Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych chromogennych odczynników do oznacza¬ nia trombiny d podobnych do trombiny enzymów. Odczynniki otrzymane sposobem wedlug wynalaz¬ ku sa specjalnie przydatne do ilosciowego ozna¬ czania trombiny lub badania reakcji, w których trombina powstaje, jest hamowana lub zuzywana, albo badania czynników wplywajacych na powyz¬ sze reakcje lub bioracych w nich udzial, np. do oznaczania antytrombiny, protrombiny i heparyny. Syntetyczne odczynniki do oznaczania enzymów sa o wiele bardziej przydatne w porównaniu z natu¬ ralnymi, gdyz spelniaja one w pelni rózne warun¬ ki, takie jak duza czulosc i specyficznosc w sto¬ sunku do enzymu, dobra rozpuszczalnosc w wo¬ dzie lub badanych plynach biologicznych oraz latwa wykrywalnosc niektórych produktów roz¬ szczepiania. Jednym z najlepszych odczynników do oznaczania trombiny jest opisany w szwedzkim opisie paten¬ towym nr 380 257 chromogenny trójpaptyd o wzo¬ rze Bz-Fe-Wal-Ang-pNA (S-2160). Znaczenia skró¬ tów podane sa w dalszej czesci opisu. Wykazuje on duza czulosc w stosunku do trombiny i daje po enzymatycznej hydrolizae jako chromogenny p-nitroaniline, która z latwoscia oznacza sie spektrofiotometryczme. Zwiazek S-2160 ma jednak ograniczone zastoso¬ wanie ze wzgledu na stosunkowo mala rozpusz¬ czalnosc, wynoszaca 1 mg/ml. Mala rozpuszczal- nosc powoduje koniecznosc pracy blisko granicy nasycenia dla uzyskania wystarczajacego stezenia odczynnika. Podczas oznaczania enzymów w róz¬ nych plynach biologicznych moze miec miejsce wytracanie sarniego odczynnika lub jego mieszani¬ ny z proteinami. Powoduje to bledne odczyty spek¬ trofotometryczne i tym samym bledy w oznacza¬ niu enzymu. Odczynnik na enzymy S-2160 uzyskuje znacznie lepsza rozpuszczalnosc po wymianie grupy benzoi- lowej na atom wodoru i otrzymaniu zwiazku o wzorze H-Fe-Wal-Arg-pNA. Wolna grupa amino¬ wa fenyloalaniny zwieksza rozpuszczalnosc odczyn¬ nika, zmniejsza jednak znacznie okolo 30 razy szybkosc rozszczepiania odczynnika przez enzym (itablica). Ponadto odczynnik moze byc w niepoza¬ dany sposób rozkladany w plynach biologicznych przez peptydazy aminowe, od strony koncowej igrupy aminowej. Zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, zwia¬ zek powyzszy modyfikuje sie, wymieniajac waline na cykliczny aminokwas (kwas 2-azetydynokarfoo- ksylowy, proline lufo kwas pipekolinowy) oraz L- -fenyloialanine na D-fenyloalanine. Zgodnie z ocze¬ kiwaniem, otrzymane odczyniki sa w dalszym cia¬ gu bardzo dobrze rozpuszczalne, a ponadto, zu¬ pelnie nieoczekiwanie, ich aktywnosc wobec trom¬ biny nie tylko nie maleje ale wzrasta 30-50-krot- nlie w porównaniu z odpowiednikiem zawierajacym tylko L-aminokwasy (tablica). Ponadto, nowe od- 103 0033 103 003 4 cznniki isa o okolo 400°/» bardziej aktywne niz S-2160. N-koncowy D-aminokwajs zapobiega takze atakowi aminopeptydaz, które sa specyficzne wo¬ bec izomeru L amJinokwasu. Nowe odczynniki chromogenne wedlug wynalazku maja strukture okreslona wzorem przedstawionym na rysunku, w którym Ri oznacza atom wodoru lub grupe hy¬ droksylowa, R2 oznacza grupe nitrofenylowa, naf- tylowa, nitronaftylowa, metoksynaftylowa, chino- linowa lub mitrochinolinowa, oraz n jest równe 1, 2 lub 3, przy czym zwiazki te moga wystepowac równiez w postaci sola. Podczas syntezy nowych chromogennych odczyn¬ ników do oznaczania enzymów stosuje sie zwykle uzywane grupy ochronne i zwykle sposoby sprze¬ gania, powszechnie znane w chemi peptydów. Do ochrony grupy a-aminowej korzystnie sto¬ suje sie grupe karbobenzoksylowa albo III-rz.-bu- tyloksykarbonylowa lub niektóre .podobne grupy, takie jak p-meitoksylowa, p-nitrowa lub p-meto- ksyfenyloazokarbobenzyloksylowa. Pozadane jest chronienie grupy 8-guanidynowej w reszcie argininy za pomoca protonówania, gru¬ py póllitrowej lub p-toluenosulfonylowej. Do ochrony grupy hydroksylowej w tyrozynie stosuje sie grupe III-rz-butylowa lub benzylowa. Jako odszczepialna ochrone grupy a-karboksylowej stosuje sie grupe metylowa, etylowa lub benzy¬ lowa. Sprzeganie dwóch aminokwasów lufo dwupepty- du i aminokwasu zachodzi po zaktywowaniu grupy a-karboksylowej. Aktywna ipochodna mozna izolo¬ wac lub zuzywac in situ. Do aktywacji stosuje sie ester p-nitrobenzylowy, trójchlorofenylowy, piecio- chlorofenylowy, N-hydroksysukcynimid, N-hydro- ksybenzotriazol, symetryczny lub asymetryczny bezwodnik albo azydek kwasowy. Synteza odczynnika polega na stopniowym dobu- ^owywaniu aminokwasów, poczawszy od C-konco- wej grupy argininy, która moze uprzednio posiadac wbudowana grupe chromoforowa, sluzaca zarazem jako ochrona grupy karboksylowej. Grupa karbo¬ ksylowa argininy moze byc równiez chroniona odszczepialna grupa ochronna i wtedy grupe chro¬ moforowa dobudowuje sie do ochronionego trój- peptydu. Mozna równiez najpierw syntetyzowac N-koncowy fragment dwupeptydu i nastepnie sprzegac go z grupa arginylowa, zawierajaca lub nie zawierajaca grupy chromoforowej. Niezaleznie od wybranego sposobu syntezy, do oczyszczania produktów przejsciowych i konco¬ wych, korzystnie jest stosowac filtracje molekular¬ na na zelu, gdyz umozliwia ona szybka synteze i zapewnia maksymalna wydajnosc. Chromaltografie cienkowiairsfiwowa stosuje sie do badania eluatów z filtracji molekularnej oraz do badania produktów przejsciowych i koncowych, po odparowaniu i wysuszeniu. Chromatografie cienkowarstwowa wykonuje sie na plytkach szklanych pokrytych zelem krzemion¬ kowym F245 (Merck), jako substancja absorbujaca. Do rozwiania stosuje sie nastepujace mieszaniny rozpuszczalników: Di — chloroformimetanol 9:1, A — n-butanol:kwas octowy:woda 3:2:1. Po rozwi¬ nieciu, plytki bada sie w swietle nadfiolkowym przy dlugosci fali 254 nm i wywoluje odczynnikiem chlorkowo-p-toluidynowym, powszechnie stosowa¬ nym. W przypadku gdy produkt okresla sie jako jednorodny wedlug chromatografii cienkowarstwo- wej, do badan pobiera sie go w ilosciach mikro- gramowych. Podane wartosci Rf dotycza poszczególnych pro¬ cesów chromatograficznych. Zel Sephadex G-15 stosowany do filtracji [molekularnej jest usieciowa- nym zelem dekstranowym. Sephadex LH-20 to hy- droksypropylowany uisieciowany zel dekstranowy,, a Sephadex Q£A-25 jest usieciowanym zelem dek¬ stranowym, posiadajacym funkcyjna grupe dwuety- lo-/2-hydroksypropylo/-aminoetylowa. Zele powyz- sze isa produkowane przez firme Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Szwecja. Skróty: Jesli nie podano inaczej, aminokwasy sa izomerami L. Arg — arginina; Aze — kwas 2-azetydynokarbokisylowy; Fe — fenyloalariina; Pip — kwas pipekolinowy; Pro — prolina; Wal — Wialina; Bz — grupa benzoilowa; Kbz — grupa karbobenzoksylowa; —OpNP — grupa p-initrofenoksylowa; —pNA — pHriitroanilid; Wynalazek jest ilustrowany nastepujacymi przy- 36 kladami. Przyklad I. Kbz-Arg/NO^-pNA. Do 35,3 g (10 milimoli) suchej Kbz-Arg(N02)-OH w 200 ml bezwodnego, swiezo destylowanego, N, N, N', N", N", —N" -szesciometylotrójamidit kwasu fosforowego, dodaje sie podczas mieszania w tem¬ peraturze pokojowej i w warunkach bezwodnych; ,1 g (100 milicmbli) trójetyloaatiiny i 24,6 g (150 mi¬ limoli) izocyjanianu pnnitrofenylu. Po uplywie 24 godzin roztwór wlewa sie podczas mieszania do 2 litrów 2°/o roztwru wodnego wodoroweglanu so¬ dowego. Wytracony osad odsacza sie i przemywa 2% roztworem wodoroweglanu sodowego, woda, 0,5 n kwasem solnym i jeszcze raz woda, a nas- 45 tepnie suszy. Surowy produkt rozpuszcza sie w go¬ racym metanolu i odsacza trudnoirozpuszczalne produkty uboczne. Roztwór oczyszcza sie za pomo¬ ca chromatografii na Sephadexie LH-20, stosujac do speczniania ii elucji metanol. Wydajnosc 29,8 g 50 (63%). Chromatografia cienkowarstwowa w ukla¬ dzie Pi wykazuje jednorodnosc produktu (Rf= =0,34). Skrecalnosc wlasciwa [oi]d24 wynosi +20,5 Cc=1,9 dwumetyloformamid). Przyklad II. Kjbz-Pro-Arg(N02)-pNA. 55 Do zawiesiny 4,8 g (10 milimoli) Kbz-Arg(NC2)- -pNA w 25 ml bezwodnego kwasu octowego doda¬ je sie 15 ml 5,6 n bromowodoru w kwasie octowym i pozostawia w temperaturze pokojowej w ciagu 50 minut, po czym wlewa roztwór, podczas silnego 60 mieszania, do 300 ml bezwodnego eteru. Faze ete¬ rowa usuwa sie a wytracony osad przemywa 2 por¬ cjami po 100 ml eteru. Otrzymany bromowodorek H-Arg(NC2)-pNA suszy sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem, nad stalym wodorotlenkiem sodowym, 65 w temperaturze 40°C, w ciagu 16 godzin, a nas-5 103 093 6 tepnie rozpuszcza w 25 ml dwumetyloformamidu i ochladza do temperatury —10°C. Do -roztworu dodaje sie trójetyloamine, w ilosci wystarczajacej do uzyskania odczynu slabozasado¬ wego {1,9 ml), który to odczyn bada sie umieszcza¬ jac tuz nad powierzchnia roztworu wilgotny papie¬ rek wskaznikowy. Wytracony bromowodorek trój¬ etyloaminy odsacza sie i do przesaczu dodaje sie 4,1 g (11 milimoli) Kbz-Pro-OpKP. Po uplywie 1 i 4 godzin dodaje sie po 0,7 ml trójetyloaminy. Mieszanine pozostawia sie w ciagu nocy w tempe¬ raturze pokojowej. Aby zapobiec zanieczyszczeniu produktu koncowego nadmiarem Kbz-Pro-OpNP, jako ze oba produkty maja podczas filtracji mole¬ kularnej zblizone objetosci elucji, dodaje sie do mieszaniny 0,5 nil (5 milimoli) n-butyloaminy. Po uplywie 30 minut dodaje sie 10 milimoli rozcien¬ czonego kwasu so.nego i mieszanine odparowuje za pomoca wyparki obrotowej a nastepnie miesza z mala iloscia wody, która nastepnie dekantuje sie. Pozostalosc rozpuszcza sie w metanolu i chroma- tograiuje na zelu Sephadex LH-20, stosujac do speczniania i elucji metanol. Chromatografia cien¬ kowarstwowa wykazuje jednorodnosc produktu. Wydajnosc wynosi 5,5 g (96%), Rf w ukladzie Pi jest równe 0,28, [a]D24 = —33,0° (c = 1,0, dwume- tylofoirmamid). Przyklad III. Kbz-Pip-Ar,g(N02)-pNA. Postepujac w sposób opisany w przykladzie II otrzymuje sie 5,1 g {86%) produktu, chromatogra¬ ficznie jednorodnego w ukladzie Pi {Rf = 0,30), o skrecalnosci wlasciwej [ci]d24 = —26,2° (c = 1,0 dwumetyloiformamid). Przyklad IV. Kbz-Fe-Pip-Arg(N02)-pNA. 2,9 g <5 milimoli) Kbz-Pip-Ar,g(N02)-pNA pod¬ daje sie reakcji odszczepiania grupy karbobenzo- ksylowej, za pomoca bromowodoru w kwasie octo¬ wym. Wytracony osad przemywa isie eterem i su¬ szy w sposób podany w przykladzie II. Otrzymany bromowodorek H-Pip-Argi(N02)-pNA rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu, ochladza roz¬ twór do temperatury —10ftC, alkalizuje za pomoca 0,9 ml trójetyloaminy i saczy. Do roztworu dodaje sie 3,0 g (7,15 milimola) Kbz-Fe-OpNP oraz 0,65 g (5 milimoli) N-hydroksybenzotriazolu, w charakte¬ rze- katalizatora. Po uplywie 1 godziny dodaje sie 0,35 ml trójetyloaminy, powtarzajac to po uplywie 4 godzin. Mieszanine pozostawia sie w ciagu nocy w tem¬ peraturze pokojowej a nastepnie odparowuje do sucha w wyparce obrotowej. Pozostalosc rozpusz¬ cza sie w octanie etylu, po czym dodaje 2% roz¬ tworu wodoroweglanu sodowego i wody i znów odparowuje. Pozostalosc rozpuszcza sie w meta¬ nolu i chromatografuje na zelu iSephadex LH-20, stosujac do speczniania i elucji metanol. Otrzymu¬ je sie produkt jednorodny chromatograficznie w ukladzie Pi (Rf = 0,35). Wydajnosc wynosi 2,7 g (73%) a skrecalnoisc [a]D24 = —32,9° (c = 1,0 dwu- etyloformamid). Przyklad V. Kbz-D-Fe-Pip-Arg{N02)-pNA. Powtarzajac postepowanie opisane w przykladzie IV otrzymuje sie 2,6 g (70°/©) produktu, jednorod¬ nego chromatografioznie w ukladzie Pi {Rf = 0,44), o skrecalnosci wlasciwej [ = —1,0, dwumetyloformamid). Przyklad VI. Kbz-Fe-Pro-Arg(N02)-pNA. Postepujac w sposób opisany w przykladzie IV otrzymuje sie 2,9 g (80%) produktu, jednorodnego chromatograficznie w ukladzie Pi {Rf = 0,38), o skrecalnosci wlasciwej [a]D24 = —39,2° (c = = 1,0, dwumetylofoirm,amid). Przyklad VII. Kbz-D-Fe-Pro-Arg(N02)-pNA. Powtarzajac postepowanie opisane w przykladzie io IV otrzymuje sie 3,1 g (86%) produktu, jednorod¬ nego chromatograficznie w ukladzie Pi(Rf = 0,46), o skrecalnosci wlasciwej [oi]d24 = — 6,2° (c = = 1,0, dwumeityloformamid). Przyklad VIII. H-D-Fe-Pro-Arg-pNA. 2HC1. Grupe ochronna w 175 mg {0,246 milimolach) Kbz-D-Fe-Pro-Arg{N02)-pNA odszczepia sie w reakcji z 5 ml bezwodnego fluorowodoru, w obecnosci 0,3 ml anizolu w aparacie Sakakiba- ry, przeznaczonym do tego celu. Proces prowadzi sie w ciagu 60 minut, w temperaturze 0aC. Po za¬ konczeniu reakcji oddestylowuje sie caly fluoro¬ wodór i surowy produkt oczyszcza sie w dwóch etapach: a) poddaje sie filtracji molekularnej na zelu Sep- hadex G-15, specznionym w kwasie octowym, któ¬ ry stosuje sie tez do elucji. Czysty produkt liofili¬ zuje sie z wodnego roztworu kwasu octowego, b) poddaje sie produkt chromatografii jonowy¬ miennej na zelu Sephadex QAE-25 w formie chlor- kowej, specznionym w mieszaninie metanolu i wo¬ dy (95:5), która to mieszanine stosuje sie równiez do rozpuszczania i elucji. Czysty produkt liofili¬ zuje sie z wody. Otrzymuje sie 120 mg {80 duktu jednorodnego chromatograficznie w ukladzie A (Rf = 0,29), o zawartosci chloru 11,53 (teoretycz¬ nie 11,6%). i skrecalnosci wlasciwej [ (c = 0,5, 50% roztwór wodny kwasu octowego). Przyklad IX. H-Fe-Pro-Arg-pNA. 2HC1. Powtarzajac postepowanie opisane w przykladzie 40 VIII otrzymuje sie z wydajnoscia 71%, produkt jednorodny chromatograficznie w ukladzie A (Rf = = 0,22), o zawartosci chloru 11,0% (teoretycznie 11,6% i sikrecalnosci wlasciwej [ci]d24 = —73,6° {c = 0,5, 50% roztwór wodny kwasu octowego). 45 Przyklad X. H-D-Fe-Pip-Arg-pNA. 2HC1. Powtarzajac postepowanie z przykladu VIII otrzymuje sie z wydajnoscia 72% produkt jedno¬ rodny chromatograficznie w ukladzie A (Rf = = 0,44), o zawartosci chloru 11,4 (teoretycznie 50 11,3%) i skrecalnosci wlasciwej [ci]d24 = —109° (c = 0,4, w 50°/o roztworze wodnym kwasu octowe¬ go). Przyklad XI. H-Fe-Pip-Arg-pNA. 2HC1. Powtarzajac postepowanie z przykladu VIII 55 otrzymuje sie z wydajnoscia 55% produkt jedno¬ rodny chromatograficznie w ukladzie A (Rf = = 0,41), o zawartosci chloru 11,3% (teoretycznie 11,3%) i skrecalnosci wlasciwej [cx]d24 = —80,3° (c = 0,5, 50% roztwór wodny kwasu octowego). 60 Pr z y k l a d XII. Kbz-D-Tyr(OBz)-Pip-Arg (N02)-pNA. Powtarzajac postepowanie z przykladu IV otrzy¬ muje sie 3,2 g (75%) produktu, jednorodnego chro¬ matograPicznie w ukladzie Pi{Rf = 0,50). g5 Przyklad XIII. H-D-Tyr-Pip-Arg-pNA.7 103 003 8 Powtarzajac postepowanie z przykladu VIII otrzymuje sie z wydajnoscia 68% produkt jedno¬ rodny chromatograficznie w ukladzie Pi (Rf = = 0,44), o zawartosci chloru 10,8% (teoretycznie 11,1%) i skrecalnosci wlasciwej [a]D24 = —75,2° 5 (c = 0,5, 50% roztwór kwaisu octowego w wodizae). Przyklad XIV. Kbz-Aze-Arg(N02)-pNA. ¦ Powtarzajac postepowanie z przykladu II otnzy- muje sie 4,2 g i(75%) produktu jednorodnego chro¬ matograficznie w ukladzie Pi (Rf = 0,27), u Przyklad XV. Kb;Z-D-Fe-Aze-Ang(N02)-pNA. Powtarzajac postepowanie z przykladu IV otrzy¬ muje sie 2,4 g (69%) produktu jednorodnego chro¬ matograficznie w ukladzie Pi (Rf = 0,47). Przyklad XVI. H-D-Fe-Aze-Arg-pNA. 2HC1. 15 Powtarzajac postepowanie z przykladu VIII otrzymuje sie z wydajnoscia 71%, produkt jedno¬ rodny chromatograficznie w ukladzie A (Rf = = 0,21), o zawartosci chloru 11,6% (teoretycznie 11,9%) i skrecalnosci wlasciwej [a]D24 = —130° 20 (c = 0,5, 50% roztwór wodny kwasu octowego). Przyklad XVII. Kbz-Arg(N02)-pNA. Do ochlodzonego do temperatury —10°C roz¬ tworu 7,2 g (20 milimoli) suchego Kbz-Arg(NC2)- -OH w 400 ml czterowodorofuranu dodaje sie 25 w calkowicie bezwodnych warunkach 2,0g (20 mi¬ limoli) trójetyloaminy a nastepnie w ciagu 10 mi¬ nut 2,7 g (20 milimoli) chloromrówczanu izobuty- lu w 20 ml cizteirowodosrofuiranu. Po uplywie 10 mi¬ nut dodaje sie 344 g <20 milimoli) a-naftyloaminy. 30 Mieszanine reakcyjna pozostawia sie do osiagnie¬ cia temperatury pokojowej w ciagu 24 godzin, po czym odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do sucha;1' Pozostalosc przemywa sie 3—5 razy woda desty- 35 lowana, 3—5 crazy 5% roztowrem wodoroweglanu sodowego oraz powtórnie 3—5 razy destylowana woda a nastepnie suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Produkt rozpuszcza sie w metanolu i chro- matografuje na zelu Sephadex LH-20, stosujac do 40 speczniania i elucji metanol. Otrzymuje sie 0,1 g <84%) produktu jednorodnego chromatograficznie w ukladzie Pi (Rf = 0,40), o skrecalnosci wlasci¬ wej [ci]d24 = +7,4° (c = 1,0, dwumetylofoorma- mid). 45 Przyklad XVIII. Klbz-Pip-Arg(N02)-aNA. Powtarzajac postepowanie opisane w przekladzie II otrzymuje sie 4,8 g (82%) produktu jednorodne¬ go chromatograficznie w ukladzie Pi (Rf = 0,36). Przyklad XIX. Kbz-D-Fe-Pip-Arg(N02)-aNA. 50 Powtarzajac postepowanie z przykladu IV otrzy¬ muje sie 2,6 g (71%) produktu jednorodnego chro¬ matograficznie w ukladzie Pi (Rf = 0,48). Przyklad XX. H-D-Fe-Pip-Arg-aNA. 2HC1. Powtarzajac postepowanie wedlug przykladu VIII 55 otrzymuje sie z wydajnoscia 68% produkt jedno¬ rodny chromatograficznie w ukladzie A (Rf = = 0,44), o zawartosci chloru 11,2% (teoretycznie 11,2%) • i skrecalniosci wlasciwej [ci]d24 = —105° (c = 0,5, 50% roztwór wodny kwaisu octowego.) 60 Przyklad XXI. Kbz-Arg(N02)-aNA (4-OMe). Powtarzajac postepowanie wedlug przykladu XVII otrzymuje sie 7,1 g (70%) produktu jedno¬ rodnego chromatograficznie w ukladzie Pi (Rf = Przyklad XXII. Kbz-Pip-Arg(N02)-aNA (40Me). Powtarzajac postepowanie wedlug przykladu II otrzymuje sie 4,9 g (70%) produktu jednorodne¬ go chromatograficznie w ukladzie Pi(Rf = 0,38). Przyklad XXIII. Kbz-iD-Fe-Pip-Airgi(N02)- -00NA (4-OMe). Powtarzajac postepowanie wedlug przykladu IV otrzymuje sie 2,7g (70%) produktu jednorodne¬ go chromatograficznie w ukladzie Pi(Rf = 0,51). Przyklad XXIV. H-D^Fe-Pip-Arg-aNA (4-OMe). 2HC1. Powtarzajac postepowanie wedlug przykladu IV otrzymuje sie z wydajnoscia 64% produkt jed¬ norodny chromatograficznie w ukladzie A (Rf = =' 0,44), o zawartosci chloru 10,4% (teoretycznie ,7%) i skrecalnosci wlasciwej [oi]d24 = —102° (c = 0,5, 50% roztwór wodny kwasu octowego.) Oznaczanie trombiny przy pomocy odczynników chroTnjogeninych. Odczynniki wytwarzane wedlug 'powyzszych przy¬ kladów sa stosowane do oznaczania trombiny. Wykorzystuje sie tu fakt, ze odszczepiony podczas hydrolizy enzymatycznej produkt ma widmo w nadfiolecie zupelnie rózne od widma odczynnika. Odczynnik wedlug przykladu X, H-D-Fe-Pip-Airg- -pNA, wykazuje maksimum absorbcji przy 315 nm, z molarnym wspólczynnikiem absoirbcji wynosza¬ cym 12 500. Przy 405 nm absorbcja odczynnika pra¬ wie calkowicie zanika. Odszczepiona od odczynnika podczas enzymatycznej hydrolizy p-nitroanilina ma maksimum absorbcji przy 380 nm, z molaornym wspólczynnikiem absoirbcji 13 200, przy którym przy 405 nm spada tylko do 9 620. Tak wiec, przy pomocy oznaczen spektrofotometrycznych przy 405 nm mozna latwo oznaczac ilosc (powstajacej p-ni- troaniliny, która to ilosc jest proporcjonalna do stopnia hydrolizy enzymatycznej, wyznaczanego iloscia aktywnej trombiny. W przypadku innych odczynników wedlug wynalazku, zachodza raczej identyczne warunki i dla tego oznaczenia wykony¬ wane sa irówniez przy dlugosci fali 405 nm. W tablicy podano porównanie wzglednych szyb¬ kosci reakcji dla znanego odczynnika na trombine S-2160 (A), jego nie zawierajacej grupy benzoilo- wej pochodnej (B) oraz odczynników wedlug wy¬ nalazku. Z tablicy wyraznie wynika wyzszosc tych ostatnich. Reaguja one 4-kroitnie szybciej niz naj¬ lepsze znane odczynniki S-2160 i sa okolo 10 krot¬ nie lepiej od niego rozpuszczalne w wodzie. Tablica Wzgledna szybkosc reakcji pomiedzy trombina (0,4 NIH/ml) i odczynnikiem (0,1 milimola/ml) ^ § : Odcz A (S-2160) Bz-Fe-Wal-Arg- -pNA B H-Fe-Wal-Arg- -pNA ;rr< s? ¦a 0) -i ^ or 8 tl-3 100 3 II ' 8 ^ * O ii £ 0,1 1103 9 Tablica c.d. IX VIII XI X H-Fe-Pro-Arg- -pNA H-D-Fe-Pro-Arg -pNA H-Fe-Pip-Arg- -pNA H-D-Fe-Pip-Arg- -pNA 400 9 420 1 3 1 3 003 PL PL PL PL PL PL