DE2629195B2 - Tripeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Thrombin - Google Patents

Tripeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Thrombin

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Description

Die Erfindung betrifft Tripeptide der allgemeinen Formel _>·.
A'-A-'-Arg-NH-R1,
mit den im Hauptanspruch angegebenen Bedeutungen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Tripeptide nach Anspruch 1 zur Bestimmung von κ ι Thrombin undThrombin-ähnlichen Enzymen.
Die Verbindungen der Erfindung sind insbesondere für die quantitative Bestimmung von Thrombin, für die Untersuchung von Reaktionen, in denen Thrombine gebildet, inhibiert oder verbraucht wird, oder zur r> Bestimmung von Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder an ihnen teilnehmen, z. B. von Antithrombinen, Prothrombinen und Heparinen geeignet.
Synthetische Substrate für die Bestimmung von m Enzymen weisen gegenüber natürlichen Substraten große Vorteile auf, vorausgesetzt, daß sie bestimmte Anforderungen erfüllen, z. B. eine große Empfindlichkeit und Spezifität für das Enzym, eine gute Löslichkeit in Wasser oder in der biologischen Testflüssigkeit und r, eine leichte Nachweisbarkeit für einige der Spaltprodukte.
Eines der bisher besten Substrate für die Bestimmung von Thrombin ist in der DF PS 18 04 022 beschrieben. Fs besteht aus dem chromogenen Tripeptidderivat ,n
H/-Phe-V;il-.-\ri!-pN;i (S-2160)
(A)
(die Abkürzungen werden weiter unten erläutert).
Fs weist eine große Empfindlichkeit für Thrombin auf ,, und ergibt bei der en/ymatischen Hydrolyse das ihromophore Produkt pNitroanilin, das in leichter Weise spekirophotometrisch bestimmt werden kann. S-2160 /eigl jedoch gewisse Nachteile, und zwar infolge seiner relativ niedrigen Löslichkeit (I mg/ml). Fine hl) geringe Löslichkeit ist mit dem Nachteil behaftet, daß man sehr nahe an der .Saiiigungsgrcnze für das Substrat arbeiten muß, um eine befriedigende Substratkonzenirulion /u erreichen. Hei der F.nzymbestimmung in verschiedenen biologischen Systemen kann eine Ausfäl- „·, lung des Substrats selbst oiler einer Protein/Substrat-Kombination erfolgen. Diese Niederschläge ergeben verfälschte spektropholometrisi he Meßwerte und so-H-Phe-Val-Arg-pNA
erhalt.
Die nunmehr freie protonierte Aminogruppe am Phe-Teil vergrößert die Löslichkeit, bewirkt jedoch auch, daß die Geschwindigkeit, mit der Thrombin das Substrat spaltet, in erheblichem Ausmaß abnimmt, und zwar etwa um den Faktor 30 (cf. Tabelle I). Weiterhin kann das Substrat in einer biologischen Versuchslösung in unerwünschter Weise vom N-terminalen Ende her durch Aminopeptidasen zersetzt werden.
Gemäß der Erfindung wird das Substrat gemäß Formel B modifiziert, indem man VaI gegen eine cyclische Iminosäure (Aze, Pro oder Pcc) und L-Phe gegen D-Phe austauscht. Die so erhaltenen Substrate sind immer noch gut löslich; überraschenderweise ist die Aktivität gegenüber Thrombin jedoch nicht verringert, sondern 3O-5Omal größer als die Aktivität eines entsprechenden Substrats, das lediglich aus L-Aminosäuren besteht (Tabelle I). Weiterhin sind die neuen Substrate um etwa 400% aktiver als S-2160. Die N-terminale D-Aminosäure verhindert zudem einen unerwünschten Angriff von Aminopeptidasen, da letztere für L-Aminosäuren spezifisch sind.
Für die Synthese der chromogenen Enzymsubstrate der Erfindung können herkömmliche Schutzgruppen und Kupplungsverfahren verwendet werden, die in der Peptidchemie wohl bekannt sind.
Als eine ac-Aminoschutzgruppe können Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppen in vorteilhafter Weise verwendet werden, oder verwandte Gruppen, z. B. p-Methoxv-, p-Nitro- oder p-Methoxyphenyl-azocarbobenzox) uppen.
Als Schutz fur die i-Guanidogruppe der Arginylgruppe kann vorzugsweise die Protonierung, eine NO)- oder eine p-Toluolsulfonylgruppe verwendet werden.
Die Hydroxylgruppe in der Tyrosingruppc kann vorzugsweise durch eine t-Butyl- oder Benzylgruppe geschützt werden. Als abspaltbare Carboxyschutzgruppe ist es /weckmäßig, den Methyl-, Ethyl- oder Benzylester zu verwenden.
Die Kupplung zwischen zwei Aminosäuren oder einem Dipeplid und einer Aminosäure kann über eine Aktivierung der χ Carboxygruppe erreicht werden. Das aktivierte Derivat kann entweder isoliert oder in situ erzeugt werden; es kann beispielsv^cise ein p-Nitrophenyl-, Trichlorphenyl- oder Pcntachlorphenylesier, ein N-Ilydroxysueeinimidestcr, ein symmetrisches oder asymmetrisches Anhvdrid, ein Säureazid oder ein Nl fydroxybenzolriu/olester sein.
Das Synlhcseprin/ip kann in einer stufenweisen Kupplung der Aminosäuren an die C-terminalc Arginylgruppe bestehen, die entweder bereits mit einer verknüpften, als C'iirhoxyschut/gruppe wirkenden chromophoren Gruppe oder mit einer abspaltbaren Carbox.yschul/griippe ausgestattet ist. Im lct/lcren Fall wird die chromophorc Gruppe dann an das geschiit/ie Tripeptidderivat angekoppelt. Alternativ ist es möglich, daß N-terminalc Dipeptidfragment selbst herzustellen, das dann entsprechend der obigen Ausführungen an die Arginylgruppe mit oder ohne chromophore Gruppe angekoppelt wird.
Unabhängig von dein gewählten Rcaktionsprin/ip ist
eine Reinigung von Zwischen- und Endprodukten durch GelRjtrationschromatografie zweckmäßig, da hierbei die Synthese rasch durchgeführt werden kann und maximale Ausbeulen ergibt.
Die dünnschichtchromatografischen Analysen (TLC-Analysen) wurden teilweise von GPC-EIuaten und teilweise von eingedampften und getrockneten Zwischen- und Endprodukten erstellt.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Abkürzungen: Arginin
Arg = 2-Azetidincarbonsäure
Aze Phenylalanin
Phe Pipecoiinsäure
Pec (2-Piperidincarbonsäure)
Prolin
Pro Valin
VaI Essigsäure
AcOII = Benzoyl
Bz Carbobenzoxy-
Cbo- Dimethylformamid
DMF Triethylamin
Et1N Ethylacetat
EtOAc = Hexamethylphosphorsäuretriamid
HMPTA = Gelfiltrationschromatografie
GPC Methanol
MeOH = p-Nitrophenoxy
-OpNP = p-Nitroanilid
-pNA Dünnschichtchromatografie
TL.C
das Rohprodukt gereinigt und in zwei Stufen durch Ionenaustauscher behandelt:
a) GPC an einer Sephadexe-G-15-Kolonne, gequollen in 33% AcOH in Wasser, wobei das gleiche Medium als Lösungs- und Eluierungsmittel dient Das reine Produkt wird durch Gefriertrocknung von der wäßrigen AcOH (aq) befreit
b) Ionenaustausch an einer Sephadex*QA E-25-Kolonne in der Chloridform, gequollen in MeOH/ Wasser (95 :5), wobei das gleiche Medium als Lösungs- und Eluierungsmitte! dient. Das reine Produkt wird durch Gefriertrocknung vom Wasser befreit
ι, Ausbeute: 120mg(80%)
Analyse: homogen gemäßTLC in A (Rf:0.29) Chloridgehalt 11,53% (theoretisch 11,6%)
[α]-,·· - 122" ^c0,5.50% AcOH [aq])
Beispie! 2 H-(D-Phe)-Pec-Arg-pNA · 2 HCI
j-, Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel 1 Ausbeute: (72%)
Analyse: homogen gemäß TLC in A (R1:0,44)
Chloridgehalt 11,4%
(theoretisch 11,3%)
[α]■:'- 109" (c0,4,50% AcOH [aq])
Dünnschichtchromatografie
Für die TLC-Analyst: werden mit Silicagel l-j« (Merck) als Absorptionsmittel pränarierte Glasplatten verwendet. Es werden die folgenc-n Lösungsmittelsysteme eingesetzt:
Pi: Chloroform : MeOH
9 : 1 (Volumenverhältnis)
A: n-Butanol: AcOH : Wasser
3:2:1 (Volumenverhältnis)
Nach Beendigung der Chromatografie wird die Platte im UV-Licht (254 nm) untersucht und anschließend in üblicher Weise mit Chlor/o-Toluidinreagenz entwickelt. Wenn die Bezeichnung »homogenes Produkt gemäß TLC« angegeben ist, wird die Analyse an μg-Mengen durchgeführt. Die Rr-Werte stellen Ergebnisse aus getrennten chromatografischcn Verfahren dar.
Das Gel G-15, das bei der Gelfiltration verwendet wird, ist ein qucrvcrnctztes Dcxirangel. Das Gel Lrl-20 ist ein hydroxypropyliertes quervernelztes Dextrangcl. Der Ionenaustauscher QAE-25 ist ein quervernetztes Dextrunge! mil Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminocthyl-F-'iinkiioncn als Funktionell Gruppen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Aur.führungsbeispielen naher erläutert:
Beispiel I
il -(D-PheJ-l'ro-Arg -pNA 2 HCI
175 mg(0,24b inMol)C bo-D-Phe Pm Arg(NO.) pNA wird durch Umsetzung mit 5 ml trockenem HI' in Gegenwart von O1J ml Anisol in einem Sakakibara-Apparal M) Minuten bei 0' C zur Ke ikiion gebracht und von seiner Schutzgruppe befreit Nach Beendigung der Reaktion und nach Destillation der gesamten HF wird Beispiel 3 H-(D-Tyr)-Pec-Arg-pNA Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel I
Ausbeute: (68%)
Analyse: homogen gemäß TLC in P, (R(: 0,44) Chloridgehalt 10,8%
(theoretisch 11,1%)
[λ] ' - 75,2° ^c0,5, 50% AcOH [aq])
Beispiel 4 H-(D-Phe)-A/e-Arg-pNA · 2 HCI
Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel I.
Ausbeute: (71%)
Analyse: homogen gemäß TLC in A (Rc 0.21)
Chloridgehalt ll,b%
(theoretisch I 1,9%)
[ix] ■ - 130' (rO,5. 50% AcOII)
Beispiel 5 H-(D l'heJ-Pec-Arg/iNA ■ 2 HCI
Die Herstellung ei folgt analog zu Beispiel 1.
Ausbeute: (68%)
Analyse: homogen gemäß TLC in A (Rc 0,44)
Chloridgehalt 11,2%
(theoretisch 11,3%)
[λ] '- 105" (f 0.5. 50% AcO H [aq j)
Beispiel 6
H-(D-Phe)-Pec-Arg-/JNA(4-0Me) · 2 HCl
Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel 1.
Ausbeule: (64%)
Analyse: homogen gemäß TLC in A (Rr: 44)
Chloridgehalt 10,4%
(theoretisch 10,7%)
[α] ·,'- 102° (c0,5,50% AcOH [aq])
Die Herstellung der für die Verbindungen der Erfindung benötigten Ausgangsverbindungen wird im folgenden beschrieben.
I. Cbo-Arg(NO2)pNA
35,3 g (!OmMoI) trockenes Cbo-Arg(NO2)-OH werden in 200 ml trockenem frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst Anschließend werden 10,1g (lOOmMol) Et3N und 24,6g (15OmMoI) p-Nitro enyiisocyanat unter Rühren und Feuchtigkeitsaussch'uß tugcgcbcn. Nach einer Reaktionszeit vor· 24 Stunden wird die Lösung in 2 I 2%ig;r Natriumbicarbonatlösung unter Rühren eingegossen. Der gebildete Niederschlag wird filtriert und mit 2%iger Bicarbonatlösung. Wasser, 0,5 N wäßriger HCl (aq) sowie Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Das rohe Produkt wird mit warmem MeOH extrahiert; schwerlösliche Nebenprodukte werden abfiltriert. Das Filtrat wird chromatographisch an einer Spphadex*LH-20-Kolonni: durch Quellung und F.luierung mit MeOH gereinigt.
Ausbeulc: 29,8 g (63%)
Analyse: homogen nach TLC in P,
(Rc 0,34)
[«] +20,5° (c 1,9, DMF)
II. Cbo-Pro-Arg(N02)-pNA
4,8 g 110 mMol) Cbo-Arg(NO,)-pNA werden in 25 ml trocken2m AcOH suspendiert, wonach 15 ml 5,6 N HBr in AcOH zugegeben werden. Nach einer Reaktionszeil von 50 Minuten bei Raumtemperatur wird die Lösung unter heftigem Rühren in 300 ml trockenen Fther eingegossen. Der erhaltene Niederschlag wird von der F.thcrphasc durch Absaugen getrennt und mil zwei lGO-ml-Por!ionen F.ther gewaschen. Das so erhaltene HBr ll-Arg(NO,)-pNA wird im Vakuum über AnOH 16 Stunden bei 40"C getrocknet. Fs wird anschließend in 25 nil DMI' gelöst; die Lösung wird auf — 10"C gekühlt. Nun wird Fl iN /!!gegeben, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um bei einem unmittelbar oberhalb der Oberfläche der Lösung gehaltenen feuchten pH-Papier eine schwach basische Reaktion zu ergeben (1,9 ml). Ausgefallenes EtsN · HBr wird durch Filtration cr.tfernt; anschließend werden 4,1 g (11 mMol) Cbo-Pro-OpNP jugegebcn. Nach einer Stunde werden weitere 0,7 ml EhN zugegeben, ebenso nach vier Stunden. Man läßt die Lösung sich über Nacht auf Raumtemperatur erwärm an. Um zu verhindern, daß der Überschuß an Cbo-Pro-OpNP das Endprodukt bei der GPC verunreinigt, da sie in dem verwendeten ehromatografischen System ähnliche Eluatvoliimina aufweisen, setzt man 0,5 ml (ü mMol) n-Butylamin hinzu. Nach 30 Minuten versetzt man mit IO mMol HCI. verdampft die Reaktionslösung in einem Rotationsfilmverdampfer und rührt mit einigen Portionen Wasser, das durch Dekanticrung entfernt wird. Der Rückstand wird in MeOH gelöst und an einer Sephadex®-LH-20-Kolonne durch Quellen und Eluieren mit MeOH chromatografiprt. Das Produkt ist homogen gemäß TLC.
Ausbeute: 5,5 g (96%)
' Analyse: TLC in P, (R,:0,28)
[«] -33,0" (c 1,0, DMF)
III. Cbo-Pec-Arg(NOj)-pNA
in Es wird wie unter II. verfahren.
Ausbeute: 5,1 g(86%)
Analyse: homogen gemäßTLC in P, (Rc 0,30)
[α] -26,2r (d.O.DMF)
'' IV. Cbo-Phc-Pcc-ArgiNOjJpNA
2,9 g (5 mMol) Cbo Pec-Arg(NO2) pNA werden in HBr-AcOH decarbobenzoKyliert. Das Produkt wird gemäß II ausgefällt, mit Ether gewaschen und
.'" getrocknet. HBr-H-Pip-Arg(NO,.)-pNA wird dann in 15 ml DMF gelöst Die '.ösung wird auf -10'C äbgckun'ii, m<t 0,9 ml Lt iN selnv; '.iioasisch gemacht und filtriert. Man setzt 3.0g (7,15niMoI) Cbo-Phe-OpNP und anschließend 0.65 g (5 mMol) N-IUdroxybenztri-
■- azo! als Katalysator hinzu. Nach einer Stunde werden weitere 0,35 ml Ft1N zugegeben; das gleiche Verfahren wird nach vier Stunden wiederholt. Man läßt die Reaktionslösung sich über Nacht au! Raumtemperatur erwärmen. Die Lösung wird in einem Rotationsfiiimc-r
υ. dämpfer bis zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird in FtOAc gelöst und mit 2%igcr Natriumbicarbonatlösung und Wasser behandelt sowie eingedampft. Jclzl wird der Rückstand in McOH gelöst und im Scphadcx8 LH-20 durch (.)uellung und F.luierung mit
:. McOH chromatograficrl. Das erhaltene Produkt ist gemäß TLC homogen.
Ausbeute: 2.7 g: (73%)
Analyse: TLC in P, (Rc0.35)
'" [λ] - 32.9 (d.O. DMI)
V. Cno-D-Phe Pec-Arg(NO ) pNA
Diese Stufe v. ird gemäß IV durchgeführt
Ausbeute: 2.ό ρ(70'Ί.)
AnnIvsc: homogen gemäß!"LC in P- (R-: 0.44)
[\] -38.4 (d.O. DMI)
Vl Cbo-Phc-l'ro-ArgiNO..) pNA
Dieses Beispiel wird gemäß IV ausgelührt.
Ausbeute: 2.4 g(80%)
Analyse: homogen gemäß! LC in P, (Rc 0.38)
Ν "-39.2 (d.O.DMF)
V.l. Cbo-D-Phc-Pro-Arg(NO:)-pNA
Dieses Beispiel wird gemäß IV ausgeführt.
Ausbeule: 3.1 g(86%)
Analyse: homogen gemäß !LC in P, (Rc 0.46)
[λ] -6,2 (d.O. I)MI)
VIII. Cbo -D-Tyr(OBzl) PccArg-(NO..)-pNA
-,-, Die Herstellung erfolgt gemäß IV.
Ausbeute: 3U g(75%)
Analyse: homogen gemäßTLC in P, (Rc 0.50)
IX. Cbo-Aze-Arg(NO2)-pNA
Die Herstellung erfolgt gemäß II.
Ausbeute: 4,2 g (75%)
Analyse: homogen gemäßTLC in P, (R,: 0,27)
X. Cbo-D-Phe-Aze-Arg(NO2)-pNA
Die Herstellung erfolgt gemäß IV.
Ausbeute: 2,4 g (69%)
Analyse: homogen gemäß TLC in Pt (Rc 0,47)
Xl. Cbo-Arg(NO2)-0NA
7,2 g (20 tnMol) trockenes Cbo-Arg(NO2)-OH werden in 400 ml THF gelöst. Man setzt 2,0 g (2OmMoI) Et1N hinzu, wonach die Lösung unter völlig feuchtigkeitsfrei-XIV. Cbo-Arg(NO2)-jJNA(4-OMe)
Die Herstellung erfolgt gemäß XI.
Ausbeute: 7,1 g(70%)
' Analyse: homogen gemäßTLC in Pi (Rf: 0,4:2)
XV. Cbo-Pec-Arg(NO2)-0NA(4-OMe)
Die Herstellung erfolgt gemäß II.
,ο Ausbeute: 4,9 g (79%)
Analyse: homogen gemäß TLC in P, (Rc 0,38)
XVI. Cbo-D-Phe-Pcc-Arg(NO2)-^NA(4-OMe)
Die Herstellung erfolgt gemäß IV.
' Ausbeute: 2,7 g(70%)
Analyse: homogen gemäßTLC in P; (Ri: 0,51)
Die Tripeptide der Erfindung können in der irr
(20 mMol) Chlor-ameisensäureisobutylester. gelöst in 201 THF, werden innerhalb von 10 Minuten zu der gekühlten Lösung gegeben. Nach weiteren 10 Minuten versetzt man mit 344 g (20 mMol) 0-Naphthylamin. Man läßt das Reaktionsgemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und läßt es 24 Stunden bei dieser Temperatur stehen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und wird 3-5mal mit destilliertem Wasser, 3-5mal mit einer 5%igen Natriumdicarbonatlösung sowie 3-5mal mit destilliertem Wasser behandelt. Anschließend wird es im Vakuum getrocknet. Das Produkt wird in MeOH gelöst und an einer Sephadex®-LH-20-Kolonne durch Quellen und Eluieren mit MeOH chromatografiert. Das erhaltene Produkt ist homogen gemäß TLC in P1.
Ausbeute: 8,1 g(84%)
Analyse: homogen gemäß TLC in P1(Rc 0.40)
Γλ] +7.40CcKO1DMF)
XII. Cbo-Pec-Arg(NO:)-/JNA
Die Herstellung erfolgt gemäß II.
Ausbeute: 4,8 g (82%)
Analyse: homogen gemäß TLC in P, (R,: 0.36)
XIII. Cbo D-Phe-Pec-Arg(NO2)-0NA
Die Herstellung erfolgt gemäß IV.
Ausbeute: 2,6 g (71%)
Analyse: homoger gemäß TLC in P1 (Rc 0,48)
I ΙίΙ UIIIUIIlUCMIItI
mung verwendet werden.
Das Bestimmungsprinzip beruht auf der Tatsache daß das durch enzymatische Hydrolyse gebildet« Spaltprodukt ein UV-Spektrum aufweist, das sich erheblich von dem des Substrats unterscheidet. Da> Substrat gemäß Beispiel 2 weist zum Beispiel eir Absorptionsmaximum bei 315 nm und einen molarer Extinktionskoeffizienten von 12 500 auf. Bei 405 nm isi die Abso jstion des Substrats nahezu vollständig beendet. p-Nitroanilin, das von dem Substrat während der enzymatischen Hydrolyse abgespalten wird, zeigt ein Absorptionsmaxin;um bei 380 nrr. und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13 200, der sich bei 405 nm lediglich auf 9620 verringert hat. Durch spektrophoto metrische Bestimmung bei 405 nm ist es somit möglich die Menge des gebildeten p-Nitroanilin in leichter Weise zu verfolgen. Diese Menge ist proportional zi dem Ausmaß der enzymatischen Hydrolyse, die ihrerseits durch die aktive Thrombinmenge bestimmt wird. Für andere Substrate gemäß der Erfindung sind ziemlich die gleichen Bedingungen gegeben. Aus diesem Grunde wurden die Bestimmungen ständig bei 405 nm durchgeführt.
Die Tabelle zeigt einen Vergleich der relativen Reaktionsgeschwindigkeit zwischen dem zuvor genannten Thrombinsubstrat S-2160, seinem n'chtbenzoylierten Derivat und Substraten der Erfindung. Aus der Tabelle geht eindeutig hervor, daß die Substrate der Erfindung überlegen sind. Sie reagieren 4mal schneller mit Thrombin als das oben genannte beste Substrat, S-2160, und sind darüber hinaus lOmal besser in Wasser löslich als S-2160.
Tabelle
Relative Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen Thrombin (0,4 NIH/ml) und Substrat (0,1 μΜοΙ/mI)
Substrat
ReI. Reaktionsgeschwindigkeit
Löslichkeit in
H2O
(mg/ml)
A (S-2160) Bz-Phe-Val-Arg-pNA
B H-Phe-Val-Arg-pNA
Bsp. 1 H-(D-Phe)-Pro-Arg-pNA
Bsp. 2 H-(D-Phe)-Pec-Arg-pNA
100
3
400
420
0,1
1
3
3

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Tripeptide der allgemeinen Formel
A'-A-'-Arg-NH-Ri,
in der bedeuten:
A1 D-PheoderD-Tyr,
A- l-A/etidinyl-2-carbonyl, Pro oder 1-Piperidinyl-2-carbonyl und
R1 eine spektrophotometrisch bestimmbare Nitrophenyl-, Naphthyl-, Nitronaphthyl- oder Methoxynaphthylgruppe sowie deren Additionssalze mit Säuren, wobei die Aminosäurereste A2 L-Konfiguration aufweisen.
2. Verwendung der Tripeptide nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Thrombin und Thrombin-ähnlichen Enzymen.
mit falsche Enzymbestimmungen. Das Enzymsubstrat S-2160 wird erheblich löslicher, wenn man die Benzoylgruppe durch H ersetzt und somit eine Verbindung der Formel
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