das erfindungsgemässe Substrat kam mit einer Mineralsäure, z.B. HCl, HBr, H₃SO. oder H₃PO., oder einer organischen Säure, z.B. Ameisensäure, Oxalsäure oder Weinsäure, protonisiert sein.

Die in der Formel I durch R bezeichnete Acylgruppe kann durch die folgende Partialformel dargestellt' werden:

R³ - CO - II

wer in R

(a) einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 17, vorzugsweise 1 bis 8, Kohlenstoffatomen,

(b) einen araliphatischen Kohlenwasserstoffrest, dessen aliphatische Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält,

(c) einen cycloaliphatischen Kohlenwasserstoffrest,

(d) einen aromatischen Kohlenwasserstoffrest oder

(e) eine Alkyloxygruppe mit 1 bis 17, vorzugsweise 1 bis 6

Kohlenstoffatomen, oder eine Benzyloxygruppe bezeichnet.

R kann insbesondere eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe, wie Methyl, ^A ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, usw., bis Heptadecyl sein. R kann ferner

eine Benzyl-, 2-Phenyläthyl-, 3-Phenylpropyl-, usw.· bis 11-

3
Phenylundecylgruppe bezeichnen. R kann ferner eine Cyclohexyl- oder eine Phenyl-, α-Naphthyl-, ß-Naphthyl- oder Biphenyl-

gruppe darstellen. Schliesslich kann R eine Benzyloxygruppe bezeichnen.

Die in der Formel I mit R bezeichnete SuIfonylgruppe kann eine Alkan:.ulf onylgruppe, deren Alkanrest 1 bis

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17, vorzugsweise 1 bis 6, Kohlenstoffatome enthält, z.B. eine Methan- oder Aethansulfonylgruppe, oder eine Arsulfonylgruppe, deren aromatischer Kern mit einer oder mehreren (z.B. drei) Alkylgruppen substituiert sein kann, z.B. eine Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl- oder Naphthalinsulfonylgruppe, sein.

it kann z.B. eine p-Nitrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy-2-naphthylgruppe sein.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des oben definierten neuen Substrates zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.G. 3.4.4., die Peptidketten aufder Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, z.B. von Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen, Ecarin-Thrombin, Plasmin und plasminähnlichen Enzymen, Trypsin, und indirekt von Proenzymen, Enzymaktivatoren und Enzyminhibitoren, in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie in tierischen Zellextrakten und Drüsengiften von Kaltblütlern.

Die Herstellung des erfindungsgemässen Substrats kann nach verschiedenen, z.T. bekannten Methoden, erfolgen.

1. Bei der ersten Methode werden die chromophoren

Gruppen (R in Formel I) an der C-terminalen Aminosäuregruppe angehängt. Diese Gruppen üben gleichzeitig die Funktion von C-terminalen Carboxylschutzgruppen während der stufenweisen Verknüpfung der Aminosäuren beim Aufbau der gewünschten Peptidkette aus. Die übrigen Schutz gruppen werden vom Endprodukt selektiv abgespalten, ohne dass die chromophore Gruppe beeinflusst

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wird. Diese Methode ist z.B. in "Peptide Synthesis" von Miklos "

BUDAMSZKI et al., Interscience Publishers, 1966, Seiten 163-165, beschrieben.

2. Bei der zweiten Methode wird die chromophore

Gruppe an das fertig aufgebaute Peptidgerüst angekuppelt, nachdem zuvor die übrigen Schutzgruppen abgespalten worden sind. Die G-terminale Carboxylgruppe wird in diesem Fall durch racemisierunRsfreie enzymatische Esterspaltung freigesetzt. Die zu diesem Zweck verwendeten esterspaltenden Enzyme können entweder frei oder an eine Matrix gebunden sein.

Zum Schutz der N -Aminogruppen während des stufenweisen Aufbaus der Peptidketten können die üblichen selektiv abspaltbaren Aminoschutzgruppen verwendet werden. Es handelt sich in erster Linie um Cbo,. MeOCbo, -NOgCbo, MCbo, BOG, TFA oder i'Ormyl. Die oc-Carboxylgruppe der Aminosäuren kann nach verschiedenen bekannten Methoden reaktionsfähig gemacht werden, z.B. durch Herstellung der p-Nitrophenylesterderivate, Trichlorphenylesterderivate, Pentachlorphenylesterderivate, N-Hydroxysuccinimidesterderivate und Isolierung dieser Derivate, oder durch Herstellung in situ der Säureazide oder Saureanhydride, die entweder symmetrisch oder asymmetrisch sein können.

Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann auch

mittels eines Carbodiimids, wie N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid, erfolgen.

Die C-terminale Carboxylgruppe der Peptid-

derivate kann während des 'stufenweisen Aufbaus der gewünschten Peptidkette entweder durch die chromophore Amid gruppe oder durch eine Methyl-, Aethyl- oder Isopropylestergruppe geschützt werden.

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Die übrigen freien reaktionsfähigen Gruppen, die nicht am Aufbau der Peptidkette beteiligt sind, können durch folgende spezielle Massnahmen blockiert werden: Die δ-Guanidinogruppe des Arginins wird durch NOp , Tos oder durch einfache Protonisierung geschützt, während die £-Aminogruppe des Lysins durch Cbo, BOC oder Tos geschützt wird.

Bei der Synthese der Tripeptidkette kann man zuerst die N-terminale Aminosäure mit der Blockierungsgruppe (Acyl- oder Sulfonylgruppe) versehen, dann die Carboxylgruppe der blockierten Aminosäure aktivieren und schliesslich das so erhaltene aktivierte Aminosäurederivat an das zur Vervollständigung der Peptidkette benötigte Dipeptidderivat anknüpfen.

Die Herstellung des erfindungsgemässen Substrates nach den oben genannten Methoden ist in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben.

Die Analyse der gemäss den Beispielen erhaltenen fluate und Produkte wurde durch ^ünnschichtchromatographie ausgeführt. Zu diesem Zweck wurden mit Siliciumdioxydgel F 2 54 (Merck) überzogene Glasplatten verwendet. Zur Entwicklung der Dünnschichtchromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme verwendet:
A Chloroform/Methanol (9 : 1)

B n-Propanol/Essigsäureäthylester/Wasser (7:1: 2) C n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1).

Die ^hromatogramme wurden zuerst im UV-Licht und dann durch Reaktion mit Chlor/Toluidin (s. G. PATAKI, "Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptid-

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- ίο -

Chemie", V/alter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, S. 125) entwickelt.

Eine Untergruppe der durch die Formel I definierten Substrate entspricht der Formel III

ti¹ _ Giy _ Pro - Ar/r _ R²

in welcher H eine Alkyloxycarbonylgruppe, deren Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Aralkyloxycarbonylgruppe, deren Alkylenrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Alkansulfonylgruppe, deren Alkanrest 1 bis 6 Kohlenstoff atome enthält, eine Arylsulfonylgruppe, derm Arylrest gegebenenfalls Substituenten trägt, oder eine Alkanoylgruppe, deren Alkanrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, darstellt

ρ
und R eine p-Witrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy-2-naphthylgruppe ist.

Die Substrate der Formel III weisen eine hohe Suszeptibilität nicht nur gegenüber Plasmin und Trypsin, sondern besonders auch gegenüber Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen auf.

In der vorliegenden Beschreibung (einschliess-Iich Patentansprüchen) werden folgende Abkürzungen verwendet:

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Arg GIy Lys Pro Ac AcOH BOG Bz BzI Bz₂O

Gb ο DMF DSC Et₃N

HMPTA

LMS MeOH NA OMe OpNP-pNA

L-Arginin

Glycin

Lysin

L-Prölin

Acetyl

Essigsäure tert.-Butoxycarboxyl Benzoyl

Benzyl

Benzoesäureanhydrid Carbobenzoxy D i me t hy1formami d Dünnschichtchromatogramm Triäthylamin

Ν,Ν,Ν· ,N¹ ,N" ,N'^Hexamethylphosphorsäuretriamid

Lösungsmittelsystem Methanol Naphthylamid Methoxy p-Nitrophenoxy p-Nitroanilid

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2-NA = 2-Naphthylaraid

Smp = Schmelzpunkt

THF = Tetrahydrofuran

Tos = p-Toluolsulfonyl

Beispiel 1

I. N^a-Cbo-Gly-Pro-Arp;-pNA-HCl
Ia. Cbo-Arpj-pNA-HCl

In einem Dreihalsrundkolben von 2 50 ml Inhalt wurden 16,0 g (47,0 mMol) über PpOc- im Vakuum getrocknetes Cbo-Arg-OH-HCl in 90 ml absolutem HMPTA unter Feuchtigkeitsausschluss bei 2O⁰C gelöst. Bei Zimmertemperatur wurden der erhaltenen Lösung zuerst eine Lösung von 4,74 g (47,0 mMol) Et~N in 10 ml HMPTA und dann 16,4 g (100 mMol·) p-Nitrophenylisocyanat (100%iger Ueberschuss) portionenweise zugesetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit bei 20⁰C wurde das HMPTA im Vakuum grösstenteils abdestilliert. Der Rückstand wurde mehrmals mit 30$>iger AcOH extrahiert. Der Rückstand wurde verworfen. Die vereinigten Essigsäureextrakte wurden zur weiteren Reinigung auf eine mit 30$iger AcOH äquilibrierte "Sephadex G-15"-Säule aufgetragen und mit 30$iger AcOH eluiert. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 12,6 g eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und

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Berechnung aus der Bruttoformel ^20^2^6^W" ergaben die folgenden Werte: C = 51,29$ (51,67 $), H = 5,48$ (5,42$), N = 17,92$ (18,08$), Cl = 7,50$ (7,63$).

I. N^a-Cbo-Glv-Pro-Arg-pNA·HCl

Unter Feuchtigkeitsausschluss wurden 4,65 g (10 mMol) der Verbindung Ia mit 40 ml 2-n HBr in Eisessig unter Rühren eine Stunde bei 20⁰C behandelt. Das Peptidderivat löste sich dabei unter COg-Entwicklung. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 250 ml absolutem Aether zugetropft, wobei (2 HBr)Ή-Arg-pNA ausfiel. Die Aetherphase wurde abgesaugt, worauf die feste Phase noch viermal mit je 100 ml absolutem Aether gewaschen wurde, um das als Nebenprodukt gebildete Benzylbromid sowie den Ueberschuss an HBr und AcOH zu entfernen. Durch Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. Das trockene (2 HBr)-H-Arg-pNA wurde in 25 ml DMF gelöst. Der auf -10⁰C gekühlten Lösung wurden 1,40 ml (10 mMol) Et₃N zugesetzt. Es bildete sich ein Niederschlag von Et„N-HBr, der abfiltriert und mit wenig kaltem DMF nachgewaschen wurde. Dem Filtrat wurden 4,70 g (11 mMol) Cbo-Gly-Pro-OpNP bei -10⁰C zugesetzt. Nach einigen Stunden war die Temperatur der Reaktionslösung auf 20⁰C gestiegen. Die Lösung wurde wieder auf -10⁰C gekühlt und mit 0,35 ml (2,5 mMol) Et₃N gepuffert. Nach weiteren 16 Stunden wurden nochmals 0,35 ml Et₃N bei -10⁰C zugesetzt. Nach weiteren 24

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Stunden wurde die Reaktionslösung im Vakuum bei 40⁰C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst. Nach Zugabe von 0,8 ml (10 mMol) konzentrierter Salzsäure wurde die Lösung im Vakuum bei 20⁰C zur Trockne eingeengt. Diese Operation wurde dreimal wiederholt, um das Tripeptidhydrobromid in das Hydrochlorid überzuführen. Das rohe Tripeptidhydrochlorid wurde in 50 ml MeOH gelöst und durch Gelfiltration über eine mit MeOH äquilibrierte Säule von "Sephadex LH-20" vorgereinigt. Zur weiteren Reinigung wurde diejenige Fraktion des MeOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess , im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in 30%iger AcOH gelöst. Die Lösung wurde durch Gelfiltrierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten Säule von "Sephadex G-15" gereinigt. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 0,80 ml (10 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Man erhielt 3,64 g (58,8$ der Theorie) eines amorphen leichten Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel Cp₇H-J^O₇Cl ergaben die folgenden Werte (die aus der Bruttoformel ermittelten Werte sind in Klammern gesetzt): C = 52,09% (52,38%), H = 5,83% (5,70%), N = 18,33 % '(18,10%), Cl = 5,75% (5,73%). .

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,96 - GIy: 1,00 - Pro: 0,96.

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Beispiel 2

II. H-Gly-Pro-Arg-pNA-2HCl

61,91 g (0,1 Mol) der gemäss Beispiel 1 hergestellten Verbindung I wurden unter Feuchtigkeitsausschluss mit 300 ml 3-n HCl in Eisessig unter Rühren zwei Stunden bei 35°G behandelt. Das Peptidderivat löste sich dabei unter COp-Entwicklung. Die Reaktionslösung wurde unter intensivem Rühren zu 2 Liter absolutem Aether zugetropft, wobei H-GIy-Pro-Arg-pNA.2HCl flockig ausfiel. Die Aetherphase wurde abgesaugt, worauf die feste Phase noch viermal mit je 0,5 Liter absolutem Aether gewaschen wurde, um das als Spaltprodukt gebildete Benzylchlorid sowie den Ueberschuss an HCl und AcOH zu entfernen. Durch Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchen wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten. Zur weiteren Reinigung wurde das getrocknete Produkt in 900 ml 30$iger AcOH gelöst. Die Lösung wurde durch Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule gereinigt. Dabei wurde das AcOH-Eluat in zwei Fraktionen aufgeteilt, die sich beide durch Try psinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liessen. Die Hauptfraktion enthielt das gewünschte Produkt und die Nebenfraktion das eingesetzte Ausgangsmaterial. Nach Zugabe von 8 ml (0,1 Mol) konz. HCl zur Hauptfraktion wurde diese gefriergetrocknet. Man erhielt 43,5 g (83,4$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C, QH₃₀NgO₅Cl₂ ergaben die folgenden Weite:

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C = 43,38% (43,77%), H - 5,88$ (5,80$), N = 21,72$ (21,49$) , Gl = 13,41^ (13,60%).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,95 - GIy: 1,00 - Pro: 0,94.

Beispiel 3

III. N^a-2-PhHnylacetyl-Gly-Pro-Ar.n;-pNA.HGl·

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 2 5 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et„N und gleich anschliessend 1,13 g (4,4 mMol) Phenylessigsäure-p-nitrophenyl-ester (Smp. 61,5-62°C) zugesetzt. Dos Reaktionsprodukt wurde- gernäss Beispiel 1 weiter behandelt.

Reinigung: Gelfiltrierungjauf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-5äule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 niMol) konz. HGl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,99 g (82,5$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₇H₃₅N₈OgCl ergaben die folgenden Werte: C = 54,06$ (53,77$), H = 5,78$ (5,85$), N = 18,83$ (18,58$), Cl = 5,79$ (5,88$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:

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Arg: 0,99 - GIy: 1,00 - Pro: 0,97.

Beispiel 4

IV. N^a-3-?henylpropionyl-GIy-Pro-Arg-pNA.HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DmF gelöst. Mach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et„N und gleich anschliessend 1,19 g (4,4 mMol) 3-Phenylpropionsäure-p-nitrophenyl-ester (Smp. 97-98,5°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 2,06 g (83,5$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel ^C28^H37^N8°6^{G1 er}S^{aben die} folgenden Vierte: C = 54,25$ (54,50$), H = 5,98$ (6,04$), N = 18,29$ (18,16$), Cl = 5,63$ (5,75$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,02 - GIy: 1,00 - Pro: 0,98.

Beispiel 5

V. N^cx-Cyclohexylcarbonyl-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C

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wurden 555 μΐ (4 mMol) Et„Ν und gleich anschliessend 1,10 g (4,4 mMol) Cyclohexylcarbonyl-p-nitrophenyl-ester (Smp. 49-50⁰C¹ zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,87 g (78,6$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSG im LMS C einheitlichwar. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel ^G26^H39^N8°6^{C1 er}S^{aben die} folgenden Werte: C = 52,7OjS, (52,47$), H = 6,72$ (6,61$), N = 19,03$ (18,83$), Cl = 5,83$ (5,96$).

Beispiel 6

VI. N^a-Capryloyl-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et„N und gleich anschliessend 1,17 g (4,4 mMol) Caprylsäure-p-nitrophenyl-ester zugesetzt- Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung

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von p-Nitroanilin spalten Hess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HGl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,99 g (81,4$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSG im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse"und Berechnung aus dor Bruttoformel C₂₇H₄₃N₈O₆Cl ergaben die folgenden Werte: C = 52,84$
(53,06$), H = 7,15$ (7,09$), N = 18,58$ (18,34$), Cl = 5,73$
(5,80$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,95 - GIy: 1,00 - Pro: 0,99.

Beispiel 7

VII. N^a-Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et_N und gleich anschliessend 840 mg
(4,4 mMol) p-Toluolsulfonsäurechlorid (Tosylchlorid) (Smp.
67-69°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Saule. Diejenige Fraktion des
AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 2,17. g (84,9$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₆H₃₅N₈O₇SCl ergaben die folgenden Werte: C = 48,50$

609853/1124

(48,86$), Η = 5,61$ (5,52$), N = 17,73$ (17,53$), S = 5,19$ (5,02$), Cl = 5,49$ (5,55$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,99 - GIy: 1,00 - Pro: 0,93.

Beispiel 8

VIII. N^a-Bengolsulfonyl-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et₃N und gleich anschliessend 780 mg (4,42 mMol) Benzolsulfonsäurechlorid (Smp. 16-17°C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,95 g (78,0$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₂₅H₃₃N₈O₇SCl ergaben die folgenden Werte: C = 47,79$ (48,03$), H = 5,40$ (5,32$), N = 18,11$ (17,93$), S = 5,06$ (5,13$), Cl = 5,61$ (5,67$).

Die Aminsoäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,01 - GIy: 1,00 - Pro: 0,96.

Beispiel 9

IX. N^a-Methansul.fonyl Gly-Pro-Arg-pNA.HCl

609853/1 1 Ik

2,09 g (4 rnMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et₃N und gleich anschliessend 345 μΐ (4,44 mMol) Methansulfonsäurechlorid zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G~15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzun, von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,70 g (75,5$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel ^C20^H31^N8°7^{SG1 er}S^{aben die} folgenden Werte: C = 42,88$ (42,66$), H = 5,63$ (5,55$), N = 20,08$ (19,90$), S = 5,62$ (5,70$), Cl = 6,21$ (6,30$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,99 - GIy: 1,00 - Pro: 0,96.

Beispiel 10

X. N^a-2-Naphthalinsulfonyl-Gly-Pro-Arg^pNA-HCl

2,09 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kuhlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et„N und gleich anschliessend 1,0g (4,41 mMol) Naphthalin-2-sulfonsäurechlorid (Smp. 74-76⁰C) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt .

Reinigung: G' Ifiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH

609853/1 124

äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des
AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freiset-.vm; von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,81 g (66,8$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₅ H J O₇SCl ergaben die folgenden Werte: C = 51,88%

C. J ö 1} O ι

(51,59%), H = 5,19% (5,23%), N = 16,75% (16,60%), S = 4,62%
(4,75%), Cl = 5,12% (5,25%).

Die Arninosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,02 - GIy: 1,00 - Pro: 0,98.

Beispiel 11
XI. Ne

2,09 g (4 mMol) der gemass Beispiel 2 hergestellten Verbindung II wurden in 25 ml DMF gelöst. Nach Kühlen auf -10⁰C wurden 555 μΐ (4 mMol) Et₃N und gleich anschliessend 6 50 μΐ
(5,0 mMol) Chlorameisensäure-isobutylester zugesetzt. Das
Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung: GeIfilt rierung auf einer mit 30%iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des
AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzum von p-NLtroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) kon-z. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,71 g (73,1% der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel Cp₄Ii₃₇N₈O₇Cl er ;aben die folgenden Werte: C = 49,06%

609863/1 124

(49,27$), H = 6,42$ (6,37$), N = 19,33$ (19,15$), Gl = 5/ (6,06$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,01 - GIy: 1,00 - Pro: 0,94.

Beispiel 12

XII· N^a-Cbo-Gly-Pro-Arp;-2-NA.HCl·
XIIa. N^a-CbQ-ArK(NO ₂ )-2-NA

3,53 g (10 mMol) gut getrocknetes Cbo-Arg(NOg)-OH wurden in 150 ml THF:DMF (3:1) unter Feuchtigkeitsausschluss gelöst. Nach Abkühlung auf -10⁰C wurden der Lösung 1,39 ml (10 mMol) Et„N zugesetzt und dann eine Lösung von 1,35 g (10 mMol) Chlorameisen säur e-isobutylester in 20 ml THF innerhalb von Minuten zugetropft, wobei die Temperatur zwischen -10⁰C und -5°C gehalten wurde. Der erhaltenen Lösung wurde dann eine Lösung von 1,72 g (12 mMol) ß-Naphthylamin in 15 ml THF zugetropft, wobei die oben genannte Temperatur eingehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden stehen gelassen. Nach Abdestillier en des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Huckstand nacheinander je dreimal mit destilliertem Wasser, dreimal mit 5$iger NaHCO_-Lösung und wiederum dreimal mit destilliertem Wasser digeriert. Nach dem Trocknen im Vakuum wurde das Rohprodukt in MeOH gelöst und durch eine mit MeOH äquilibrierte Säule von "Sephadex LH-20" chromatographiert. Aus einer Fraktion des Eluats erhielt man 3,75 g der kristallinen Verbindung XIIa (78,4$ der Theorie) mit Smp.

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173-174,5°C, die im DSG in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel Ο,,,Η NgOjergaben die folgenden Vierte: C = 60 ,82$. (60,24$) , H = 5,63$ (5,48$), N = 17,48$ (16,72$).
XIIb. H-Arg-2-NA.HCl

9 57 mg (2 mMol) der Verbindung XIIa wurden im Reaktionsgefäss eines Sakakibara-Apparates eingewogen. 15 ml getrocknetes Fluorwasserstoffgas wurden im Reaktionsgefäss kondensiert. Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 0⁰G wurden unter Rühren die Arginin-Nitroschutzgruppe sowie die Carbobenzoxygruppe abgespalten. Das kondensierte Fluorwasser^ stoffgas wurde im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert und der Rückstand in DMF gelöst. Um das Aminosäurederivat in das HGl-SaIz überzuführen, wurde 0,5 ml (^ 6 mMol) konz. HCl zugesetzt und die Lösung zur Trockne eingeengt. Nach zweimalige: Wiederholen dieses Vorganges wurde der Rückstand in 50 ml 40$i, AcOH gelöst. Zur Reinigung wurde die AcOH-Lösung auf eine mit 30$iger AcOH äquilibrierte "Sephadex G-15"-Säule aufgetragen und mit 30$iger AcOH eluiert. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 473 mg (63,5$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel ^cig^H23^N5^0C12 ^erT^{aben die} folgenden Werte: C = 51,82$ (51,62$), H = 6,18$ (6,23$), Ei « 17,08$ (18,81$), Cl = 18,75$ (19,05$).

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· N^a-Cbo-Gl,y-Pro-Ar^-2-NA.HCl·

372 mg (1 mMol) der Verbindung XlIb wurden gemäsr, Beispiel 1 mit 470 mg (1,1 rriMol) Cbo-Gly-Pro-GpNP zu der Verbindurig XiI umgesetzt. ReLrIIgUiIg: GeIfiltrierung auf einer mit 3üVaiger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcUH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unte Freisetzung von ß-Naphthylamin spalten Hess, wurde nach Zugabe von 80 μΐ (l mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 425 mp: (68,1$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSG im LKS G einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Brut toformel C₃₁HL_nN₇O₁-Cl ergaben die folgenden Werte: G = 60,11$ (59,65%) , H = 6,25# (6,14$), N = 16,07·ί (15,71$), Cl = 5,59$ (5,68$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,98 - GIy: 1,00 - Pro: 0,97.

Beispiel 13

XIII. N^a-Tos-Gly-Pro-Arp;-2-NA.HCl

625 mg (1 mMol) der Verbindung XII (Beispiel 12) wurden gemäss Beispiel 2 deblockiert und in 8 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10⁰C wurden 140 μΐ (1 rnMol) Et₃N und gleich anschliessend 210 mg (1,1 mMol) p-Toluolsulfonsäurechlorid (Smp. 67-69°G) zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gernäss Beispiel 1 weiterbehandelt.

Reinigung'· GeIfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule- Diejenige Fraktion des AcüH-Eulates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung

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von ß-Naphthylamin spalten Hess, wurde nach Zugabe von 80 μΐ (1 mMol) konz. HCL gefriergetrocknet. Ausbeute: 500 mg (77,6$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoforrael C₃₀FI₃₈M₇O₁-SCl ergaben die folgenden Werte: C = 56,13$ (55,93$), H= 5,36$ (5,95$), N = 15,48$ (15,22$), S = 5,07$ (4,98$), Cl = 5,39$ (5,50$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,95 - GIy: 1,00 - Pro: 0,96.

Beispiel 14

XIV. N^g-Cbo-Gly-Pro-Arg-4-Me0-2-Na.HCl ZIVa. N^g-Cbo-Arg(NO ₃ )-4-MeO-2-NA

3,53 g (10 mMol) CbO-Ar^(NO₉)-OH wurden gemäss Beispiel 12, Absatz XIIa, mit 2,17 g (12,5 mMol) 4-Methoxy-2-naphthylamin umgesetzt.und aufgearbeitet. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex LH-20"-Säule. Aus einer Fraktion des Eluates erhielt man 3,35 g (65,9$ der Theorie) der teilweise kristallinen Verbindung XIVa, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel Cp_rH_? N 0_fi ergaben die folgenden Werte: C = 59,18$ (59,05$), H = 5,43$ (5,55$), N = 16,49$ (16,23$).
ZIVb. H-Arg-4-HeO-2-NA.2HCl

1,02 g (2 mMol) der Verbindung XIVa wurden gemäss Beispiel 12, Absatz XIIb, zu der Verbindung XIVb umgesetzt. Reinigung: Gclfiltri<--n.ng auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex Gl- . !3"-Säule · Diejenige Fraktion des AcOH-

S09853/1124

Eluates, die sich durch Behandlung mit Trypsin unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde nach Zugabe von 320 μΐ (4 mMol) konz. HGl gefriergetrocknet. Ausbeute: 570 mg (71,0$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Eleinentaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G-J₇H₂₄N₁-O₂Cl₂ ergaben die folgenden Werte: C = 51,08$ (50,385b), H = 5,98$ (6,03$), N f 17,7 5$ (17,45$), Cl = 17,55$ (17,67$).

XIV. N^a-Cbo-Gly-Pro-Arg-4-Me0-2-NA.HCl

402 mg (1 mMol) der Verbindung XIVb wurden gemäss Beispiel 1, Absatz I, mit 470 mg (1,1 mMol) Cbo-Gly-Pro-OpNP zu der Verbindung XIV umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-I5"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde nach Zugabe von 80 μΐ (1 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 493 mg (75,4$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im D3C im LM3 C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung-aus der Bruttoformel C„pH₄Q.N₇0_fiCl ergaben die folgenden Werte: C = 59,01$ (58,75$), H = 6,10$ (6,16$), N = 15,19$ (14,99$), Cl = 5,35 $ (5,42$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 1,02 - GIy: 1,00 - Pro: 0,95.

Beispiel 15

XV. N^a-Tos-Gly-Pro~Arg-4-Me0-2-NA.HCl

655 mg (1 mMol) der gemäss Beispiel 14 hergestellten

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-2B-

Verbindung XIV wurden geniäss Beispiel 2 deblockiert und in 8 ml DMF gelöst. Nach dem Abkühlen auf -10⁰C wurden 140 μΐ (1 mMol) Et₃N und gleich anschliessend 210 mg (1,1 mMol) p-Toluolsulfonsäurechi orid zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1 weit er behandelt. Reinigung: GeIf iltrierung auf einer mit 3C$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde nach Zugabe von 80 μΐ (1 mMol) konz. HGl gefriergetrocknet. Ausbeute: 465 mg (69,0$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C„-,H qN-O^SCI ergaben die folgenden Werte: C = 55,75$ (55,22$), H = 6,01$ (5,98$), N = 14,89$ (14,54$), S = 4,59$ (4,76$), Cl = 5,16$ (5,26$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Arg: 0,98 - GIy: 1,00 - Pro: 0,96.

Beispiel 16

XVI. N^a-Tos-Gly-Pro-Lys-pNA.HCl
XVIa. N^a-BOC-N^£-Cbo-Lys-pNA

19,0 g (50 mMol) der Verbindung N^a-BOC-N^-Cbo-Lys-OH wurden gemäss Beispiel 1, Absatz Ia, in 100 ml HMPTA gelöst und mit 5,06 g (50 mMol) Et₃N und dann mit 16,4 g (100 mMol) p^-Nitrophenylisocyanat versetzt. Nach 24 Stunden Reaktionszeit wurde die R eakt ions lösung unter Rühren zu 1 Liter 2$iger NaHCO.,-Lösung zugetropft. Das ausgefallene Produkt wurde abfiltriert und dreimal mit je 0,1 Liter 2$iger NaHCO„-Lösung, dreimal mit

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je 0,5 Liter dest. V/asser, dreimal mit je 0,5 Liter 0,5-n HCl und schliesslich dreimal mit je 0,5 Liter dest. Wasser gevrascher: Das derart gewonnene Produkt wurde im Vakuum bei 40°.C getrocknet- und hierauf zweimal mit je 30 ml auf 70⁰C erhitztem DMF extrahiert, wobei das gewünschte Produkt vollständig herausgelöst wurde, während das Nebenprodukt, N,N^f-bis-p-Nitrophonylharnstoff, ungelöst zurückblieb. Die DMF-Lösung wurde im Vakuum bei 4O⁰C eingeengt. Der Rückstand wurde in MeOH gelöst, und durch Gelfiltration über einer mit MeOH äquilibrierten Säule von "Sephadex LH-20" erhielt man 18,85 g (75,3$ der Theorie) der kristallinen Verbindung XVIa mit Smp. 12 5-125,5°C, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel ^pc^op^A ergaben die folgenden V/er to: C = 60,49$ (59,99$), H = 6,35$ (6,44$), N = 11,48$ (11,19$).

⁰^-LYS fc»Cb.o) -pNA

1,5 g (3 ml'lol) der Verbindung XVIa wurde unter Feuchtigkeitsausschluss und unter Rühren 1 Stunde bei 20⁰C mit 20 ml Trifluoressigsäure behandelt, wobei sich das Aminosäurederivat unter COp-Entwicklung löste. Die Rea-kti ons lösung wurde unter intensivem Rühren zu 150 ml getrocknetem Aether langsam zugetropft, wobei H-Lys(£-Cbo)-pNA.Trifluoracetat ausfiel. Die Aetherphase wurde mit einem Filtrierstab abgesaugt. Der verbleibende Niederschlag wurde noch viermal mit je 50 ml trockenem Aether gewaschen, um die überschüssige Trifluoressigsäure zu entfernen. Durch Trocknen im Vakuum über NaOH-Plättchoi wurde das deblockierte Produkt in quantitativer Ausbeute er-

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halten. Das trockene Aminosäurederivat-Trifluoracetatsalz i-.urde in 15 ml IMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10⁰C wurden der Lösung 415 μΐ (3 rnMol) Et„N zugesetzt, um das AminosäurederLvc'jt, aus dem Trifluoracetat freizusetzen. Dem Reaktionsgemisch wurden 1,48 g (3,31 mMol) Tos-Gly-Pro-OpNP zugesetzt. Das Resktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz I, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Dophadex LH-20"-Säule. Ausbeute: 1,77 g (83,2$ der Theorie) einer amorphen Substanz, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C H ,,N_fiO_QS ergaben die folgenden Werte". C = 57,95$ (57,61$), H = 5,59$ (5,69$), N = 12,27$ (11,86$), S = 4,49$ (4

XVI. W^tt-Tos-GIy-Pro-Lyn-pNA,HCl

1,42 g -(2 mMol) der Verbindung XVIb wurden gemäss Beispiel 2 deblockiert. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit Steiger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten Hess, wurd.e nach Zugabe von 160 μΐ (2 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 1040 mg (85,1$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel Cp-H₃-N-O₇SCl ergaben die folgenden Werte: C = 50,76$ (51,10$), H = 5,68$ (5,77$), N = 13,98$.(13,75$), S = 5,19$ (5,25$), Cl = 5,68$ (5,80$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Amino-

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säuren im richtigen Verhältnis:
Lys: 0,99 - GIy: 1,00 - Pro: 0,96.

.Beispiel 17

XVIl. n"-IsGbutoxycarhonyl-Gly-Pro-Lys-pNA.HCl XVIIa. N^a-B0C-G3y-Pro-Lys(£-Cbo)-pNA

2,0 g (4 mMol) der gemäss Beispiel 16 hergestellten Verbindung XVIa wurden gemäss Beispiel 16, Absatz XVIb, deblockiert und in 20 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10⁰C wurden der Lösung 555 μΐ (4 mMol) Kt₃N und gleich anschliessend 1,73 g (4,40 mMol) BOC-Gly-Pro-OpNP zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz I, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex I.H-20"-Säule. Ausbeute: 2,20 g (84,0$ der Theorie) einer amorphen Substanz, die im DSC in den LKS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel ^C32^H42^N6°9 ^erS^{aben die} folgenden Werte: C = 59,03$ (58,7056), H = 6,46$ (6,47$), N = 12,89$ (12,84$). XVIIb. N^a-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys(s-Cbo)-pNA

1,31 g (2 mMol) der Verbindung XVIIa wurden gemäss Beispiel 16, Absatz XVIb, deblockiert und in 12 ml DMF gelöst. Nach Abkühlung auf -10⁰C wurden der Lösung 280 μΐ (2 mMol) Et₃N und gleich anschliessend 285 μΐ (2,2 mMol) Chlorameisensäure-isobutylester zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz I, weiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex LH-20"-3äule. Ausbeute: 1,15 g (87,8$ der Theorie) einer arnor-

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phen Substanz, die im DSG in den LMS A und D einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C„pH.pN_O„ ergaben die folgenden Werte: C = 58,01$ (58,70$), H = 6,40$ (G ,AT:i), N - IR ,99$ (12,84$).

XVII. H^tt-Isobutoxycarbonyl-Gly-Pro-Lys-pHA.HGl

660 mg (1 mMol) der Verbindung XVIIb wurden gemäss Beispiel 2 deblockiert. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 3ü>ai£er AcOK äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von p-Nitroanilin spalten liess, wurde nach Zugabe von 80 μΐ (1 mMol) konz. HCl gefriergetrockne^; Ausbeute: 430 mg (77,2% der Theorie) eines amorphen Pulvers, dar im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranslyse und Berechnung aus der Bruttoformel C_orH_ooN_cÜ_cCl ergaben die folgenden Werte:

ti Ό JO O D

C = 52,04$ (51,75$), H = 6,82$ (6,70$), N = 15,30$ (15,09$), Cl 6,18$ (6,36$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Lys: 0,93 - GIy: 1,00 '- Pro: 0,96.

Beispiel 18

XVIII. N^a-Tos-Gly-Pro-Lys-2-NA.HCl
XVIIIa. N^a-B0C-N*-Cbo-Lys-2-NA

1,90 g (5 mMol) der Verbindung N^ot-BOB-N^£:-Cbo-Lys-OH wurden gemäss Beispiel 12, Absatz XIIa, zu der Verbindung XVIIIa umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierten "Sephadex LH-20"-Säule. Ausbeute: 1,60 g (63,3$

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der Theorie) einer amorphen Verbindung, die im DSC in den LHS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₀ ^1,,(-N-Q₅ ergaben die folgenden Werte: C = 68,08',ί (68,89%), H = 7,03$. (G,98$), N - 8,59$ (8,32$). XVIIIb, H^a -Tos-G]y-Pro-Lys(£-Cbo)-2-NA

1,05 g (2 mMol) der Verbindung XVIIIa wurden gemäss Beispiel 16, Absatz XVIb, deblockiert und in 20 ml DMF gelöst. Mach dein r.ühlen auf -10°C wurden der Lösung 28Ü μΐ (2 mMol.) 1¹It₃N und pleich anschliessend 985 mg (2,21 mMol) Tos-Gly-Pro-OpNP zugesetzt. Das Roaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz I, weiterbehandoit. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOIi äquilibrierten "Sephadex LH-20"-Säule. Ausbeute: 1,11 g [77 ,T/i der Theorie) einer amorphen Substanz, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. El ernen taranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C_qpH „N,_O_VS ergaben die folgenden Vierte: C = 64,30^ (63,949b), H = 5,98^ (6,07^), N = 10,18$ (9,819b), S = 4,35^ (4,49$).

XVIII. N^a-Tos-Gly-Pro-Lys-2-NA.HCl

715 mg (1 mMol) der "Verbindung XVIIIb wurden gemäss Beispiel 2 deblockiert. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 30>iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des AcOH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 2-Naphthylamin spalten lieso, v/urde nach Zugabe von 80 μΐ (1 mlvlol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbemte 470 mg (76.3$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS-einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnum? aus der Bruttoformel C„-iL Nj-

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ergaben die folgenden Werte: C = 58,11$ (58,48$), H = 6,15$ (6,2?$), N = 11,79$ (11,37$), S = 5,13$ (5,20$.), Cl = 5,63$ (5,7^).

Die Aminosäure analyse ergab die zu erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Lys: 0,94 - GIy: 1,00 - Pro: 0,98.

Beispiel 19

XIX. N^a-Tos-01y-Pro-Lys-4-MR0-2-NA.HCl XIXa. M^a-B0C-M^-Cbo-Lys-4-Me0-2-NA

1,90 g (5 mMol) der Verbindung N^a-BOC-N^€-Cbo-Lys-OH wurden gemäss Beispiel 12, Absatz XIIa, mit 1,22 g (7 mMol) 4-Methoxy-2-naphthylamin umgesetzt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOK äquilibrierten "Sephadex LH-20"-Säule. Ausbeute: 1,82 g (68,0$ der Theorie) einer amorphen Verbindung, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₃QH₃₇N₃Og ergaben die folgenden Werte: C =68,05$ (67,27$), H = 6,83$ (6,96$), N = 9,10$ (7,85$).
XIXb. N ^a-Tos-Gly-Pro-Lys(S-Cbo)-4-MeO-2-NA

1,07 g (2 mMol) der Verbindung XIXa wurden gemäss Beispiel 16, Absatz XVIb, deblockiert und in 20 ml DMF gelöst. Nach dem Abkühlen auf -10°C wurden der Lösung 280 μΐ (2 mMol) Et₃N und gleich anschliessend 985 mg (2,21 mMol) Tos-Gly-Pro-OpNP zugesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde gemäss Beispiel 1, Absatz I, v/eiterbehandelt. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit MeOH äquilibrierton "Sephadex LH-20"-Säule. Ausbeute: 895 m/·.

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(60,2$ der Theorie) einer amorphen Substanz, die im DSC in den LMS A und B einheitlich war. Element aranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel G^ H N_rü„S ergaben die folgenden Werte:'C = 63,62$ (62,97%), H = 6,^2$ (6,10%), N = 0,88$ (9,42$), S = 4,21$ (4,31$),
XIX. N^a-To5-Gly-Pro-Lys-4-Me0-2-NA.HCl

745 mg (l.mMol) der Verbindung XIXb wurden gemäss Beispiel 2 deblockiert. Reinigung: Gelfiltrierung auf einer mit 3ü$iger AcOH äquilibrierten "Sephadex G-15"-Säule. Diejenige Fraktion des A_COH-Eluates, die sich durch Trypsinbehandlung unter Freisetzung von 4-Methoxy-2-naphthylamin spalten liess, wurde nach Zugabe von 80 μΐ (1 mMol) konz. HCl gefriergetrocknet. Ausbeute: 470 mg (72,7$ der Theorie) eines amorphen Pulvers, das im DSC im LMS C einheitlich war. Elementaranalyse und Berechnung aus der Bruttoformel C₃^H QN₅O SCl ergaben die folgenden Vierte: C = 57,95$ (57,62$), H = 6,31$ (6,24$), N = 11,09$ (10,84$), S = 4,88$ (4,96$), Cl = 5,41$ (5,49$).

Die Aminosäureanalyse ergab die zu· erwartenden Aminosäuren im richtigen Verhältnis:
Lys: 1,03- GIy: 1,00 - Pro:0,97.

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-. 36 - ■ "

,j

Die erfindungsgemässen Substrate der formel I eignen sich allgemein zur Bestimmung von Enzymen der Gruppe E.C. 3.4.4._} welche Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten. Zu dieser Gruppe von Enzymen gehören insbesondere Thrombin und thrombinähnliche Enzyme, Ecarinthrombin, Plasmin und. Trypsin. Mittels der erfindungsgemässen Substrate können auf indirektem Wege auch Proenzyme, z.B. Prothrombin, Plasminogen und Trypsinogen, Enzymaktivatoren und Enzyminhibitoren, z.B. Antithrombine, insbesondere Heparin-Cofaktor (Antithrombin HL) und dadurch auch Heparin, ferner Antiplasmin (a₂-Makroglobulin), Trypsininhibitoren (α,-Antitrypsin), Aprotinin, Sojabohnentrypsininhibitoren und Piasmininhibitoren, bestimmt werden.

Bei der vollständigen Aktivierung von Proenzymen durch Aktivatoren oder Aktivatorgemische entsteht die äquivalente Menge Enzym, die als solche gemessen werden kann. Die Messung der Aktivatorenkonzentration wird indirekt so durchgeführt, dass man die Geschwindigkeit der Bildung des Enzyms aus dem Proenzym bestimmt. Diese Geschwindigkeit ist der Aktivatorkonzentration proportional.

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Die erfindungsgemässen Substrate, z.B. das gemäss Beispiel 1 erhaltene Substrat, nämlich N^a- Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA*HCl, wurden zur Bestimmung verschiedener Enzyme in Blutplasma verwendet. Die Bestimmung erfolgte nach dem Prinzip, dass das durch die' enzymatische Hydrolyse des Substrates ge-

2
bildete Spaltprodukt NHp-R ein UV-Spektrum aufweist, das von demjenigen des Substrates verschieden und nach höheren Wellenlängen verschoben ist. So weist das Substrat gemäss Beispiel 1, d.h. N^a-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA*HCl, ein Absorptionsmaximum bei nm (Manometer) und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 12920 auf. Die Absorption des Substrates- ist bei 405 nm praktisch Null. Das bei der enzymatischen Hydrolyse des Substrates ge~

■ ρ
bildete Spaltprodukt NHpR , d.h. p-Nitroanilin, weist ein Absorption maximum bei 380 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13200 auf. Bei 405 nm sinkt der Extinktionskoeffizient nur wehig, d.h. auf 9650.

Durch spektrophotometrisehe Messung bei 405 nm lässt sich der Grad der enzymatischen Hydrolyse des Substrates, welcher der Menge an abgespaltenem p-Nitroanilin proportional ist, leicht bestimmen. Das im Ueberschuss vorhandene Substrat stört somit die Messung bei 405 nm nicht. Die Verhältnisse sind für die anderen erfindungsgemässen Substrate, die eine p-Nitroanilinogruppe enthalten, praktisch identisch. Die spektrophotometris ehe Messung wurde deshalb in allen Fällen bei 405 nm durchgeführt.

Das N^a-Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA-HCl (Substrat gemäss Beispiel 1) besitzt den wichtigen Vorteil, dass es eine vier-

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mal höhere Wasserlöslichkeit (>4 mg/ml) aufweist als das in der DOS 2.322.116 beschriebene Thrombinsubstrat Bz-Phe-Val-ArgpN/vHCl (ungefähr 1 mg/ml) . Diese höhere Wasserlöslichkeit ermöglicht es, Enzymbestimmungen in einem viel breiteren Konzentrationsbereich auszuführen. Bei standardisierten biologischen Prüfverfahren ist dies vonmassgebender Bedeutung, weil gerade in diesen Fällen Extremwerte genau bestimmt werden können, ohne dass die biologischen Proben vorher verdünnt bzw. konzentriert werden müssen. Der dadurch erzielte Zeitgewinn ist oft ausschlaggebend, da man in der klinischen Praxis danach strebt, Extremwerte für die Diagnose möglichst- schnell zu bestimmen. Bei niedriger Substratlöslichkeit ist es nicht möglich, im ganzen Konzentrationsbereich Substratsättigung zu erzielen. .Wenn keine Substratsattigung besteht, weichen die Resultate der Enzymbestimmung von der Dosis A/irkungs-Kurve ab, was bei einem standardisierten biologischen Prüfverfahren von grossem Nachteil ist.

609853/1124

Die enzyinatische Hydrolysereaktion kann schematisch folgenderrnassen dargestellt werden:

.· E ·»■ S ES · > ES¹ -i Ghromuphor I'

^w ι ^X

^k2 j -^k-₄

E + P₂

E = Enzym

S = Substrat

ES = Enzyin-Substrat-Komplex P₁ und P₂ = Produkte k-, , kp , kg und k·, = Geschwindigkeitskonstanten Dissoziationskonstante für ES = τρ = K (Michaelis-Konstante)

Iv-I JfI

Wenn [S j » [Ej und k₄«k₃, gilt: _ ([IiJ - [ESj) · [SJ

^Km

Die Geschwindigkeitskonstante, bei vielcher i\ gebildet wird, ist: v= -k₃«[ES]

Wenn E vollständi/r, an S gebunden ist, so f^ilt: [ESj = [Ej und . '

^{v= v}max^{= k}3-t^Ej - ⁽³⁾

Linev/eaver-Hurk-Gleichunr^'.

6098S3/1124

Aus der Gleichung (2) folgt, dass die Konstanten K und k₃ die Wirksamkeit des Substrats f_{ur e}i_n gegebenes ^nzym bestimmen. Zur Bestimmung dieser Konstanten wendet man die folgende Methode an:

Man mischt das Enzym und das Substrat in einer Pufferlösung und verfolgt die Hydrolysereaktio.n während 2 bis 30 Minuten. Die Konzentration des Substrates [S] wird variiert, während die Enzymkonzentration konstant gehalten wird. Wenn die Extinktion (OD/Min = Aenderung der optischen Dichte pro Minute) in einem Koordinatensystem als Funktion der Zeit aufgetragen wird, erhält man eine Kurve, deren Tangente im Nullpunkt dem idealen Verlauf der Hydrolyse entspricht. Mit Hilfe dieser Tangente kann man die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse ermitteln. Wenn — als Funktion von -to—r aufgetragen wird,

Vo L"oJ

erhält man ein Lineweaver-Burk-Diagramm (siehe "Kurzes Lehrbuch der Biochemie", P. KARLSON, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, S. 70), aus welchem sich ν und K graphisch ermitteln lassen. . „

K und k_o = ^vmax wurden unter Verwendung von N^am 3 -g

Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl (Substrat gemäss Beispiel 1) für Human-Thrombin, Human-Plasmin und Rinder-Trypsin bestimmt. Mittels der Lineweaver-Burk-Gleichung wurden K und ν für die genannten Enzyme ermittelt (das Lineweaver-Burk-Diagramm für Human-Thrombin ist in Fig. 7 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt). Da die enzymatische Hydrolyse des Substrats durch

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- 4l -

Human-Thrombin dem Michaelis-Menton-rGesetz folgt, ist es möglieh, grosse Variationen in der Thrombinmenge genau zu bestimmen. Nach demselben Prinzip wurden K und v_mov für die anderen Enzyme ermittelt. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Alle Bestimmungen wurden in Tris-Imidazol-Puffer bei einer Ionenstärke von 0,15 und einem pH von 8,4 bei 37⁰C ausgeführt.

In den beigefügten Zeichnungen sind die Fig. 1

bis 6 graphische Darstellungen, in welchen die durch die hydrolytische Wirkung von Human-Thrombin, Ecarin-Thrombin,- Human-Staphylo-Thrombin, Batroxobin (aus Gift von Bothrops moojeni), Human-Plasmin bzw.. Rind er-Trypsin auf das Substrat gemäss Beispiel 1 hervorgerufene Aenderung der optischen Dichte Δ OD als Funktion der Zeit in einem Koordinatensystem aufgetragen ist. Zum Vergleich ist auch die durch die Wirkung der genannten Enzyme auf N^a-Bz-Phe-Val-Arg-pNA'HCl (Substrat gemäss DOS 2.322.1i6) hervorgerufene Aenderung der optischen Dichte aufgetragen. Alle Bestimmungen wurden ausgeführt in Tris-Imidazol-Puffer bei einer Ionenstärke von 0,15, einem pH von 7,9 und bei 37°C. Die Lösungen der beiden Substrate wiesen die gleiche molare Konzentration (1 μΜοΐ/ml) auf.

Fig. 7 stellt das. Lineweaver-Burk-Diagramm für Human-Thrombin dar.

Die Messungen, deren Resultate in den Fig. 1 bis 6 aufgezeichnet sind, wurden wie folgt durchgeführt:

0,25 ml Enzymlösung (0,56 NIH/ml Human-Thrombin, 0,28 NIH/ml Human-Ecarin-Thrombin, 1,05 NIH/ml Human-Staphylo-

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Thrombin, 4,0 NIH/ml Batroxobin (moojeni), 0,4 CU/ml Human-Plasmin und 1,8 NF/ml Rinder-Trypsin) wurde zu 2,0 ml Tris-Imidazol-Puffer (pH = 8,4, Ionenstärke = 0,15) gegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten bei 37°G präinkubiert. Dann wurde dem Gemisch 0,25. ml wässrige Substratlösung (1 μΜοΐ/ml des Substrats remäss Beispiel 1 bzw. des vorbekannten Substrats N -Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl) bei 37°C zugegeben. Die Zunahme der Absorption wurde spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen und mittels eines Schreibers kontinuierlich verfolgt. Die in dem Tabellen 1 und 2 zusammengestellten Messresultate wurden unter den oben definierten Testbedingungen ermittelt. Die Menge des gebildeten Spaltproduktes ist ein Mass für die Empfindlichkeit der Substrate gegenüber den Enzymen. Bei der Berechnung der pro Minute gebildeten Menge (Nmol) p-Nitroanilin wurde einfachheitshalber.ein molarer Extinktionskoeffizient von 10000 statt 9620 verwendet, da die Relation zwischen den Spaltbarkeiten der verschiedenen Substrate durch die Enzyme dadurch nicht geändert wird. Zur Berechnung der pro Minute gebildeten Menge (Nmol) ß-Naphthylamin bzw. 4-Methoxy-ß-naphthylamin (Substrate XII bis XV, XVIII und XIX) wurde die Probe in einem Fluoreszenzphotometer mit Licht einer Wellenlänge von 350 nm bestrahlt. Die Menge des gebildeten Spaltproduktes wurde durch Messung der Intensität des bei 42Ö nm emittierten Lichtes ermittelt.

Aus der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Suszeptibilität der gemass den Beispielen 1 bis 19 erhaltenen Substrate gegenüber Human-Thrombin, Human-Plasmin und Rinder-Trypsin ersichtlich.

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TABELLE 1

Aktivität von Human-Thrombin, Human-Plasmin und Rinder-Trypsin, gemessen mittels der erfindungsgemassen Substrate bei konstanter Substrat- und_aEnzymkonzentration. Zum Vergleich die entsprechenden mit N -Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl ermittelten Werte.

Substrat- konzentra- tion 10~⁴-m	Menge des pro Minute durch 1 NIH-Einheit Human- •Thrombin oder 1 CU-Einheit Human-Plasmin bzw. 1 NF-Rinder-Trypsin aus den Substraten enzyma tisch freigesetzten Spaltproduktes NH_p-R² in Nanomol	Human-P1asmi n	Rinder-Trypsin
Substrate	Human-Thrombin	36,0	8,4
N^a-Bz-Phe-Val- Arg-pNA.HCl	29,6	204,0	34,7 .
I	45,7	20,2	12,3
II	11,2	49,5	21,9
III	18,0	60,8	24,8
IV	21,3	33,8	28,5
V	2,4	47,3	20,1
VI	14,6	195,5	26,1
VII	73,8	111,0 .	27,5
VIII	65,8	126,0	33,0
IX	16,2	196,0	28,4
X	86,9	93,5	25,3
XI	43,8	116,9	19,5'
XII	28,5	109,0	21,7
XIII	29,6	95,6	18,2
XIV	19,5	125,0	28,6
XV	25,9	192,6	22,9
XVI	0,9	150 ,8	26,1
XVII	0,85	' 126,5	19,8
XVIII	1,1	98,5	19,2
XIX	0,6

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Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die gemäss den Beispielen 1 bis 19 erhaltenen Substrate, mit Ausnahme der Substrate· Il'und V, gegenüber Human-Plasmin eine signifikant und in den meisten Fällen wesentlich grössere Suszeptibilität aufweisen als das bekannte N^a-Bz-Phe-Val-ArgpNA.HCl. Gegenüber Rinder-Trypsin weisen die aufgezählten Substrate ausnahmslos eine wesentlich grössere Suszeptibilität auf als das bekannte Vergleichssubstrat» Aus der Tabelle 1 ist ferner ersichtlich, dass die Suszeptibilität der aus I, VII, VIII und XI gebildeten Gruppe von Substraten gegenüber Humanthrombin viel grosser ist als diejenige des bekannten Substrats.

TABELLE 2

Aktivität von Human-Ecarin-Throbmin, Human-Thrombinkoagulase und Batroxobin (aus Gift von Bothrops moojeni), gemessen mittels des erfindungsgemassen Substrates I bei konstanter Substrat- und Enzymkonzentration. Zum Vergleich die entsprechenden mit N -Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl gemessenen Werte.

Substrat konzentration 10~⁴-m	Menge des pro Minute durch die 1 NIH-Einheit entsprechenden Menge Human-Ecarin-Thrombin, Human-Thrombinkoagulase und Batroxobin aus dem Substrat enzymatisch abgespaltenen p-Nitroanilins in Nanomol	Human-Thrombin koagulase	Batroxobin
Substrate	Human-Ecarin- Thr ombin	102	3,26
N^a-Bz-Phe- Val-Arg- pNA.HOl	30,7	575	15,81 ·
I	246,4

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TABELLE

K und ν von verschiedenen Enzymen, bestimmt mittels der zwei

erfindungsgemässen Substrate N -Cbo-Gly-Pro-ArgpNA.HGl (I) und N -Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl (VII) [graphisch ermittelt aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm (Fig. 7)J

Enzym	^Km	Mol/Liter	,71	MO"⁵	Substr.VII	10~⁵	^vmax	μΜοΐ/Liter	IG'² MIH	Substr.VII	ΙΟ"² NIH
Human- Thrombin	Substrat I	,57	•ΙΟ"⁴	1,70	ΙΟ"⁴	Substrat · I	•ΙΟ"² CU	7,57·	¹⁰In
Human- Plasmin'	5	,70	'1O^-5	3,23<	'10~⁵	5,34	•ΙΟ"² NF	61,8	ΙΟ"² NF
Rinder- Trypsin	3		1,58	67,3		2,97
	2	4,27

Definitionen:

Die Thrombin-NIH-Einheit ist diejenige des "US National Institute of Health", und der Thrombinstandard entspricht dem "US Standard Thrombin Lot B-3" (21,7 NIH/mg), herausgegeben am 21.3. 1973 von der "Division of Biologies Standards, National Institute of Health, Bethesda, Maryland 20014, USA".

Die der NIH-Einheit entsprechende Menge Human-Ecarin-Thrombin, Human-Thrombinkoagulase und Batroxobin (moojeni) ist diejenige Menge des Enzyms, die eine Fibrinogenlösung unter Standardbedingungen in der gleichen Zeit zur

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Gerinnung bringt wie 1 NIH-Einheit Standard-Thrombin.. Testbedingungen: Das Gemisch von 0,2 ml einer Lösung von 1 NIH/ml "US Standard Thrombin Lot B-3" in Albuminpuffer (pH = 7,2) und 0,2 ml 0,4$iger Rinderfibrinogenlosung in destilliertem Wasser ergibt eine Gerinnungszeit von 20,P Sekunden.

Die Plasmin GU-Einheit ist die Casein-Einheit, die am Casein unter Standardbedingungen gemessen wird.

Eine Trypsin-NF-Einheit ist diejenige Menge

Enzym, die eine Absorptionsänderung Δ OD von 0,003 pro Minute, gemessen an Benzoyl-L-arginin-äthylester, unter Standardbedingungen bewirkt (siehe."The National Formulary XII", herausgegeben von der "The American Pharmaceutical Association", Washington, D.C., 1965, Seiten 417/418).

Eine Enzymeinheit ist diejenige Menge Enzym., die 1 μΜο.1 Substrat in einer Minute bei Sübstratsättigung und bei festgelegter Temperatur., Ionenstärke und pH hydrolysiert. Ein Tausendstel dieser Einheit ist eine Milli-EnzymeinheLt (mU), die entsprechend 1 Nanomol Substrat pro Minute unter den oben genannten Bedingungen hydrolysiert.

Eine Human-Thrombin-Einheit (1 U), gemessen mit dem erfindungsgemässen Substrat I (N^a~Cbo-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl) bei einer 1,5x10 -molaren Substratkonzentration, einer Temperatur von 37°C, einer Ionenstärke von 0,15 und einem pH von 8,4, entspricht der Menge von 27,1 NIH-Einheiten Human - Thro mb in (1 Millieinheit = 0,0271 NIH-Einheit oder 1 NIH-Einheit - 36,9 . Millieinheiten).

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Dadurch ist es-möglich, kleinere Mengen dieser Enzyme mittels der erfindungsgemässen Substrate zu bestimmen als mit dem vorbekannten Substrat, was in der klinischen Praxis von grösster Wichtigkeit ist, wo oft nur kleine Probemengen zur Verrügung stehen oder wenn die Konzentration der Proben der zu bestimmenden Enzyme, Proenzyme, Proenzymaktivatoren und Enzyminhibitoren bei pathologischen Zuständen extrem gering ist.

Die erfindungsgemässen Substrate können z.B. auch zur Bestimmung von Prothrombin und Antithrombin verwendet werden , wie im folgenden gezeigt wird.

Zur ProthrombinbeStimmung wurden zu 0,5 ml Glycin-

puffer mit pH 8,4 und einer Ionenstärke von 0,3 5 μΐ Citrat-

TM
plasma (Markenprodukt "Gi-TROL Normal" der Firma American Hospital Supply Corp., DADE division, Miami) zugegeben. Die Mischung wurde während 30 Sekunden bei 37°G präinkubiert. Dann wurden der präinkubierten Mischung 100 μΐ wässriger Calcium thromboplastinlosung zugesetzt (Calciumthromboplastin ist ein von der Firma Boehringer, Mannheim, kommerzialisierter Prothrombinaktivator). Die erhaltene Mischung wurde bei 37°G inkubiert. Nach 2 1/4 Minuten Inkubationszeit war die Prothrombinaktivierung vollständig. Nach Inkubationszeiten von mehr als 5 Minuten verschwand ein Teil des aktivierten Thrombins als Folge der Einwirkung der im Plasma enthaltenen Antithrombine. Nach einer Inkubationszeit von 4 Minuten wurden der genannten Mischung 1 ml Glycinpuffer mit pH 8,4, einer Ionenstärke von 0,3 und einer Temperatur von 37°C und anschliessend 0,25 ml

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einer 1,5 χ 10" -molaren wässrigen Lösung des Substrates I zugesetzt. Der Verlauf der Hydrolyse des Substrates wurde durch photometrische Messung der Menge des pro Minute freigesetzten p-Nitroanilins bei 405 nm verfolgt. Die Zunahme der optischen Dichte betrug 0,162 pro Minute. Aus diesem Wert und dem molaren Extinktionskoeffizienten des p-Nitrophenylanilins bei 405 nm von 10'000 wurde der Wert von 5,99 mU des aus Prothrombin gebildeten Thrombins pro μΐ Plasma errechnet. Daraus folgte, dass 5,99 Einheiten Substrat X Thrombin pro ml Plasma aus dem Prothrombin gebildet worden waren, was 162,3 NIH-Einheiten Thrombin pro ml Plasma entspricht.

Zur Antithrombinbestimmung wurde zu 1 ml eines 3 USP-•Einheiten Heparin enthaltenden Glycinpuffers mit pH 8,4 und einer Ionenstärke von 0,3 0,1 ml einer wässrigen Thrombin-' lösung mit einer Konzentration von 25 bis 40 NIH-Einheiten pro ni bei 37°C zugesetzt. Der erhaltenen Mischung wurden Mengen von 2,5 bis 10 μΐ Citratplasma zugesetzt, worauf die Mischung während 30 Sekunden bei 37°C inkubiert wurde.« Der inkubierten Mischung wurde sofort 0,25 ml "Polybren"-Lösung (Konzentration 1 mg "Polybren" pro 1 ml 0,3-molarer Kochsalzlösung) zugesetzt ("Polybren" ist ein aus l,5-Dimethyl-l,5->diazaundecamethylenpolymethobromid bestehendes, von der Firma Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, V/isconsin, USA, vertriebenes Produkt) . Die erhaltene Mischung wurde während 30 Sekunden bei 37⁰^ inkubiert. Dann wurde der Mischung 0,5 ml einer 0,75 χ 10" -molaren wässrigen Substrat-I-LÖsung zugesetzt. Der Verlauf der Hydrolyse des Substrats durch das von ^Hntithrombin nicht

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neutralisierte Thrombin wurde durch photometrische Messung der Menge des pro Minute freigesetzten p-Nitroanilins bei 405 nm verfolgt. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung des eingesetzten Thrombins durch verschiedene Mengen Citratplasma diesen Mengen proportional war.

TABELLE 4

H

H-

W

3*

ο

Φ

S5E

M

ο

t>

3

H

' O

ο

3

H

ρ

490

ΐ>

3

■

CT

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ο

[>

3

H-

θ

W

0,525

3

O

M

3

α

M

3

390

M

3

M

3

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Φ

ο

Cj

■\^

C

270

ο

P

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Q

ο

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H-

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H-

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P

3

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H-

Ct

H-

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3

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H-

Φ

H-

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H

H-

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H

3

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H-

ω

),835

(Jl

φ

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φ

(Jl

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Φ

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3

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6

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Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass Variationen in der Menge des in der Inkubationsmischung enthaltenen Thrombins zwischen 2,6 und 4,1 NIH-Einheiten keinen Einfluss auf die Bestimmung des Antithrombins ausüben, wenn die Plasmamengen zwischen 2,5 und 10 μΐ liegen. Es wurden pro μΐ Plasma 6,-40-4$ Sübstrat-I-Milli-Inhibitoreinheiten Antithrombin gemessen, was 6400±4%.Substrat-I-Milli-Inhibitoreinheiten pro ml Plasma entspricht. Dies bedeutet, dass 1 ml Plasma 17-3,4-4$ NIH-Einheiten Thrombin zu hemmen vermag.

609853/Π24

Claims

- 51 PATENTANSPRÜCHE

Substrat, das als Reagens zur quantitativen Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C. 3.4.4., welche Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie in tierischen Zellextrakten und in Drüsengiften von Kaltblütlern durch photometrische, spektrophotometrische oder fluoreszenzphotometrisehe Methoden verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Struktur aufweist:

R¹ _ GIy - Pro - X - NH - R² I

worin R Wasserstoff oder eine blockierende Acyl- oder Sulfonylgruppe, R einen gegebenenfalls Substituenten tragenden aromatischen Kohlenwasserstoffrest und X eine Arginyl- oder Lysylgruppe darstellen, wobei -NH-R eine chromophore bzw. fluoreszierende Gruppe darstellt, und dass es die Eigenschaft besitzt, unter der hydrolytischen Einwirkung der genannten Enzyme ein

2
Spaltprodukt der Formel NH₂-R abzugeben, dessen Menge durch die genannten photometrischen Methoden quantitativ messbar ist.
2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer Mineralsäure, z.B. HCl, HBr, HpSO. oder H₃PO₄, oder einer organischen Säure, z.B. Ameisensäure, Oxalsäure oder Weinsäure, protonisiert ist.
3. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die durch R bezeichnete Acylgruppe die folgende Teilformel aufweist:

R³ - CO - II

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worin R"

(a) einen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen,

(b) einen araliphatischen Kohlenwasserstoffrest, dessen aliphatische Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält,

(c) einen cycloaliphatischen Kohlenwasserstoffrest,

(d) einen aromatischen Kohlenwasserstaffrest oder

(e) eine Alkyloxygruppe mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen oder eine Benzyloxygruppe bezeichnet.
4. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gegekennzeichnet, dass die durch R bezeichnete Sulfonylgruppe eine Alkansulfonylgruppe, deren Alkanrest 1 bis 17 Kohlenstoffatome enthält, z.B. eine Methan- oder Aethansulfonylgruppe, oder eine Arylsulfonylgruppe, deren aromatischer Kern gegebenenfalls mit einem oder mehreren niederen Alkylresten substituiert ist, z.B. eine Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl- oder Naphthalinsulfonylgruppe, ist.
5. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

-2
zeichnet, dass R eine p-Nitrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy-2-naphthylgruppe ist.

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6. Substrat zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C.3.4.4., welche Peptidketten auf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, insbesondere Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen, dadurch gekennzeichnet, .dass es die folgende Struktur aufweist:

R¹ - GIy - Pro - Arg - NH - R²

worin R eine Alkyloxycarbonylgruppe, deren Alkylrest .1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Aralkyloxycarbonylgruppe, deren Alkylenrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Alkyl-sulfonylgruppe, deren Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Arylsulfonylgruppe, deren Arylrest gegebenenfalls Substituenten trägt, oder eine Alkanoylgruppe, deren Alkanrest 1 bis

6 Kohlen st off atome enthält, darstellt und R eine p-Nitrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy-2-naphthylgruppe ist.
7. N^a-2-Naphthalinsulfonyl-glycyl-prolylarginin-p-nitroanilid-chlorhydrat.
8. N^a-Tosyl-glycyl-prolyl-arginin-p-nitroanilid-chlorhydrat.
9. N -Benzolsulfοnyl-glycyl-prolyl-argininp-nitroanilid-chlorhydrat.

609853/11,24
10. l^-Benzyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-argininp-nitroanilid-chlorhydrat.
11. N^a-Isobutyloxycarbonyl-glycyl-prolyl-argininp-nitroanilid-chlorhydrat.
12. Verwendung des Substrates geraäss Anspruch 1 zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C. 3.4.4., welche Peptidkettenauf der Garboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie .in tierischen Zellextrakten und in Drüsengiften von Kaltblütlern.
13. Verwendung gemäss Anspruch 12 zur Bestimmung von Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen, Ecarinthrombin, Plasmin und plasminähnlichen Enzymen, Trypsin sowie von Proenzymen, Proenzymaktivatoren und Enzyminhibitoren.
14. Verwendung des Substrates gemäss Anspruch 6, zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.C. 3.4.4., welche Peptidketten auf der Carboxylseit e sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten, insbesondere Thrombin und thrombinähnlichen Enzymen, in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie in tierischen Zellextrakten und in Drüsengiften von Kaltblütlern.
15. Verfahren zur Bestimmung von proteolytischen Enzymen der Gruppe E.G. 3.4.4., welche Peptidkettenauf der Carboxylseite sowohl von Arginin als auch von Lysin spalten ,

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in Körperflüssigkeiten des Menschen und der Säugetiere sowie in tierischen Zellextrakten und in Drüsengiften von Kaltblütlern, dadurch gekennzeichnet, dass man die genannten Körperflüssigkeiten, Zellextrakte bzw. Drüsengifte mit einem Substrat zur Reaktion bringt, welches die folgende Struktur aufweist:

R¹ _ Giy - Pro - X - NH - R² I,

worin R Wasserstoff oder eine blockierende Acyl- oder

ο
SuIfonylgruppe, R einen gegebenenfalls Substituenten tragenden aromatischen Kohlenwasserstoffrest "und X eine Arginyl- oder Lysylgruppe darstellen, wobei -NH-R eine chromophore bzw. fluoreszierende Gruppe darstellt, und dass man die Menge des durch die hydrolytische Einwirkung

der Enzyme auf das Substrat gebildeten Spaltproduktes NHp-R durch photometrische, spektrophotometrisehe oder fluoreszenzphotometrische Methoden quantitativ misst.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man Thrombin und thrombinähnliche Enzyme, Ecarinthrombin, Plasmin und plasminähnliche Enzyme, Trypsin sowie Proenzyme, Proenzymaktivatoren und Enzyminhibitoren bestimmt.
17. Verfahren nach. Anspruch 15 zur Bestimmung von Thrombin und thrombinähn3ichen Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man die genannten Körperflüssigkeiten, Zellextrakte bzw. Drüsengifte mit einem Substrat zur Reaktion bringt, welches die folgende Struktur" aufweist:

R¹ _ GIy - Pro - Arg- NH-R²

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-■ 56 -

worin R eine Alkyloxycarbonylgruppe, deren Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoff atome enthält, eine Ar al k oxycarbonyl gruppe, deren Alkylenrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Alkylsulfonylgruppe, deren Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, eine Arylsulfonylgruppe, deren Arylrest gegebenenfalls Substituenten trägt, oder eine Alkanoylgruppe, deren Alkanrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, darstellt

und R eine p-Nitrophenyl-, 2-Naphthyl- oder 4-Methoxy-2-naphthylgruppe ist.

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