CH622287A5 - Method for the determination of thrombin or of enzymes which cleave the substrates in the same way as thrombin, and use of the method - Google Patents

Method for the determination of thrombin or of enzymes which cleave the substrates in the same way as thrombin, and use of the method Download PDF

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CH622287A5
CH622287A5 CH887476A CH887476A CH622287A5 CH 622287 A5 CH622287 A5 CH 622287A5 CH 887476 A CH887476 A CH 887476A CH 887476 A CH887476 A CH 887476A CH 622287 A5 CH622287 A5 CH 622287A5
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Thrombin und solchen Enzymen, die Substrate in der gleichen Weise spalten wie Thrombin. Bei dem erfindungs-gemässen Verfahren wird das Material, in dem die Enzyme bestimmt werden sollen, mit einem neuen chromogenen Substrat zusammengebracht, wobei durch die enzymatische Hydrolyse aus dem Substrat ein den chromogenen Rest tragendes Amin abgespaltet wird, das sich in seinem Absorptionsspektrum von dem des chromogenen Substrates unterscheidet. Die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt ist proportional zur Menge an Enzym, die in dem getesteten Material anwesend ist, sodass sich das erfindungsgemässe Verfahren auch zur quantitativen Bestimmung der fraglichen Enzyme eignet.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Substrate sind besonders geeignet, um eine quantitative Bestimmung von Thrombin durchzuführen oder um Reaktionen zu studieren, bei den Thrombin entweder gebildet, oder gehemmt oder konsumiert wird, oder auch um Faktoren zu bestimmen, die einen Einfluss auf solche Reaktionen nehmen oder an derartigen Reaktionen teilnehmen. Dementsprechend kann das erfindungsgemässe Verfahren auch zur Bestimmung von Antithrombin, Prothrombin und Heparin herangezogen werden.
Synthetische Substrate, die in Verfahren zur Bestimmung von Enzymen eingesetzt werden, haben grosse Vorteile im Vergleich zu natürlichen Substraten, vorausgesetzt dass sie bestimmte Bedingungen erfüllen, zu denen gehören: eine grosse Empfindlichkeit oder Sensitivität gegenüber dem fraglichen Enzym, dass sie gegenüber dem fraglichen Enzym spezifisch sind und eine gute Löslichkeit in Wasser oder biologischen Testflüssigkeiten aufweisen und dass ferner mindestens eines der Ab-spaltungsprodukte leicht feststellbar ist.
Eines der am besten geeigneten bisher bekannten Substrate zur Bestimmung von Thrombin ist in der schwedischen Patentschrift Nr. 380 257 beschrieben, und dieses Substrat besteht aus einem chromogenen Tripeptid-Derivat der folgenden Formel A
abgespaltet wird, die sich bezüglich ihres Absorptionsspektrums von dem Substrat der Formel I unterscheidet, und wobei die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt proportional zur Menge an in dem Material anwesendem Enzym ist.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat oder ein Salz desselben verwendet, in welchem der chromogene Rest R2 ein Nitrophenylrest, ein Naphthylrest, ein Nitronaphthylrest, ein Methoxynaphthylrest, ein Chinolylrest oder ein Nitrochinolylrest ist.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat oder ein Salz des Substrates der Formel I verwendet, in welchem der Rest R2 der p-Nitrophenyl-rest ist.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine quantitative Bestimmung des Enzymes durchführt.
5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine quantitative Bestimmung von Thrombin in einem System durchführt, in dem Thrombin gebildet oder verbraucht wird, oder die Bildung von Thrombin gehemmt wird.
6. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 5 zur Bestimmung von Faktoren, die einen Einfluss auf solche Reak-
Bz-Phe-Val-Arg-pNA (S-2160)
(A)
Die in dieser Formel für die fraglichen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen werden in der Folge noch tabellarisch zusam-50 mengestellt.
Das chromogene Substrat der Formel A bestitzt eine grosse Empfindlichkeit gegenüber Thrombin und es gibt bei der enzy-matischen Hydrolyse als chromophores Produkt das p-Nitroani-55 lin, das mit «pNA» in der Formel abgekürzt wird. Das p-Nitro-anilin kann spektrophotometrisch leicht bestimmt werden. Das Enzymsubstrat der Formel A, welches auch die Bezeichnung S-2160 aufweist, ist bezüglich seiner Verwendung jedoch Einschränkungen unterworfen, und zwar aufgrund seiner relativ 60 geringen Löslichkeit, die bei 1 mg/ml liegt. Diese geringe Löslichkeit führt zu dem Nachteil, dass man sehr nahe an der Sättigungsgrenze für dieses Substrat arbeiten muss, um in dem System eine befriedigende Konzentration an dem Substrat zu erreichen. Bei der Enzymbestimmung in verschiedenen biologi-(,5 sehen Systemen kann eine Ausfällung des Substrates selbst stattfinden, oder es kann ein Niederschlag entstehen, der eine Kombination aus Protein plus Substrat enthält. Diese Ausfällungen führen zu falschen Werten bei der photometrischen
3
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Bestimmung, und dementsprechend auch zu falschen Werten bezüglich der Enzymbestimmung.
Das Enzymsubstrat der Formel A, mit der Bezeichnung S-2160 wird wesentlich besser löslich, wenn in ihm die Benzoyl-gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt wird, sodass dieses weitere Substrat dann die folgende Formel B
NH,-C H-CO
H-Phe-Val-Arg-pNA
(b)
aufweist.
In dem Substrat der Formel B führt die nunmehr freie m protonisierte Aminogruppe bei dem Rest des Phenylalanines zu einer Erhöhung der Löslichkeit, es wird jedoch der Nachteil in Kauf genommen, dass auch die Geschwindigkeit, mit der Thrombin das fragliche Substrat spaltet, wesentlich vermindert wird, und zwar, wie aus der Tabelle I zu ersehen ist, etwa um das 15 Dreissigfache. Ausserdem kann das fragliche Substrat in einer biologischen Testlösung in unerwünschter Weise von der endständigen Aminogruppe her, durch Aminopeptidasen zersetzt werden.
Es wurde nun festgestellt, dass ein neues Substrat erhalten 2» werden kann, das durch Modifizierung des Produktes der Formel B erhalten wird, und zwar indem man in der Formel B die Aminosäure Valin durch eine cyclische Iminosäure ersetzt, und zwar durch 2-Azetidin-Carbonsäure (Aze), durch Prolin (Pro) oder durch Pipecolin-säure (Pip) und indem man ferner das 25 endständige L-Phenylalanin (L-Phe) durch D-Phenylalanin (D-Phe) ersetzt. Wie erwartet wurde, sind die so erhaltenen Substrate noch immer sehr gut löslich, überraschenderweise ist jedoch ihre Aktivität gegenüber Thrombin nicht vermindert, sondern anstatt dessen etwa 30-50-mal höher als die Aktivität 30 für die entsprechenden Substrate, die ausschliesslich aus L-Aminosäuren aufgebaut sind (es sei auf Tabelle I hingewiesen). Ausserdem sind die neuen Substrate um etwa 400%
stärker aktiv als das Substrat der Formel A mit der Bezeichnung S-2160. 35
Die endständigen D-Aminosäuren mit freier Aminogrup-pierung verhindert in den beim erfindungsgemässen Verfahren einzusetzenden Substraten ferner, dass ein nicht erwünschter Angriff von Aminopeptidasen an dem Substrat stattfindet, weil diese Enzyme gegenüber L-Aminosäuren spezifisch sind. 40
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von Thrombin, bzw. Enzymen, die Substrate in der gleichen Weise spalten wie Thrombin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Material, in dem die Enzyme bestimmt werden sollen, mit einem Substrat der folgen- 45 den Formel I
D-NH2-C H-CO-N - C H-CO-NH-C H-CO-NH-R,
in der D-Form vorliegt,
oder einem Salz des Substrates der Formel I zusammenbringt, wobei aus dem Substrat durch die enzymatische Hydrolyse eine Verbindung der Formel II
r2-nh2
(ii)
CH2-(CH2)n
(ch2)3)
I
nh
A
h2n nh
(I)
in welcher
Rj ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe ist, n 1,2 oder 3 ist,
R2 einen chromogenen Rest darstellt, und D veranschaulicht, dass der endständige Aminosäurerest der Formel abgespaltet wird, die sich bezüglich ihres Absorptionsspektrums von dem Substrat der Formel I unterscheidet, und wobei die Menge an gebildetem Hydrolyseprodukt proportional zur Menge an in dem Material anwesenden Enzym ist.
In bevorzugten, beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Substraten der Formel I ist der chromogene Rest R2 ein Nitrophenylrest, insbesondere der p-Nitrophenylrest, ein Naph-thylrest, ein Nitronaphthylrest, ein Methoxynaphthylrest, ein Chinolylrest oder ein Nitrochinolylrest.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann zur quantitativen Bestimmung der Enzyme herangezogen werden. So kann beispielsweise eine quantitative Bestimmung von Thrombin in einem System durchgeführt werden, in welchem Thrombin gebildet oder verbraucht wird, oder in welchem die Bildung von Thrombin gehemmt wird.
Dieses Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Thrombin kann erfindungsgemäss auch angewandt werden um solche Faktoren zu bestimmen, die einen Einfluss auf solche Reaktionen nehmen, oder an solchen Reaktionen teilnehmen, bei welchen Thrombin entweder gebildet oder verbraucht, oder die Bildung von Thrombin gehemmt wird. Beispiele für durch diese Anwendung in dem System bestimmbare Faktoren, die den Einfluss auf die fraglichen Reaktionen nehmen oder an den Reaktionen teilnehmen, sind Anti-thrombin, Pro-thrombin oder Heparin.
Zur Herstellung der neuen, beim erfindungsgemässen Verfahren einzusetzenden chromogenen Substrates der Formel I können übliche Schutzgruppen und Kupplungsverfahren angewandt werden, wobei alle diese Verfahrensweisen für den Fachmann auf dem Gebiete der Peptid-Chemie geläufig sind.
Als a-Aminoschutzgruppe kann die Carboxybenzoxy- oder die t-Bütyloxycarbonyl-Gruppe mit Vorteil eingesetzt werden, oder jede beliebige Schutzgruppe, die ähnlich aufgebaut ist wie die erwähnten Gruppen, wie z.B. die p-Methoxy-, p-Nitro- oder p-Methoxyphenylazo-carbobenzoxy-Gruppe.
Als Schutzgruppe für die ô-Guanidino-Gruppe des Arginy-les ist es vorteilhaft, eine Protonisierung zu verwenden oder eine N02-Gruppe oder eine p-Toluolsulfonyl-Gruppe.
Zum Schutz der Hydroxygruppe des Tyrosines kann vorteilhafterweise die t-Butylgruppe oder der Benzylrest verwendet werden.
Als abspaltbare Schutzgruppe für die Carboxylgruppe sind beispielsweise die entsprechenden Methylester, Äthylester oder Benzylester geeignet.
Die Kupplung zwischen zwei Aminosäuren oder einem Di-peptid und einer Aminosäure wird durch Aktivierung der a-Carboxygruppe erreicht. Diese aktivierten Derivate können entweder isoliert werden oder sie können in situ hergestellt
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werden und können beispielsweise die entsprechenden p-Nitro-phenyl-, Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl- oder N-Hydroxy-succinimidester oder symmetrische oder asymmetrische Anhydride, Säureazide oder N-Hydroxybenzotriazol-ester sein.
Das Prinzip des Herstellungsverfahrens kann eine stufenweise Kupplung der Aminosäuren an die Arginylgruppierung mit endständigem Kohlenstoffatom sein, wobei an diesen Argi-nylrest entweder die chromophore Gruppierung angekuppelt sein kann, die dann in diesem Fall bereits als Schutzgruppe für die Carbonsäuregruppierung des Arginylrestes wirkt, oder das eingesetzte Arginyl kann eine abspaltbare Carbonsäureschutzgruppe aufweisen, und der chromophore Rest wird dann an das geschützte Tripeptid-Derivat angekuppelt. Andererseits ist es auch möglich, das Dipeptid-Fragment mit endständigem Stickstoffatom selbst herzustellen, und dieses dann an den Arginyl-rest anzukuppeln, wobei dieser entweder bereits die chromophore Gruppe tragen kann oder frei von dieser chromophoren Gruppe sein kann, wie dies vorhin erläutert wurde.
Unabhängig von dem gewählten Herstellungsprinzip kann eine Reinigung der Zwischenprodukte und der Endprodukte durch Gelfiltrationchromatographie geeignet sein, denn dadurch wird eine rasche synthetische Arbeit ermöglicht, und es werden maximale Ausbeuten erzielt.
Die Dünnschichtchromatographie wurde teilweise anhand von Eluaten durchgeführt, die aus der Gelfiltrationschromatographie stammten, und teilweise anhand von Eindampfungs-rückständen und getrockneten Endprodukten und Zwischenprodukten.
In der vorliegenden Beschreibung werden die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Abkürzungen verwendet.
Abkürzung Substanz
Aminosäuren Falls nicht ausdrücklich andere Angaben gemacht werden, handelt es sich immer um die L-Formen der Aminosäure.
Arg Arginin
Aze 2-Azetidin-carbonsäure
Phe Phenylalanin
Pip Pipecolinsäure
Pro Prolin-
Val Valin
AcOH Essigsäure
Bz Benzoyl
Cbo Carbobenzoxy-
DMF Dimethylformamid
Et3N Triäthylamin
EtOAc Essigsäureäthylester
HMPTA N,N,N' ,N',N",N" -Hexamethylphosphorsäure-triamid
GPC Gelfiltrationschromatographie
MeOH Methanol
-OpNP p-Nitrophenoxy
-pNA p-Nitroanilin
TLC Dünnschichtchromatographie
Dünnschichtchromatographie
Zur Durchführung der Dünnschichtchromatographie wurden hergestellte Galsplatten verwendet, deren Absorptionsmittel das Silicagel F254 war. Die zur Durchführung der Dünn-schichtchromatogramme verwendeten Lösungsmittel waren die folgenden, wobei die Mengenverhältnisse immer auf das Volumen bezogen sind:
Lösungsmittel-System Pt Chloroform: Methanol = 9:1
Lösungsmittel-System A n-Butanol:Essigsäure:Wasser = 3:2:1
Nach der Durchführung der Dünnschichtchromatographie wird die Platte im Ultraviolettlicht (Wellenlänge 254 nm) betrachtet, und man entwickelt sie anschliessend nach üblichen Arbeitsverfahren unter Verwendung eines Chlor/o-toluidin-reagens. Wenn in der vorliegenden Beschreibung gesagt wird, «dass das Produkt nach der Dünnschichtchromatographie homogen ist» dann bedeutet dies, dass die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Menge von (i durchgeführt wurde. RrWerte, die angegeben sind, sind diejenigen Werte, die von getrennten chromatographischen Verfahren herrühren.
Das Gel Sephadex(R) G-15, das zur Durchführung der Gelfiltration verwendet wird, ist ein vernetztes Dextran-Gel.
Das Gel Sephadex^ LH-20 ist ein hydroxypropyliertes vernetztes Dextran-Gel.
Der Ionenaustauscher Sephadex^ QAE-25 der verwendet wird, ist ein vernetztes Dextran-Gel mit Diäthyl-(2-hydroxy-propyl)-amino-äthyl als funktioneller Gruppe.
Alle diese Gele stammen von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden.
Beschreibung der Herstellungsverfahren
I. Herstellung von Cbo-Arg(NO?)pNA
35,3 g (10 mMol) an trockenem Cbo-Arg(N02)-OH werden in 200 ml trockenem, frisch destilliertem HMPTA bei Zimmertemperatur gelöst, und dann setzt man 10,1 g (100 mMol) an Triäthylamin und 24,6 g (150 mMol) an p-Nitrophenyliso-cyanat zu, wobei man rührt und unter feuchtigkeitsfreien Bedingungen arbeitet. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung in 21 einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung unter Rühren eingegossen. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtration entfernt, und mit 2%iger Natriumbicarbonatlösung, mit Wasser, mit 0,5 normaler wässriger Salzsäure und mit Wasser gewaschen, und schliesslich getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt wird mit warmem Methanol extrahiert und schwer lösliche Nebenprodukte werden abfiltriert. Das Filtrat wird durch Chromatographie auf einer Säule gereinigt, die mit Se-phadex(R) LH-20 gefüllt ist, welches in Methanol quellen gelassen wurde, und man eluiert ebenfalls mit Methanol.
Die erzielte Ausbeute beträgt 29,8 g, entsprechend 63 % der theoretischen Ausbeute. Das Produkt ist nach der Dünnschichtchromatographie im Lösungsmittel Pi rein und besitzt einen Rr Wert von 0,34.
Die optische Drehung beträgt
[a] p +20,5° (c, 1,9, DMF)
II. Herstellung von Cbo-Pro-Arg(NQ7)-pNA
4,8 g (10 mMol) an dem Cbo-Arg(N02)-pNA werden in 25 ml an trockener Essigsäure aufgeschlämmt und dann gibt man 15 ml an 5,6 normaler Bromwasserstoffsäure in Essigsäure zu. Man lässt 50 Minuten lang bei Zimmertemperatur reagieren und giesst dann die Lösung unter heftigem Rühren in 300 ml trockenen Äther ein. Die Ätherphase wird von dem so erhaltenen Niederschlag abgesaugt, und der Niederschlag wird mit 2 Portionen von je 100 ml Äther gewaschen. Man erhält dabei das Hbr • H-Arg(N02)-pNA das in Vakuum über Natronlauge bei 40° C während 16 Stunden getrocknet wird. Dieses Produkt wird dann anschliessend in 25 ml Dimethylformamid aufgelöst, und die Lösung wird auf —10° C abgekühlt. Dann gibt man Triäthylamin in einer ausreichenden Menge zu, damit ein feuchtes pH-Papier, das unmittelbar über der Oberfläche der Lösung gehalten wird, eine schwach basische Reaktion liefert. Im allgemeinen werden dazu 1,9 ml benötigt. Es fällt dabei das Hydro-bromidsalz des Triäthylamines aus, und dieses wird durch Abfiltrieren entfernt, und man gibt dann zu dem Filtrat 4,1 g (11 mMol) an Cbo-Pro-OpNP zu. Nach einer weiteren Stunde werden 0,7 ml an Triäthylamin zugesetzt und ebenfalls nach 4 Stunden. Dann lässt man die Lösung sich auf Zimmertempera-
4
5
lü
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(<5
5
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tur über Nacht erwärmen. Es soll vermieden werden, dass eine zu grosse Menge an Cbo-Pro-OpNP als Verunreinigung im Endprodukt vorliegt, weil dieses Produkt bei der Durchführung der Gelfiltrationschromatographie ähnliche Eluationsvolumina in dem angewandten chromatographischen System aufweist wie ? das Endprodukt, und deshalb setzt man 0,5 ml (5 mMol) an n-Butylamin zu. Nach 30 Minuten werden 10 mMole an verdünnter Salzsäure zugegeben, und die Reaktionslösung wird auf einem Rotationsverdampfer eingedampft, der Rückstand wird mit mehreren Portionen Wasser gerührt, das durch Dekantieren hi entfernt wird. Der Rückstand wird dann in Methanol aufgelöst, und auf einer Säule, die mit Sephadex(R) LH-20 gefüllt ist,
welches in Methanol quellen gelassen wurde, Chromatographien, wobei man als Eluationsmittel Methanol verwendet. Das so erhaltene Produkt ist nach der dünnschichtchromatographi- i 5 sehen Analyse homogen.
Die Ausbeute betrug 5,5 g, entsprechend 96% der Theorie.
Die Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj lieferte einen RrWert von 0,28.
Die optische Drehung war 20
24
V. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO?)-pNA
Das Herstellungsverfahren wird nach der Methode IV durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 2,6 g, entsprechend 70% der Theorie. Das Produkt war nach der Dünnschichtchromatographie, ausgeführt unter Verwendung des Lösungsmittelsystemes Pls homogen und besass einen Rf-Wert von 0,44.
Die optische Drehung war wie folgt:
24
[a] _ —38,4° (c 1,0, Dimethylformamid).
[a] p -33,0° (c 1,0, DMF)
III. Herstellung von Cbo-Pip-Arg(NO?)-pNA
Die Herstellung wird nach dem Verfahren II durchgeführt. 25
Die Ausbeute beträgt 5,1 g, entsprechend 86% der Theorie. Das erhaltene Produkt ist nach der Dünnschichtchromatographie, unter Verwendung des Lösungsmittels Pb homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,30. 30
Die optische Drehung beträgt
D
VI. Herstellung von Cbo-Phe-Pro-Arg (NO?)-pNA
Das Herstellungsverfahren wurde wie unter IV erläutert durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 2,9 g, entsprechend 80% der Theorie. Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besass einen RrWert von 0,38.
Die optische Drehung war wie folgt:
24
[a] D —39,2° (c 1,0, Dimethylformamid)
VII. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N07)-pNA
Das Herstellungsverfahren wurde wie unter IV beschrieben durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 3,1 g, entsprechend 86% der Theorie. Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P1; homogen und besass einen RrWert von 0,46.
Die optische Darstellung war wie folgt:
[a] ™ -26,2°
(c 1,0, Dimethylformamid)
IV. Herstellung von Cbo-Phe-Pip-Arg(NO?)-pNA
2,9 g (5 mMol) Cbo-Pip-Arg(N02)-pNA werden decarbo-benzoxyliert indem man Bromwasserstoffsäure in Essigsäure verwendet, und man fällt dann aus und wäscht mit Äther und trocknet, wie dies unter II beschrieben ist.
Das erhaltene HBr ■ H-Pip-Arg(N02)-pNA wird dann in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf —10° C abgekühlt, unter Verwendung von 0,9 ml an Triäthylamin basisch gemacht und filtriert. Dann setzt man 3,0 g (7,15 mMol) an Cbo-Phe-OpNP zu und anschliessend 0,65 g (5 mMol) an N-Hydroxybenzotriazol als Katalsator. Nach einer Stunde werden weitere 0,35 ml an Triäthylamin zugegeben, und das gleiche Arbeitsverfahren wird nach 4 Stunden wiederholt. Man lässt die Reaktionslösung sich über Nacht auf Zimmertemperatur erwärmen. Die Lösung wird dann zur Trockene, unter Verwendung eines Rotationsverdampfers, eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst und mit einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser behandelt, und dann dampft man die organische Schicht ein. Der erhaltene Rückstand wird dann in Methanol gelöst, und man chromatographiert unter Verwendung einer Säure, die mit Sephadex(R) LH-20, welches in Methanol quellen gelassen wurde, gefüllt ist, wobei man mit Methanol eluiert.
Das erhaltene Produkt ist gemäss der Dünnschichtchromatographie homogen.
Die erzielte Ausbeute betrug 2,7 g, entsprechend 73% der Theorie.
Die Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittel Pj lieferte einen Rf-Wert von 0,35.
Die optische Drehung war wie folgt:
M d -32,9°
(c 1,0, Dimethylformamid).
24
[a] —6,2° (c 1,0, Dimethylformamid)
35 VIII. Herstellung von H-D-Phe-Pro-Arg-pNA • 2HC1
175 mg (0,246 mMol) an Cbo-D-Phe-Pro-Arg(N02)-pNA wurden von den Schutzgruppen befreit, indem man das Produkt mit 5 ml trockenem Fluorwasserstoff in Anwesenheit von 0,3 ml Anisol in einer Apparatur nach Sakakibara, die zur Durchfüh-40 rung dieses Verfahrens geeignet ist, umsetzte, wobei die Umsetzung während 60 Minuten bei 0° C durchgeführt wurde. Sobald die Reaktion abgeschlossen war, und sobald die gesamte Menge an Fluorwasserstoffsäure abdestilliert war, wurde das Produkt gereinigt, indem man es in zwei Stufen einem Ionenaustausch 45 unterwarf:
a) Gelfiltrationschromatographie auf einer Säule, die mit Sephadex(R) G-15, das in 33 % Essigsäure in Wasser quellen gelassen wurde, gefüllt war. Das gleiche Medium wurde zum Auflösen des Produktes und zur Durchführung der Elution
50 herangezogen. Das reine Produkt wird aus der wässrigen Essigsäurelösung durch Gefriertrocknung gewonnen.
b) Ionenaustausch auf einer Säule, die mit Sephadex(R) QAE-25 in der Chloridform, welche in einer Mischung aus 95 Volumina Methanol und 5 Volumina Wasser quellen gelassen
55 wurde, gefüllt war. Das gleiche Medium wurde verwendet, um das Material aufzulösen und auch zur Durchführung der Elution. Das reine Produkt wurde aus dem Wasser durch Gefriertrocknung gewonnen.
Die Ausbeute betrug 120 mg, entsprechend 80% der m> Theorie.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A, homogen und besass einen Rf-Wert von 0,29.
Der Chloridgehalt betrug 11,23 % (theoretischer Wert: f* 11,6%). Die optische Drehung war
24
[a] D —122° (c 0,5,. .50%igewässrige Essigsäure).
622 287
6
IX. Herstellung von H-Phe-Pro-Arg-pNA • 2HC1
Das Herstellungsverfahren wurde gemäss VIII durchgeführt.
Die Ausbeute betrugt 71 % der Theorie.
Gemäss einer Dünnschichtchromatographie, durchgeführt mit dem Lösungsmittelsystem A, war das Produkt homogen und besass einen Rf-Wert von 0,22.
Der Chloridgehalt betrug 11,0 Gew. -%, wobei der theoretische Wert 11,6% ist. Die optische Drehung war wie folgt:
24
[a] —73,6° (c 0,5,50%ige wässrige Essigsäure).
X. Herstellung von H-D-Phe-Pip-Arg-pNA • 2HC1
Das Herstellungsverfahren wurde gemäss VIII durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 72% der Theorie.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, durchgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besass einen RrWert von 0,44.
Der Chloridgehalt betrug 11,4 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,3%). Die optische Drehung war wie folgt:
24
[a] —109° (c 0,4, 50%ige wässrige Essigsäure).
XI. Herstellung von H-Phe-Pip-Arg-pNA • 2HC1 Die Herstellung wurde gemäss VII durchgeführt. Die Ausbeute betrugt 55 % der Theorie.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt unter Verwendung des Lösungsmittelsystems A, homogen und zeigte einen Rf-Wert von 0,41.
Der Chloridgehalt betrug 11,3 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,3 Gew.-%). Die optische Drehung war wie folgt:
24
[a] j-j —80,3° (cO,5, 50%ige wässrige Essigsäure).
XII. Herstellung von Cbo-D-Tyr(OBzl)-Pip-Arg(NQ,)-pNA Die Herstellung wurde gemäss IV durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 3,2 g, entsprechend 75 % der Theorie. Das Produkt war, gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pls homogen und besass einen Rf-Wert von 0,50.
XIII. Herstellung von H-D-Tyr-Pip-Arg-pNA Die Herstellung erfolgte gemäss VIII.
Die Ausbeute betrug 68 % der Theorie.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P1; homogen und besass einen Rf-Wert von 0,44.
Der Chloridgehalt betrug 10,8 Gew.-% (theoretischer Wert 11,1 Gew.-%).
Die optische Drehung war
24
[a] D -75,2° (c 0,5,50% ige wässrige Essigsäure).
XIV. Herstellung von Cbo-Aze-Arg(NQ9)-pNA Die Herstellung wurde gemäss II durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 4,2 g, entsprechend 75 % der Theorie.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besass einen Rf-Wert von 0,27.
XV. Herstellung von Cbo-D-Phe-Aze-Arg(NO?)-pNA Die Herstellung wurde gemäss IV durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 2,4 g, entsprechend 69 % der Theorie. Das erhaltene Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pl5 homogen und besass einen Rf-Wert von 0,47.
XVI. Herstellung von H-D-Phe-Aze-Arg-pNA • 2HC1 Die Herstellung wurde gemäss VIII durchgeführt. Die Ausbeute betrug 71 % der Theorie.
Das Produkt war gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besass einen Rf-Wert von 0,21.
Der Chloridgehalt betrug 11,6 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,9 Gew.-%).
Die optische Drehung betrug
24
[a] —130° (c 0,5,50%igeEssigsäure).
XVII. Herstellung von Cbo-Arg(NCM-ßNA
7,2 g (20 mMol) an trockenem Cbo-Arg(N02)-OH werden in 400 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Dann setzt man 2,0 g (20 mMol) an Triäthylamin zu, worauf dann die Lösung auf —10° C, unter Einhaltung von vollständig feuchtigkeitsfreien Bedingungen gekühlt wird. Dann setzt man 2,7 g (20 mMol) an Chlorameisensäure-isobutylester gelöst in 20 ml THF zu der gekühlten Lösung während 10 Minuten zu. Anschliessend werden während weiteren 10 Minuten 144 g (20 mMol) an ß-Naphthylamin zugegeben. Dann lässt man die Reaktionsmischung sich auf Zimmertemperatur erwärmen und belässt sie bei dieser Temperatur während 24 Stunden. Anschliessend wird die Reaktionsmischung in Vakuum zur Trockene eingedampft, und 3- bis 5mal mit destilliertem Wasser, 3- bis 5mal mit einer 5 %igen Natriumbicarbonatlösung und dann wieder 3- bis 5mal mit destilliertem Wasser behandelt und anschliessend im Vakuum getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in Methanol aufgelöst, auf einer Säule chromatographiert, die mit Sephadex^ LH-20, welches in Methanol quellen gelassen wurde, gefüllt ist, und man eluiert mit Methanol. Das erhaltene Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen.
Die Ausbeute beträgt 8,1 g, entsprechend 84% der Theorie.
Gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pl5 ist das Produkt homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,40.
Die optische Drehung beträgt
[a] ^ +7,4° (c 1,0, Dimethylformamid).
XVIII. Herstellung von Cbo-Pip-Arg(NQ7)-ßNA
Das Herstellungsverfahren wird gemäss II durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 4,8 g, entsprechend 82% der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P1; homogen und besitzt einen RrWert von 0,36.
XIX. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO->)-ßNA Das Herstellungsverfahren wird gemäss IV durchgeführt. Die Ausbeute betrugt 2,6 g, entsprechend 71 % der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie,
unter Verwendung des Lösungsmittelsystems Pl5 homogen und besitzt einen RrWert von 0,48.
XX. Herstellung von H-D-Phe-Pip-Arg-ßNA • 2HC1 Die Herstellung wird gemäss VIII durchgeführt. Die Ausbeute betrug 68 % der Theorie.
Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besitzt einen RrWert von 0,44,
Der Chloridgehalt beträgt 11,2 Gew.-% (theoretischer Wert: 11,3 Gew.-%).
Die optische Drehung beträgt 24
[a] D —105° (c 0,5, 50%ige wässrige Essigsäure).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7
622 287
XXI. Herstellung von Cbo-Arg(NO,)-ßNA (4-OMe)
Das Herstellungsverfahren wurde gemäss XVII durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 7,1 g, entsprechend 70% der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, 5 ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,42.
XXII. Herstellung von Cbo-Pip-Arg(NQ7)-ßNA (4-OMe) Das Herstellungsverfahren wurde gemäss II durchgeführt. Die Ausbeute betrugt 4,9 g, entsprechend 79% der Theorie. Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie,
ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem Pj, homogen und besitzt einen Rf-Wert von 0,38.
XXIII. Herstellung von Cbo-D-Phe-Pip-Arg(NO?)-ßNA (4- ,, OMe)
Das Herstellungsverfahren wird gemäss IV durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 2,7 g, entsprechend 70% der Theorie Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem P!, homogen und be- 20 sitzt einen Rf-Wert von 0,51.
XXIV. Herstellung von H-D-Phe-Pip-Arg-ßNA (4-OMe) 2HC1
Die Herstellung wird gemäss VIII durchgeführt.
Die Ausbeute beträgt 64 % der Theorie. 25
Das Produkt ist gemäss einer Dünnschichtchromatographie, ausgeführt in dem Lösungsmittelsystem A, homogen und besitzt einen Rt-Wert von 0,44.
Der Chloridgehalt beträgt 10,4 Gew.-% (theoretischer Wert: 10,7 Gew.-%). 30
Die optische Drehung ist
24
24
[a] j-j —102° (c 0,5,50%ige wässrige Essigsäure).
Bestimmung von Thrombin, unter Verwendung der chromogenen Substrate.
Die nach den vorangegangenen Beispielen hergestellten
35
Substrate wurden zur Bestimmung von Thrombin verwendet, wobei das untenstehende Arbeitsverfahren durchgeführt wurde.
Das Prinzip des Bestimmungsverfahrens beruht auf der Tatsache, dass das Produkt, das durch die enzymatische Hydrolyse des Substrates gebildet wird, ein Ultraviolettspektrum aufweist, das sich wesentlich von demjenigen des Substrates unterscheidet. So hat das gemäss Beispiel X hergestellte Substrat der Formel H-D-Phe-Pip-Arg-pNA ein Absorptionsmaximum bei 315 nm und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 12.500. Bei einer Wellenlänge von 405 nm hat die Absorption des Substrates fast vollständig aufgehört. Während der enzyma-tischen Hydrolyse des Substrates wird p-Nitroanilin abgespalten, und dieses hat ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 380 nm, und einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13.200. Bei einer Wellenlänge von 405 nm hat jedoch der molare Extinktionskoeffizient nur auf 9.620 abgenommen. Durch die spektrophotometrische Bestimmung bei einer Wellenlänge von 405 nm ist es daher möglich leicht die Menge an gebildetem p-Nitroanilin festzustellen. Diese Menge ist dem Ausmass der enzymatischen Hydrolyse proportional, und dieses ist wieder durch die aktive Menge an Thrombin bestimmt. Für andere erfindungsgemäss einzusetzende Substrate existieren im wesentlichen identische Bedingungen, und aus diesem Grunde wurden ständig die spektroskopischen Bestimmungen bei einer Wellenlänge von 405 nm durchgeführt.
Die folgende Tabelle I zeigt einen Vergleich der relativen Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen dem bereits bekannten Thrombin-Substrat der Formel A, mit der Bezeichnung S-2160, dem entsprechenden nicht benzoylierten Substrat und beim erfindungsgemässen Verfahren zu verwendenden Substraten. Aus dieser Tabelle sieht man klar, dass die erfindungsgemäss zu verwendenden Substrate überlegen sind. Sie reagieren 4mal rascher mit dem Thrombin als das beste bisher bekannte Substrat der Formel A, mit der Bezeichnung S-2160. Ausserdem sind die erfindungsgemäss zu verwendenden Substrate in Wasser etwa lOmal besser löslich als das Substrat mit der Bezeichnung S-2160.
Tabelle I
Substrat
Bezeichnung
Formel
Rei. Reaktions
Löslichkeit
geschwindigkeit in Wasser in
mg/ml
A (S-2160)
Bz-Phe-V al- Arg-pNA
100
0.1
B
H-Phe-Val-Arg-pNA
3
1
IX
H-Phe-Pro-Arg-pNA
15
1
VIII
H-D-Phe-Pro-Arg-pNA
400
3
XI
H-Phe-Pip-Arg-pNA
9
1
X
H-D-Phe-Pip-Arg-pNA
420
3
Die in der Tabelle I angegebenen relativen Reaktionsgeschwindigkeiten beziehen sich auf die Reaktion zwischen Thrombin (0,4 NIH/ml) und Substrat bei einer Substratkonzentration von 0,1 |xmol/ml.
C

Claims (2)

  1. 622 287
    2
    PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Bestimmung von Thrombin, bzw. Enzymen, die Substrate in der gleichen Weise spalten wie Thrombin, dadurch gekennzeichnet, dass man das Material, in dem die Enzyme bestimmt werden sollen, mit einem Substrat der folgenden Formel I
    D-NH,-C H-CO- N - C H-CO-NH-C H-CO-NH-R,
    tionen nehmen, oder an solchen Reaktionen teilnehmen, bei welchen Thrombin entweder gebildet oder verbraucht oder die Bildung von Thrombin gehemmt wird.
  2. 7. Anwendung gemäss Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem System bestimmten Faktoren, die den Einfluss auf die Reaktionen nehmen oder an den Reaktionen teilnehmen, Anti-thrombin, Prothrombin oder Heparin sind.
    I I
    CH2-(CH2)n
    (CH2)3
    NH
    c
    H2H NH
    (I)
    in welcher
    Rx ein Wasserstoff atom oder eine Hydroxygruppe ist, n 1,2 oder 3 ist,
    R2 einen chromogenen Rest darstellt, und D veranschaulicht, dass der endständige Aminosäurerest der Formel
    NH2-C H-CO
    15
    20
    25
    35
    in der D-Form vorliegt,
    oder einem Salz des Substrates der Formel I zusammenbringt, wobei aus dem Substrat durch die enzymatische Hydrolyse eine Verbindung der Formel II
    R,-NH,
    (II)
    45
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