DE2552570B2 - Tri- und Tetrapeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Serinproteasen - Google Patents

Tri- und Tetrapeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Serinproteasen

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Description

2. Tetrapeptide der allgemeinen Formel
R1 A1 A2 Gly-Arg-NH-R- (II)
in der A' GIy, Vai, Leu, lie. Pro, Phe oder Tyr bedeutet und die Reste R1, A- und R1 die in Anspruch 1 angegebener. Bedeutungen haben.
3. Verwendung der Tri- und Tetrapeptide nach Anspruch 1 und 2 zur Bestimmung von Serinproteasen.
Die Erfindung betrifft Tripeptide der allgemeinen Formel
R1 Α' C;iy-Ar»-Nll-R-
sovvic Tetrapeptide der alluemeinen Formel
R1 Λ1 Λ- Gly-Arg-NH-R-
mit den in den Ansprüchen angegebenen Bedeutungen sowie deren Verwendung zur Bestimmung von Serin proteasen.
Die Tri- bzw. Tetrapeptide der Erfindung sind insbes. für die Bestimmung des Faktors Xa(E. C. 3.4. 21.6) oder für die Untersuchung von Reaktionen, die die Bildung, Inhibicrung oder Verbrauch von Xa verursachen, oder selbst für die Bestimmung solcher Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an ihnen teilnehmen, geeignet.
Der Faktor X ist eine Schlüsselsubstanz in der Reaktionsreihe, die zur Blulkoagulation führt. Die Aktivierung des Faktors X bewirkt die Bildung des proteolytischen Enzyms, des Faktors Xa, welches direkt für '.lie Umwandlung von Prothrombin in Thrombin verantwortlich ist. Für Diagnosen wäre es besonders wertvoll, wenn ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa zur Verfügung stünde.
Die bisher verwendeten Reagenzien zur Bestimmung des Faktors Xa bestehen gewöhnlich aus Estersubstraten sehr unspe/ifischcn Charakters. Ein Beispiel hierfür ist p-Nitrophenyl-p'-guanidinebenzoat (p-NPGB), das ein gutes Substrat für Thrombin, Trypsin und Plasmin ist. Seine Anwendbarkeit für den Faktor Xa ist auf die Verwendung für gereinigte Enzymzubereitungen begrenzt. Die bei der Verwendung von Blut erhaltenen Ergebnisse sind nicht verwertbar, sind /war infolge der Anwesenheit von anderen Estcrasen mit einer Aktivität für P-NPCiU(R. L Smith. I.Biol.Chem. 24«, 2418 (1972).
In der DE-OS 23 22 116 sind sehr gut wirkende chromogene Amidsubstrate für Thrombin-ähnliche Enzyme beschrieben worden. Eines dieser Substrate mit der Formel
Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid (A)
arbeitet gut bei Thrombin, wird jedoch bei der Verwendung mit dem Faktor Xa lediglich geringfügig gespalten. Die Suszeptibilität eines Substrates bezüglich Thrombin soll vernachlässigbar sein, wenn es in diagnostischer Blutanalyse für den Faktor Xa verwendet werden soll.
Die Bereitstellung eines für den Faktor Xa spezifischen Substrats, das somit gegenüber der Spaltung durch Thrombin weniger empfindlich ist, wäre daher erwünscht. Das Substrat sollte die biologischen Funktionen des Enzyms, d. h. die Spt'ajng von Amidbildungen, messen. Weiterhin ist es erwünscht, daß das Substrat rasch in leicht bestimmbare Produkte gespalten werden kann, z. B. in chromophore Verbindungen, die in leichter Weise spektrophotometrisch verfolgt werden können.
Die Tri- bzw. Tetrapeptide der Erfindung können grundsätzlich gemäß zwei verschiedenen Verfahren hergestellt werden.
1. Das erste Verfahren beruht auf der Kopplung der chromophoren Gruppe Rj mit Arginin, gefolgt von einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur mittels einer fortschreitenden Kopplung der verbleibenden Aminosäuren. Die chromophore Gruppe wird hier als Blockierungsgruppe der c-terminalen Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet.
2. Das andere Verfahren beruht auf dem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur, wonach die verwend en ßlockierungsgruppen entfernt und die chromophore Gruppe Ri an die Pcptidstruktur gekoppelt wird.
Während der .Stufensynthese der Peptidstruklur gemäß den genannten Verfahren ist es möglich, nach jedem Koppeln einer neuen Aminosäuren eine geeigne te Reinigung durch Gelfiltration zu bewirken.
Die in der Stufensynthcse der Pcptidderivate verwendeten Kopplungsmethoden sind an sich bekannt und in der Peptidchcmic üblich. Als .Schutzfunktion für Aminogruppen können bekannte und in der Pcptidchemie übliche .Schutzgruppen, z. II.
Cbo (carboben/oxy).
MeOCbo(p-Methoxycarbobenzoxy),
NO2CbO (p-Nitroearbobcnzoxy),
MCbofp-Methoxyphenylazocarbobcnzoxy),
BOC (tert.-Butyloxycarbonyl),
TFA (trifluoracetyl) oder
Formyl
verwendet werden. Die x-Carboxylgruppe kann mittels einer Umwandlung in andere aktive, in der Peptidchc mie bekannte und häufig verwendete Derivate aktiviert werden. Diese Derivate können entweder isoliert oder in situ hergestellt werden. Beispiele hierfür sind p-Nitrophenylestcr, Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidestcr, Säureazide und Säiireanhydride, wobei die letzteren entweder symmetrisch oder unsymmetrisch sein können. Sie kann auch mit einem Carbodiimid aktiviert werden. /. IJ. mit N-N'-Dicyclohcxalcarhodiimid. Die C'-lcrminale ( nrb
oxylgruppe in dem Aminopeptidderivat oder dem Aminosäuederivat kann durch Veresterung geschützt werden, und zwar z. B, durch Veresterung zum Methyl-, Ethyl- oder Isopropylester, oder mittels einer Umwandlung zu dem chromophoren Anilinderivat, das dabei als Schutzgruppe während des Aufbaus der Peptidkette wirkt. Diejenigen freien funktionellen Gruppen, die nicht an der Reaktion teilnehmen, können während der Synthese der Peptide oder der Peptidderivate in der folgenden Weise geschützt werden:
Für den Schutz der verbleibenden Arginyl-(5-guanidogruppe kann man in der Peptidchemie übliche Aminoschutzgruppen verwenden, z. B. die bei der Protonierung erhaltene oder NO2 oder TOS (p-Toluolsulfonyl).
H) Als Schutz für die Carboxylgruppe der Glutamin- und Asparaginsäure kanr man ebenfallshäufigin der Peptidchemie verwendete Schutzgruppen, z. B. die Benzyl- und tertiären Butylschutzgruppen verwenden.
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert, wobei auf die Beispiele bezug genommen wird. Die Beispiele erläutern die Herstellung verschiedener Substrate gemäß der Erfindung mittels der Stufensynthese.
Bei der dünnschichtchromatografischen Analyse von Eluaten und Produkten wurden als Absorptionsmedium mit Silicagel F>w beschichtete Glasplatten verwendet. Die verwendeten Lösungsmittelsysteme sind gemäß der folgenden Tabelle bezeichnet:
Bezeichnung Lösungsmittel
Volumenverhältnisse
Λ
C
I)
Pl
n-Butanol : Essigsäure : Wasser n-Propanol : Ethylacetat : Wasser n-IIeptan : n-Butanol : Essigsäure Chloroform : Methanol
Nach der Dünnschichtchromatografie wurden die Platten zunächst im UV-Licht (254 ,im) und anschließend mittels der Chlor/Toluidinreaktion als Entwicklungsverfahren untersucht (Lit.: G. Pataki: Dünnschichtchromatografie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruylcr, Berlin, 1966, S. 125).
Die Bedeutung der nachstehend verwendeten Abkürzungen sind die folgenden:
Aminosäuren
Diese Abkürzungen beziehen sich auf Aminosäurereste. Die freie Aminosäure oder das freie Peptid werden mittels II- an der Aminogruppe und -Oll an der Carboxylgruppe bezeichnet. Die Aminogruppc wird immer links, die Carboxylgruppe rechts angegeben.
Arg = Arginin = Acetyl
Asn = Asparagin = Acetanhydrid
Asp = Asparaginsäure = Essigsäure
Gin = Glutamin = tcrt.-ßutyloxycarbonyl
GIu = Glutaminsäure = Benzoyl
GIy = CJIycin = Benzyl
lie = Isoleucin = Benzoesäureanhydricl
Leu = Leucin = Carbobenzoxy
Phe = Phenylalanin = Dicyclohcxylcarbodiimid
Pro = Prolin = Dimethylformamid
Tyr = Tyrosin -■= Triethylamin
VaI = Valin = p-Mclhoxyphcnyla/ocarboben/oxy
;ere Abkürzungen: = Methanol
Ac
Ac..()
AcOH
BOG
Bz
ßZI
Bz2O
Cbo
DCCL
DMF
Et1N
MCbo
MeOII
(3:1:1)
(7:1:2!
(3:2:1)
(9:1)
OtBu = tert.-Butyloxy
OEt = Ethylo* y
OMe = Methyloxy
OpNP = p-Nitrophenoxy
OiPr = i-Propyloxy
pNA = p-Nitroanilid
TFA = Trifluoracetyl
TOS = 4-Toluolsulfonyl
Das Gel 15. das in den Ausführungsbeispielen bei der Gelfiltration verwendet wird, ist ein quervernetztes Dextrangel. Das Gel LH-20 ist ein hydroxypropyliertes quervernetztes Dextrangel. Der Ionenaustauscher QAE-25 ist ein quervernetztes Dextra.nijel mit Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethyI-Funktionen als funktionelle Gruppe.
Beispiel I
Bz-lle-GluGly-ArgpNA
Die Verbindungen la bis Id sind Zwischenprodukte
la
Cbo-Gly-Arg-(NO,)-pNA
(Mol-Gew. 5J0.4)
5,0 g (10,6 mMol) Cbo-Arg-(NO2)-pNA wird in 21 ml AcOIi und 22 ml 4 N HBr in AcOH unter wasserfreien Bedingungen gelöst. Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und danach langsam in 200 ml Ether unter heftigem Rühren eingegossen. Die Etherlösung wird dekantiert und der erhaltene granulatförmige Rückstand wird weitere zwei mal mit 100 ml Ether behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum über PjO-, und KOH-Plätzchen bei JO0C erhält man eine nahezu quantitative Ausbeute (4,95 g) des Hydrobmmids des Aminosäurederivats. Das Produkt erweist sich in A als dünnschichtchromatographisch homogen.
Das obige Produkt wird in 50 ml destillierten DMF gelöst. Die Lösung wird auf -I0"C gekühlt und mit EtiN versetzt, bis die Lösung neutral ist (2,1 ml). Ausgefallenes Et iN · HIJr wird abgefiltert und das liltiiil wird aiii -IOC gekühlt ).Mg (II.« mMol)
Cbo-Gly-OpNP werden zugegeben. Man läßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach drei Stunden wird die Lösung erneut auf - 10°C gekühlt und mit 0,45 g (5,3 mMol) Et3N gepuffert. Die Pufferprozedur wird ein weiteres Mal nach zwei bis drei Stunden wiederholt. Man läßt die Reaktionslösung über Nacht stehen und verdampft im Vakuum bei 40"C. Das zurückbleibende schwere öl wird sorgfältig mit 100 ml destilliei tem Wasser gerührt. Das Wasser wird dekantiert, und das Waschverfahren wird weitere zwei Mal wiederholt. Das zurückbleibende öl wird in warmem MeOH gelöst. Beim Kühlen fällt das Produkt in kristalliner Form aus.
Ausbeute: 4,2 g (75%) Ia.
Homogen gemäß Dünnschichtchromatographie (TLC) in P1 (R1 =0,16)
[α]*1 -36° <t 0,50. MeOH).
Ib
t-BOC-Glu-(y-OBZI)-Gw-Arg(NO:>)-pNA
" (M. W. 715.8)
2,65 g (5,0 mMol) Ia wird decarbobenzoxyliert und mit 2,50 g (5,5 mMol) t-BOC-Glufr-OBZIJ-OpNP gemäß dem Verfahren in Beispiel Ia gekoppelt. Das rohe Produkt wird durch Gelchromatografie an einer LH-20 in MeOH enthaltenden Kolonne gereinigt.
Ausbeute: 3.25 g (910Zo)Ib
Homogen gemäß TLC in P, (Ri = 0,22)
[<%}' - 34° (c 1,0. MeOH)
Ic
Cbo-lle-Glu()"OBZI)-Gly-Arg(NO2)-pNA
(Mol Gew. 862.9)
1,08 g (1.5 niMol) Ib werden in 10 ml TF-A gelöst. Die Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und danach langsam in 75 ml heftig gerührten trockenen Ether gegossen. Die Etherlösung wird dekantiert und der e.haltene granulatförmige Rückstand wird weitere zwei Ma! mit 50 ml Ether behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum über P2O5 und KOH-Plätzchcn bei 30:C erhält man dasTFA-SaIz desTripeptiddcrivats in nahezu quantitativer Ausbeute (1,08l')·
Das Produkt ist gemäß TLC in A homogen. Das obige Produkt wird in 20 ml DM F gelöst. Die Lösung wird auf -|0"C gekühlt und mil EtjN (0,23 ml) neutralisiert. Danach fügt man 0,65 g (1,68 mMol) Cbo-Ile-OpNP hinzu und läßt die Lösung langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach etwa drei Stunden wird die Lösung erneul auf - 10 gekühlt und mil 0,12 ml Et1N gepuffert. Das Pufferverfahren wird ein weiteres Mal nach zwei bis drei Stunden wiederholt. Man läßl die Lösung über Nacht Mehcn. Der Überschuß an Cbo-Ile-OpNP wird dann durch Zugabe von etwa 100 mg j^ca.1,4 mMol) n-Butylamin zu der Lösung zerstört. (Der Überschuß an aktivem Fstcr isi unerwünscht, da es schwierig ist. diesen bei der Gelfiltration von dem Tetrapcptid abzutrennen). Nach etwa 30 Minuten wird die Lösung im Vakuum bei 401C eingedampft. Das verbleibende schwere Ol wird mit drei Portionen destilliertem Wasser gewaschen. Das Öl wird in McOH gelöst und durch Gclchromaiografic an einer mit LH-20 in Methanol gefüllten Kolonne gereinigt.
Ausbeute:
1,07 g (K J1M.) Ic. Ik.mögen gemäß TLC in P,
(R1 = 0.J5)
\\\ ' 12 ,V0.3. MeOH : DM1.95:5)
Id
Bz-lle-Glu()>-OBZI)-G|y-Arg(NO2)-pNA
260 mg (0,30 mMol) Ic wird gemäß dem Verfahren des Beispiels Ia decarbobenzoxyliert Das Produkt zeigt im TLC in A zwei Flecken (Ri = 0,45 und 0,60). Das IR-Spektrum zeigt, daß das Produkt aus einem Gemisch von
HBr · H-Ile-Glu()<-OH)-Gry-Arg(NO2)-pNA und
HBr · H-Ile-Glu(}'-OBZI)-Gly-Arg(NO2)-pNA
besteht. Dieses Gemisch wird mit 800 mg (0,35 mMol) Benzoesäureanhydrid gemäß dem Verfahren des Beispiels Ia umgesetzt. Das rohe benzoylierte Produkt wird an einer Kolonne mit LH-20 in Methanol gereinigt. Man erhält zwei Fraktionen, und zwar α: 130 mg, [«]:' -15C (cO,5, CHjCN), R,=20 in P, und ß: 105 mg, [α];' -11° (c 0,5, CH1CN), Ri = 0,06 in P1. Das IR-Spektrum zeigt, daß die zwei Fraktionen aus
Bz-IIe-GIu(>'-OBZI)-Gly-Arg(NO2)pNAund
Bz-IIe-GIu-Gly-Arg(NO^NA
besteht. (Die Reaktion mit Hf ergibt aus beiden Fraktionen das gleiche Endprodukt, Ie.)
Ie
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA HCI
(Mol-Gew. 734.3)
100 mg (0.12 mMol) Id. Fraktion «, und 0,5 ml Anisol werden in das Reaktionsgefäß eines Sakakibara-Apparates gegeben. In das Gefäß werden etwa 5 ml trockener Fluorwasserstoff eindestilliert. Man läßt 75 Minuten unter Rühren bei 00C reagieren. Der Fluorwasserstoff wird dann unter vermindertem Druck abdestilliert und man löst den öligen Rückstand in 10 ml AcOH (33% in Wasser) sowie reinigt chromatografisch an einer Kolonne mit G-15 in 33% AcOH in Wasser. Die das reine, von der Schutzgruppe befreite Tt'.rapeptidderivat enthaltende Fraktion des Eluals wird dann lyophilisiert. Die erhaltene Verbindung wird in MeOH : destilliertem Wasser (95 : 5) gelöst und an einem schwach basischen anionischen Austauscher QAL A-25 in dessen Chloridform, und zwar mi' dem gleichen Lösungsmittclgcmisch aus Eluant. chromatografiert. Das Methanol wird aus dem Lluat bei 30' C unter vermindertem Druck entfernt. Die verbleibende wäßrige Lösung wird lyophilisiert.
Ausbeute:
75 mg (85%). homogen gemäß TL(' in A (R. = 0.48).
[r\]' -40 'rO.5. 50% AcOH in dest. Wasser)
Aminosäurcnar.alysc:
lic: 0,9«. GIu: 0.9b. Arg: 0.89. GIy: 1.00.
He: spie I 11
H-lle-Glii-(;i>-Arg-pNA 2 HCI
100 mg ('),116mMol) Ic wird mit Fluor«,asse;stoff umgesetzt, gereinigt und an einem Ionenaustauscher behandelt, und /war gemäß den Verfahren des Heispiels Ie.
Ausbeute:
5b mg (73%). homogen gemäß 1 LC in A (R1 = 0.34).
[α] ' -35" (V 0.5. 50"/(i AcOH in destilliertem Wasser)
Aminosäurcanhlvse:
He: 0.9b, GIu: 0.94. Arg: 0.96. GIy: 1.00.
Weiterhin wurden die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen III bis XXVI her gestellt.
Tabelle
Beispiel Substrat (Hydrochloride) I ■'!?') TLC2)
(eingegangen
am 6. 7. 1977)
Hl Bz-Leu-Olu-Oly-Arg-pNA -35 0,52
IV Bz-Val-Glu-Gly-Arg-pNA -43 0,48
V Bz-Pro-Glu-Gly-Arg-pNA -77 0,40
Vl Bz-Gly-Glu-Gly-Arg-pNA 17 0,42
VII Bz-Phe-Glu-Gly-Arg-pNA 45 0,52
VIII Bz-Tyr-Glu-Gly-Arg-pNA 43 0,33
IX Ae-lle-Glu-Gly-Arg-pNA 37 0.40
X ll-lle-Glu-Gly-Arg-pNA -35 0,32
Xl M-Pro-Glu-Gly-Arg-pNA 61 0,20
\ü M-G!y-G!u-G!y-Arg-pNA - 5!) 0,26
XIII H-Phe-Glu-Gly-Arg-pNA -38 0,38
XIV Bz-llc-Gln-Gly-Arg-pNA -40 0,42
XV Bz-lle-Asp-Gly-Arg-pNA -53 0,50
XVI Bz-llc-Asn-Gly-Arg-pNA 36 0.42
XVII Bz-Glu-Gly-Arg-pNA - 16 0.46
XVIII Bz-Gln-Gly-Arg-pNA -17 0,40
XIX Bz-Asp-Gly-Arg-pNA -38 0.46
XX Bz-Asn-Gly-Arg-pNA 24 0,40
XXI H-Glu-Gly-Arg-pNA -24 0,30
XXII H-Asp-Gly-Arg-pNA 26 0.24
XXIII H-Asn-Gly-Arg-pNA - 30 0,16
XXIV H-Gln-Gly-Arg-pNA -27 0.25
XXV Bz-IIe-GIu-GIy-A rg-2-Niiphthyliimid -41 0.26
XXVI Bz-lle-Glu-Gly-Arg-4-Methoxy-2-Naphthylamid 40 0.28
1I ( 0.5 in 50% l-ssigsäurc.
') K1-WeHe: I)C-I ertigplattcn Kieselgel 60
in Butanol : lis-iesa'urc : Wa-ser
Beispiel XXVII
C Il C'Ο lleülu-Gly-Arg-pNA ■ HCL (M. W. = 812,4)
(eingegangen am 14.7.1978) Die Verbindungen XXVII a und b betreffen Zwischenprodukte.
XXVIIa
BOC-l!e-Glu(OBZI)-Gly-Arg(NO2)pNA (M. W. = 828.9)
Ausführung und Ausgangsmaterial wie für I c; statt Cbo-Ile-OpNP jedoch BOC-He-OpNP Ausbeute: 113 g (76%) XXVI a.
TLC in P, (R. =0,35) zeigt nur einen Fleck. [*] -35.3C CC03, MeOH)
XXVIIb
C,iH>,CO-Ile-Glu(OBZl)-Gly-Arg(NO2)pNA (M. W. = 911,1)
829 mg (1.0 mMol) XXViI a werden in 7 ml trockenem CHjCI: gelöst und 2,4 ml trockenes, destilliertes TFA zugegeben. Man läßt 20 Minuten reagieren, wonach das Produkt mit Ether ausgefällt und auf übliche Weise getrocknet wird. Das trockene DFA-SaIz wird in 3 ml Dioxan gelöst und mit 185 mg (2,2 mMol in 2 ml destilliertem Wasser gelösten NaHCOi versetzt. Unter Kälte und Rühren werden danach 360 μ 1 (etwa 1,5 mMol) Laurinsäurechlorid (CiιH2)COCI) hinzugegeben. Kurz danach erstarrt der ganze Kolbeninhalt; und das TLC (P1) ergibt, daß die Reaktion beendet ist und so gut wie keine Nebenprodukte gebildet wurden.
Das Produkt wird mit destilliertem Wasser durchgearbeitet und anschließend aus warmem MeOH umkristallisiert.
Ausbeute: 562 mg(62%) XXVII b
TLC in P, (Rf = 033): nur ein Fleck
[«]■ -12,7VCK
XXVlIc
250 mg (0,27 mMol) XXVII b läßt man mit Fluorwasserstoff gemäß Beispiel I e reagieren, jedoch ohne Anisol. Der eingedampfte Rückstand wird in einer
kleinen Menge MeOH gelöst und an einer Säule mit LH-20 in MeOH, wobei MeOH Eluationsmittel ist, chromatografiert. Die Fraktion mit dem gewünschten Produkt wird in einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Die Substanz wird in EtOH : H2O 50:50 gelöst. Es folgt h-enaustausch an einer Sephadex®-Säule (QAE · 25) in ChI jridform; das gleiche Mittel dient als Elutionsmittel. Das Eluat wird aus einer Wasser-Essigsäure-Mischung lyophilisiert, nachdem das FtOH v.'jllig verdampft wurde.
Ausbeute: 107 mg(48%) XXVII.
TLC in A(R, = 0,48): nur ein Fleck.
M -51.1"
(CO.b, 50% AcOlI in destilliertem Wasser)
Chloridgelvilt - 4.3.3% (theoretisch 4,37%).
Das in Beispiel I beschriebene Substrat wurde in der
Tabelle 2
Konz. Substrat Relative Reaktionsgeschwindigkeiten
Throm- Xa Trypsin Plasmin
bin
0,1 mM (A)
0,25 mM I
100
100
KX)
500
100
iinmiina
Die Tabelle zeigt, daß der Faktor Xa das Substrat Ic 100 mal schneller alt (A) spaltet. Im Vergleich zu (A) wird es lediglich in einem unbedeutenden Ausmaß durch Thrombin beeinflußt. Es liegt somit auf der Hand, daß I entsprechend diesem Vergleich eindeutig das beste Substrat für Xa ist. Weiterhin zeigt die Tabelle, daß I erfolgreich auch als Substrat für Trypsin verwendet werden kann. Dieser positive Trypsineffekt stört jedoch nirht pinp RpchmmnnD /l**c Palrlrvrc Yu /I-.» Xruncin
verwendet: Das Prinzip der Bestimmung beruht auf der Talsache, daß das bei der enzymatischen Hydrolyse gebildete Produkt ein UV-Spektrum aufweist, das von dem des Substrats völlig verschieden ist. Das Substrat des Beispiels i, B/.-lle-Glu-Gly-Arg-pNA-HCI, weist beispielsweise ein Absorptionsmaximum bei 315 nm mit einem molaren Extinktionskoeffi/ienten von 12 000 auf. Die Absorption des Substrats bei 405 nm ist unbedeutend. p-Nitroanilin (pNA), das während der enzymatischen Hydrolyse aus dem Substrat gebildet wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 380 ηm mit einem rr ilaren Extinktionskoeffizienten von 1 3 200 auf, der bei 405 nm lediglich 9620 abnimmt. Durch spektrophotometrische Messung bei 405 nm ist es daher möglich, in leichter Weise das Ausmaß der enzymatischen Hydrolyse, das proportional zu der Menge des gebildeten p-Nitroanilins ist, zu verfolgen. Der Überschuß des Substrats beeinflußt die Messung bei dieser Wellenlänge nicht. Diese Situation ist fast identisch für die anderen Substrate der Erfindung. Aus diesem Grunde wurden die spektrophotometiischen Messungen durchweg bei 405 nm durchgeführt. Tabelle 2 zeigt einen relativen Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten für unterschiedliche Enzyme vom Typ der Serinproteasen (E. C. 3.4.21) zwischen dem zuvor genannten Substrat (A) und dem Substrat I gemäß der Erfindung. Die Reaktionsgeschwindigkeiten werden gemäß den oben beschriebenen Verfahren bestimmt.
normalerweise im Blut nicht zugegen ist.
Schließlich wird in der Tabelle 3 eine qualitative Übersicht über Reaktionsgeschwindigkeiten einiger Verbindungen der Erfindung im Vergleich zu der Verbindung (A) gegeben.
Tabelle 3
Heispiel
Relative Reaktionsgeschwindigkeit*)
Faktor Xa Trypsin Thrombin
1 XXXXX XXXXX (X)
(A) (X) XX XXXXX
3 XXX XXXXX (X)
5 XXX XXXX (X)
<) XXXX XXXXX (X)
14 XXXXX XXXXXX X
15 XXX XXXX (X)
16 XXX XXXXX (X)
17 XX XXX (X)
·) XXXXXX - mehr als 110% der Geschwindigkeit 'er
Vergleichsverbindung (Λ)
XXXXX - 1X) -110%.
XXXX - 70 90%.
XXX = 50- 70%.
XX = .10- 50%.
X = 10- 30%.
(X) = weniger al
Is 10%.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Tripeptide der allgemeinen Formel (I)
R1 —A2—Gly-Arg-NH-R2
in der bedeuten:
R1 Wasserstoff, Alkanoyl mit 1 -12 Kohlenstoffatomen oder Benzoyl
A2 Asp, Asn, GIu oder GIn und
R2 eine spektrophotometrisch bestimmbare Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl- oder Methoxynaphthylgruppe
sowie deren Additionssalze mit Säuren, wobei die Aminosäurereste L-Konfiguration aufweisen
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