DE2919545A1 - Neue l-leucyl-4-hydroxyanilid-derivate, verfahren zu deren herstellung, sowie verwendung derselben - Google Patents
Neue l-leucyl-4-hydroxyanilid-derivate, verfahren zu deren herstellung, sowie verwendung derselbenInfo
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Description
32 066 m/wa
1. NITTO BOSEKI CO«, LTD., FUKUSHIMA-SHI /
JAPAN
2. IATRON LABORATORIES INC., TOKYO / JAPAN
Neue L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivate,, Verfahren
zu deren Herstellung, sowie Verwendung derselben
Die Erfindung betrifft neue L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivate,
ein Verfahren zum Nachweis der Leucin-aminopeptidase-Aktivität unter Verwendung der genannten Anilid-derivate, und ein
Verfahren zur Herstellung der genannten Anilid-derivate.
Wie allgemein bekannt ist, stellt Leucin-aminopeptidase (im
folgenden als LAP bezeichnet) ein Enzym dar, welches in der
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Lage ist, von L-Peptiden Leucin freizusetzen bzw. abzuspalten, und zwar insbesondere von solchen Peptidverbindungen,
welche am Aminoende Leucingruppen aufweisen. Dieses Enzym ist in Geweben von Lebewesen weit verbreitet und
kommt ebenfalls in Seren vor. Es ist bekannt, dass sich der LAP-Gehalt eines Serums in Abhängigkeit vom Zustand
des jeweiligen Lebewesens, von welchem das Serum stammt, stark schwankt. Die LAP-Aktivität im Serum eines Patienten,
welcher an akuter Hepatitis, einemHäpatom, einem metastatischen
Häpatom, einer Leberzirrhose oder an Cholangie leidet, nimmt zu. Aus diesem Grunde wird die LAP-Aktivität als
eine Indikation der vorstehend genannten Krankheiten gewertet und der Nachweis der LAP-Aktivität wurde zu einem unentbehrlichen
Test zur Diagnose dieser Krankheiten.
Zum'Nachweis der LAP-Aktivität wurden mehrere Methoden vorgeschlagen,
wobei in den meisten derselben die aus synthetischen Substraten durch Einwirkung von LAP freigesetzten
Verbindungen colorimetrisch bestimmt werden.
Da jedoch sämtliche dieser Methoden Nachteile und Vorteile aufwiesen, war es erforderlich, neue synthetische Substrate
zu entwickeln. Zum Beispiel erfordert die L-Leucyl-ß-naphthylamid-Methode
(Cancer, Band 11, 283(1958)) ß-Naphtylamin als Standardsubstanz. Aufgrund ihrer Carcinogenität stellt ß-Naphthylamin
eine der Substanzen dar, deren kommerzielle Herstellung verboten wurde und bei der Verwendung von ß-Naphthylamin
ist es erforderlich, eine entsprechende Schutzausrüstung zu tragen und die grösste Sorgfalt anzuwenden. Der
Einfluss von Serumbestandteilen ist bei einer Methode, bei welcher L-Leucyl-p-nitroanilid als Substrat verwendet wird
und das gelbe p-Nitroanilin, welches gebildet wird, wird
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β» Εν α.
colorimetrisch bestimmt (Klin. Wochenschr.,Band 45, 474
(1967)). Die colorimetrische Bestimmung von p-Nitroanilin
nach der Kondensation mit Dimethylaminozimtaldehyd lässt in ihrer Reproduzierbarkeit zu wünschen übrig, da die Farbentwicklung
gegenüber Temperaturveränderungen zu empfindlich ist. Kürzlich wurde ein Versuch unternommen, die LAP-Aktivität
unter Verwendung von einem L-Leucyl-p-aminoanilidderivat
als Substrat zu bestimmen und das gebildete p-Aminoanilid-derivat nach oscidativer Kondensation mit einem geeigneten
Kuppler (japanische, offengelegte Patentschrift 52 691/77 (Kokai)) colorimetrisch zu. bestimmen. Dieses Verfahren
weist insofern Nachteile auf, da die Substratreaktivität mit der von L—Leucyl-ß-naphthyIamid vergleichbar oder
etwas geringer ist und die Methode zu hohe Aktivitätswerte ergibt, wenn sie bei einem Serum einer Schwangeren angewandt
wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Substrat zum Wachweis der
LAP-Aktivität zur Verfügung zu stellen, welches in Wasser
in ausreichendem Masse löslich ist und mit welchem die Nachteile der bekannten Methoden in bezug auf Sicherheit, Reproduzierbarkeit,
Stabilität, Reaktivität und Selektivität vermieden werden.
Ausserdem ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis der LÄP-Aktivität unter Verwendung des genannten
Substrates zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Verfahren zum Herstellen des genannten Substrates zur Verfügung zu stellen.
Im Rahmen der Erfindung wurden Untersuchungen zur Verbesserung
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der üblichen Methoden zum Nachweis der LAP-Aktivität, die
die vorher genannten Nachteile aufweisen, durchgeführt. Es wurden neue Substrate mit ausgezeichneten Eigenschaften
gefunden.
Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst,
dass ein L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat gemäss der
Formel
NH0 | CO - | NH- | |
CH3\0H . ( |
!
JHp -CH- |
||
CH-T^ | |||
T | |||
=/ | |||
,R | |||
OH
oder ein Säureadditionssals desselben, welche als Substrat
beim Nachweis der LAP-Aktivität geeignet sind, zur Verfügung
gestellt wird. In der vorstehend genannten Formel bedeutet R eine Carboxyl- oder Sulfogruppe.
Wie nachfolgend beschrieben, stellt die erfindungsgemässe
Verbindung ein ausgezeichnetes Substrat dar, welches keine der vorstehend genannten Nachteile der üblichen Substrate, wie
sie zum Nachweis der LAP-Aktivität verwendet werden, aufweist.
Die erfindungsgemässe Verbindung ist in Wasser in ausreichendem
Masse löslich und weist gegenüber LAP eine Substratreaktivität auf, die zweimal so hoch oder höher ist als die
•eines der üblichen Substrate. Dies wird in der nachfolgenden
Tabelle 1 gezeigt.
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SUBSTRATREAKTIVITÄT
Substrat Relative Substrat-
. . . reaktivität
L-Leucy1-ß-naphthylamid 1OO
L-Leucyl-4-N,N-diäthylaminoanilid 81
L-Leucyl-p-nitroanilid · 95
L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid 223
L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid 263
Die vorstehend genannten Eigenschaften zeigen die Vorteile des erfindungsgemässen Substrates, wie die einfache Herstellung
der Reagentien, die Reduktion der zum Nachweis erforderlichen Zeit, die Reduktion der für die Bestimmung
erforderlichen Probenmenge, etc.
Wie vorstehend beschrieben, erfolgt die Verwendung der Verbindung
zum Nachweis der LAP-Aktivität. Bei der Durchführung der Bestimmung lässt man das erfindungsgemäss.e Substrat
mit LAP eines Serums in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert
von 6,5 bis 7,5 reagieren und unterwirft das bei der Reaktion gebildete 4-Hydroxyanilin-derivat einer oxidativen
Kondensation mit einem geeigneten Kuppler unter Bildung einer gefärbten Substanz, welche dann zur Bestimmung der
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LAP-Aktivität im Serum colorimetrisch bestimmt wird.
Geeignete Kuppler für die Farbentwicklung im sauren Milieu stellen Anilinverbindungen dar, wie z.B. Ν,Ν-Diäthylanilin,
während Kuppler für die Farbentwicklung im Alkalischen zu den Phenol- und Naphtho!verbindungen gehören, wie z.B.
m-Cresol.
Das bei der vorstehend genannten oxidativen Kondensation am besten geeignete . Oxidationsmittel ist Natriummetaperjodat,
obwohl verschiedene andere, wie Wasserstoffperoxid, Persulfate und dergleichen ebenfalls verwendet werden
können.
Die durch oxidative Kondensation eines Kupplers und dem Reaktionsprodukt von LAP und der erfindungsgemässen Verbindung
gebildete gefärbte Substanz weist in Abhängigkeit von der Art des Kupplers einen weiten Wellenlängenbereich von
560 bis 770 ran auf. Die Farbentwicklung wird durch eine Veränderung der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit nur
sehr wenig beeinflusst und ist in ausreichendem Masse stetig, um den wichtigsten Anforderungen an ein Reagenz, welches
zu einem derartigen Nachweis verwendet wird, zu entsprechen.
Nach den üblichen Methoden wird die Colorometrie bei einer unterhalb 560 nm liegenden Wellenlänge durchgeführt, wohingegen
die colorimetrische Bestimmung der erfindungsgemässen
Methode bei einer über 560 nm liegenden Wellenlänge erfolgt. Aus diesem Grunde wird die colorimetrische Bestimmung der
erfindungsgemässen Methode kaum durch die Anwesenheit von Verunreinigungen im Serum beeinflusst, weshalb es nicht erforderlich
ist, für jede Probe eine Blindprobe durchzuführen,
wodurch sich eine Einsparung an Arbeit und Zeit ergibt.
Darüber hinaus war es bei den konventionellen Methoden schwierig, die nachteiligen Effekte von reduzierenden Substanzen
im Serum, wie z.B. Harnsäure und Ascorbinsäure, zu eliminieren, wohingegen bei dem erfindungsgemässen Verfahren
der Effekt derartiger reduzierender Substanzen die Genauigkeit der Messung nur sehr wenig beeinflusst, da diese
reduzierenden Substanzen durch die im Überschuss vorliegenden oxidierenden Mittel zersetzt werden.
Wie die voranstehenden Ausführungen zeigen, ist zum Nachweis bzw. der Bestimmung der LAP-Aktivität die erfindungsgemässe
Verbindung als Substrat den bisher bekannten Substraten gegenüber weit überlegen.
Die neue Verbindung gemäss der Erfindung kann in üblicher
Weise hergestellt werden, indem man ein aktiviertes L-Leucin, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einem p-Hydroxyanilinderivat
umsetzt und dann die Schutzgruppe von dem bei dieser Reaktion gebildeten Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat entfernt.
Beispiele von aktiviertem L-Leucin, welche als Ausgangsmaterial verwendet werden, umfassen aktivierte Ester entsprechend
der Formel
X-NH- CHC - Y
CH0
CH0
I
/\
CH3 CH3
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worin X eine N-Schutzgruppe darstellt, wie ein tert-Butyloxycarbonyl,
p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder Phthalyl und Y eine aktivierende Gruppe darstellt, wie
- S
CH-
CH-
- 0 - N;
• V
Cl
(η = 3 oder 5)
Die freigesetzte Verbindung (HY) ist vorzugsweise
H-S-
CH.
CH-
oder
HO - Nv
welche in Wasser oder einer sauren wässrigen Lösung löslich sind.
Die Entfernung der Schutzgruppe kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel und im allgemeinen in Gegenwart eines Amins durchgeführt. Geeignete
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organische Lösungsmittel umfasssen Tetrahydrofuran, Dimethylformamid,
Dioxan und Äthylacetat? geeignete Amine sind tertiäre Amine, wie Triäthylamin, N-Methylmorpholin und N-Äthylmorpholin.
"Triton B" (Benzyltrimethyl-ammonium-hydroxid) kann ebenfalls verwendet werden.
Das präparative Verfahren wird im einzelnen in den nachstehend gegebenen Beispielen erläutert, die jedoch die Erfindung
nicht einschränken sollen.
Herstellung von L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid-hydrochlorid.
In 100 ml Dimethylformamid wurden 7,7 g (0,05 Mol) 5-Aminosalicylsäure
und 14 ml (0,10 Mol) Triäthylamin aufgelöst. Zu der Lösung wurden tropfenweise innerhalb einer Stunde bei
-5°C bis O0G eine Lösung aus 17,3 g (0,05 Mol) tert-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thioester
in 150 ml Tetrahydrofuran gegeben. Unter Rühren wurde bei
Raumtemperatur das Gemisch weitere 18 Stunden lang umgesetzt. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch destilliert, um das
Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde sukzessive
mit kalter 5 %-iger Salzsäure, Wasser und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, dann über einem Gemisch
aus Magnesiumsulfat und Aktivkohle entfärbt und getrocknet. Die auf diese Weise behandelte Äthylacetatschicht
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wurde destilliert, um das Äthylacetat zu entfernen, wobei eine kristalline Substanz zurückblieb. Diese Substanz wurde
weiter aus einem Äthylacetat-Petroleumäther-Gemisch umkristallisiert, wobei 12,4 g (68 %) weisse Kristalle erhalten
wurden. Schmelzpunkt 168 bis 170°C; spezifische Drehung: /öO/p0 = -16,4 (C = 1, DMF).
Elementaranalyse: c-j8H26N2°8 (M°lekulargewicnt 3 66,4)
Gefunden %: | C | 58 | ,98 | H | 7 | ,28 | N | 7 | ,88 |
Berechnet %: | 59 | ,01 | 7 | ,15 | 7 | ,65 |
Dünnschichtchromatografie:
Rf = 0,39 (CHCl3: MeOH : AcOH : H2O = 80 : 20 : 2,5 : 5)
In 30 ml eines Gemisches aus 2,4 N Salzsäure und Essigsäure wurden 10 g (0,027 Mol) tert-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid,
welches vorstehend erhalten wurde, aufgelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden
lang umgesetzt, um die tert-Butyloxycarbonylgruppe zu entfernen.
Das Reaktionsgemisch wurde zu 500 ml getrocknetem Äther gegeben. Die sich bildenden weissen Niederschläge wurden
durch Filtration gesammelt und getrocknet, wobei quantitativ 8,3 g des gewünschten L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid-hydrochlorid
erhalten wurden. Schmelzpunkt: 217°C (Zersetzung); spezifische Drehung: /_°^_/Ώ = + 36,3 (C = 1 ,
MeOH); Rf = 0,70 (n-BuOH : AcOH : H3O =4:1:1).
Elementaranalyse: C13Ii19N2O4Cl-^H2O (Molekulargewicht 311,783)
Gefunden %: | C | 50, | 15 | H | 6 | ,57 | N | 8, | 82 |
Berechnet %: | 50, | O4 | 6 | ,47 | 8, | 98 |
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Herstellung von L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid
Zu 200 ml Methanol wurden 7,6 g (40 mMol) 3-Sulfo-4-hydroxyanilin
und 18,4 ml (40 %-ige Lösung in Methanol) Triton B gegeben. Das Gemisch wurde erwärmt unter Bildung einer homogenen
Lösung und dann eingedampft, um das Methanol zu entfernen.
Der Rückstand wurde in 50 ml Dimethylformamid, welchem 15,5 g (40 mMol) Ben2ylöxycarbonyl-L-leucyl-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thioester
zugemischt waren, aufgelöst und bei Raumtemperatur 48 Stunden lang umgesetzt. Nach Zugabe von
300 ml Äthylacetat wurde das Reaktionsgemisch sukzessive jeweils 2 mal mit 60 ml kalter 5 N Salzsäure, 60 ml 2 N Salzsäure
und 60 ml 5 %-iger Salzsäure, welche mit Natriumchlorid gesättigt war, gewaschen. Die auf diese Weise behandelte
Äthylacetatlösung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Destillation das Äthylacetat entfernt,
wobei Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid als öliger Rückstand erhalten wurde. Der ölige Rückstand wurde
mit 47 ml eines Gemisches aus 25 %-iger Bromwasserstoffsäure und Essigsäure gemischt, bei Raumtemperatur 1 Stunde
lang umgesetzt und dann in 470 ml Äther gegossen. Die gebildeten Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt,
mit Äthyläther gewaschen und aus einem Äthylalkohol-Äthyläther-Gemisch
umkristallisiert, wobei 5,8g (41 %) L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid
erhalten wurden. Schmelzpunkt: 214 bis 217°C; spezifische Drehung: £°t7^° - + 57,6 (C = 1, H2O);
Rf = 0,52 (n-BuOH : AcOH : H2O =4:1:1).
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Elementar analyse: C. 2 h-iqN2O5S* Y HBr * H2° (Molekular<Jewicht
355,417)
Gefunden %: C 40,41 H 5,68 N 7,86 S 9,11 Br 9,42 Berechnet %: 40,55 5,79 7,88 9,02 9,42
Fig. 1 bis 3 stellen Infrarotabsorptionsspektren von jeweils tert-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid,
L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid-hydrochlord
und L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid dar.
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Claims (5)
1. NITTO BOSEKI CO., LTD., FUKUSHIMÄ-SHI /
JAPAN
2. IA.TRON LABORATORIES INC., TOKYO / JAPAN
Neue L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivate, Verfahren
zu deren Herstellung, sowie Verwendung derselben
PATENTANSPR Ü' CH E
.J L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat entsprechend der
allgemeinen Formel
NH2 /
CH - CH-, - CH -CO-NH-/ \-OH
worin R eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe darstellt
oder ein Säureadditionssalz desselben«
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2= Verbindung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass R eine Carboxylgruppe bedeutet.
3. Verbindung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass R eine Sulfogruppe darstellt.
4. Verfahren zur Herstellung von L-Leucyl~4-hydroxyanilidderivaten
gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass in an sich bekannter Weise ein
aktiviertes L-Leucin, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einem p-Hydroxyanilidderivat umgesetzt wird
und darauf die Schutzgruppe von dem gebildeten Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat
entfernt wird.
5. Verwendung von L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivaten gemäss
Anspruch 1 zum Machweis bzw. zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase-Aktivität.
909849/0595
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