Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zwiazków diagnostycznych o duzej wrazliwosci na trombine i inne enzymy proteolityczne typu peptydohydrolaz peptydowych, w postaci wolnych zasad lub addycyjnych soli tych zasad z kwasami. ( Strukture tych zwiazków wyraza wzór przedstawiony na rysunku, w którym to wzorze Rt oznacza atom wodoru, rodnik acylowy o 1 - 12 atomach wegla, co-aminoacylowy o 1 — 12 atomach wegla, cykloheksylokar- bonylowy, co-cykloheksyloacylowy, 4-aminometylocykloheksylokarbonylowy, benzoilowy niepodstawiony lub podstawiony np. jednym lub wieksza liczba atomów chlorowca, grupe metylowa, aminowa lub fenylowa, rodnik co-fenyloacylowy o 1—6 atomach wegla w czesci acylowej, ewentualnie podstawiony w pierscieniu, rodnik benzenosulfonylowy, 4-toluenosulfonylowy lub Na-benzoilofenyloalanylowy, R2 oznacza rodnik fenylowy, benzylowy, 4-hydroksybenzylowy, 4-metoksybenzylowy lub 4-metylobenzylowy, R3 oznacza prosto lancucho¬ wy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o 3 - 8 atomach wegla, rodnik fenylowy lub benzylowy, R4 oznacza atom wodoru lub rodnik guanylowy, R5 oznacza rodnik fenylowy, nitrofenylowy, metylonitrofenylowy, dwunitrofenylowy, naftylowy, nitronaftylowy, chinolilowy lub nitrochinolilowy, a n oznacza liczbe calkowita 2, 3 lub 4. W sposobie wedlug wynalazku do odpowiedniego aminokwasu dolacza sie grupe chromoforowa R5, a do tak powstalej struktury stopniowo przylacza pozostale aminokwasy, w takiej kolejnosci, by otrzymac pozadany zwiazek o wzorze przedstawionym na rysunku (grupa chromoforowa blokuje C-terminalna grupe karboksylowa pierwszego aminokwasu) lub tez stopniowo tworzy sie pozadana strukture peptydowa, usuwa z niej grupy blokujace i przylacza grupe chromoforowa R5.Aminokwas zawierajacy ugrupowanie o wzorze R4NH/CH2/nCHNH/B1/CO poddaje sie reakcji ze zwiaz¬ kiem zawierajacym grupe chromoforowa R5 a nastepnie z aminokwasem zawierajacym ugrupowanie o wzorze R3CHNH/B1/CO. Tak wytworzona struktura peptydowa reaguje dalej z aminokwasem zawierajacym ugrupowa¬ nie o wzorze R2CHNH/B1/CO-, po czym do powstalego ugrupowania peptydowego wprowadza sie grupe RlB W przytoczonych wzorach B1 oznacza grupe blokujaca, a poszczególne skladniki aminokwasowe laczy sie ze soba znanymi sposobami. < Mozna tez zachowujac powyzsza kolejnosc najpierw wytworzyc strukture poptydowa o wzorze Rj-NH CH/R2/CONHCH/R3/CONHGH/CH2/n/NHR4/CONH - do której nastepnie wprowadza sie grupe chromoforowa R5.2 90 746 Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku sa przeznaczone do ilosciowego oznaczenia sklasyfikowa¬ nych i dotychczas nie sklasyfikowanych enzymów typu E.C.3.4.4, a szczególnie enzymów rozkladajacych wiazania peptydów lub bialek, w które sa zaangazowane grupy karboksylowe argimny lub lizyny, np. trombiny, plazminy, enzymu o nazwie Reptilase ®, produkcji Pentapharm, Bazylea, Szwajcaria, enzymu o nazwie Arvine ®» produkcji Ferring AB, Malmó, Szwecja lub dotychczas nie sklasyfikowanego enzymu o nazwie Brinase®, produkcji Astra, Sódertalje, Szwecja. Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna stosowac do badania reakcji, w których powyzsze enzymy powstaja, sa inhibitowane lub rozkladane, jak równiez do oznaczenia czynników wplywajacych na przebieg takich reakcji lub bioracych w nich udzial, np. do oznaczenia proenzymów aktywatorów, antyehzymów i inhibitorów enzymów.W klasyfikacji enzymów oparto sie na podreczniku „Enzymie Nomenclature", Elsevier, Amsterdam 1965, zaleconym przez The International Union of Biochemistry.• Zwiazki dotychczas stosowane do ilosciowego oznaczenia wyzej wymienionych enzymów sa opisane w podreczniku „Methoden der enzymatischen Analyse", vol I, str. 1023, Bergmeyer l-LU., Verlag Chemie, 1970.Te syntetyczne zwiazki moga byc podzielone, w zaleznosci od tego, w jakiego rodzaju katalitycznej reakcji enzymów proteolitycznych biora udzial, na dwie grupy: zwiazków estrowych i amidowych. Wiekszosc stosowa¬ nych dotychczas zwiazków syntetycznych nalezy do grupy pierwszej. Sa one rozkladane przez peptydohydrolazy peptydowe znacznie szybciej niz znane dotychczas zwiazki typu amidowego. Jednakze glówna funkcja biologiczna enzymów klasyfikowanych jako peptydohydrolazy peptydowe jest, jak to wynika z ich nazwy, czynnosc hydrolizowania wiazan peptydowych (amidowych), a nie wiazan estrowych, zwiazków pochodzenia naturalnego. Jak wynika z literatury (Blood Clotting Enzymology, str. 36 i 42—44, Seegers W.H., Academic Press, 1967), stosunek szybkosci reakcji estrolitycznej do szybkosci reakcji amidolitycznej trombiny nie ma stalej wartosci w róznych warunkach reakcji. Dlatego pozadane sa syntetyczne zwiazki typu amidowego o znacznie wiekszej wrazliwosci na omawiane enzymy , które szybciej rozkladaja sie na mierzalne produkty niz zwiazki znane dotychczas.Do badania i sledzenia przebiegu enzymatycznej,hydrolizy nadaje sie takie zwiazki typu amidowego, które rozkladaja sie dajac: a) produkty chromoforowe latwe do pomiaru spektrofotometrycznego i posiadajace maksima absorpcji swiatla nie pokrywajace sie z maksimami zwiazków wyjsciowych, b) produkty fluoryzujace, które moga byc mierzone za pomoca spektrofotometrii fluorescencyjnej, c) produkty, które reaguja z odpowiednimi odczynnikami w wyniku czego powstaja zwiazki fotometrycz- nie mierzalne z duza czuloscia.Zastosowanie znalazly pewne zwiazki typu amidowego z hydrolitycznie odszczepialnymi grupami chromo- forowymi. Sa to glównie mono-p-nitroanilidy i mono-^naftyloamidy aminokwasów niepodstawionych i podsta¬ wionych w pozycji Na. Sposród tych zwiazków mozna wymienic odczynnik na trypsyne i reakcje, w których trypsyna bierze udzial — chlorowodorek p-nitroanilidu Na-benzoilo-DL-argininy (BAPNA). Enzymatyczna hydroliza tego zwiazku daje posiadajaca chromofor p-nitroaniline, która mozna ilosciowo oznaczac spektrofoto- metrycznie. Znane dotychczas odczynniki amidowe nie wykazuja pozadanej wybiórczosci i czulosci, co stanowi powazna ich wade, poniewaz pociaga to za soba koniecznosc stosowania bardziej zlozonej procedury i w zwiazku z tym uzycia znacznej ilosci materialu biologicznego. Ponadto czas przebiegu reakcji enzymatycznej jest dlugi, a dokladnosc oznaczenia enzymu moze byc zadawalajacy. Jak dotychczas brak syntetycznego zwiazku typu amidowego dostatecznie wrazliwego na trombine (BAPNA jest stosowany glównie do oznaczania trypsyny i w malym stopniu przydatny do oznaczania trombiny, poniewaz wrazliwosc tego zwiazku na trombine jest mala, a kinetyka reakcji nie jest kinetyka Michae lisa-Mentena).Wad dotychczas znanych zwiazków pozbawione sa otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku. Skladniki aminokwasowe tych zwiazków laczy sie ze soba ogólnie znanymi sposobami. Jako grupy blokujace grup aminowych stosuje sie np. grupe karbobenzoksylowa (Cbo), p-metoksykarbobenzoksylowa (MeCbo), p-nitrokarbobenzoksylowa (N02Cbo), p-metoksyfenyloazokarbobenzo- ksylowa (MCbo), lllrz.butoksykarbonylowa (BOC), trójfluoroacetylowa (TFA) lub formylowa. a-karboksylowe grupy mozna aktywowac przez przeprowadzenie ich w odpowiednie, znane z chemii peptydów pochodne, takie jak np. ester p-nitrofenylowy, ester trójchlorofenylowy, ester pieciochlorofenylowy, ester N-hydroksysukcynimi- dowy, azydek, symetryczny lub niesymetryczny bezwodnik. Pochodne mozna wyodrebniac lub poddawac dalszej reakcji bez wyodrebniania. Aktywacje mozna równiez przeprowadzac karbodwuimidami, takimi jak np.N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimid. 0-terminalna grupe karboksylowa pochodnej aminopeptydu lub amino¬ kwasu mozna chronic przez estryfikacje np. do estru metylowego, etylowego lub izopropylowego lub przez przeprowadzenie w chromoforowa pochodna anilinowa, która wówczas spelnia zadanie grupy blokujacej w procesie syntezy lancucha peptydowego. Grupy funkcyjne nie biorace udzialu w reakcjach syntezy chroni sie90746 3 odpowiednimi grupami blokujacymi. Grupe S-guanidynowa argininy mozna chronic np. grupa N02, p-toluenosul- fonylowa (Tos) lub protonujac ja, grupe e-aminowa lizyny mozna chronic grupa Cbo, BOC lub Tos. Grupe wodorotlenowa tyrozyny mozna chronic np. grupa benzylowa lub 11 Irz.butyIowa.W stopniowej syntezie ukladu peptydowegp po przylaczeniu kolejnego aminokwasu mozna produkt oczyscic przez chromatografie kolumnowa na zelu, np. na usieciowanym zelu dekstranowym Sephadex®G lub LH produkcji Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala Szwecja. Odpowiednimi do tego celu zelami sa równiez kopolimery octanu winylu, np. Merckogel®OR-PVA produkcji A G E.Merck, Darmstadt, NRF. Zel równowazy sie odpowiednim rozpuszczalnikiem którym nastepnie prowadzi sie elucje, np. metanolem, etanolem, acetonem, dwumetyloformamidem, dwumetyloacetamidem, dwumetylosulfotlenkiem lub trójamidem kwasu szesciometylo- fosforowego. « W przykladach przebieg syntezy i oczyszczania kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (F 254 A G E. Merck, Darmstadt, NRF) w nastepujacych ukladach: A: n-butanol — kwas octowy —woda (3:1:1) C: n-propanol — octan etylu —woda (7:1:2) D: n-heptan — n-butanol — kwas octowy (3:2:1) Px: chloroform —metanol (9:1) Rozwiniete chromatogramy obserwuje sie w swietle nadfioletowym (254 nm), a nastepnie wywoluje odczynnikiem chlorowotolu idynowym (C. Pataki: Dunnschichtchromatografie in der Aminosaure und Peptid-Che- mie, Walter de Gruyter und Co., Berlin, 1966 str. 125).Jezeli nie zaznaczono inaczej, uzyte w syntezach aminokwasy maja konfiguracje L. Oznaczono je nastepu¬ jacymi symbolami: Arg = arginina Phe = fenyloalanina Ile = izoleucyna Tyr = tyrozyna Leu = leucyna Val = walina Lys = lizyna C-Ph.Gly = C-fenyloglicyna Ponadto w opisie przyjeto nastepujace skróty: Ac = acetyl AC2O " = bezwodnik octowy AcOH *= kwas octowy BOC = rodnik lllrz.butoksykarbonylowy Bz = rodnik benzoilowy Bzl = rodnik benzylowy Bz20 = bezwodnik kwasu benzoesowego Cbo = grupa karbobenzoksylowa DCCI = dwucykloheksylokarbodwuimid DCHA = dwucykloheksyloamina DCU = dwucykloheksylokarbamid DMF = dwumetyloformamid Etj-N = trójetyloamina HMPTA = N,N,N', N", N"-szesciometylotrójfosforowego kwasu trójamid MCbo = grupa p-metoksyfenyloazokarbobenzoksylowa MeOH = metanol NA = nafty loamina OtBu •= grupa lllrz.butoksylowa OEt = grupa etoksylowa OMe = grupa metoksylowa OpNP = grupa p-nitrofenoksylowa OisoPr = grupa izopropoksylowa pNA = p-nitroanilid TFA = grupa trójfluoroacetylowa Tos =grupa p-toluenosulfonylowa TLC = chromatografia cienkowarstwowa Stosowane w chromatografii kolumnowej zele Sephadex ® G—15 i G—25 sa usieciowanymi zelami dekstranowymi o róznym stopniu usieciowania, Sephadex® LH—20 jest hydroksypropylowanym zelem dekstra¬ nowym. Zele te sa produkowane przez Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Szwecja.4 90 746 Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zastosowano do oznaczenia róznych enzymów. Zasada oznaczenia jest oparta na tym, ze w wyniku enzymatycznej hydrolizy powstaje zwiazek o widmie w nadfiolecie w istotny sposób rózniacym sie od widma substratu. Tak wiec np. N°f-Bz-Phe-Val-Arg-pNA'HCI ma widmo absorpcji z maksimum przy 303 nm, z molowym wspólczynnikiem ekstynkcji przy tej dlugosci fali 12900.Absorpcja substratu przy 405 nm jest nieznaczna. Powstajaca z substratu w wyniku enzymatycznej hydrolizy p-nitroanilina (pNA) wykazuje maksimum absorpcji przy 380 nm, z molowym wspólczynnikiem ekstynkcji 13200, a przy 405 nm jej molowy wspólczynnik ekstynkcji wynosi 9620. Tak wiec ze spektrofotometrycznego pomiaru absorpcji przy 405 nm mozna wyliczyc stopien enzymatycznej hydrolizy, który jest proporcjonalny do ilosci powstalej p-nitroaniliny. Nadmiar substratu nie przeszkadza w pomiarach przy tej dlugosci fali. Warunki pomiaru z uzyciem innych zwiazków otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku sa prawie identyczne i dlatego wszystkie pomiary spektrofotometryczne wykonywano przy 405 nm.Rea-kcje enzymatyczna wyraza schemat przedstawiony na rysunku. Uzyte w tym schemacie symbole maja nastepujace znaczenie: E — enzym, S — substrat (zwiazek do ilosciowego oznaczania enzymu), ES — kompleks enzymu z substratem, Pj i P2 - produkty* kt, k2, k3 i k4 — stale szybkosci reakcji. Stala dysocjacji dla ES = k2/k1=km (stala Michaelisa).Jezeli (S) (E), a l<4< k3, to wazna jest zaleznosc: k„[iei-iesi|-isi i-.(ES) Szybkosc powstawania chromoforu: v = k3 '(ES) k3 ¦ (E) • (S) v =— (2) Km + (S) Gdy E jest calkowicie zwiazane z S to (ES) = (E), a v = vmax = k3 *(E) (3) Równanie Lineweaver-Burka 1 K™ 1 1 -= • + (4) v vmax (S) vrnax Jak wynika z równania (2), stale Km i k3 okreslaja wydajnosc substratu w stosunku do danego enzymu.Wartosci tych stalych oznacza sie jak nastepuje: enzym i substrat miesza sie w roztworze buforowym i w ciagu minut przeprowadza pomiary spektrofotometryczne. Stezenie substratu (S) jest zmienne, natomiast stezenie enzymu (E) jest dla kazdego substratu takie same. Wykresla sie ekstynkcje (OD) w funkcji czasu, a nastepnie wyznacza styczna (zmiane ekstynkcji wciagu minuty, AOD/min, z której to wartosci mozna wyliczyc ilosc powstajacych w ciagu minuty /imoli p-NA/ do otrzymanej w ten sposób krzywej w czasie zero, która odpowiada poczatkowej szybkosci reakcji v. Z wykresu y w funkcji (\) mozna wyliczyc wchodzace w równanie (4) wielkosci Km i vmax- Wartosci Km i k3 = vjnax dla trombjny i innych substratów enzymowych sa podane w tablicy I, a dla trypsyny w tablicy II. Danych dotyczacych Km i k3 nie podano w tych przypadkach, gdy nie mogly one byc oznaczone lub nie mogly byc obliczone z powodu braku liniowej zaleznosci miedzy v a,gv.Przyblizone obliczenia zaleznosci miedzy enzymem a substratem mozna wykonac porównujac ilosci p-nitroaniliny powstajacej w 1 ml wciagu minuty, przy tym samym stezeniu substratów w tablicach III, IV, V i VI przedstawiono te dane odpowiednio dla trombiny, trypsyny, Reptilazy ® (enzymu wyodrebnionego z Bothrops Atrox, o czynnosci zblizonej do czynnosci trombiny) i plazminy.Optymalnymi warunkami amidolizy N<*-Bz-Phe-Val-Arg-plMA*HCI sa: pH 8,2, sila jonowa 0,13-0,15, temperatura 37 - 40°C.Uzyty w tablicach skrót NIH oznacza jednostki przyjete przez Narodowy Instytut Zdrowia (National Institute of Health). Jednostka trypsynowa jest równa hydrolizie jednego mikromola chlorowodorku estru metylowego Na-tosyloargininy (TAME) wciagu 1 minuty, przy 25°C i pH 8,1 w obecnosci 0,01 M jonu wapniowego. Trypsyne otrzymana z Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., USA, plazmine z AB Kabi, Sztokholm, Szwecja; 1 mg odpowiada 3 jednostkom kazeinowym (CU).90 746 Tablica I. Aktywnosc trombinowa, Km i k3 ibstrat ^ BAPNA 1 II VIII XII Stezenie substratu (jU mol/1) 250-666 19,3-89,6 28,2- 94,0 19,3- 89,6 31.8-106,0 Stezenie enzymu (NIH/ml) 50 0,5 0,5 Km X (mol/ 6 1,62 0.8 0,55 3,91 104 k3 x 104 'D (/imol/min, NIH/ml) 11 1340 50 360 110 Tablica II. Aktywnosc trypsynowa, Km i k3 Substrat Stezenie substratu (/i mol/1) Stezenie enzymu (NIH/ml) Kmx 104 k3 x 104 (mol/1) (jU mol/min, NIH/ml) BAPNA I II VIII XII 255-666 19,0- 88.2 28,2-94,0 19,0-88,2 31,8-106.0 75 3 3 3 3 16 0,31 1,01 0.31 0,89 8.3 110 112 98 60 Tablica III. Aktywnosc trombinowa Substrat BAPNA I VI VIII IX X XI XVIII XIX XX XXI XXII XXIV xxv XXVI XXXVII Stezenie substratu jUmol/ml 333,0 64,6 67,4 65,4 66,4 58.2 65,1 66,9 66,2 67,6 65,6 65.7 66,6 66,4 64,7 69.0 Stezenie enzymu jednostek NIH/ml 50,0 0,417 0,417 0,417 0,41 7 0,417 0,417 0,417 0.417 0,417 0,417 0.417 0,417 0,417 0,417 0,417 Utworzona p-nitro anilina /imol/min/rnl 1,04 G$ 0,3 2,7 0,5 1,7 0.2 ,6 0.3 0,2 1.7 2,0 0,4 0,6 1,4 OJ90 746 Substrat BAPNA 1 V VI VIII IX X XI XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV xxv XXVI XXXII Tablica Stezenie substratu /imol/ml 333,0 66,7 66,2 67,4 65,4 66,4 58,2 65,1 66,9 66,2 67,6 65,6 65,7 67,1 66,6 66,4 54,7 69,0 IV. Aktywnosc trypsynowa Stezenie enzymu jednostek/ml 2,08 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 Utworzona p-nitro- anilina /imol/min/ml 6,1 16,3 12,9 11,1 13,7 6,8 13,1 1,6 14,1 ,5 ,6,2 14,0 6,2 ,9 6,2 ,9 23,7 2,9 Tablica V. Aktywnosc reptilazowa Substrat 1 II XIII XV Stezenie substratu /imol/ml 66,7 66,7 66,7 66,7 Stezenie enzymu jednostek/ml 0,5 0,5 0,5 0,5 Utworzona p-nitro- anilina /imol/min/ml 4,4 3,0 2,2 4,6 Tablica VI. Aktywnosc plazminowa Substrat 1 V VI VIII IX X XI XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV xxv XXVI XXVII Stezenie substratu Jlmol/ml 66,7 66,2 67,4 65,4 66,4 58,2 65,1 . 66,9 66,2 67,6 65,6 65,7 67,1 66,6 66,4 64,7 69,0 Stezenie enzymu jednostek CU/ml 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 Utworzona p-nitro- anilina jLtmo!/min/ml .6 6,2 4,1 7,6 3,4 2,7 4,7 ,3 2,1 2.1 3,4 2,2 ,4 2.5 4,3 6,2 ,790 746 7 Wzory chemiczne substratów oznaczonych cyframi rzymskimi sa podane w przykladach.Dane przedstawione w tablicach wykazuja wyzszosc zwiazków o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku nad substratami amidowymi dotychczas stosowanymi do oznaczenia trypsyny (BAPNA). Nowe substraty, dzieki wiekszej czulosci, umozliwiaja oznaczenie z duza dokladnoscia malych ilosci enzymu, co jest bardzo wazne z klinicznego punktu widzenia, poniewaz upraszcza zbieranie materialu do prób.Krzepniecie krwi jest bardzo zlozonym procesem, w którym przemiana fibrynogenu w fibryne jest enzymatycznie regulowana trombina. Równiez inne czynniki krzepliwosci krwi sa w rózne sposoby zwiazane z trombina. Ilosciowe oznaczanie tych czynników jest mozliwe przy zastosowaniu zwiazków o wzorze przedsta¬ wionym na rysunku.Nizej opisane oznaczanie trombiny polega na dodaniu okreslonej ilosci nadmiaru trombiny do plazmy.Dodana trombina wiaze obecna we krwi antytrombine, a jej nadmiar jest oznaczony za pomoca zwiazku otrzymanego sposobem wedlug wynalazku. Z ilosci nadmiaru trombiny mozna obliczyc ilosc obecnej w plazmie antytrombiny.Oznaczanie antytrombiny. Krew pobrana z zyly defibrynogenuje sie i odwirowuje. 0,5 ml plazmy rozcien¬ cza sie 2 ml buforowego roztworu trisimidazolu. Do 0,25 ml rozcienczonego roztworu dodaje sie 0,1 ml wodnego roztworu trombiny (10 jednostek NIH) i calosc inkubuje w ciagu dokladnie 5 minut w temperaturze 37-40°C.Nastepnie dodaje sie 0,25 ml ogrzanego do tej temperatury roztworu substratu o stezeniu 1 mg/ml i mieszanine inkubuje wciagu dokladnie 1 minuty w temperaturze 37—40°C. Reakcje przerywa sie za pomoca 0,25 ml stezonego kwasu octowego i spektrofotometrycznie mierzy ekstynkcje przy 405 nm.Przyklad I. Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Arg-pLIA -HCL (I) SyntezaCbo-Arg/N02/-pNA (la) 1) W 200 ml bezwodnego, swiezo przedestylowanego HMPTA rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej, ,3 g (0,1 mola) suchego Cho-Arg/N02/-OH. W warunkach uniemozliwiajacych dostep wilgoci, mieszajac, dodaje sie do roztworu 10,1 g (0,1 mola) Et3N i 24,6 g (0,15 mola) izocyjanianu p-nitrofenylu. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, a nastepnie wylewa ja do 2 litrów 2% roztworu kwasnego weglanu sodu, mieszajac roztwór. Wytracony osad odsacza sie i przemywa kolejno trzema porcjami po 0,5 litra 2% roztworu kwasnego weglanu sodu, dwiema porcjami po 0,2 litra wody destylowanej, dwiema porcjami po 0,5 litra 0,5 n kwasu solnegD i piecioma porcjami po 0,2 litra wody destylowanej. Surowy produkt suszy sie i ekstrahuje cieplym metanolem. Do roztworu przechodzi produkt wlasciwy i niektóre produkty uboczne. Nierozpuszczony N,N'-dwu-p-nitrofenylokarbamid odsacza sie, a przesacz oczyszcza na kolumnie wypelnionej zelem Sephadex ®LH-20, zrównowazonym MeOH. Otrzymuje sie 29,8 g (wydajnosc 63%) zwiazku la o temperaturze topnienia 185—188°. Produkt jest jednorodny w chromatografii cienkowarstwo¬ wej w ukladach P{ i C. Skrecalnosc wlasciwa [a] D = —1,3° (c = 1,1, AcOH). 2) 35,3 g (0,1 mola) suszonego Cbo-Arg/N02/-OH rozpuszcza sie w 600 ml mieszaniny 1:1 czterowodoro- furanu zDMF. Do roztworu dodaje sie 10,1 g (0,1 mola) Et3N, po czym roztwór ochladza do -10°C, w warunkach zabezpieczajacych przez dostepem wilgoci. Do chlodzenia mieszaniny wkrapla sie wciagu minut 13,7 g (0,1 mola) chloromrówczanu izobutylu rozpuszczonego w 50 ml czterowodorofuranu, a w ciagu nastepnych 10 minut 16,4 g (0,1 mola) p-nitroaniliny. Mieszanine reakcyjna doprowadza sie do temperatury pokojowej i w tej temperaturze pozostawia w ciagu 24 godzin. Pod zmniejszonym cisnieniem oddestylowuje sie rozpuszczalnik, a pozostalosc kolejno 3—5 krotnie przemywa 5% roztworem kwasnego weglanu sodu i woda destylowana, po czym suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Oczyszczanie: dwukrotna rekrystalizacja z MeOH.Lug macierzysty oczyszcza sie na zelu Sephadex ®LH-20 równowazonym MeOH. Otrzymuje sie 23,0 g (wydajnosc 48,5%) la o wlasciwosciach fizycznych jak poprzednio. 3) 35,3 g (0,1 mola) Cbo-Arg/N02/-OH rozpuszcza sie w DMF, roztwór ochladza do -10°C i dodaje do niego 20,6 g (0,1 mola) DCCI i 16,4 g (0,1 mola) p-nitroaniliny. Reakcje prowadzi sie wciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, po czym mieszanine odparowuje do sucha i 3—5-krotnie luguje kolejno woda destylowana, 5% roztworem kwasnego weglanu sodu, woda destylowana, 0,5 n HCI i ponownie woda destylowa¬ na. Pozostalosc suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem.Oczyszczanie: przesaczenie przez zel Sephadex ®LH-20 równowazony MeOH. Otrzymuje sie 14,7 g zwiazku la (wydajnosc 34%) o temperaturze topnienia 186-188°C. Produkt jest jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej w ukladach P! i C. Skrecalnosc wlasciwa [a] D = —1,38° (c = 1,0, AcOH).SyntezaCbo-Val-Arg/N02/-pNA (Ib) W warunkach chroniacych przed dostepem wilgoci, do 20,6 g (43,5 mmoli) zwiazki la dodaje sie 110 ml AcOH i 110 ml 4 n HBr w AcOH. Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 60 minut, a nastepnie powoli wylewa do 750 ml bezwodnego eteru, intensywnie mieszajac. Wytraca sie osad 1,5 HBr-H-Arg/N02/- -pNA. Faze eterowa zdekantowuje sie, a osad czterokrotnie przemywa 250 ml bezwodnego eteru, w celu usuniecia utworzonego bromku benzylu oraz nadmiaru HBr i AcOH. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem nad P205 otrzymuje sie bromowodorek pochodnej aminokwasu z wydajnoscia ilosciowa (20,0 g).8 90 746 ,0 g (43,5 mmoli) 1,5 HBr*H-Arg/N02/-pNA rozpuszcza sie w 150 ml DMF. Roztwór ochladza sie do °C i dodaje sie do niego 6,60 g (65,2 mmol) Et3N w celu uwolnienia H-Arg/N02/-pNA. z bromowodorku.Odsacza sie Et3N*HBr, przesacz ochladza do -10°C i dodaje do niego 20,3 g (54,3 mmol) Cbo-Val-OpNP.Wciagu kilku godzin roztwór dochodzi do temperatury pokojowej. Wówczas ponownie chlodzi sie go i buforuje 2,2 g (21,7 mmol) Et3N. Buforowanie powtarza sie po uplywie dalszych 3 godzin. Reakcje prowadzi sie lacznie w ciagu okolo 24 godzin, po czym mieszanine reakcyjna suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Pozostalosc ekstrahuje sie trzykrotnie porcjami po 100 ml wody destylowanej, a nastepnie suszy pod zmniejszonym cisnieniem. « Oczyszczanie: Dwukrotna rekrystalizacja z MeOH daje 12,4g (wydajnosc 50%) substancji czystej. Lug macierzysty oczyszcza sie na zelu Sephadex®LH—20 równowazonym MeOH. Z wycieku otrzymuje sie dalsze ,8 g czystej substancji.SyntezaCbo-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (Ic) Materialy wyjsciowe: 28,6 g (50 mmol) Ib i 31,5 g (75 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do opisanego dla Ib.Oczyszczanie: Trzykrotna krystalizacja z MeOH daje 14,4 g substancji jednorodnej wTLC wPj. Lug macierzysty oczyszcza sie na zelu Sephadex® w MeOH, otrzymujac 19,6 g substancji jednorodnej w TLC w ?i.W sumie otrzymuje sie 34,0 g zwiazku Ic (wydajnosc 94,4%) o temperaturze topnienia 219,5 — 222, jednorodne¬ go w TLC w Pi, o skrecalnosci wlasciwej [a] 2Q3 = -17,1° (c = 1,0, DMF - AcOH 99:1).Synteza Na-Bz-Phe-Val-Arg/N02/-OMe (Id) Materialy wyjsciowe: 30,7 g (50 mmol) Cbo-Phe-Val-Arg/N02/-OMe i 16,0 g (75 mmol) Bz20.Sposób syntezy: Odszczepienie grupy karbobenzoksylowej przeprowadza sie jak w syntezie Ib. ,0 g (50 mmol) 1,5 HBrH-Phe-Val-Arg/N02/OMe rozpuszcza sie w 350 ml DMF. Roztwór ochladza sie do —10°C i dodaje do niego 7,6 (75 mnol) Et3N. Roztwór miesza sie wciagu godziny w warunkach zabezpieczajacych przed dostepem wilgoci, po czym odsacza wytracony Et3N-JBr. Przesacz ochladza sie do —10°C i dodaje 16,0 g (75 mmol) Bz20. W ciagu okolo 3 godzin roztwór dochodzi do temperatury pokojowej.Wówczas ponownie chlodzi sie go i buforuje za pomoca 2,5 g (25 mmol) Et3N. Buforowanie powtarza sie po uplywie dalszych 3 godzin. Reakcje prowadzi sie lacznie w ciagu okolo 24 godzin, po czym roztwór odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Ekstrakcje i suszenie pozostalosci przeprowadza sie jak przy syntezie Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 26,0 g (wydajnosc 88,9%) Id o tempera¬ turze topnienia 138-141°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach P! i D. Skrecalnosc wlasciwa [a] 2D4 =-39,8° (c = 1, MeOH). - Synteza NO-Bz-Phe-Val-Arg/N02/-OH (le) 11,7 g (20 mmol) Id rozpuszcza sie w 200 ml 50% EtOH, a do roztworu dodaje 200 ml 1 n KOH w 95% EtOH. Roztwór miesza sie w ciagu 75 minut w temperaturze pokojowej, a nastepnie za pomoca gazowego C02 doprowadza do pH 7 i pod zmniejszonym cisnieniem zateza do objetosci okolo 25 ml i rozciencza H20 do calkowitej objetosci 500 ml. Roztwór czterokrotnie ekstrahuje sie za pomoca EtOAc, nastepnie zakwasza faze wodna 1 n HCI do pH 2,8. Uwolniony zwiazek le odsacza sie i wielokrotnie przemywa woda destylowana i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Oczyszczanie: dwukrotna krystalizacja z MeOH. Lug macierzysty oczyszcza sie na zelu Sephadex®LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 10,1 g (wydajnosc 88,5%) bezpostaciowego zwiazku le. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach A i C.SyntezaNa-Bz-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (If) 1) Materialy wyjsciowe: 7,2 g (10 mmol) zwiazku Ic i 3,4 g (15 mmol) Bz20.Sposób syntezy: jak w przypadku Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 5,2 g (wydajnosc 75,5%) If o temperatu¬ rze topnienia 236—237°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach Pj i D. Skrecalnosc wlasciwa [a] ?D4 =-23,0° (c = 1,DMF). 2) Materialy wyjsciowe: 5,7 g (10 mmol) le i 2,46 g (15 mmol) izocyjanianu p-nitrofenylu.Sposób syntezy: jak w przypadku la.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 5,3 g (75,5%) If o temperaturze topnienia 235-237°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach Pj i D. Skrecalnosc wlasciwa [a] =-22,5° (c = 1,DMF).SyntezaNO-Bz-Phe-Val-Arg-pNa-HCI (Ig) 345 mg (0,5 mmol) If wprowadza sie do naczynia reakcyjnego aparatu Sakakibary. W naczyniu skrapla sie ml suchego fluorowodoru. Galosc miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C, co wystarcza do odszczepienia grupy nitrowej chroniacej grupe guanidynowa. Pod zmniejszonym cisnieniem oddestylowuje sie90 746 9 fluorowodór, a sucha pozostalosc rozpuszcza w DMF. Dla przeprowadzenia pochodnej fluorowodorowej pepty- du w chlorowodorek, do roztworu dodaje sie 0,25 ml stezonego HCI i pod zmniejszonym cisnieniem odparowuje roztwór do sucha. PowVzszy zabieg ponawia sie, a pozostalosc rozpuszcza w 33% AcOH.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji, otrzymuje sie 275 mg (wydajnosc 80,7%) I w postaci proszku o zawartosci Cl 5,12%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. Skrecalnosc wlasciwa [afD3 = -43,5 ° (c = 0,69, 50% AcOH).Przyklad II. Synteza N<*-3-fenylopropionylo-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (II) Synteza N<*-3-fenylopropionylo-Phe-Val-Arg/IM02/-OMe (I la) Materialy wyjsciowe: 30,7 g (50 mmol) Cbo-Phe-Val-Arg/N02/-OMe i 16,3 g (60 mmol) 3-fenylopropio- nylo-OpNP. • Sposób syntezy: analogicznie do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 25,2 g (wydajnosc 82,5%) Ma. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach Px i C.Synteza Na-3-fenylopropionylo-Phe-Val-Arg/N02/-OH (Mb) Material wyjsciowy: 7,1 g (11,5 mmol) I la.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy le.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 6,5 g (wydajnosc 93,7%) Mb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach A i C. Skrecalnosc wlasciwa [a] p - —9,3 ° (c = 1,0, MeOH).Synteza N^3-fenylopropionylo-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (Mc) Materialy wyjsciowe: 3 g (5 mmol) Mb i 1,23 g (7,5 mmol) izocyjanianu p-nitrofenylu. - Sposób syntezy: analogiczny do syntezy 1) zwiazku la.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 2,65 g (wydajnosc 66,3%) Mc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt.Synteza N«-3-fenylopropionylo-Phe-Val-Arg-pNa*HCI (II).Material wyjsciowy: 179 mg (0,25 mmol) Mc. « Sposób syntezy: analogiczny do syntezy lc.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G—15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 45 mg (wydajnosc 26,5%) bezpostaciowego II o zawartosci Cl 4,91%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach A. Skrecalnosc wlasciwa [ Przyklad III. Synteza H-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (III) Material wyjsciowy: 198 mg (0,28 mmol) lc.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G—25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 170 mg (wydajnosc 61,0%) bezpostaciowego III o zawartosci Cl 11,37%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. Skrecalnosc wlasciwa [afD3 = -26,3° (c = 0,61, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 0,95, Arg 1,0.Przyklad IV. Synteza H-Phe-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (IV) SyntezaCbo-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (IVa) Materialy wyjsciowe: 335 mg (0,46 mmol) lc i 317 mg (0,75 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®LH-20 w DMF. Otrzymuje sie 282 mg (wydajnosc 70,0%) IVa o temperaturze topnienia 201-204°C. Produkt jest jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej w ukladzie P!. Skrecalnosc wlasciwa [a]2D5 = -1,02° (c = 0,98, DMF) Synteza H-Phe-Phe-Val-Arg-pNa-HCI (IV) Material wyjsciowy: 92,9 mg (0,107 mmol) IVa.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G-25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 59,5 mg (wydajnosc 73,1%) IV o zawartosci Cl 9,18%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. Skrecalnosc wlasciwa [a] 2D3 = -19,7° (c = 0,76, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 2,2, Arg 0,98.Przyklad V. Synteza p-Me-Bz-Phe-Val-Arg-pHa-HCI (V) Synteza p-Me-Bz-Phe-Val-Arg/N02ApNA (Va) Materialy wyjsciowe: 155 mg (0,216 mmol) lc i 83,2 mg (0,324 mmol) p-Me-Bz-OpNP o temperaturze topnienia 169-172°C.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 69,5 mg (wydajnosc 45%) bezpostacio¬ wego Va. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P^ Skrecalnosc wlasciwa [a]D =-26,1° (c = 0,69, DMF).10 90 746 Synteza p-Me-Bz-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (V) Material wyjsciowy: 68,98 mg (0,0965 mmol) Va.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 44,5 mg (wydajnosc 66%) V o zawartosci Cl ,5,01%. Produkt jest jednorodnym wTLC w ukladzie A. Skrecalnosc wlasciwa [a] 2D3 = -40,8° (c = 0,70, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy Val 1,0, Phe 1,0, Arg 1,0.Przyklad VI. Synteza Na-Ac-Phe-Val-Arg-p-NA-HCI (VI) ' (VI) SyntezaNa-Ac-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (Via) Materialy wyjsciowe: 233 mg (0,33 mmol) Ic i 41 mg (0,40 mmol) Ac^O. < Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie na zelu Sephadex®LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 119 mg (66%) bezpostaciowego Via.Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. Skrecalnosc wlasciwa [a] D = -3,6° (c = 1,16, DMF).Synteza NO-Ac-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (VI) Material wyjsciowy; 116 mg (0,185 mmol) Via.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®G—15 w 20% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 90 mg (79%) bezpostaciowego VI o zawartosci Cl 5,59%. Produkt jest jednorodnym w TLC w ukladzie A. Skrecalnosc wlasciwa [a]2D3 = -21° (c = 0,62, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,2, Arg 1,1. ¦ Przyklad VII. Synteza Na-n-oktanoilo-Phe-Val-Arg-pNA* HCI (VII) (VII) Synteza N^-n-oktanoilo-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (VIla) Material wyjsciowy: 207 mg (0,288 mmol) Ic i 109 mg (0,41 mmol) estru nitrofenylowego kwasu kaprylowego. « Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib. « Oczyszczanie: na zelu Sephadex®_R—20 w MwOH. Otrzymuje sie 172 mg (wydajnosc 84%) bezpostacio- 2 3 wego Vlla. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P^ Skrecalnosc wlasciwa [a]D = _5 50 (c = 0 5 DMF). ¦ Synteza NO-n-oktanoilo-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (VII) Material wyjsciowy: 129,4 mg (0,182 mmol; VI la.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig. - Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH i na zelu Sephadex®G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 109 mg (wydajnosc 85%) bezpostaciowego VII o zawartosci Cl 4,96%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [afD3 = -29,5° (c = 0,7, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,0, Arg 0,95.Przyklad VIII. Synteza N^Cykloheksylokarbonylo-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (VIII) (VIII) Synteza N«-cykloheksylokarbonylo-Phe-Val-Aig/N02/-pNA (VIIla) Material wyjsciowy: 233 mg (0,33 mmol) Ic i 100 mg (0,40 mmol) estru p-nitrofenylowego kwasu cykloheksylokarboksylowego. < Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 117 mg (wydajnosc okolo 50%) bezpostaciowego VII la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P,. [<*]2q = -10,9° (c = 0,23, DMF).Synteza N^-cykloheksylokarbonylo-Phe-Val-Arg-pNA*HCI Material wyjsciowy: 48,02 mg (0,069 mmol) Vllla.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G-15 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 33,7 mg (wydajnosc 71%) bezpostaciowego VIII o zawartosci Cl 5,11%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D3 = -32,8° (c = 0,68, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,3, Arg 1,0. • Przyklad IX. Synteza N<*-Tos-Phe-Val-Arg-pN A- HCL (IX) (IX) Synteza N^Tos-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (IX) Materialy wyjsciowe: 360 mg (0,5 mmol) Ic i 180 mg (0,95 mmol) chlorku kwasu p-toluenosulfonowego.Sposób syntezy: 360 mg Ic rozpuszcza sie w 1 ml AcOH i 1 ml 5,6 n HBr(AcOH) w atmosferze pozbawio¬ nej wilgoci i miesza roztwór wciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie mieszanine reakcyjna wkrapla sie do intensywnie mieszanego, przedestylowanego eteru. Wytraca sie 350 mg 1,5 HBr*H-Phe-Val- -Arg/N02/-pNA. Faze eterowa zdokantowuje sie, a osad trzykrotnie przemywa eterem. Po wysuszeniu nad.P202 bromowodorek pochodnej aminokwasu otrzymuje sie z wydajnoscia ilosciowa. Produkt rozpuszcza sie w 4 ml DMF, roztwór ochladza do -10°C i dla uwolnienia H-Phe-Val-Arg/N02/-pNA dodaje do niego 75 mg (0,75 mmol) Et3N. Reakcje prowadzi sie wciagu godziny, w atmosferze pozbawionej wilgoci. Odsacza sie wytracony Et3N-HBr, przesacz ochladza do -10°C i dodaje do niego 190 mg chlorku kwasu p-toluenosulfono- wego. Roztwór powoli doprowadza sie do temperatury pokojowej, po uplywie okolo 3 godzin ponownie90 746 11 ochladza do -10 C i buforuje dodatkiem 25 mg (0,25 mmol) Et3N. Po uplywie dalszych 2—3 godzin buforowanie powtarza sie. Reakcje prowadzi sie w sumie okolo 24 godzin, po czym roztwór odparowuje sie do sucha, pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 40°C. Pozostalosc trzykrotnie ekstrahuje sie woda destylowana i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w MeOH i oczyszcza. < Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 135 mg (wydajnosc 36,5%) bezpostacio¬ wego IXa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt .[a] 2£ = ±0° (c = 1,0, DMF).Synteza N<*-Tos-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (IX) Material wyjsciowy: 81,43 mg (0,11 mmol) IXa.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®G-15 w 20% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 63 mg (wydajnosc 78,4%) bezpostaciowego IX o zawartosci Cl 4,79%. Produkt jest jednorodnym w TLC w ukladzie A. [a] ^ = ±0° (c - 073, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,2, Arg 1,0. « Przyklad X. Synteza l\|a-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA- HCI (X) (X) SyntezaCbo-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA (Xa) Material wyjsciowy: 233 mg (0,33 mmol) Ic i 170 mg (0,44 mmol) Cbo-p-ammo-Bz-OpNP o temperaturze topnienia 169-172°C.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib. • Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 55 mg (wydajnosc 20%) bezpostaciowe¬ go Xa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt .[a] 2D3 = -30,2° (c = 0,53, DMF).Synteza Na-p-amino-Bz-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (X) Material wyjsciowy: 46,81 mg (0,056 mmol) Xa.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig. « Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G—15 w 20% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 15 mg (wydajnosc 37%) bezpostaciowego X o zawartosci Cl 9,43%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a]2p =—46,7° (c = 0,74, 59% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,0, Arg 0,95. ¦ Przyklad XI. Synteza N^6-aminoheksanoilo-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (XI) (XI) Synteza Cbo-6-aminoheksanoilo-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (Xla) Materialy wyjsciowe: 360 mg (0,5 mmol) Ic i 290 mg (0,75 mmol) estru p-nitrofenylowego kwasu Cbo-6-aminokapronowego Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib. < Oczyszczanie: na zelu Sephadex(s)LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 398 mg (wydajnosc 95,5%) bezpostacio¬ wego Xla. Produkt jest jednorodny w TLC. [a] 2D5 = -5,7° (c = 1,1, DMF). Synteza N<*-6-aminoheksanoilo-Phe- -Val-Arg-pNA-HCI,(XI) Material wyjsciowy: 300 mg (0,361 mmol) Xla Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oznaczenie: na zelu Sephadex®G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 127 mg (wydajnosc 48%) bezpostaciowego XI o zawartosci Cl 9,68%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2q = —32,0° (c = 0,72, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 1,0.Przyklad XII. Synteza H-Phe-Leu-Arg-pNA- HCI (XII) (XII) Synteza Cbo-Leu-Arg/N02AplSTA (XI la) Materialy wyjsciowe: 5 g (10,6 mmol) la i 4,92 g (12,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 6,1 g (wydajnosc 98%) bezpostaciowego XI la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt. [a] 2D5 =-33,5° (c = 1,0 MeOH).Synteza Cbo~Phe-Leu-Arg/N02/-pNA (XMb) Materialy wyjsciowe: 3,6 g (6,5 mmol) XI la i 3,27 g (7,8 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 2,95 g (69,0%) bezpostaciowego lllb.Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a] 2D5 = -6,2° (c = 1,0, DMF).Synteza R-Phe-Leu-Arg-pNA-2HCI (XII) Material wyjsciowy: 124,9 mg (0,17 mmol) XI Ib.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G-25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 65 mg (wydajnosc 61%) bezpostaciowego XII o zawartosci Cl 11,15%. Produkt jest jednorodnym w TLC w ukladzie A. [a] 2D = -24,4° (c = 0,63, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 1,0, Phe 1,1, Arg 1,0.Przyklad XIII. Synteza N^-Bz-Phe-Leu-Arg-pNA-HCI (XIII) (XIII)12 90 746 Synteza N<*-Bz-Phe-Leu-Arg/N02/-pNA (XIIla) Materialy wyjsciowe: 734 mg (1 mmol) XII Ib i 272 mg (1,2 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 589 mg (wydajnosc 84%) Xllla o temperaturze topnienia 196-197°C. Produkt jest jednorodny wTLC w ukladzie Pi i D. [a] 2q =-19,1° (c= 1,01, DMF).Synteza Na-Bz-Phe-Leu-Arg-pNA-HCI (XIII) Material wyjsciowy: 198,5 mg (0,282 mmol) XII la.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ®G—25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 188 mg (wydajnosc 96%) bezpostaciowego XIII o zawartosci Cl 4,96%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2^ = -38,3° (c = 0,69, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 1,0, Phe 1,0, Arg 1,0.Przyklad XIV. Synteza H-Phe-lle-Arg-pNA*2HCJ (XIV) (XIV) SyntezaCbo-lle-Arg/N02/-pNA (XIVa) Material wyjsciowy: 1 g (2,1 mmol) la i 0198 g (2,46 mmol) Cbo-lle-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,12 g (91%) XIVa o temperaturze topnienia 195-202°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a] 2S = +2,8° (c = 1,0 DMF).SyntezaCbo-Phe-lle-Arg/N02/pNA (XIVb) Materialy wyjsciowe: 0,8 g (1,36 mmol) XI Va i 0,69 g (1,63 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 445 mg (wydajnosc 41% XIVb o temperaturze topnienia 219—222°. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P^ [a]2p =—7,1° (c = 1, DMF).Synteza H-Phe-lle-Arg-pNA • HCl (XIV) Material wyjsciowy 166,43 mg (0,226 mmol) XIVb. §posób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: Na zelu Sephadex® G-25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 95,3 mg (67%) bezpostaciowego XIV o zawartosci Cl 11,17%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Px. [a] 2q = —32,0° (c = 0,63, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Ile 1,0, Phe 1,1 Arg 1,0.Przyklad XV. Synteza N<*-Bz-Phe-lle-Arg-pNA-HCI,(XV) # (XV) SyntezaNa-Bz-Phe-lle-Arg/N02/-pNA (XVa) Material wyjsciowy: 250 mg (0,34 mmol) XIVb i 92 mg (0,4 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 210 mg (wydajnosc 88%) XVa o temperaturze topnienia 244-245°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Px. [a] 2D5 = —22,3° (c = 1, DMF).Synteza NOf-Bz-Phe-lle-Arg-pNA-HCI , (XV) Material wyjsciowy: 182,7 mg (0,26 mmol) XVa Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 176,9 mg (wydajnosc 97%) bezpostaciowego XV o zawartosci Cl 4,98%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D = -41,5° (c = 0,69, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Ile 1,0, Phe 1,1, Arg 1,1.Przyklad XVI. Synteza H-Phe-Phe-Arg-pNA- 2HCI (XVI) (XVI) SyntezaCbo-Phe-Arg/N02/-pNA (XVIa) Material wyjsciowy: 1 g (2,1 mmol) la i 1,06 g (2,46 mmol) Cbo-Phe-OpNP. * Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,25 g (wydajnosc 96,9%) XVIa o temperaturze topnienia 198-204°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P1# [a] 2D5 = +4,2° (c = 1,0, DMF)s Synteza Cbo-Phe-Phe-Arg/N02/-pNA Material wyjsciowy: 0,9 g (1,45 mmol) XVIa i 0,737 g (1,74 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 635 mg (wydajnosc 58%) XVIb o temperaturze topnienia 201-203°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pr. [a] 2D5 = -23,0° (c = 1,0, DMF).90 746 13 Synteza H-Phe-Phe-Arg-pNA-2HCI (XVI) Material wyjsciowy: 196,9 mg (0,257 mmol) , XVIb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® G-25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 75,8 mg (46%) bezpostaciowego XVI o zawartosci Cl 10,65%. Produkt jest jednorodny wTLC w ukladzie A. [a] 2D3 =-6,7° (c = 0,65, 50% AcOH) sklad aminokwasowy: Phe 2,0 Arg 1,1.Przy klad XVII. Synteza N<*-Bz-Phe-Phe-Arg-pNA-HCI (XVII) (XVII) SyntezaNO-Bz-Phe-Phe-Arg/N02/-pNA (XVIla) Materialy wyjsciowe: 250 mg (0,325 mmol) XVIb i 90 mg (0,312 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 wMeOH. Otrzymuje sie 220 mg (wydajnosc 92%) bezpostaciowego XVI la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P!. [a] 2D5 = -36,6° (c = 0,95, DMF).Synteza N<*-Bz-Phe-Phe-Arg-pNA-HCI XVI I Material wyjsciowy: 114,6 mg (0,156 mmol) XVI la Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® G-25 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 77,4 mg (68%) bezpostaciowego XVII o zawartosci Cl 4,81%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2q = -25,5° (c = 0,72, 50% AcOH). Sklad aminokwasów: Phe 2,0, Arg 0,97.Przy klad XVIII. Synteza H-D-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (XVIII) (XVIII) SyntezaCbo-D-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (XVIlla) Materialy wyjsciowe: 480 mg (0,83 mmol) Ib i 530 mg (1,25 mmol) Cbo-D-Phe-OpNP o temperaturze topnienia 126,2-126,6°, [a] 2D4 = +24,75° (c = 1,0, DMF).Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 587 mg (wydajnosc 98%) bezpostaciowego XVIIIa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt. [a] 2D3 = +18,9° (c = 2,0, DMF).Synteza H-D-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (XVIII) Material wyjsciowy: 153,8 mg (0,212 mmol) XVI I la Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® G-15 w 20% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 36,3 mg (28%) bezpostaciowego XVIII o zawartosci Cl 11,34%. Produkt jest jednorodnym w TLC w ukladzie A. [cc] 2D3 = -70,3°- (c = 0,16, 50% AcOH) Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 1,0.Przyklad XIX. Synteza NO-Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA- HCI (XIX) (XIX) Synteza N<*-Bz-D-Phe-Val-Arg/N02/-pNA (XIXa) Materialy wyjsciowe: 244 mg (0,34 mmol) XVI I la i 92 mg (0,41 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH—20 MeOH. Otrzymuje sie 181 (wydajnosc 77%) XIX o temperaturze topnienia 211-215°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D3 =-1,36° (c = 0,8, DMF).Synteza N<*-Bz-D-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (XIX) • Material wyjsciowy: 128,3 mg (0,186 mmol) (XIXa) Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—25 w 5% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 103,8 mg (wydajnosc 81%) bezpostaciowego XIX o zawartosci Cl 5,15%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D3 = -36,9° (c = 0,68, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 0,9, Arg 0,9.Przy klad XX. Synteza H-Tyr-Val-Arg-pNA-HCI(XX) (XX) Synteza Cbo-Tyr-/OBz/-Val-Arg/N02/-pNA (XXa) Materialy wyjsciowe: 480 mg (0,83 mmol) i 660 mg (1,25 mmol) Cbo-Tyr/OBz/-OpNP o temperaturze topnienia 147,5-149° i [a] 2D5 = -8,5° (c = 2,0, DMF).Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 460 mg (wydajnosc 65%) bezpostaciowego XXa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P!. [a] 2D3 = —9,66° (c = 1,0, DMF).Synteza H-Tyr-Val-Arg-pNA-HCI (XX) Material wyjsciowy: 144,7 mg (0,169 mmol) XXa.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—15 w 20% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 65,4 mg (wydajnosc 62%) bezpostaciowego XX o zawartosci Cl 11,20%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D3 = -29,8° (c = 0,63, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Tyr 1,2, Arg 1,0.14 90 746 Przyklad XXI. Synteza N<*-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA-HCI(XXI) *' jXX\) Synteza N^Bz-Tyr-Val-Arg/N02/-pNA **(XXIa) "1$- Material wyjsciowy: 246 mg /0,287 mmol/ XXa i 65 mg (0,29 mmol) Bz20. ? Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Ochraniajaca grupe OH tytrozyny grupa Bz ulega czesciowemu odszczepieniu pod wplywem Hbr. Jako produkt reakcji otrzymuje sie mieszanine XXIa i N<*-Bz-Tyr/OBz/-Val-Arg/N02/-pNA.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 195 mg (wydajnosc 81%) bezpostaciowego produktu. TLC w ukladzie P, wykazuje obecnosc dwóch substancji.Synteza N<*-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA-HCI,(XXI) Material wyjsciowy: 138,9 mg XXIa i N«-Bz-Tyr/OBz/-Val-Arg/N02ApNA.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® G—15 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 75,4 mg bezpostaciowego XXI o zawartosci Cl 5,3%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2q =—34,7° (c = 0,7, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Tyr 1,2, Arg 1,0.Przyklad XXII. Synteza NO-4-aminoetylocykloheksylokarbonylo-Phe-Val-Arg-pNA*2HCI, (XXII) Synteza Cbo-4-aminoetylocykloheksylokarbonylo-Phe-Val-Arg-pNA (XXII) Material wyjsciowy: 268 mg (0,65 mmol) Cbo-4-aminpetylocykloheksylokarbonylo-OpNP i 360 mg (0,5 mmol) Ic.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 265 mg (62%) bezpostaciowego XXIIa.Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Px. [a] 2D3 =-8,3° (c = 0,51, DMF).Synteza N»-4-aminoetylocykloheksylokarbonylo-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (XXII) Material wyjsciowy: 137 mg (0,16 mmol) XXia.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 82,2 mg (wydajnosc 68,5%) bezpostaciowego XXII o zawartosci Cl 9,37%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [ot] 2D5 = -35,2° (c = 0,73, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 1,0.Przyklad XXIII. Synteza N^-2-cykloneksyloacetylo-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (XXIII) (XXIII) Synteza Na-2-cykloheksyloacetylo-Phe-Val-Arg/N02/-pNa (XXII la) Materialy wyjsciowe: 197 mg (0,75 mmol) cykloheksyloacetylo-OpNP i 331 mg (0,46 mmol) Ic.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 205 mg (wydajnosc 63%) bezpostaciowego XXI I la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [aj 2D3 = —5,0° (c = 0,5, DMF).Synteza Na-2-cykloheksyloacetylo-PheA/al-Arg-pNa-HCI (XXIII) Material wyjsciowy: 173 mg (0,244 mmol) XXI I la.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 139 mg (wydajnosc 81%) bezpostaciowego XXIII o zawartosci Cl 5,01%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D3 ' = -32,0° (c = 0,35, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 1,0.Przyklad XXIV. Synteza 4-aminobutyrylo-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (XXIV) (XXIV) Synteza Cbo4-aminobutyrylo-Phe-Val-Arg/N02ApNA (XXIVa) Materialy wyjsciowe: 234 mg (0,65 mmol) Cbo-4-aminobutylo-OpNP i 360 mg (0,5 mmol) Ic.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 297 mg (wydajnosc 74%) bezpostaciowego XXIVa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a] 2D3 = -5,0° (c = 0,6, DMF).Synteza 4-aminobutyrylo-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI Material wyjsciowy: 291 mg (0,362 mmol) XXIVa.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 167 mg (wydajnosc 66%) bezpostaciowego XXIV o zawartosci Cl 10,05%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D3 = -35,3° (c = 0,72, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,0, Arg 1,1.Przyklad XXV. Synteza 2-/4-aminofenylo/acetylo/-Phe-Val-Arg-pNA-2HCI (XXV) (XXV) Synteza 2-/4-Cbo-aminofenylo/acetylo-Phe-Val-Arg/N02ApNA (XXVa) Materialy wyjsciowe: 200 mg (0,273 mmol) Ic i 152 mg (0,371 mmol) 274-aminofenylo/acetylo-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 201 mg (wydajnosc 85%) bezpostaciowego XXVa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P!. [a] D = —4,3° (c = 0,5, DMF).90 746 15 Synteza 2-/4-aminofenylo/acetylo-Phe-Val-Arg-pNA*2HCI (XXV) Material wyjsciowy: 97,5 mg (0,114 mmol) XXVa.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—15 w 33% AcOH. Po liofilizacji, otrzymuje sie 43,5 mg (wydajnosc 51%) bezpostaciowego XXV o zawartosci Cl 9,47%. Produkt jest jednorodny wTLC w ukladzie A. [a] 2D3 = -33,0° (c = 0,75, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 1,1.Przyklad XXVI. Synteza N^Bz-C-Ph-Gly-Val-Arg-pNA-HCI (XXVI) (XXVI) SyntezaCbo-C-Ph-Gly-Val-Arg/N02/-pNA (XXVIa) Materialy wyjsciowe: 230 mg (0,568 mmol) Cbo-C-Ph-Gly-OpNP i 250 mg (0,437 mmol) Ib.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ic.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 292 mg (wydajnosc 95%) bezpostaciowego XXVIa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a] 2q = +8,2° (c = 0,50, DMF) Synteza Na-Bz-Ph-Gly-Val-Arg/N02/-pNA (XXVIb) Materialy wyjsciowe: 290 mg (0,41 mmol) XXVI i 130 mg (0,595 mmol) Bz2".Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 211 mg (wydajnosc 76%) bezpostaciowego XXVIb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a] 2q = +10,4° (c = 0,51, DMF).Synteza N^Bz-C-Ph-Gly-Val-Arg-pNA-HCI , (XXVI) Material wyjsciowy: 200 mg (0,296 mmol) XXVIb Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®G—15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otzrymuje sie 186 mg (wydajnosc 95%) bezpostaciowego XXVI o zawartosci GJ 5,85%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a]2D5 = -27,0° (c= =0,67, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, C-Ph-Gly 1,2, Arg 0,9.Przyklad XXVII. Synteza N^Bz-Phe-Phe-Val-Arg-pNA-HCI (XXVII) (XXVII) Synteza Na-Bz-Phe-Phe-Val-Arg/N02/-pl\IA ' -, (XXVIla) Material wyjsciowy: 141 mg (0,163 mmol) IVa i 90 mg (0,4 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 114 mg (wydajnosc 84%) bezpostacio¬ wego XXVI la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [ot] 2p =-0,75° (c = 1,2, DMF)..Synteza Na-Bz-Phe-Phe-Val-Arg-pNA-NCI (XXVII) Material wyjsciowy: 71 mg(okolo 0,087 mmol) XXVI la.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex®S-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 47 mg (wydajnosc 60%) bezpostaciowego XXVII o zawartosci Cl 4,23%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. Sklad aminokwa¬ sowy: Val 1,0, Phe 2,3, Arg 1,0.Przyklad XXVIII. Synteza Na-Bz-DI-C-Ph-Gly-Val-Arg-pNA-HCI (XXVIII) (XXVIII) Synteza Cbo-DI-C-Ph-Gly-Val-Arg/N02/-pNA (XXVNIa) Material wyjsciowy: 285 mg (0,5 mmol) Ib i 285 mg (0,7 mmol) Cbo-DI-Ph-Gly-OpNP o temperaturze topnienia 107-108°C.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ic.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 353 mg (wydajnosc 81%) bezpostacio¬ wego XXVI I la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi.Synteza N^-Bz-DI-C-Ph-Gly-Val-Arg/N02/-pNA (XXVIMb) Material wyjsciowy: 285 mg (0,403 mmol) XXVIIIa i 181 mg (0,8 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 MeOH. Otrzymuje sie 226 mg (wydajnosc 83%) bezpostaciowego XXVI I Ib. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj.Synteza N<*-Bz-DI-C-Ph-Gly-Val-Arg-pNA-HCI (XXVIII) Material wyjsciowy: 101 mg (0,15 mmol) XXVIIIb).Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 61 mg (wydajnosc 61%) bezpostaciowego XXVIII o zawartosci Cl 5,21%. Produkt jest jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej w ukladzie A. Sklad aminokwasowy: Val 1,0, C-Ph-Gly 1,2, Arg 0,9.Przy klad XXIX. Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Arg-2-NA- HCI (XXIX) (XXIX) SyntezaCbo-Arg/N02/-2-NA (XXIXa) Materialy wyjsciowe 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg/N02/-OH i 1,73 g (12 mmol) 2-naftyloaminy.16 90 746 Sposób syntezy: analogiczny do syntezy la 2).Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 4,05 g (wydajnosc 84%) bezpostaciowe¬ go XXIXa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a] 2Q3 = +7,4° (c = 1,0, DMF).SyntezaCbo-Val-Arg/N02/-2NA (XXIXb) Materialy wyjsciowe: 1,5 g (3,1 mmol) XXIX i 1,38 g (3,7 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,66 g (wydajnosc 95%) czesdowo krystalicznego XXIXb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a]" = -6,0° (c = 1,01, DMF).Synteza Cbo-Phe-Val-Arg/N02/-2-NA (XXIXc) Materialy wyjsciowe: 1,65 g (2,84 mmol) XXIXb i 1,43 g (3,4 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ic.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,55 g (wydajnosc 75%) bezpostaciowe¬ go XXIXc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P!. [a] 2D2 = -10,9° (c =1,01, DMF).Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Arg/N02/-2-NA (XXIXd) Material wyjsciowy: 1,15 g (1,58 mmol) XXIXc i 465 mg (2,05 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 0,89 g (wydajnosc 80,3%) czesciowo krystalicznego XXIXd. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [ot] p° = -31,1° (c = 1,01, DMF).Synteza N^-Bz-Phe-Val-Arg-2-NA-HCI (XXIX) Material wyjsciowy: 620 mg (0,89 mmol) XXIXd.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—15 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 385 mg (wydajnosc 63%) bezpostaciowego XXIX o zawartosci Cl 5,12%. Produkt jest jednorodny w chromatografii cienkowarstwo¬ wej w ukladzie A. [a] 2D2 = -53,8° (c = 0,71, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 1,0.Przyklad XXX. Synteza Na-Bz-Phe-Val-Arg-1-nitro-2-NA- HCI (XXX) (XXX) Synteza Cbo-Arg/N02IA-nitro-2-Na (XXXa) Material wyjsciowy: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg/N02/-OH i 2,26 g (12 mmol) 1-nitro-2-naftyloaminy.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy la 2) Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 3,85 g (wydajnosc 73,1%) bezpostacio¬ wego XXXa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a]\f* = -11,8° (c = 1,0, DMF).SyntezaCbo-Val-Arg/N02/-1-nitro-2-NA (XXXb) Material wyjsciowy: 950 mg (1,8 mmol) XXXa i 825 mg (22 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 0,9 g (wydajnosc 80%) czesciowo krystalicznego XXXb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a] 2^ = +1,05° (c = 1,0, DMF).Synteza Cbo-Phe-Val-Arg/N02/-1-nitro-2-NA (XXXc) Materialy wyjsciowe: 800 mg (1,27 mmol) XXXb i 640 mg (1,52 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ic.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH—20 w ItoeOH. Otrzymuje sie 785 mg (wydajnosc 79,9%) bezpostacio¬ wego XXXc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a] ** = -7,0° (c = 1,02, DMF).Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Arg/N02IA-nitro-2-NA Materialy wyjsciowe: 680 mg (0,88 mmol) XXXb i 260 mg (1,15 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 480 mg (wydajnosc 73%) bezpostacio¬ wego XXXd. Produkt jest jednorodny TLC w ukladzie Pi. [a] 2p = -31,4° (c = 0,9, DMF).Synteza N«-Bz-Phe-Val-Arg-1-nitro-2-NA-HCI ,(XXX) Material wyjsciowy: 480 mg (0,65 mmol) XXXd.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 268 mg (wydajnosci 57%) bezpostaciowego XXX o zawartosci Cl 4,80%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D2 = -39,7° (c= 0,73,50% AcOH) Przy kad XXXI. Synteza N«-Bz-Phe-Val-Arg-4-nitro-1-NA-HCI (XXXI) (XXXI) Synteza Cbo-Arg/N02/-4-nitro-1-NA (XXXIa) Materialy wyjsciowe: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg/N02/-OH i 2,26 g (12 mmol) 4-nitro-1-naftyloaminy.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy la 2).Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w.MeOH. Otrzymuje sie 3,61 g (wydajnosc 69%) czesciowo krystalicznego XXXa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a] 2Q2 = -11,4° (c = 1,01, DMF).90 746 17 Synteza Cbo-Val-Arg/N02/-4-nitro-1-NA • (XXXIb) Materialy wyjsciowe: 650 mg (1,23 mmol) XXXIa i 550 mg (1,45 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 460 mg (wydajnosc 60%) bezpostacio¬ wego XXXIb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a] 2Q3 = +0,9° (c = 0,55, DMF).SyntezaCbo-Phe-Val-Arg/N02/-4-nitro-1-NA (XXXIc) Materialy wyjsciowe: 450 mg (0,72 mmol) XXXIb i 365 mg (0,86 mmol) Cbo-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ic.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 500 mg (wydajnosc 90%) czesciowo krystalicznego XXXIc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi. [a] p4 = (c = 1,0, DMF) Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Arg/N02/-4-nitro-1-NA (XXXId) Materialy wyjsciowe: 490 mg (0,633 mmol) XXXIc i 180 mg (0,80 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 400 mg (wydajnosc 84,7%) bezpostacio¬ wego XXXId. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj. [a] p° = -31,0° (c = 1,0, DMF).Synteza N^Bz-Phe-Val-Arg-4-nitro-1-NA-HCI (XXXI) Material wyjsciowy: 380 mg (0,51 mmol) XXXId.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G—15 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 303 mg (wydajnosc 81%) bezpostaciowego XXXI o zawartosci Cl 4,79%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. [a] 2D2 = -37,7° (c = 0,74, 50% AcOH). Sklad eminokwasowy: Val 1,0, Phe 1,1, Arg 0,9.Przyklad XXXII. Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Lys-pNA-HCI (XXXII) Synteza N<*-BOC-Lys/e-Cbo/-pNA (XXXI la) 6,3 g (11,2 mmol) N<*-BOC-lys/e-Cbo/-OH-DCHA rozpuszcza sie w 40 ml bezwodnego swiezo przedestylowanego HMPTA, w temperaturze pokojowej. Roztwór zabezpiecza sie przed dostepem wilgoci i mieszajac dodaje do niego porcjami 5 g (50,5 mmol) izocyjanianu p-nitrofenylu. Pu uplywie 24 godzin mieszanine, utrzymywana w temperaturze pokojowej, traktuje sie w sposób opisany w przykladzie la. Produkty uboczne — N,N'-dwu-p-nitrofenylokarbamid i N p-njtrofenylo-N', N'-dwucykloheksylokarbamid sa trudno roz¬ puszczalne w MeOH. Glówny produkt oczyszcza sie na zelu Sephadex® LH—20 równowazonym MeOH.Otrzymuje sie 4,17 g (wydajnosc 74,5%) czesciowo krystalicznego XXXIIa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt. [a] ^ = +1,7° (c= 1,0, DMF).Synteza N<*-BOC-Val-Lys/e-Cbo/-pNA (XXXIIb) W pozbawionej wilgoci atmosferze, do 2,20 g (4,4 mmol) XXXI la dodaje sie 10 ml swiezo przedestylowan¬ ego kwasu trójfluorooctowego. Calosc miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 60 minut, a nastepnie wylewa do 150 ml bezwodnego eteru intensywnie mieszajac. Wytraca sie CF3COOH*H-lys/e-Cbo/-pNA o konsys¬ tencji.oleju, twardniejacego po ochlodzeniu. Faze eterowa zdekantowuje sie, a osad trzykrotnie przemywa porcjami po 75 ml bezwodnego eteru. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem nad NaOH i P202 otrzymuje sie trójfluorooctowa sól pochodnej Ijzyny z wydajnosciowa (2,25 g). 2,25 g (4,4 mmol) CF3COOH-H-Lys/e-Cbo/-pNA rozpuszcza sie w 10 ml DMF. Roztwór ochladza sie do —10°C i dodaje do niego 0,75 ml (5,5 mmol) Et3N, w celu uwolnienia pochodnej aminokwasu z soli trójfluoro- octowej, a nastepnie 2,0 g (5,5 mmol) BOC-Val-OpNP. W ciagu kilku godzin temperature mieszaniny reakcyjnej podnosi sie do pokojowej, nastepnie ponownie chlodzi i buforuje za pomoca 0,31 ml (2,2 mmol) Et3N. Proces buforowania powtarza sie po 2 godzinach. Reakcje prowadzi sie w sumie 24 godziny. Po uplywie tego czasu roztwór odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 40°C, pozostalosc zadaje trzykrotnie porcjami po 20 ml wody destylowanej i ponownie suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Surowy produkt rozpuszcza sie*w MeOH i oczyszcza na zelu Sephadex® LH—20 równowazonym MeOH.Z wycieku wyodrebnia sie 2,12 g (wydajnosc 80,3%) XXXIIb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach Pi •C[a]2D2 =-1,9°(c= 1,0, DMF).Synteza BOC-Phe-Val-Lys/e-Cbo/-pNA (XXXIIc) Materialy wyjsciowe: 0,85 g (1,42 mmol) XXXIIb i 0,77 g (2,0 mmol) BOC-Phe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy XXXIIb.Oczyszczanie: na zelu Sephadex ® LH-20 w MeOH, otrzymuje sie 0,84 g (79,3%) bezpostaciowego XXXIIc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Px. [a] 2D3 = -9,3° (c = 1,02, DMF).Synteza N<*-Bz-Phe-Val-Lys/e-Cbo/-pNA (XXXIId) Material wyjsciowy: 600 mg (0,804 mmol) XXXI Ic i 280 mg (1,25 mmol) Bz2 ".Sposób syntezy: odszczepienie grupy karbonylobutoksylowej zXXXIIc przeprowadza sie w sposób analogiczny do zastosowanego w syntezie XXXI Ib.18 90 746 608 mg CF3COOH*H-Phe-Val-Lys/e-Cbo/-pNA rozpuszcza sie wlOmIDMF. Roztwór ochladza sie do -10°C i dodaje do niego 113 ml (0,8 mmol) Et3N, w celu uwolnienia aminy peptydu z soli. Do roztworu dodaje sie 280 mg (1,25 mmol) Bz20 w temperaturze -10°C. Roztwór buforuje sie i przerabia w sposób analogiczny do przedstawionego w przykladzie XXXI Ib. Po oczyszczeniu surowego produktu na zelu Sephadex® LH—20 w MeOH otrzymuje sie 460 mg produktu jednorodnego w TLC w ukladach Pi i C. [a] 2^ = -22,8° (c = 0,99, DMF).Synteza N^Bz-Phe-Val-Lys-pNA-HCI (XXXII) Material wyjsciowy: 280 mg (0,373 mmol) XXXIId.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ig.Oczyszczanie: na zelu Sephadex® G-15 w 50% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 172 g (wydajnosc: 1%) bezpostaciowego XXXII o zawartosci Cl 5,39%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A, [a] " = -36,2° (c = 0,67, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Phe 0,9, Lys 1,1. PL