JPS5859952A - 新規合成基質 - Google Patents

新規合成基質

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JPS5859952A
JPS5859952A JP56157423A JP15742381A JPS5859952A JP S5859952 A JPS5859952 A JP S5859952A JP 56157423 A JP56157423 A JP 56157423A JP 15742381 A JP15742381 A JP 15742381A JP S5859952 A JPS5859952 A JP S5859952A
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chloroform
leucyl
thf
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Kunio Matsumoto
邦男 松本
Yoshitaka Kagimoto
鍵本 佳孝
Susumu Watanabe
晋 渡辺
Akira Otsuka
明 大塚
Seiji Takahashi
清治 高橋
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KOKUSAN KAGAKU KK
Toyo Jozo KK
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KOKUSAN KAGAKU KK
Toyo Jozo KK
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    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は下記一般式   CI) (ただし、式中Xl  は結合基、または置換基を有し
てもよいアルキレン基、X2  はフェニル基、置換フ
ェニル基、低級アルキル基、−C0OH,−5o3H1
または低級アルキルチオ基よりなる置換基を示す)で表
わされる化合物、またはその塩に関する。
さらに詳しくは、本発明は 下記一般式   (II) R8゜ (ただし、式中X1  は結合基、まだは、 CH3ま
たは−OH基よりなる置換基を有してもよa低級アルキ
レフ基、Roは水素、 CH3、−0CH3、CI、−
N02、−OHまたは−COOH基、R2は水素、−〇
CH3または−OH基を示す)で表わされる化合物、ま
たはその塩および 下記一般式   (III) (ただし、Xl  はX3  と結合してアルキル基を
示し、または、Xl  は結合基または低級アルキレン
基、X3  は−〇〇〇H,−8o3H,または低級ア
ルキルチオ基を示す)で表わされる化合物またはその塩
に関するものである。
本発明の化合物は、ロイシンアミノベプチダーW (T
rue LAPともいう)やアリルアミダーゼ(Cl 
1nical  L A Pともいう、以下時としてA
Aと称する)などのアミノペプチダーゼ(以下、Tru
eLAPとC11nical  LAPを併せて単にL
APと称する)の活性測定用基質として有用な新規化合
物である。
LAPは生体内のあらゆる組織に広く分布し、血清中に
も存在するもので、また病的条件によって増加すること
が知られている。LAP活性の測定は、種々の病変の診
断および予後の観察に必要な臨床検査の対象となってお
り、その臨床化学的分析値としてG−R単位(Gold
barg Rutenburg )を使用し、G−FL
単位= 2,72 x LA P国際単位(mU、/ 
ml )としティる〔Cancer、 11.283(
1958))。
LAP活性の測定法としては種々知られているがいずれ
も一長一短があり、現在、一般に用いられている測定法
としては、L−ロイシンとアミン化合物よりなる合成基
質を用いてLAPの酵素作用に、より生成されるアミン
化合物の比色定量法である。この比色定量法において、
合成基質を用いる場合には、その合成基質としてl−=
インルーp−ニトロアニリドを用い、LAPの酵素作用
で生成するp−ニトロアニリンの黄色を比色している。
しかしこの比色定量に当っては、その合成基質と生成し
たp−ニトロアニリンは比色の際に測定波長がオーバー
ラツプする欠点があり、また血清成分、特にビリルビン
系色素による測定への影響も免れることができないなど
という欠点があった。さらにL−ロイシル−β−ナフチ
ルアミドを基質として用いる場合には、生成するβ−ナ
フチルアミンに、5−ニトロ?−2−アミノメトキシベ
ンゼンジアゾテートなどをカップリングさせて色素を形
成させるか、または生成するβ−プフチルアミンを亜硝
酸ナトリウムでジアゾ化し、N−(1、ナフチル)−エ
チレンジアミンにカップリングさせるか、もしくはp−
ジメチル−アミノベンズアルデヒドまたFip−ジメチ
ルアミノグイ皮アルデヒドを縮合させC色素を形成せし
め、次いでこれを比色定量する方法がとられている。し
かしこれらの比色定量法は、反応過程が複雑で、かつ厳
密な操作を必要とするために、検査法としてはなお不便
なものであった。また標準物質として使用されるβ°−
ナフチルアミンは、毒性が著しく、特に近年膀胱の腫瘍
および癌を発生することが明らかと々す、発癌物質とし
てその使用に特に厳密な注意を要するものであった。そ
の他、酵素を用いるLAP活性の測定法としては、その
基質としてL−ロイシナミド(L −Leucinam
ide )を用い、LAPにより生成したアンモニアを
、α−ケトグルタル酸、グルタミン酸脱水素酵素および
還元型ニコチンアデニンジヌクレオグド(NADH2)
と反応せしめてグルタミン酸に変化せしめ、この際に反
応系のNADH2の減少を分光学的に追跡する方法が知
られている。またL−ロイシル−L−アラニンを基質と
して用いた場合には、LAPの作用により生じたL−ア
ラニ/に、α−クトグルタル酸および、グルタミン酸−
ビルピンff−トランスアミナーゼを用いて反応せしめ
、ピルビン酸を生成させ、このピルビン酸を乳酸脱水素
酵素を用いて乳酸に変化せしめ、その際に消費されるN
ADH2を分光学的に追跡する方法も知られている。さ
らにL−ロイシン脱水素酵素を用いる測定法も知られて
いる。即ち、L−ロイシル−グリシンなどの基質を用い
て、LAPにより生成したL−ロイシンを、L−ロイシ
ン脱水素酵素を用いて反応させ、その際に変化するNA
DH2を分光学的に測定してなる方法である。(特開昭
54−119290号)。また、L−ロイシナミドを基
質として用い、生成するL−ロイシンをL−、アミノ酸
酸化酵素を用いて反応させ、反応系に生ずる過薫化水素
を比色定量してなる測定法も知られている〔ファルマシ
ア、14.872(1978)〕。
しかしながら、これらの酵素を用いる測定法は、反応系
が複雑であり、かつ比色による測定法であるがために、
血清中のビリルビン系色素などや乳濁血清などによる白
濁の影響も大きく、そのために必ずブランクを取らねば
ならない。特にL−アミノ酸酸化酵素を用いる測定法に
おいては、LAPによって生成するL−ロイシンの量に
比べて相当量のL−アミノ哨が血清中に存在している上
に、この血清中のL−アミノ酸含量も栄養剤や食事等の
摂取により著しく変化しているために、LAPを用いた
L−ロイシンの定量には血清中の多量のL−アミノ酸の
影響が著しく強く現われ、LAPよりのl−ロイシンの
定量が著しく困難である、等の欠点があった。
本発明者らは、かかる欠点を有する従来のLAP活性の
測定法を改善すべく鋭意研究した結果、全く意外にも、
血清中に存在しない置換メチルアミン化合物またはD−
アミノ酸化合物をL−ロイシンyc結合せしめて得られ
る合成基質はLAPにより定量的に分解されて著しく良
好に置換メチルアミン化合物、例えばチラミンなどや、
D−アミノ酸を生成せしめ得ることを知った。さらにこ
の合成基質にLAPを作用せしめて生成する置換メチル
アミン化合物またはD−アミ/酸化合物に、対応する酸
化酵素を作用させ、次いで反応によって消費される酸素
または生成される過酸化水素の量を測定し、LAP活性
の測定を行うことにrす、従来の如き複雑な方法を行う
ことのない簡便かつ良好な再現性を示すLAP活性の新
規な測定法を見い出した。またそれに有用な新規な合成
基質である下記式 で表わされるN−L−ロイシルーチラミ/を見い出した
(特願昭55−46085号参照)。
またさらに本発明者らは下記式 (ただし、式中Rは低級アルキル基、特にメチルおよび
イソブチル基を示す)で表わされる化合物が、LAPの
作用により良好にチラミンを遊離、生成せしめ、この生
成するチラミンを、対応する酸化酵素にて酸化せしめ、
次いで反応に1って消費される酸素または生成される過
酸化水素の量を測定してLAP活性の測定を行うことが
できることを見い出した(特願昭55−171268 
)。
さらに本発明者らは種々研究した結果、下記式(ただし
、式中X1  およびX2  は前記と同じ意味を示す
。)で表わされる化合物、またはその塩で表わされる新
規なN−L−口イシル−置換メチルアミド化合物が、L
APの作用により良好に置換メチルアミン化合物を遊離
、生成せしめ、この生成する置換メチルアミン化合物に
、対応する酸化酵素を作用せしめ、次いで反応によって
消費される酸素または生成される過酸化水素の量を測定
することによってLAP活性の測定を行うことができる
ことを見い出した。
本発明は、上記の知見に基いて完成されたもので、下記
一般式CI) (ただし、式中Xl  およびX2  は前記と同じ意
味を示す。)で表わされる化合物、またはその塩に関す
るもので、LAP活性の測定に有用な新規化合物である
本発明の化合物を製造するに当っては、ペプチド合成の
だめの常法・手段に従って、 L−ロイシンと、 X2−Xl−CH2−NH,で表わされる置換メチルア
ミン化合物の縮合反応により行われる。
反応に際しては、必要に応じて官能基が保護される。保
護基としては、ペプチド合成反応において汎用される通
常の保護基をあげることができる。
例えば、L−ロイシンのα−アミン基を、通常の保護基
、例えばt−ブトキシカルボニル、t−アミルオキシカ
ルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ベンジルオ
キシカルボニル、0−ニトロフェニルチオ、ニトロ置換
ベンジルオキシカルボニル基などにて保護すればよい。
ついでそのカルボキシル基は、例えば酸アジド、酸無水
物、酸イミダゾリドまたは活性エステル、例えばシアン
メチルエステル、p−ニトロフェニルエステル、2,4
−ジニトロフェニルエステル、N−ヒドロキシスクシン
イミドエステル、N−ヒドロキシフタル酸イミドエステ
ルなどに変換することによって、あるいはカルボジイミ
ド、N、N′−カルボニル−ジイミダゾールまたはイン
オキサシリウム塩、例えばウッドワード反応剤などを使
用して反応せしめて活性化せしめる。さらにこの活性化
した化合物と置換メチルアミン化合物とを反応せしめる
。置換メチルアミン化合物の具体例として、フェネチル
アミン、フェニルプロピルアミン、p−メチルフェネチ
ルアミン、p−メトキシフェネチルアミン、p−クロロ
フェネチルアミン、p−ニトロフェネチルアミン、3.
4−ジメトキシフェネチルアミン、ドーパミン、p−ニ
トロベンジルアミン、β−メチルフェネチルアミン、β
−ヒドゴキシフエネチルアミン、p−カルボキシフェネ
チルアミン、ベンジルアミン、3−メチル−4−ヒドロ
キシヘンシルアミン、オクトハミン、インアシルアミン
、n−ヘキシルアミン、E−アミノカプロン酸、エチル
アミン、n−ブチルアミン、n−オクチルアミン、n−
デシルアミン、ラウリルアミン、3−メチル−チオ−プ
ロピルアミン、2−エチル−yオクチルアミンカどがあ
げられる。
好ましい縮合反応手段としては、上述したようにカルボ
ジイミド法、アジド法、活性エステル法や酸無水物法で
ある。また反応に当っては不活性溶媒、例えばジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホ
キサイド、テトラヒドロフランなどの溶媒中にL−ロイ
シンと置換、メチルアミン化合物の両者はぼ等モル量を
溶解し、約−30°C〜室温中にて攪拌すればよい。一
般に反応は30分〜50時間で完了する。反応後、α−
アミノ基の保護基を脱離せしめる。脱離反応は好ましく
はt7−ブトキシカルボニル基の場合では2N−HCI
の酢酸溶液やトリフルオロ酢酸を用いて、またはベンジ
ルオキシカルボニル基の場合ではパラジウム−炭素を用
いる接触還元手段またはHBrの酢酸溶液を用いて行わ
れる。目的物は分離手段、例えば抽出、洗浄、クロマト
操作、結晶化など操作により得ることができる。さらに
目的物は、塩形成に適する酸、例えば塩酸、臭化水素酸
、リン酸などの無機酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シ
ュウ酸などの有機酸と反応させることによって相当する
塩を形成することができる。
このようにして得られた本発明の目的物たるN−L−口
イシル−アミド化合物またはそれらの塩などの一般式〔
I〕で表わされる化合物またはその塩は、LAP活性の
測定のだめの合成基質として用いられるものである。例
えばそのLAP活性測定の一例をあげればこの合成基質
に、LAP含有被検液を作用せしめ、その酵素活性によ
り生成される置換メチルアミン化合物を、対応するその
酸化酵素、例えばアミンオキシダーゼ、好ましくは豚や
牛血清またはアスペルギルス・ニガー々どより得られた
酵素やサルシナ・ルテア・IAM1099より得られた
酵素(Biochem、 Biophys。
Res、 Commn、 、 27.850 (196
7)、Methodsin Enzymology、 
17.722(1971))や市販のアミンオキシダー
ゼを用いて反応せしめ、反応によって消費される酸素ま
たは生成される過酸化水素の量を測定する方法をあげる
ことができる。
測定反応に使用される酸化酵素は固定化酵素として使用
してもよい。この場合には、自動分析装置へ組み込んで
測定を行うことが可能となり、酸素電極や過酸化水素電
極にて測定を行うことにより、有用かつ高価な酵素の使
用を著しく少量ならしめることができるため特に有効で
ある。さらに酵素電極たる固定化酵素と上記電極とを組
み合わせたセンサーとして用いることにより、迅速に、
しかも種々の試薬も必要とせず、さらに繰り返し測定に
利用でき、さらにまた有色物質を含むLAP活性測定用
試料にも適用できるために極めて有効な測定方法とする
ことができる。またこの固定化酵素は、公知の種々の固
定化手段により調製できる。
例えば、アクリルアミドで包括固定化する方法、アルブ
ミンなどゐ蛋白質と共に混合した後、蛋白質同士を架橋
して固定化する方法、コラーゲンやフィブロインなどに
包括するか、またはこれを共有結合せしめて固定化する
方法、多孔性有機高分子樹脂に吸着または共有結合にて
固定化する方法、光硬化性樹脂を用いて包括固定化する
方法なとり種々の包括、吸着、結合等の手段が用いられ
る。
このようにして調製された固定化酵素は酵素電極用の形
として使用に好ましい膜状繊維状物、粒状またはチュー
ブ状として加工使用される。・つぎに、LAP活性測定
を行う場合の例を以下に述べる。まず本発明の合成基質
の一定濃度溶液を調製し、これと、LAP活性測定用被
検液、例えば血清、および緩衝液を加えて反応せしめる
反応にあたっては通常37℃近辺にて行えばよく、反応
時間としてはLAPにより合成基質から置換メチルアミ
ン化合物が生成される時間であれば特に限定されるもの
ではない。次いで反応後、生じた置換メチルアミン化・
合物を対応する酸化酵素によシ酸化せしめる。その際反
応終了液と対応する酸化酵素が反応し、それによって酸
素が消費され、また過酸化水素が生成されればよい。通
常対応する酸化酵素の溶液を添加して反応せしめるか、
または対応する酸化酵素の固定化酵素に接触せしめて反
応を進行せしめればよい。反応は通常87℃近辺にて行
なわれる。反応後、消費される酸素または生成される過
酸化水素の量を測定するのであるが、好ましくは酸素電
極または過酸化水素電極にて測定すればよい。この測定
は上記固定化酵素と電極とを組み合せてなる酵素電極を
使用することによってより簡便に行なわれる。さらにこ
れらの電極によって測定された値は電気的変化として、
必要に応じて記録するか表示し、LAP活性値として換
算すればよい。また上記過酸化水素の量の測定に当って
は、4−アミノアンチピリン、フェノール、パーオキシ
ダーゼを含有する呈色試薬やルミ°ノー°ルなどの発光
試薬を用いて定量してもよく、適量公知の種々の過酸化
水素の定量手段を用いることができる。
またLAP活性測定のだめの系としては、例えば、LA
P活性測定用試料、合成基質溶液、反応媒体たる緩衝液
の注入口を、合成基質より置換メチルアミン化合物を生
成せしめるためのLAP反応槽に導き、さらに反応によ
って生成した置換メチルアミン化合物に対応する酸化酵
素を作用せしめ、酸素または過酸化水素の量を検出する
ことより反応−検出槽を有する測定系をあげることがで
きる。また好ましくは、そO反応−検出槽において、対
応する酸化酵素の固定化酵素カラム部と検出のための電
極部とに分離してもよい。さらに、または電極部の検知
部にその固定化酵素を具備した酵素電極部として一体化
せしめたものであってもよい。さらに、LAP反応槽と
反応−検出槽とは対の系に限定されるものではなく、例
えば複数のLAP反応槽よりサンプリング装置にて順次
反応−検出槽に測定サンプルを注入し、順次検出、洗浄
を繰り返すことよりて′なる2以上のLAP反応槽と反
応−検出槽を有する測定系であってもよい。
本明細書中の記載の略記号は、次の意味を有するもので
ある。
BoCst−ブトキシカルボニル基 HO8u:N−ヒドロキシスクシンイミドHoBt:1
−ヒドロキシベンゾトリアゾールO8u:N−ヒドロ上
シスクシ/イミドエステルDCC,: N、N’−ジシ
クロへキシルカルボジイミドTHF:テトラヒドロフラ
ン DCU: N、N’−ジシクロへキシルウレアn−Bu
OH:n−ブチルアルコール BtOH:エチルアルコール AcOH:酢酸 DMFニジメチルホルムアミド NMM:N−メチルモルホリン Z:ペンジルオキシカルボニル基 さらに赤外線吸収スペクトルの測定において、シロップ
状物は食塩板に塗布した後に測定に供し、また他のもの
は通常のKBr法に基いて測定に供して行なった。
次に、本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何んら限定されるものではない、。
実−施例(1) N −L−ロイシル−フェネチルアミ
ド(HLe u NHCH2CH2−0)Z −L −
oイシン(4,’12?、17.8mM)をT I−(
F(20ml)に溶解させて、N−ヒドロキシベンゾト
リアゾール(2゜642.19.5mM)、フェネチル
−アミ7 (2,45m1.19.5mM)を加えて0
℃でDCC(4,OB?、19.5m、/りのTHF(
20ml)溶液を滴下した。
室温にて一夜攪拌して、析出したDCUを炉去し、涙液
を減圧にて濃縮して、酢酸エチル(50m1)に溶解し
た。飽和炭酸水素す) IJウム溶液(20ml ) 
テ2回、飽和食塩水(20ml ) 、冷IN−HCI
(20ml ) テ2回、飽和食塩水(20+++l’
)で2回夫々洗浄し、無水Mg5O,で乾燥した。酢酸
エチルを留去し残渣に25%HBrの酢酸溶液(10m
/’)を加えて室温で1時間攪拌した。80℃以下で減
圧留去し、油状の残渣に水(20ml )を加え不溶物
をのぞいて冷4N−NaOHでpHを約11に調節した
。クロロホルム(80m/)で8回抽出して抽出液を合
わせ、飽和食塩水で洗浄し無水Mg804で乾燥した。
クロロホルムを留去して油状のN−L−ロイシン−フェ
ネチルアミドを得た。
収率 : 2.5Of (60チ) 〔α)22=−2,9(C=1.0、EtOH)Rf 
 =0.68(n−BuoH:AcOH:H20=4:
1:1)(シリカゲル−薄層クロマトグラフィー)実m
 例(2)N−L−ロイシルーフェニルグロピルアミド
(HLeu −NHCH2CH2CH24)BoC−L
eu−OH(4,6LP、20mM)、フェニルプロピ
ルアミ7 (2,7Of、20mM)をTHF(50r
nl )に溶解し、−5〜0℃でDCC(4,18?。
20mM)OTHF (100m/)溶液を滴下した。
反応混合物を一夜室温で攪拌し、析出したDCUを炉去
する。涙液を30℃以下で減圧濃縮して酢酸エチル(8
00m1)に溶解する。飽和Na HCOs、飽和食塩
水、lN−HCl、飽和食塩水(各50m1りで3回洗
浄を繰シ返し、無水MgSO4で乾燥する。
酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸エチル=1:1)によ
り精製した。得られたBoC−Leu −NHCH,C
H2CH2−0(8,48f、10mM)に室温にて2
N−HCIの酢酸溶液20 mlを加え1時間攪拌し3
0℃以下で酢酸を留去した。残渣に水(10ml )を
加えて不溶物をのぞき冷4N−NaOHでpH約11と
した。クロロホルム(50mj!X8)で3回抽出して
飽和食塩水(50mJ)で2回洗浄、無水MgSO4で
乾燥した。
クロロホルムヲ留去シてN−L−ロイシル−フェニルプ
ロピルアミドを得た。
収率 : 1.51y  (61,0LII)シロップ
状〔α)”=+4.6  (C=1.0.EtOH)R
f  =0.55  (n−BuOH:AcOH+H2
0=4:1:1)実施例(3)N−L−口イシル−P−
メチルフェネチルアミド(H−Leu−NHCH2CH
2−◇xCHs)BoC−Le u−OH(4,68f
l、 20mM)、p−メチルフェネチルアミド(2,
7Of、20mM)、を’rHF(50m)に溶解させ
て一5℃でDCC(4,13f、20mM)のTHF(
100ml)溶液を滴下した。
反応混合物を一夜室温で攪拌し、析出したDCUを戸去
する。F液を30℃以下で減圧濃縮して酢酸エチル(8
00mJ)に溶解する。飽和Na HCO3、飽和食塩
水、IN−MCI、飽昭食塩水(各50 mt )で3
回洗浄を繰り返し、無水MgSO4で乾燥する。
酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸エチル=1:1)によ
り精製した。得られたBoC−Leu−Nl(CH2C
H2−()−CHs  (8,48f、10mM)に室
温にて2N−HCIの酢酸溶液(20ml)を加えて1
時間攪拌した。30℃以下で酢酸を減圧留去し、残渣に
水(10ml)を加えて不溶物を除去し、冷4N−HC
IでpHを約11に調節した。クロロホルム(50ml
 )で3回抽水して飽和食塩水(50ml )で2回洗
浄し、無水MgSO4で乾燥した。
クロロホルムを留去してN−L−ロイシル−P−メチル
フェネチルアミドを得た。
収率 : 1.68f  (65,6チ)融点 : 4
8−50°C 〔α)22=5.5  (C=1.0.EtOH)’F
Lf   =0.54  (n−BuOH:AcOH:
H20=4:1:1)元素分析値(C,5H24N20
(248,370)として〕Cチ     I4チ  
   Nチ 測定値 :  72.60  9.85  11.00
計算値 :  72,54  9.74  11.28
実施例(4)N−L−口イシル−p−メトキンフェネチ
ルアミド(H−Leu −NI(CH2CH2−◇XO
CH3)Bo C−Le u−OH(4,63fl、、
 20mM)、p−メトキシフェネチルアミン(8,8
8f、20mM)をT I−TF(50mg)に溶解し
て一5〜0℃でDCC(4,13?、20mM)のTH
F(100m1!l)溶液を滴下した。
反応混合物を一夜室温で攪拌し、析出したDCUを涙去
する。ろ液を30℃以下で減圧濃縮して酢酸エチル(8
00m/りに溶解する。飽和NaHCO3、飽和食塩水
、IN−MCI、飽和食塩水(各50m1)で3回洗浄
を繰り返し、無水MgSO4で乾燥する。
酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸エチル=1=1)によ
り精製した。得られた油状のBoC−Leu−NHCH
2C口2−(D←OCH3に室温で2.N −HClの
酢酸溶液(20ml )を加えて1時間攪拌した。30
℃以下で酢酸を減圧留去し、残渣に水(10ml)を加
えて不溶物を除去し、冷4N−HCIでpHを約11に
調節した。クロロホルム(50ml )で8回抽水して
飽和食塩水(50ml )で2回洗浄し、無水MgSO
4で乾燥した。
クロロホルムを留去してN−、−L−:イシ>−p−メ
トキシフェネチルアミドを得た。
収率 :3゜O(156゜7% 融点 :51−52°G 〔α)22 :l:  2゜4   (C=1.0.E
tOH)Rf   = 0.51 (n−BuOH:A
cOH:H20=4:1:1)元素分析値(Cl5H2
40□(264,870としゼ〕Cチ   Hチ  N
チ 測定値  68,79  9.68  10.66計算
値  68.1’5  9.15  10.60実tt
fn 例(5) N−L−ロイシル−p−クロロフェネ
チルアミド(H−Leu−NHQ(2G(2−0XC’
)BoC−Leu−OH(4,63S’、20mM)、
p−クロロフェネチルアミy (8,IIf、20mM
)をTHF(50ml )に溶解し一5″〜0℃でDC
C(4,18?、20mM)(7)THF (100m
1)溶液を滴下した。
N応混合物を一夜室温で攪拌し、析出したDCUを涙去
する。ろ液を30℃以下で減圧濃縮して酢酸エチル(3
00ml)に溶解する。飽和N a HCO3、飽和食
塩水、lN−HCl、飽和食塩水(各50 ml )で
3回洗浄を繰り返し、無水MgSO4で乾燐する。
酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸エチル=1:1)によ
シ精製した。得られたBoC−Leu−p−クロロフェ
ネチルアミン(8,699,10mM)に室温で2N−
HCIの酢酸溶液(20ml)を加え1時間攪拌した。
80℃以下で酢酸を減圧留去し、残渣に水(1oml)
を加えて不溶物を除去し、冷4N−MCIでpHを約1
1に調節した。クロロホルム(50at )で3回抽水
して飽和食塩水(50mA’)で2回洗浄し、無水Mg
SO4で乾燥した。
クロロホルムヲ留去シてN−L−口イシル−〇−クロロ
フェネチルアミドを得た。
収率 : 1.68f  (62,8チ)融点 :41
−48°C 〔α虜=J、9  (C=t、O,EtOH)Rf  
 =0.56(n−BuOH:Ac0)1:H20=4
:1:1)元素分析値(C14H21N20CI・−H
,Oとして〕8 Cチ   Hチ   8%   C1チ測定値 62,
56 8゜16 9,74 13.10計算値 62.
88 7.89 10.88 18.14実施例(6)
N−L−ロイシル−p−ニトロフェネチルアミド(H−
Leu −NHC)T2 CH2−@→o2)BoC−
Leu−OH(4,68f、20mM)p−二)。
フェネチルアミン塩酸塩(5,129,20mM)をT
)(F(50ml)に懸濁して0℃でトリエチルアミy
 (2,8ml、 20mM)を加え30分攪拌した。
0〜−5℃でDCC(4゜18f、20mM)のT)1
F(100d)溶液を滴下した。
反応混合物を一夜室温で攪拌し、析出したDCUを戸去
する。ろ液を30℃以下で減圧濃縮して酢酸:r−fk
(800+++l)に溶解する。飽和NaHCO3、飽
和食塩水、lN−HCl、飽和食塩水(各50mA’)
で3回洗浄を繰り返し、無水Mg804で乾燥する。
酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸エチル−1:1)によ
り精製した。得られたBoC−p−ニトロフェネチルア
ミン(4,16f、10mM)に室温で2N−HCIの
酢酸溶液(20ml )を加え1時間攪拌した。’30
℃以下で酢酸を減圧留去し、残渣に水(10m/)を加
えて不溶物を除去し、冷4N−HCIでpHを約11に
調節した。クロロホルム(50ml )で3回抽水して
飽和食塩水(50ml )で2回洗浄し、無水MgSO
4で乾燥した。
クロロホルムヲ留去シてfl−L−ロインルーp−ニト
ロフェネチルアミドを得だ。
収率 : 1.82グ (65,0%)融点 : 10
5−108°C 〔α): =+2.5  (C=1.0.EtOH)R
f  =0.66(n−BuOH:AcOH:H20=
4:1:1)BoC−Leu−OH(4,63t、20
mM)、3,4−ジメトキシフェネチルアミン(3,8
8ml、 20mM)をTHF(50m/)に溶解し、
−5℃−r:Dec (4,189,20mM)のTH
F(100mJ)溶液を滴下した。
反応混合物を一夜室温で攪拌し、析出したDCUを渥去
する。p液を80℃以下で減圧濃縮して酢酸”−fk 
(BOOml )に溶解する。飽和NaHCO3飽和食
塩水、lN−HCl、飽和食塩水(各50m1)で3回
洗浄を繰り返し、無水Mg804で乾燥するっ酢酸エチ
ルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフィ(溶媒
系:クロロホルム:酢酸エチル=1=1)により精製し
た。得られたBoC−Leu −3,4−ジメトキシフ
ェネチルアミド(8,95f。
10mM)に室温で2N−HCIの酢酸溶液(20m/
)を加え1時間攪拌した。
無水エーテル(100m/)を加え、生じた白色沈殿を
濾過採取して、N−L−ロイシル−3,4−ジメトキシ
フェネチルアミド塩酸塩を得た。
収率 : 2.OB?  (61,4チ)融点 ニア6
−79℃ 〔α): = −4,O(C=1.0. EtOH)R
f   =0.49(n−BuOH:AcOH:H20
=4:1:1)実施例(8)N−i−ロイシル−3,4
−ジヒドロキシフェネチルアミド塩酸塩ドーパミン増酸
塩(6,21?、 82.7mM)を0°CでI)MP
 (50m1)に懸濁してトリエチルアミン(4,58
ml、 82.7mM)を加えて80分反応した。
次にBoC−L−Le u−OH(8゜60グ、32.
7mM)。
HoBt(4,42f、82.7mM)を加えて一5℃
でDCC(6,759,32,7mM)のDMF(50
ml)溶液を滴下して室温で一晩攪拌した。生じたDC
Uの沈殿をのぞいて30′℃以下でDMFを留去乾燥し
た。酢酸エチル(80oml)に溶解させて、飽和Na
HCO3,飽和食塩水、lN−HCl、飽和食塩水(各
50m/)で3回洗浄して無水MgSO4で乾燥した。
酢酸エチルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフ
ィ=(溶媒系:クロロホルム:酢エチー1=1)により
精製した。収量11.’1(92,6チ)。
Bo C−L −Le u −8、4−ジヒトロキシフ
エネチルアミド(8,66t、10mM)に2 N−H
Cl / Ac0H(20ml )を加えて室温にて1
時間攪拌した。無水エーテル(100+++Aりを加え
て生じた白色沈殿を口取乾燥して、N−L−口イシル−
3,4−ジヒドロキシフェネチルアミド塩酸塩を得た。
収率 : 2,75f  (90,8%)融点 :81
−85°C 〔α )22  ==    s 。 t    (C
= 1.O,EtOH)Rf  = 0.66 (n−
BuOH:AcOH:H20=4:1:1)実施例(9
)N−L−ロイシル−p−ニトロベンジルア檀ド塩酸塩
(HCl−H−Leu−NI(cH2+NO□)BoC
−L−Leu−OH,(4,63F、20mM)、  
p−ニトロベンジルアミy −HCI (L 77f、
20mM)をTF’H(50ml)に溶解し0℃でT 
EA (2,80m1!、20mM)を加えた。30分
後にDCC(4,18r、20mM)のTHF(100
m/)溶液を滴下して室温にて一晩攪拌した。
生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHFを減
圧留去乾燥した。酢酸エチル(800mJ)に溶解させ
て、飽和NaHCO3、飽和食塩水、lN−HCl、飽
和食塩水(各50m1)で3回洗浄して無水MgSO4
で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して残渣をシリカゲ
ルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸エチ
ル=(1:1)にて精製した。得られたBoC−I、e
u−p−ニトロベンジルアミド(C66り、10mM)
に室温で2N−HCIの酢酸溶液(20ml )を加え
1時間攪拌した。
無水エーテル(100ml)を加え生じた白色沈殿を炉
取し、乾燥してN−L−口イシル−p−ニトロベンジル
アミド塩酸塩を得た。
収率 : 2.549  (84,2%)融点 : 1
78−175°C 〔α〕22=+24.2  (C=1.0.BtOH)
Rf  = 0.54 (n−BLloH:ACOH:
H20=4:1:1)元素分析値(C13HtsN30
3・HCIとして〕6%  Hチ  N%  C1% 測定値 51.62 6.71 18.94 11.8
0計算値 51.74 6.68 13,92 11.
75実施例(転)N−L−ロイシル−β−メチル・フェ
ネチルアミドBo C−Le u−OH(4,68f、
 20mM)、β−メチルフェネチルアミ7 (2,7
Of、20mM)をTHF(50m/)に溶解して一5
〜O℃fDec(4,18F、20mM)のTHF(1
00mA’)溶液を滴下した。
生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHPを減
圧留去乾燥した。酢酸エチル(800m/りに溶解させ
て、飽和N a HCO3、飽和食塩水、lN−MCI
、飽和食塩水(各5 Q tnl )で3回洗浄して無
水MgSO4で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して残
渣をシリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系(8,48f
、10mM)に室温で2N−HCI /A c 0H(
20+++J)を加えて1時間攪拌し、30℃以下で酢
酸を留去した。
残渣に水(10ml)を加えて不溶物を除去し、冷4N
−NaOHでpHを約11に調節した。クロロホルム(
50ml )で3回抽出して、抽出液を合わせ、飽和食
塩水(50+++/)で2回洗浄し、無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥した。
クロロホルム溶液を減圧乾固して油状のN−L−ロイン
ルーβ−メチルフェネチルアミドラ得る。
収率 : 1.85F  (75,0%)シロップ状〔
α)22 =−5,5(C=1.0.EtOH)棧r 
  =o。55 (n−Buoll : AcOH: 
H20=4:1:2)実施例α1)N−L−ロイシル下
β−ヒドロキシ・フェネチルアミドBoC−Le u−
OH(4,639,20mM ) 、 2−アミノ−1
−フェニルエタノール(2,74r、20mM)をTH
F(50ml)に溶解して一5〜0℃でDCC(4,1
8グ、 20mM)ノT HF (100m1 )溶液
を滴下した。
生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHFを減
圧留去乾燥した。酢酸エチル(800mj’)に溶解さ
せて、飽和NaHCO3、飽和食塩水、lN−HCl、
飽和食塩水(各50 ml )で3回洗浄して無水Mg
80.’で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して残渣を
シリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホルム:
酢酸エチル=(1:1)にて精0H (3゜509.10mM)に室温で2N−Helの酢酸
溶液(20ml)を加え1時間攪拌し、30℃以下で酢
酸を留去した。
残渣に水(lQm/’)を加えて不溶物を除去し、冷4
N−NaOHでpHを約11に調節した。クロロホルム
(50m、l )で3回抽出して、抽出液を合わせ、飽
和食塩水(5、Q ml )で2回洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。
クロロホルム溶液を減圧乾固して油状のN−L−ロイシ
ル−β−ヒドロキンフェネチルアミドを得た。
収率 : 1,26f  (50,2チ)〔ατ=−6
.5  (C=1.0.EtOH)Rf  =0.62
f(n−BuOH:AcOH:H20=4:1:1)実
m 例1)aN−L=ロイシル−p−カルボキシフェネ
チルアミド塩酸塩(HCl ・H−Leu−NHCH2
CH2−GトC0OH)BoC−L−Leu−OH,(
4,631,20mM)、p −カルボキシフェネチル
アミン(8,80f、20mM)をTHF(50m/)
に溶解してO〜−5℃でDCC(4,IEF、 20m
M) ノTHF (100m/り溶液を滴下した。
生じたDCUの沈殿を除去し、30℃以下でTHFを減
圧留去乾燥した。酢酸エチル(800m/)に溶解させ
て、飽和NaHC’03、飽和食塩水、IN−HCl、
飽和食塩水(各50m/)で3回洗浄1.て無水’Mg
SO4で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して残渣をシ
リカゲルクロマトグラ−フイ(溶媒系:クロロホルム:
酢酸エチル=(1:1)にて精製した。得られたBoC
−Leu−p−カルボキンフェネチルアミド(3,78
f、10mM)に室温で2N−HCI(7)酢酸溶液(
20ml)を加え、室温にて1時間攪拌した。無水エー
テル(100ml)を加えて生じた白色沈殿を戸数し、
乾燥してN−L−ロイシル−p−カルボキシフェネチル
アミド塩酸塩を得た。
収率 : 1,56f(61,9チ) 融点 :228−280°C 〔α)22=−4,1’(C=1.0.EzOH)Rf
  = 0.66 (n−BuOH:AcOH:H20
=4:1:l)実施例(18) N−L−ロイシル−(2−P−ヒドロキンフェニル−2
−ヒドロキシ)−エチルアミド塩酸塩H Boa−Leu−OH(4,689,20mM)、dl
−オクトハミン(2−P−ヒドロキシフェニル−2−ヒ
ドロキシ−エチルアミン) HC/ (8,79g、 
20mM)、トリエチルアミ7 (2,8ml、 20
mM)をTHF(50mlにに溶解し、−5〜θ℃でD
CC(4,189,20mM)のTHF(100ml)
溶液を滴下して室温で一晩攪拌する。
生じたDCUの沈澱を除去し、30℃以下でTHFを減
圧留去し乾燥した。酢酸エチル(800ml )に溶解
させて、飽和NaHCO3、飽和食塩水、lN−HCl
、飽和食塩水(各50 ml ) f a 回洗浄して
無水MgSO4で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホ
ルム:酢酸エチル=(1:1)にて精製した。得られた
Bo c−Le u−NH−CH2−OH に−’C2N−HClの酢酸溶液(20ml )を加え
1時間攪拌した後、無水エーテル(100ml)を加え
て結晶化した。無水エーテルで洗浄後、結晶を沖集して
乾燥した。
収率−2,669(87,8%) 融点=196〜200°G(分解) 〔α)” =+20 、9 (C=1.0. EtOH
)Rf=0.58(n−BuOH:AcOH:H20=
4−1:1) 実施例(14) N−L−口イシル−3−メトキシ−4−ヒドロキシベン
ジルアミド・塩酸塩 Boc−Leu−OH(4,689,20mM)、3−
メ ト キシ−4・ヒドロキシベンジルアミンHC1(
8,80,9,20mM)、トリエチルアミン(2,8
mJ。
20mM)をTHF(50ml)に溶解上、r−5〜0
℃でDCC(4,18g、20mM)のTHF(100
mJ)溶液を滴下して室温で一晩攪拌した。
生じたDCUの沈澱を除去し、30℃以下でTHFを減
圧留去して乾燥した。酢酸エチル(300at )に溶
解させて、飽和N a HC03,飽和食塩水、lN−
HCl、飽和食塩水(各50m1)・−で3回洗浄して
無水Mg804で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して
残渣をシリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホ
ルム:酢酸エチル= (1: 1 ’)6.6mM)に
室温にて2N−H(Jの酢酸溶液(18ml)を加え1
時間攪拌した後、無水エーテル(100ml)を加えて
結晶化した。無水エーテルで洗浄後、結晶をp集して乾
燥した。
収率: 1.74g(87,7%) 融点:40〜48°C 〔α)  =+4 、2 (C=1.0. Et oH
)Rf = 0.46 (n−BuOH:AcOH: 
H2O=4:1:1) 実施例(15) N−L−ロインルーベンジルアミド Boc−Leu−OH(463g、20mM)、ベンジ
ルアミン(8,219,80mM)をTHF (50m
l )に溶解し、−5〜0℃でDCC(4,13g。
20 m M )のTHF(100ml)溶液を滴下し
、た。
生じたDCUの沈澱を除去し、30℃でTHFを減圧留
去して乾燥した。酢酸エチル(800mJ)に溶解させ
て、飽和N a HCO3、飽昭食塩水、lN−HCl
、飽和食塩水(各50 ml ) f 8回洗浄して無
水MgSO4で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して残
渣をシリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系゛クロロホル
ム:酢酸エチル=(1: 1)にて精製した。得られた m M )に室温にて2N−HClの酢酸溶液(20m
l )を加え1時間攪拌し、30℃以下で酢酸を留去し
た。残査に水(19mlりを加えて不溶物を除き、冷4
N−NaOHでpH約11に調節し、クロロホルム(5
0mJ)で3回抽出して、抽出液を合わせて飽和食塩水
(50ml)で2回洗浄、無水硫酸マグネシウムMgS
O4で乾燥した。クロロホルムを減圧留去してN−L−
口イシル−ベンジルアミドを得た。
収率:1.19!j(54,0%) 融点:56〜57℃ 〔α:l   =+5.4(C=1.EtOH)Rf 
=0.55 (n−BuOH:AcOH:H20=4:
1:1) 実施例(16) N−L−ロイシル−P−スルホンアミド−ベンジルアミ
ド (H−Leu−NH−CH2(■5O2NH2)  ’
Bo c−Le u−OH(2,82,9,、10mM
)、P−7ミノメチルベンゼンスルホアミド塩酸塩(2
,22g。
10 m M )、トリエチルアミン’(1、40ml
、10m M )をTHF(25ml)に溶解した。次
に0〜=5℃でDCC(2,07g、10mM)のT)
(F”(50ml)溶液を滴下し室温で一晩攪拌した。
生じたDCUの沈澱を戸別して、30℃以下でTHFを
留去した。残渣を酢酸エチル(300ml )に溶解し
て゛飽和NaHCO3、飽和食塩水、IN−I(Cl 
%飽和食塩水(各50 ml ) ノ順で3回洗浄して
無水硫酸マグネシウムで乾燥する。酢酸エチルを濃縮し
て残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(溶媒系:クロ
ロホルム:酢酸−1:1)により精製した。
Boc−Leu−P−スルホンアミド−ベンジルアミド
(1,60g、4mM)に室温で2N−HC7の酢酸溶
液(8ml)を加えて室温にて1時間攪拌した。無水エ
ーテル(5Q ml )を加えて結晶化させ、生じた結
晶を戸数して減圧乾燥した。
収率:1.10g(81,9%) 融点=120〜123℃ 〔α)、=+i 1,9 (C=1.エタノール)実施
例(17) N−L−口イシル−イソアミルアミド Boc−Leu−OH(4,689、20mM )、イ
ンアミルアミy (1,92’9.22mM)をTHF
(50ml )溶液に溶解して一5〜0℃でDCC(4
,18g、20mM)のTHF(100at)溶液を滴
下して一晩攪拌した。生じたDCUの沈澱を除去して8
0℃以下でTHFを留去した。残渣を酢酸エチル(80
0ml )に溶解して飽和NaHCO3、飽和食塩水、
lN−HCl、飽和食塩(各5 Q me )での順に
8回洗浄して無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エ
チルを濃縮して残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(
溶媒系:クロロホルム:酢酸=l:1)により精製した
Boc−Leu−イソアミルアミド(8,01g。
10mM)に室温で2N−HCIの酢酸溶液(20ml
 )を加えて1時間攪拌し、80℃以下で酢酸を留去し
た。残査に水(10ml)を加えて不純物をのぞき、冷
N−NaOHでpH約11に調節した。
クロロホルム(50+++l)で3回抽出して抽出液を
合わせて飽昭食塩水(50ml )で2回洗浄し、無水
硫酸マグネシウム士乾燥した。クロロホルムを留去シて
N−Lロイシル−イソアミルアミドを得た。
収率:1.60g(80,0%)シロ−ツブ状〔α) 
 =+5.5 (C=I EtOH)Rf=0.80 
(nBuOH:AcOH:H2O=4:1:1) 実施例(18) N−L−ロイシルニロ−へキシルアミド(H−Leu−
NHCH2CH2CH?CH2CH2−OH5)Boc
−Leu−OH(4,68g、20mM)n−ヘキシル
アミy (8,96ml、 80mM)をTHF(50
ml )に溶解して25〜0℃でDCC(4,18g。
20 m M )のTHF(100ml)溶液を滴下し
て一夜攪拌した。生じたDCUの沈澱を除去して30℃
以下でTHFを留去し、残渣を酢酸エチル(300at
 )に溶解した。酢酸エチル溶液を飽和NaHCO3、
飽和食塩水、lN−HCl、飽和食塩水(各50m1 
)の順に3回ずつ洗浄した後無水硫酸マグネシウムで乾
燥した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮して得られた残渣を
シリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホルム:
酢酸=t:i)により精製した。得られたBoc−Le
u−n−へキシルアミドに室温で2N−HClの酢酸溶
液(40ml )を加えて1時間攪拌し、30℃以下で
AcOHを減圧留去した。残渣に水(10++A’)を
加えて不溶物を除き、冷lN−NaOHでpHを約11
に調節した。
クロロホルム(50ml )で3回抽出して、抽出液を
合わせ、飽和食塩水(5Q ml )で2回洗浄した後
、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。クロロホルムを減
圧留去して、N−L−口イシル−〇−へキシルアミドを
得た。
収率: 2.609(60,6%)シロップ状〔α)、
=+e、o(c=1.EtOH)Rf=0.80  (
n−BuOH:AcOH:H2O=4:l:1) 実施例(19) N−L−口イシル−5−カルボキシヘキシルアミド (HI、eu  NHCH2CH2CH2CHzCH2
COOH)Boc−Leu−OH(4,68g、20m
M)、Σ−アミノカブo7酸(2,62,j7.20m
M)をTHF(50ml )に溶解して一5〜θ℃でD
CC(4,18jj。
20mM)のTHF(100at’)を滴下して一晩攪
拌した。
生じたDCUの沈澱を除去し、30℃以下でTHPを減
圧留去して乾燥した。酢酸エチル(300ml )に溶
解させて、飽和NaHCO3、飽和食塩水、lN−HC
l、飽和食塩水(各50 ml)で3回洗浄して無水M
gSO4で乾燥した。酢酸エチルを減圧濃縮して残渣を
シリカゲルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホルム:
酢酸エチル=(1:1)にて精製した。得られたBoc
−Leu−5−カルボキンヘキシルアミド(8,44g
、10mM)に室温で2N−HCt2o酢酸溶液(20
ml )を加え、1時間攪拌し、80℃以下でAcOH
を留去した。
残渣に水(10ml)を加えて不溶物を除き、冷lN−
NaOHでpHを約11に調節した。クロロホルム(5
0ml )で3回抽出して、抽出液を合わせ、飽和食塩
水(50ml)で2回洗浄した後、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥した。クロロホルムを減圧留去して、N−L−
ロイシル−5−カルボキシヘキシルアミドを得り。
収率: 1.209 (49,1%) 融点:105〜108℃ 〔α)” =+ 17 、 1  (C=’l、 Er
 OH)Rf=0.68(n−BuOH:AcOH:H
20=4:1:1) 実施例(20) N−L−ロイシル−エチルアミド (H−Le u−NHCH2CH3) Boc−Leu−OH(4,689,20mM)、エチ
ルアミ:/(2,459,80mM)をTHF(50m
l )に溶解して一5〜0℃でDCC(4,18g。
20mM)のTHF(100ml)溶液を滴下して一夜
攪拌した。生じたDCUの沈殿を除去して80℃以下で
THFを留去し、残渣を酢酸エチル(300ml )に
溶解した。酢酸エチル溶液を飽和NaHCO3、飽和食
塩水、lN−HCl、飽和食塩水(50ml)の順に8
回ずつ洗浄した後無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢
酸エチル溶液を減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲル
クロマトグラフィ(溶媒系:クロロホルム:酢酸=1:
1)により精製した。
B、oc−Leu−エチルアミド(129g、5mM)
に室温で2N−HClの酢酸溶液(10m/りを加え、
1時間攪拌し、30℃以下でA c OHを留去した。
残渣に水(toml)を加えて不溶物を除き、冷lN−
NaOHでpHを約11に調節した。
クロロホルム(50ml)で3回抽出して、抽出液を合
わせ、飽和食塩水(50ml)で2回洗浄した後、無水
硫酸マグネシウムで乾燥した。クロロホルムを減圧留去
して、N−L−口イシル−エチルアミドを得だ。
収率:0.58.!11(67,8%)シロップ状〔α
〕:、” =+5.5 (C=1 、EtOH)実施例
(21) N−L−口イシル−n−ブチルアミン (H−L e u−NH−CH2CH,CH2CH2)
Boc−Leu−OH(4,689,20mM)、n−
ブチルアミン(2、j9.li+、80mM)をTHF
(50m7りに溶解して一5〜θ℃fDec(4,18
g。
20 m M )のTHF(100ml)溶液を滴下し
て一夜攪拌した。生じたDCUの沈澱を除去して30℃
以下でTHFを留去し、残渣を酢酸エチル(800ml
)に溶解した。酢酸エチル溶液を飽和N a HC03
、飽和食塩水、lN−HCl、飽和食塩水(各50d)
の順に3回ずつ洗浄した後無水硫酸マグネシウムで乾燥
した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮して得られた残渣をシ
リカゲルクロマトグラフィ(溶媒系:クロロホルム:酢
酸=1:1)により精製した。得られたBoc−Leu
−n−ブチルアミド(2,86,!9.10mM)に室
温で2N−HC/の酢酸溶液(20ml )を加え、1
時間攪 ・拌し、80℃以下で酢酸を留去した。
残渣に水(10+++l)を加えて不溶物を除き、冷l
N−NaOHでpHを約11に調節した。クロロホルム
(50ml)で3回抽出して、抽出液を合わせ、飽和食
塩水(50+++l)で2回洗浄した後、無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥した。クロロホルムを減圧留去して、N
−L−ロイシル−ロープチルアミドを得た。
収率: 0.88g(47,2%)シロップ状〔α) 
 =+5.6 (C=1.E[)H)Rf=0.54(
n−BuOH:Ac−OH:H20=4:1:2) 実施例(22) N−L−口インル−8−メfルチオープ口ピルアミド (H−L e u −NH−CH2CH2CH2−8−
CH3)Boc−Leu−OH(4,68g、20mM
  )、S−メチルプロピルアミン(2,10,j9.
20mM)をTHF(50ml)に溶解して一5〜0℃
でDCC(4,18g、2’OmM)のTHF (10
0m1)溶液を滴下して一夜攪拌した。生じたDCUの
沈澱を除去して30℃以下でTHFを留去し、残渣を酢
酸エチル(800il)に溶解した。酢酸エチル溶液を
飽和N a HCO3、飽和食塩水、lN−HCl。
飽和食塩水(各5 Q ml )の順に3回ずつ洗浄し
た後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。酢酸エチル溶
液を減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルクロマトグ
ラフィイ(溶媒系:クロロホルム:酢酸=1:1)によ
り精製した。得られたBoc−Leu−8−メチルプロ
ピルアミド(s、isg、i。
mM)に室温で2N−HClの酢酸溶液(20m/)を
加えて1時間攪拌し、30℃以下で酢酸を留去した。残
渣に水(lom/)を加えて不溶物を除き、冷lN−N
aOHでpHを約11に調節した。クロロホルム(50
ml )で3回抽出して、抽出液を合わせ、飽和食塩水
(50m/)で2回洗浄した後、無水硫酸マグネシウム
で乾燥した。クロロホルムを減圧留去して、N−L−口
イシル−3−メチルチオ−プロピルアミドを得た。
収率: 1,589(70,5%)シロップ状〔α)2
3=+ 5 、8 (C= j、’ −EtCH()R
f=0.58(n−BuOH:AcOH:H20=4:
1:1) 実施例(23) N−L−口イシル−2−エチルチオエチルアミド (Leu−NHCHzCH28−CH2CH3)Boc
−Leu−OH(468g、20mM)、エチルチオエ
チルアミンHcl (2,849,20mM)をTHF
(50ml)に溶解して一5〜0℃でDCC(4,18
ji、20mM)のTHF(100m/り溶液を滴下し
て一晩攪拌した。生じたDCUの沈澱を除去して80℃
以下でTHFを留去し、残渣を酢酸エチル(300mJ
)に溶解した。酢酸エチル溶液を飽和NaHCO3、飽
和食塩水、lN−HCl飽和食塩水(各50m1)の順
に3回ずつ洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し
た。酢酸エチル溶液を減圧濃縮して得られた残渣をシリ
カゲルクロマトグラフィ(溶媒系;クロロホルム:酢酸
=1:1)により精製した。得られたBoc−Leu=
2−エチルチオエチルアミド(8,86,9,10mM
)に室温で2N−HCIの酢酸溶液(20ml)を加え
て1時間攪拌し、30℃以下で酢酸を留去した。残渣に
水(10+++/)を加えて不溶物を除き、冷lN−N
aOHでpHを約11に調節した。クロロホルム(50
ml)で3回抽出して、抽出液を合わせ、飽和食塩水(
50ml )で2回洗浄した後、無水硫酸マグネシウム
で乾燥した。クロロホルムを減圧留去して、N−L−ロ
イシル−2−エチルチオ−エチルアミドを得た。
収率: 1.70.9 (77、9%)シロップ状〔α
〕。=+2.4 (C=1.EzOH)Rf=0 60
(n−BuOH:AcOH:H20=4:1:1) 実施例(24) N−L−ロインルーn−オクチルアミド(HL e u
  NH(CH2)7 CH3>Boc−Leu−OH
2,829(10mM)、n−オクチ/I/ 7ミy 
1 、559 (12mM )、DCC2,07,9(
10mM)、T HF 75 miを用いて実施例17
と同様に行なってBoc−Leu −NH−(CH2)
7−CH33゜26.p(9,5mM)を得、さらに2
N−HClの酢酸溶液20m1を用いて、以下実施例1
7と同様にして保護基を脱離せしめ、N−L−ロインル
ーローオクチルアミドを得り。
収率: 2.009(80,9%)、シロップ状〔α)
20=+9.5 (C=l  O,EtOH,)Rf=
0.62(n  BuOH:AcOH:H20=4:1
:1) 実施例(25) N−L−口イシル−〇−デシルアミド (H−Le u −NH−(CH2) g−CH3)B
oc−Le u−OH2,8217(10m M )、
n−デンルアミ71.94g(12mM)、DCC20
7,9(10mM)、THP75mlを用いて実施例1
7と同様に行、なって、Boc−Leu−NH−(CH
2)g−CH3855g(96mM)を得、さらに2N
−HClの酢酸溶液を用いて保護基を脱離せしめ、N−
L−口イシル−〇−デシルアミドを得た。
収率; 1.62g(62,4%)シロップ状〔α)o
=+4.8 (C=1.0.EtOH)Rf=0.62
(n−BuOH:AcOH:H20=4:1:1) 実施例(26) N−L−ロイシル−ラウリルアミド (HLeu  NH(CH2)11  CH3)Boc
−Leu−OH2,829(10mM)、ラウリルアミ
ン2.229 (12mM)、DCC2,07g(10
mM)、THF75mlを用いて、実施例17と同様に
行なって、Bo c−Le u−NH(CH2)B−C
H3を得、さらに2N−)(C/の酢酸溶液20m1を
用いて保護基を脱離せしめ、N−L−ロイシル−ラウリ
ルアミドを得た。
収率: 1.66、g(58,5%) 融点二36〜88°C 〔α)23=+2  4 (C=1.EtOH)Rf 
= 0.65 (n−BuOH:AcOH:H20=4
:I:1) 参考例 I N−L−ロイシル−β−ヒドロキシフユネチルアミド、
アミンオキシダーゼを用いるLAP活性測定法 前記実施例11で得られたN−L−口イシル−β−ヒド
ロキシフエネルアミドを、0.1M−IJン酸Buff
er(pH70)に溶解して基質溶液(25m M )
とした。又、この基質溶液を用いて、以下の通りの組成
を有する溶液〔I〕を調製した。
0.1Mリン酸バッフ7−(pH7,0)     0
.1   m18rry/m14−7ミノアンチビリン
       0005m10.3% 3−メチル−N
−エチル−N(β−ヒドロキシエチル)N−エチルアニ
リン           0.05m10.5■/m
e  パーオキシダーゼ (7グマ社製、yype−1)      0.05 
 m12″5  mM  基質(N−L−口イシル−β
−ヒドロキシフェネチルアミド)          
        O,1m19.5U/ml  7ミン
オキシダーゼ(起源:Eurotiunchevali
eri  M2SO4:FERM−PNa5869  
特願昭56−24281)           0.
01  meloomM  MgCl2       
    0.025m1上記の組成の溶液CI)の1.
45m1へ、患者血清(A、B、C)50μlを加え、
37℃、10分間インキュベートせしめ、反応後、55
0nmの波長にて吸光度変化を測定した。
別に、LAP活性既知の血清(セラクリアN。
122G−41単位1日本商事社製)を用いて同様に操
作を行い、上記各血清中のLAP活性値を算出した。
その結果は、第1表に示す通りであった。
又、上記の測定法の比較として、既知のLAP活性測定
法(ヤトロン社製、イアトロセツ)LAPRM154−
K)によシ、上記の各血清を用いてそのLAP活性の測
定を行った。
その結果、第1表に示す通りであった。
この第1表に示す通り、本発明におけるN−L−ロイシ
ルーβ−ヒドロキシフエネチルアミトハへ血清中のL 
A P活性を適格にとらえる事の出来る良好な合成基質
であると認められる。
参考例 2 N−L−口イシル−2−エチルチオエチルアミド、アミ
ンオキシダーゼを用いるLAP活性測定法 前記実施例23で得られたN−L−ロインルー2〜エチ
ルチオエチルアミドを、0.IM−リン酸バッフ7−(
1))17.0)に溶解して基質腋液(25mM)とし
た。また、前記参考例1における基質N−L−oイシル
ーβ−ヒドロキシフエネルアミドの代りに、N−L−ロ
イシル−2−エチル−チオ−エチルアミドを含む上記基
質溶液を用いて、溶液Cl1Fを調製した。この溶液〔
10145m1を用いて前記参考例1記載と同様に患者
血清中のLAP活性を測定して第2表に示す結果を得だ
この第2表に示す通り、本発明におけるN−L−ロイシ
ル−2−エチルチオエチルアミドは、前記参考例1と同
様に人血清中のり、AP活性を適格にとらえる事の出来
る良好な合成基質であると認められる。また、他の合成
基質も同様の操作を行う事により、良好に測定する事が
できた。
明の物質の赤外線吸収スペクトル図を示す。
第1図:N−L−ロイシルフキネチルアミド第2図:N
−L−ロイシルフェニルプロピルアミド 第8図:N−L−ロイシル−P−メチルフェネチルアミ
ド 第4図:N−L−口イシル−P−メトキシフェネチルア
ミド 第5図: N−L−ロイシル−P−クロロフェネチルア
ミド 第6図: N−L−口イシル−P−ニトロフェネチルア
ミド 第7図:N−L−ロイシル−3,4−ジメトキ7フエネ
チルアミド塩酸塩 第8図: N−L−口イシル−3,4−ジヒドロキシフ
ェネチルアミド塩酸塩 第9図:N−L−ロイシル−P−ニトロペンシルアミド
塩酸塩 第10図二N−L−ロインルーβ−メチルフェネチルア
ミド 第11図:N−L−口イシル−β−ヒドロキシフェネチ
ルアミド 第12図:N−L−ロイシル−P−カルボキシフェネチ
ルアミド塩酸塩 第18図:N−L−口イシルベンジルアミド第14図:
N−L−口イシル−3−メトキシ−4−ヒドロキシベン
ジルアミド塩酸塩 第15図:N−L−口イシル−(2−P−ヒドロキシフ
ェニル−2−ヒドロキシ)−エチルアミド塩酸塩 第16図:N−L−ロイシル−P−スルホンアミド−ベ
ンジルアミド 第17図:N−L−口イシル−インアミルアミド第18
図二N−L−ロイシル−3−メチルチオ−プロピルアミ
ド 第19図:N−L−ロイシル−2−エチルチオ−エチル
アミド

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)下記一般式   (1) (ただし、式中X1  は結合基、または置換基を有し
    てもよいアルキレン基、X2 はフェニル基、置換フェ
    ニル基、低級アルキル基、−COOHl−803H,ま
    たは低級アルキルチオ基よりなる置換基を示す)で表わ
    される化合物、またはその塩。
  2. (2)下記一般式   (II) (ただし、式中X1  は結合基、または、−CHsま
    たは一〇H基よりなる置換基を有してもよい低級アルキ
    レン基、R1は水素、−CH3、−0CH3、−CI、
    −No□、−0’Hまたは−COOH基、R2は水素、
    −0CH3または−OH基を示す)で表わされる特許請
    求の範囲第1項記載の化合物、またはその塩。
  3. (3)  下記一般式   (II) (ただし、XI  はX3  と結合してアルキル基を
    示し、または、XI  は結合基またはアルキレン基、
    X3  は−COOH,−803)ル、まだは低級アル
    キルチオ基を示す)で表わされる特許請求の範囲第1項
    記載の化合物またはその塩。
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JPS5113806A (ja) * 1974-07-24 1976-02-03 Tanabe Seiyaku Co Kosankazai

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