JPS592278B2 - ロイシンアミノペプチダ−ゼ活性の測定法 - Google Patents
ロイシンアミノペプチダ−ゼ活性の測定法Info
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- JPS592278B2 JPS592278B2 JP4608580A JP4608580A JPS592278B2 JP S592278 B2 JPS592278 B2 JP S592278B2 JP 4608580 A JP4608580 A JP 4608580A JP 4608580 A JP4608580 A JP 4608580A JP S592278 B2 JPS592278 B2 JP S592278B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
- C07C271/06—Esters of carbamic acids
- C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
- C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
- C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
- C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
- C07D209/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D209/20—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals substituted additionally by nitrogen atoms, e.g. tryptophane
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はロイシンアミノペプチターゼ活性の測定法に関
する。
する。
ロイシンアミノペプチターゼとは常用基であり、正式に
は、Ｌ−ロイシル−ペプチド・ヒドロラーゼ（Ｌ−Ｌ
ｅｕｃｙｌ −ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
１酵素番号Ｅ Ｃ３ｊ ４ ｔ １ ｔ １ ；酵素ハ
ンドブック第４９６頁、昭和４１年以下ＬＡＰと略す）
である。
は、Ｌ−ロイシル−ペプチド・ヒドロラーゼ（Ｌ−Ｌ
ｅｕｃｙｌ −ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
１酵素番号Ｅ Ｃ３ｊ ４ ｔ １ ｔ １ ；酵素ハ
ンドブック第４９６頁、昭和４１年以下ＬＡＰと略す）
である。
ＬＡＰは、近年臨床的に主にミクロゾーム由来のＬＡＰ
と細胞由来のＬＡＰとに大別され、また生体内のあらゆ
る組織に広く分布し、薄情中にも存在するもので、病的
条件によって増加することが知られている。
と細胞由来のＬＡＰとに大別され、また生体内のあらゆ
る組織に広く分布し、薄情中にも存在するもので、病的
条件によって増加することが知られている。
即ち、肝実質障害、肝の細胆管を含む肝汁流出阻害、糖
尿病、腎炎、癌、妊娠において、ＬＡＰ活性は増加する
もので、ＬＡＰ活性の測定は、これら病変の診断および
予後の観察に必要な臨床検査の対象となっている。
尿病、腎炎、癌、妊娠において、ＬＡＰ活性は増加する
もので、ＬＡＰ活性の測定は、これら病変の診断および
予後の観察に必要な臨床検査の対象となっている。
ＬＡＰの臨床化学的分析値としては、Ｇ−Ｒ単位（Ｇｏ
ｌｄ−ｂａｒｇ Ｒｕｔｅｎｂｕｒｇ ）を使用し、Ｇ
−Ｒ単位＝２．７２ＸＬＡＰ国際単位（ｍＵ、／ｍｉ）
としている（Ｃａｎ−ｃｅｒ、１１．２８３（１９５８
）、分析ライブラリー、第３巻、臨床化学分析、■、第
１１７〜１３１頁〕。
ｌｄ−ｂａｒｇ Ｒｕｔｅｎｂｕｒｇ ）を使用し、Ｇ
−Ｒ単位＝２．７２ＸＬＡＰ国際単位（ｍＵ、／ｍｉ）
としている（Ｃａｎ−ｃｅｒ、１１．２８３（１９５８
）、分析ライブラリー、第３巻、臨床化学分析、■、第
１１７〜１３１頁〕。
ＬＡＰの正常値としては、薄情では男女上も７０〜２０
０Ｇ−Ｒ単位、尿（２４時Ｍ）では男５０〜１７５Ｇ−
Ｒ単位、女２０〜７０Ｇ−Ｒ単位であり、この数値が増
加すると危険である。
０Ｇ−Ｒ単位、尿（２４時Ｍ）では男５０〜１７５Ｇ−
Ｒ単位、女２０〜７０Ｇ−Ｒ単位であり、この数値が増
加すると危険である。
ＬＡＰ活性の測定法としては種々知られているがいずれ
も一長一短があり、現在、一般に用いられている測定法
としては、Ｌ−ロイシンとアミン化合物よりなる合成基
質を用いてＬＡＰの酵素作用により生成されるアミン化
合物の比色定量法である。
も一長一短があり、現在、一般に用いられている測定法
としては、Ｌ−ロイシンとアミン化合物よりなる合成基
質を用いてＬＡＰの酵素作用により生成されるアミン化
合物の比色定量法である。
この比色定量法における合成基質を用いる場合には、そ
Ｄ合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ −ニトロアニリド
を用い、ＬＡＰの酵素作用にて生成するｐ−二トロアニ
リンの黄色を比色してなるもので、しかしこの比色定量
ｌこ当っては、その合成基質とｐ−ニトロアニリンとの
比色の際の測定波長がオーバーラツプする欠点があり、
また薄情成分、特にビリルビン系色素による測定への影
響も免れることができない欠点があった。
Ｄ合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ −ニトロアニリド
を用い、ＬＡＰの酵素作用にて生成するｐ−二トロアニ
リンの黄色を比色してなるもので、しかしこの比色定量
ｌこ当っては、その合成基質とｐ−ニトロアニリンとの
比色の際の測定波長がオーバーラツプする欠点があり、
また薄情成分、特にビリルビン系色素による測定への影
響も免れることができない欠点があった。
さらにＬ−ロイシル−β−ナフチルアミドを基質として
用いる場合には、生成するβ−ナフチルアミンに、５−
ニトロ−２−アミノメトキシベンゼンジアゾテートなど
をカップリングさせて色素を形成させるか、または生成
するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化
し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンにカップ
リングさせるか、もしくはｐ−ジメチルアミノベンズア
ルデヒドまたはｐ−ジメチルアミノケイ皮アルデヒドを
縮合させて色素を形成せしめ、次いでこれを比色定量し
てなる方法である。
用いる場合には、生成するβ−ナフチルアミンに、５−
ニトロ−２−アミノメトキシベンゼンジアゾテートなど
をカップリングさせて色素を形成させるか、または生成
するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化
し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンにカップ
リングさせるか、もしくはｐ−ジメチルアミノベンズア
ルデヒドまたはｐ−ジメチルアミノケイ皮アルデヒドを
縮合させて色素を形成せしめ、次いでこれを比色定量し
てなる方法である。
しかしこれらの比色定量法は、反応過程が複雑で、かつ
厳密な操作を必要とするために、検査法としてはなお不
便なものであった。
厳密な操作を必要とするために、検査法としてはなお不
便なものであった。
また標準物質たるβ−ナフチルアミンは、毒性が著しく
、特に近年膀胱の腫瘍および癌を発生することが明らか
となり、発癌物質としてその使用に特に厳密な注意を要
するものであった。
、特に近年膀胱の腫瘍および癌を発生することが明らか
となり、発癌物質としてその使用に特に厳密な注意を要
するものであった。
その他、酵素を用いてなるＬＡＰ活性の測定法としては
、その基質としてＬ−ロイシナミド（Ｌ−Ｌｅｕｃ−ｉ
ｎａｍｉｄｅ）を用い、ＬＡＰにより生成したアンモニ
アを、α−ケトゲルタール酸、グルタミン酸脱水素酵素
および還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ２）と反応せしめてグルタミン酸に変化せしめ、この
際に反応系のＮＡＤＨ２の減少を分光学的に追跡する方
法が知られている。
、その基質としてＬ−ロイシナミド（Ｌ−Ｌｅｕｃ−ｉ
ｎａｍｉｄｅ）を用い、ＬＡＰにより生成したアンモニ
アを、α−ケトゲルタール酸、グルタミン酸脱水素酵素
および還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ２）と反応せしめてグルタミン酸に変化せしめ、この
際に反応系のＮＡＤＨ２の減少を分光学的に追跡する方
法が知られている。
またＬ−ロイシル−Ｌ−アラニンを基質として用いた場
合には、ＬＡＰの作用により生じたＬ−アラニンを、α
−ケトグルクール酸、グルタミン酸−ピルピン酸−トラ
ンスアミナーゼを用いて反応せしめ、ピルビン酸を生成
させ、さらにこのピルビン酸を乳酸脱水酵素を用いて乳
酸に変化せしめ、その際に消費されるＮＡＤＨ２を分光
学的に追跡する方法も知られている。
合には、ＬＡＰの作用により生じたＬ−アラニンを、α
−ケトグルクール酸、グルタミン酸−ピルピン酸−トラ
ンスアミナーゼを用いて反応せしめ、ピルビン酸を生成
させ、さらにこのピルビン酸を乳酸脱水酵素を用いて乳
酸に変化せしめ、その際に消費されるＮＡＤＨ２を分光
学的に追跡する方法も知られている。
さらにＬ−ロイシン脱水素酵素を用いる測定法も知られ
ている。
ている。
即ち、Ｌ−ロイシル−クリシンなどの基質を用いて、Ｌ
ＡＰにより生成したし一ロイシンを、Ｌ−ロイシン脱水
素酵素を用いて、反応させ、その際に変化するＮＡＤＨ
２を分光学的に測定してなる方法である。
ＡＰにより生成したし一ロイシンを、Ｌ−ロイシン脱水
素酵素を用いて、反応させ、その際に変化するＮＡＤＨ
２を分光学的に測定してなる方法である。
（特開昭５４−１１９２９０号）。
また、Ｌ−ロイシナミドを基質として用い、生成するＬ
−ロイシンをＬ−アミノ酸酸化酵素を用いて反応させ、
反応系に生ずる過酸化水素を比色定量してなる測定法も
知られている〔ファルマシア、１４．８７２（１９７８
））。
−ロイシンをＬ−アミノ酸酸化酵素を用いて反応させ、
反応系に生ずる過酸化水素を比色定量してなる測定法も
知られている〔ファルマシア、１４．８７２（１９７８
））。
しかしながら、これらの酵素を用いてなる測定法は、反
応系が複雑であり、かつ比色による測定法であるために
、血清中のビリルビン系色素などや乳濁薄情などの白濁
の影響も大きく、そのために必ずブランクを取らねばな
らず、特にＬ−アミノ酸酸化酵素を用いる測定法におい
ては、ＬＡＰによって生成するし一ロイシンの量に比べ
て相当量のし一アミノ酸が血清中に存在しており、かつ
この血清中のし一アミノ酸含量も栄養剤や食事等の摂取
により著しく変化しているために、ＬＡＰによるし一ロ
イシンの定量には血清中の多量のＬ−アミノ酸の影響が
著しく強く現われ、ＬＡＰよりのし一ロイシンの定量が
著しく困難である、等の欠点があった。
応系が複雑であり、かつ比色による測定法であるために
、血清中のビリルビン系色素などや乳濁薄情などの白濁
の影響も大きく、そのために必ずブランクを取らねばな
らず、特にＬ−アミノ酸酸化酵素を用いる測定法におい
ては、ＬＡＰによって生成するし一ロイシンの量に比べ
て相当量のし一アミノ酸が血清中に存在しており、かつ
この血清中のし一アミノ酸含量も栄養剤や食事等の摂取
により著しく変化しているために、ＬＡＰによるし一ロ
イシンの定量には血清中の多量のＬ−アミノ酸の影響が
著しく強く現われ、ＬＡＰよりのし一ロイシンの定量が
著しく困難である、等の欠点があった。
本発明者らは、かかる欠点を有する従来のＬＡＰ活性の
測定法を改善すべく鋭意研究した結果、全く意外にも、
血清中に存在しない置換メチルアミン化合物またはＤ−
アミノ酸化合物をＬ−ロイシンに結合せしめて得られる
合成基質はＬＡＰにより著しく良好に置換メチルアミン
化合物、Ｄ−アミノ酸を生成せしめ得ることを知り、さ
らにこの合成基質にＬＡＰを作用せしめて、生成するこ
の置換メチルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物を
、対応するその酸化酵素にて作用せしめ、次いで反応ζ
こよって消費される酸素または生成される過酸化水素の
量を測定し、よってＬＡＰ活性の測定を行なうこきζこ
より、従来の如き複雑な方法を行なうことのない簡便か
つ良好な再現性を示す優れたＬＡＰ活性の新規な測定法
を見い出した。
測定法を改善すべく鋭意研究した結果、全く意外にも、
血清中に存在しない置換メチルアミン化合物またはＤ−
アミノ酸化合物をＬ−ロイシンに結合せしめて得られる
合成基質はＬＡＰにより著しく良好に置換メチルアミン
化合物、Ｄ−アミノ酸を生成せしめ得ることを知り、さ
らにこの合成基質にＬＡＰを作用せしめて、生成するこ
の置換メチルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物を
、対応するその酸化酵素にて作用せしめ、次いで反応ζ
こよって消費される酸素または生成される過酸化水素の
量を測定し、よってＬＡＰ活性の測定を行なうこきζこ
より、従来の如き複雑な方法を行なうことのない簡便か
つ良好な再現性を示す優れたＬＡＰ活性の新規な測定法
を見い出した。
特に、酸化酵素の作用による消費される酸素または生成
される過酸化水素の量の測定において、過酸化水素の量
の測定の場合にルミノールなどによる発光法を用いるこ
とにより薄情中の有色物質などの影響を受けることなく
測定できさらに酸素電極または過酸化水素電極、またそ
れらの酵素電極を用いるこさにより有色物質の影響を全
く受けることなく、かつ著しく簡便かつ正確に、さらに
短時間にて良好に測定し得る極めて好ましい測定法であ
ることを見い出した。
される過酸化水素の量の測定において、過酸化水素の量
の測定の場合にルミノールなどによる発光法を用いるこ
とにより薄情中の有色物質などの影響を受けることなく
測定できさらに酸素電極または過酸化水素電極、またそ
れらの酵素電極を用いるこさにより有色物質の影響を全
く受けることなく、かつ著しく簡便かつ正確に、さらに
短時間にて良好に測定し得る極めて好ましい測定法であ
ることを見い出した。
また、本発明の合成基質は、特にＬＡＰに良好に作用を
受け、薄情内に共存するアミノペプチターゼの作用は受
は難いために、ＬＡＰ活性の測定において著しく正確に
測定できるものであった。
受け、薄情内に共存するアミノペプチターゼの作用は受
は難いために、ＬＡＰ活性の測定において著しく正確に
測定できるものであった。
本発明は上記の知見に基いて完成されたもので下記一般
式〔■〕 １３＼ （ただし式中 ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＯ−は／ Ｈ３Ｉ ＮＨ２ Ｌ−ロイシル基、Ｒは置換メチルアミノ基またはＤ−ア
ミノ酸残基を示す。
式〔■〕 １３＼ （ただし式中 ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＯ−は／ Ｈ３Ｉ ＮＨ２ Ｌ−ロイシル基、Ｒは置換メチルアミノ基またはＤ−ア
ミノ酸残基を示す。
）で表わされるＬ−ロイシル−アミド化合物またはその
可溶性塩を基質とし、これにＬＡＰ活性測定用試料を作
用せしめた後、反応生成物たる置換メチルアミン化合物
またはＤ−アミノ酸化合物に対応する酸化酵素を作用せ
しめ、次いで反応によって消費される酸素または生成さ
れる過酸化水素の量を測定することを特徴とするＬＡＰ
活性測定法である。
可溶性塩を基質とし、これにＬＡＰ活性測定用試料を作
用せしめた後、反応生成物たる置換メチルアミン化合物
またはＤ−アミノ酸化合物に対応する酸化酵素を作用せ
しめ、次いで反応によって消費される酸素または生成さ
れる過酸化水素の量を測定することを特徴とするＬＡＰ
活性測定法である。
まず、本発明に用いられる基質としては、Ｌ−ロイシン
と置換メチルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物と
を結合せしめて得られる一般式（１）で表わされるし一
ロイシルーアミド化合物で、詳しくは下記一般式〔■〕 （ただし、式中、 はＬ−ロイシル基、−ＮＨ−’ｃＨ；二は置換メチルア
ミノ基またはＤ−アミノ酸残基を示し、置換メチルアミ
ン基の場合にはＲ１またはＲ２のいずれか一方は水素原
子を示し、他は有機残基を示し、Ｄ−アミノ酸残基の場
合にはＲ１またはＲ２のいずれか一方はカルボキシル基
を示し、他方は有機残基を示し、Ｃ※はＤ型不整炭素を
示す）で表わされるし一ロイシルーアミド化合物であり
、測定反応系の媒体に可溶性のものであればよい。
と置換メチルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物と
を結合せしめて得られる一般式（１）で表わされるし一
ロイシルーアミド化合物で、詳しくは下記一般式〔■〕 （ただし、式中、 はＬ−ロイシル基、−ＮＨ−’ｃＨ；二は置換メチルア
ミノ基またはＤ−アミノ酸残基を示し、置換メチルアミ
ン基の場合にはＲ１またはＲ２のいずれか一方は水素原
子を示し、他は有機残基を示し、Ｄ−アミノ酸残基の場
合にはＲ１またはＲ２のいずれか一方はカルボキシル基
を示し、他方は有機残基を示し、Ｃ※はＤ型不整炭素を
示す）で表わされるし一ロイシルーアミド化合物であり
、測定反応系の媒体に可溶性のものであればよい。
またＬ−ロイシル−アミド化合物において、その置換メ
チルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物としては特
ζこ限定されるものではなく、例えばエチルアミン、ｎ
−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、１ｓｏ−ブチル
アミン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、チラ
ミン、３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン、ヒ
スタミン、トリプタミン、ベンジルアミン、Ｄ−メチオ
ニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−フェニルグリ
シンなどが挙られ、具体例としては、Ｌ−ロイシル−ベ
ンジルアミド、Ｌ−ロイシル−チラミン、Ｌ−ロイシル
−ｎ−ブチルアミドなどのＬ−ロイシンと置換メチルア
ミン化合物よりなる化合物、Ｌ−ロイシル−Ｄ−メチオ
ニン、Ｌ−ロイシル−Ｄ−ロイシンなどのＬ−ロイシン
とＤ−アミノ酸化合物よりなる化合物が挙られ、これは
適宜塩酸塩、リン酸塩、酢酸塩などの可溶性塩として使
用してもよい。
チルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物としては特
ζこ限定されるものではなく、例えばエチルアミン、ｎ
−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、１ｓｏ−ブチル
アミン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、チラ
ミン、３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン、ヒ
スタミン、トリプタミン、ベンジルアミン、Ｄ−メチオ
ニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−フェニルグリ
シンなどが挙られ、具体例としては、Ｌ−ロイシル−ベ
ンジルアミド、Ｌ−ロイシル−チラミン、Ｌ−ロイシル
−ｎ−ブチルアミドなどのＬ−ロイシンと置換メチルア
ミン化合物よりなる化合物、Ｌ−ロイシル−Ｄ−メチオ
ニン、Ｌ−ロイシル−Ｄ−ロイシンなどのＬ−ロイシン
とＤ−アミノ酸化合物よりなる化合物が挙られ、これは
適宜塩酸塩、リン酸塩、酢酸塩などの可溶性塩として使
用してもよい。
さらに上記の合成基質からＬＡＰの作用により生成され
る置換メチルアミン化合物やＤ−アミノ酸化合物に対応
する酸化酵素としては、これらの置換メチルアミン化合
物またはＤ−アミノ酸化合物を基質として、反応におい
て、少なくとも酸素を消費し、過酸化水素を生成する酵
素であればよく、例えば置換メチルアミン化合物の場合
にはアミンオキシダーゼ（モノアミンオキシダーゼ、ジ
アミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ）が挙ら
れ、Ｄ−アミノ酸化合物の場合にはＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼが挙られる。
る置換メチルアミン化合物やＤ−アミノ酸化合物に対応
する酸化酵素としては、これらの置換メチルアミン化合
物またはＤ−アミノ酸化合物を基質として、反応におい
て、少なくとも酸素を消費し、過酸化水素を生成する酵
素であればよく、例えば置換メチルアミン化合物の場合
にはアミンオキシダーゼ（モノアミンオキシダーゼ、ジ
アミンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ）が挙ら
れ、Ｄ−アミノ酸化合物の場合にはＤ−アミノ酸オキシ
ダーゼが挙られる。
またこれらの酸化酵素としては、限定されるものではな
いが、モノアミンオキシダーゼとしては例えば豚や牛薄
情またはアスペルギルス・ニガーなどより得られた酵素
、チラミンオキシダーゼとしては例えばサルシナ・ルテ
ア・ＩＡＭ１０９９より得られた酵素（Ｂｉｏｃｈｅｍ
＋ −Ｂ １ｏｐｈｙｓ−Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｎ−２７ｔ
３５０（１９６７）、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １７ 。
いが、モノアミンオキシダーゼとしては例えば豚や牛薄
情またはアスペルギルス・ニガーなどより得られた酵素
、チラミンオキシダーゼとしては例えばサルシナ・ルテ
ア・ＩＡＭ１０９９より得られた酵素（Ｂｉｏｃｈｅｍ
＋ −Ｂ １ｏｐｈｙｓ−Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｎ−２７ｔ
３５０（１９６７）、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １７ 。
７２２’（１９７１））、さらにＤ−アミノ酸オキシダ
ーゼとしては例えば動物由来の酵素やトリコツプシス・
パリアビリスなどより得られた酵素が挙られ、これらは
摂取したものでもよく、市販されているものであっても
よい。
ーゼとしては例えば動物由来の酵素やトリコツプシス・
パリアビリスなどより得られた酵素が挙られ、これらは
摂取したものでもよく、市販されているものであっても
よい。
さらにこれらの酸化酵素は固定化酵素として使用しても
よい。
よい。
この場合には、自動分析装置へ組み込んで測定を行なう
ことが可能となり、酵素電極や過酸化水素電極にて測定
を行なうことにより、有用かつ高価な酵素の使用を著し
く少量ならしめるため特に有効である。
ことが可能となり、酵素電極や過酸化水素電極にて測定
を行なうことにより、有用かつ高価な酵素の使用を著し
く少量ならしめるため特に有効である。
さらに酵素電極たる固定化酵素と上記電極とを組み合わ
せたセンサーとして用いることにより、迅速に、しかも
種々の試薬も必要とせず、さらに繰り返し測定に利用で
き、さらにまた有色物質を含むＬＡＰ活性測定用試料に
も適用できるために啄めて有効なものとなる。
せたセンサーとして用いることにより、迅速に、しかも
種々の試薬も必要とせず、さらに繰り返し測定に利用で
き、さらにまた有色物質を含むＬＡＰ活性測定用試料に
も適用できるために啄めて有効なものとなる。
またこの固定化酵素となすに当っては、公知の種種の固
定化手段が使用できるもので、好ましくは、アクリルア
ミドで包括固定化する方法、アルブミンなどの蛋白質と
共に混合した後、蛋白質同士を架橋して固定化する方法
、コラーゲンやフィブロインなどに包括するか、または
これを共有結合せしめて固定化する方法、多孔性有機高
分子樹脂に吸着または共有結合にて固定化する方法、光
硬化性樹脂を用いて包括固定化する方法などの種々の包
括、吸着、結合等の手段が用いられ、その固定化酵素の
形状としては、酵素電極用の形として使用に好ましい膜
状繊維状物、粒状またはチューブ状として加工使用され
る。
定化手段が使用できるもので、好ましくは、アクリルア
ミドで包括固定化する方法、アルブミンなどの蛋白質と
共に混合した後、蛋白質同士を架橋して固定化する方法
、コラーゲンやフィブロインなどに包括するか、または
これを共有結合せしめて固定化する方法、多孔性有機高
分子樹脂に吸着または共有結合にて固定化する方法、光
硬化性樹脂を用いて包括固定化する方法などの種々の包
括、吸着、結合等の手段が用いられ、その固定化酵素の
形状としては、酵素電極用の形として使用に好ましい膜
状繊維状物、粒状またはチューブ状として加工使用され
る。
次いでＬＡＰ活性測定を行なうに当って例示すれば、ま
ず合成基質の一定濃度溶液を調整し、これ古、ＬＡＰ活
性測定用試料、例えば薄情、および緩衝液を加えて反応
せしめる。
ず合成基質の一定濃度溶液を調整し、これ古、ＬＡＰ活
性測定用試料、例えば薄情、および緩衝液を加えて反応
せしめる。
反応に当っては通常３７°Ｃ近辺に行なえばよく、反応
時間としてはＬＡＰにより合成基質からアミン化合物ま
たはＤ−アミノ酸化合物が生成される時間であれば特に
限定されるものではない。
時間としてはＬＡＰにより合成基質からアミン化合物ま
たはＤ−アミノ酸化合物が生成される時間であれば特に
限定されるものではない。
次いで反応後、ＬＡＰにより生じた置換メチルアミン化
合物またはＤ −アミノ酸化合物を対応する酸化酵素に
より酸化せしめるものであるが、その際反応終了液と対
応する酸化酵素が反応し、それによって酸素が消費され
、また過酸化水素が生成されればよいものであって、通
常対応する酸化酵素の溶液を添加して反応せしめるか、
また対応する酸化酵素の固定化酵素に接触せしめて反応
を進行せしめればよく、さらに通常３７ｔ近辺Ｏこて行
なわれる。
合物またはＤ −アミノ酸化合物を対応する酸化酵素に
より酸化せしめるものであるが、その際反応終了液と対
応する酸化酵素が反応し、それによって酸素が消費され
、また過酸化水素が生成されればよいものであって、通
常対応する酸化酵素の溶液を添加して反応せしめるか、
また対応する酸化酵素の固定化酵素に接触せしめて反応
を進行せしめればよく、さらに通常３７ｔ近辺Ｏこて行
なわれる。
反応後、消費される酸素または生成される過酸化水素の
量は、好ましくは酸素電極または過酸化水素電極にて測
定されるもので、さらに上記固定化酵素と電極とを組み
合せてなる酵素電極として使用することによってより簡
便に行なわれる。
量は、好ましくは酸素電極または過酸化水素電極にて測
定されるもので、さらに上記固定化酵素と電極とを組み
合せてなる酵素電極として使用することによってより簡
便に行なわれる。
さらにこれらの電極によって測定された値は電気的変化
として、必要に応じて記録するか表示し、ＬＡＰ活性値
として換算すればよい。
として、必要に応じて記録するか表示し、ＬＡＰ活性値
として換算すればよい。
また上記過酸化水素の量に当って、ルミノールなどの発
光試薬を用いて定量してもよく、適量公知の種々の過酸
化水素の定量手段を用いてもよい。
光試薬を用いて定量してもよく、適量公知の種々の過酸
化水素の定量手段を用いてもよい。
またＬＡＰ活性測定のための系としては、例えば、ＬＡ
Ｐ活性測定用試料、合成基質溶液、反応媒体たる緩衝液
の注入口を、合成基質より置換メチルアミン化合物また
はＤ−アミノ酸化合物を生成せしめるためのＬＡＰ反応
槽に導き、さらに反応によって生成したアミン化合物ま
たはＤ−アミノ酸を対応する酸化酵素にて作用せしめ、
酸素または過酸化水素の量を検出してなる反応−検出槽
を有する測定系を設ければよく、また好ましくは、その
反応−検出槽において、対応する酸化酵素の固定化酵素
カラム部と検出のための電極部とに分離してもよく、ま
たは電極部の検知部にその固定化酵素を具備した酵素電
極部として一体化せしめたものであってもよい。
Ｐ活性測定用試料、合成基質溶液、反応媒体たる緩衝液
の注入口を、合成基質より置換メチルアミン化合物また
はＤ−アミノ酸化合物を生成せしめるためのＬＡＰ反応
槽に導き、さらに反応によって生成したアミン化合物ま
たはＤ−アミノ酸を対応する酸化酵素にて作用せしめ、
酸素または過酸化水素の量を検出してなる反応−検出槽
を有する測定系を設ければよく、また好ましくは、その
反応−検出槽において、対応する酸化酵素の固定化酵素
カラム部と検出のための電極部とに分離してもよく、ま
たは電極部の検知部にその固定化酵素を具備した酵素電
極部として一体化せしめたものであってもよい。
さらに、ＬＡＰ反応槽と反応−検出槽とは対の系に限定
されるものではなく、例えば複数のＬＡＰ反応槽よりサ
ンプリング装置にて順次反応−検出槽に注入し、順次検
出、洗浄を繰り返してなる２以上のＬＡＰ反応槽と反応
−検出槽を有する測定系であってもよい。
されるものではなく、例えば複数のＬＡＰ反応槽よりサ
ンプリング装置にて順次反応−検出槽に注入し、順次検
出、洗浄を繰り返してなる２以上のＬＡＰ反応槽と反応
−検出槽を有する測定系であってもよい。
なお、後述各実施例においては酸素電極による測定系を
例示しているが、本発明においてはその酸素電極の代り
に過酸化水素電極を用いることにより同様に良好になし
得ることは言うまでもないことであろう。
例示しているが、本発明においてはその酸素電極の代り
に過酸化水素電極を用いることにより同様に良好になし
得ることは言うまでもないことであろう。
このようにしてなる本発明のＬＡＰ活性の測定法は、極
めて簡便にて、迅速に、さらに再現性も良好な測定法で
あり、診断上極めて有用な測定法である。
めて簡便にて、迅速に、さらに再現性も良好な測定法で
あり、診断上極めて有用な測定法である。
次に、本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に述
べるが、本発明はこれらによって何んら限定されるもの
ではない。
べるが、本発明はこれらによって何んら限定されるもの
ではない。
実施例 １
（Ｌ−ロイシル−ベンジルアミド、アミンオキシダーゼ
を用いるＬＡＰ活性活性活 性９５９５御 ＭＩＪＭすン酸緩衝液７．０）１ｍを、酵素電極を具備
した反応槽ζこ加えた。
を用いるＬＡＰ活性活性活 性９５９５御 ＭＩＪＭすン酸緩衝液７．０）１ｍを、酵素電極を具備
した反応槽ζこ加えた。
次いでこれに各濃度のＬＡＰ（ベーリンガー社製）含有
試料（５０Ｕ、４Ａ１１００Ｕ／ｍｌ！、 １５０Ｕ／
ｍＡ、 ２００Ｕ、４Ａ、 ２５０ Ｕ／ｍｌ！ ）
５０μ４を加え、攪拌下、３７°Ｃ１１５分間反応せし
めた。
試料（５０Ｕ、４Ａ１１００Ｕ／ｍｌ！、 １５０Ｕ／
ｍＡ、 ２００Ｕ、４Ａ、 ２５０ Ｕ／ｍｌ！ ）
５０μ４を加え、攪拌下、３７°Ｃ１１５分間反応せし
めた。
反応後、アミンオキシダーゼ（２Ｕ／ｍｌ、マイルス社
製）５０μｌを加え、３７℃にて１分後、ＬＡＰにより
生成されたベンジルアミンを酸化させ、反応ζこよって
消費される酸素の減少量を具備した酸素電極にて電流変
化値として測定した。
製）５０μｌを加え、３７℃にて１分後、ＬＡＰにより
生成されたベンジルアミンを酸化させ、反応ζこよって
消費される酸素の減少量を具備した酸素電極にて電流変
化値として測定した。
その結果、第１図に示す通りで、得られた電流変化値と
ＬＡＰ活性値との間に比例関係が成立するもので、即ち
、電流変化値を測定することにより良好（こＬＡＰ活性
を測定し得ることが判った。
ＬＡＰ活性値との間に比例関係が成立するもので、即ち
、電流変化値を測定することにより良好（こＬＡＰ活性
を測定し得ることが判った。
実施例 ２
〔Ｌ−ロイシル−チラミン、チラミンオキシダーゼを用
いるＬＡＰ活性活性活 性族例１における基質溶液および酵素の代りに、５０ｍ
ＭＬ−ロイシル−チラミンの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）ｌｙｄ、およびチラミンオキシダーゼ（３’
［Ｊ／ｙｄ、サルシナ・ルテアＩＡＭ１０９９より採取
）５０μ４を用いて、以下実施例１と同様に行なって、
ＬＡＰ活性の測定を行なった。
いるＬＡＰ活性活性活 性族例１における基質溶液および酵素の代りに、５０ｍ
ＭＬ−ロイシル−チラミンの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）ｌｙｄ、およびチラミンオキシダーゼ（３’
［Ｊ／ｙｄ、サルシナ・ルテアＩＡＭ１０９９より採取
）５０μ４を用いて、以下実施例１と同様に行なって、
ＬＡＰ活性の測定を行なった。
その結果、第２図に示す通りで、良好にＬＡＰ活性を測
定し得るものであった。
定し得るものであった。
実施例 ３
（Ｌ−ロイシル−Ｄ−メチオニン、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼを用いるＬＡＰ活性測定〕実施例１における基質
溶液および酵素の代りに、５０ｍＭＬ−ロイシル−〇ー
メチオニンの０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
１ｍｌ、およびＤ−アミノオキシダーゼ（１１，５Ｕ／
ｄ、ベーリンガー社製）１０μ４を用いて、以下実施例
１と同様に行なって、ＬＡＰ活性の測定を行なった。
ダーゼを用いるＬＡＰ活性測定〕実施例１における基質
溶液および酵素の代りに、５０ｍＭＬ−ロイシル−〇ー
メチオニンの０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
１ｍｌ、およびＤ−アミノオキシダーゼ（１１，５Ｕ／
ｄ、ベーリンガー社製）１０μ４を用いて、以下実施例
１と同様に行なって、ＬＡＰ活性の測定を行なった。
その結果、第３図に示す通りで、良好にＬＡＰ活性を測
定し得るものであった。
定し得るものであった。
実施例 ４
（Ｌ−ロイシル−ｎ−ブチルアミド、アミンオキシダー
ゼを用いるＬＡＰ活性活性測 定族、ＬＡＰ活性測定系のためのフローダイヤグラムを
第４図に示す。
ゼを用いるＬＡＰ活性活性測 定族、ＬＡＰ活性測定系のためのフローダイヤグラムを
第４図に示す。
即ち、ＬＡＰ活性測定用試料の注入口１および基質溶液
２をＬＡＰ反応槽３に導入し、その際ＬＡＰ活性測定用
試料はマイクロピペットやオートサンプラー等にて注入
すればよく、また基質溶液は定量ポンプ４にて送られる
もので、反応：終了後、反応液は、固定化酵素含有カラ
ム５に送られ、その際緩衝液槽６が定量ポンプ７により
送られる。
２をＬＡＰ反応槽３に導入し、その際ＬＡＰ活性測定用
試料はマイクロピペットやオートサンプラー等にて注入
すればよく、また基質溶液は定量ポンプ４にて送られる
もので、反応：終了後、反応液は、固定化酵素含有カラ
ム５に送られ、その際緩衝液槽６が定量ポンプ７により
送られる。
さらに固定化酵素カラムを通過した液は、酵素反応によ
って消費された酸素または生成された過酸化水素の量を
測定するための酸素電極または過酸化水素電極等の電極
８を具備するフローセル９に導き、これらを恒温槽１０
ζこて一定温度に保持せしめる。
って消費された酸素または生成された過酸化水素の量を
測定するための酸素電極または過酸化水素電極等の電極
８を具備するフローセル９に導き、これらを恒温槽１０
ζこて一定温度に保持せしめる。
次いで、その電極による電気的変化を増巾器１１を介し
て記録計１２にて記録せしめるか、デジタルメーター１
３、デジタル記録計１４を具備せしめて記録せしめるも
のである。
て記録計１２にて記録せしめるか、デジタルメーター１
３、デジタル記録計１４を具備せしめて記録せしめるも
のである。
上記フローダイヤグラムにおいて、その基質溶液として
５０ｍＭＬ−ロイシル−ｎ−ブチルアミドの０．１ Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い、ＬＡＰ活性測定用
試料として各種濃度のＬＡＰ含有試料（５０Ｕ／麻、
１００Ｕ／７７１７１！、 １５０Ｕ／ｍｌ、 ２００
Ｕ／ｒｒＬｌ、 ２５０ＴＩＪ／ｙｄ）を用い、さらに
固定化酵素カラムとしてはアミンオキシダーゼを多孔性
高分子樹脂（アミン基含有ポリアクリロニトリル繊維を
担体とし、架橋斉拮してグルタルアルデヒドを使用；英
国特許第２１５００１号参照）に共有結合せしめてなる
アミンオキシダーゼ固定化酵素（１５Ｕ／ｇ担体）１０
０■含有のカラム（２，８Ｘ３０ｍｍ）を用い、また内
容積０．１ ｒａｌのフローｕ住酸素電極を具備せしめ
たものを用いた。
５０ｍＭＬ−ロイシル−ｎ−ブチルアミドの０．１ Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い、ＬＡＰ活性測定用
試料として各種濃度のＬＡＰ含有試料（５０Ｕ／麻、
１００Ｕ／７７１７１！、 １５０Ｕ／ｍｌ、 ２００
Ｕ／ｒｒＬｌ、 ２５０ＴＩＪ／ｙｄ）を用い、さらに
固定化酵素カラムとしてはアミンオキシダーゼを多孔性
高分子樹脂（アミン基含有ポリアクリロニトリル繊維を
担体とし、架橋斉拮してグルタルアルデヒドを使用；英
国特許第２１５００１号参照）に共有結合せしめてなる
アミンオキシダーゼ固定化酵素（１５Ｕ／ｇ担体）１０
０■含有のカラム（２，８Ｘ３０ｍｍ）を用い、また内
容積０．１ ｒａｌのフローｕ住酸素電極を具備せしめ
たものを用いた。
まず、その基質溶液５０μｌに、各種濃度のＬＡＰ含有
試料１０μｌを加えて３７℃で１５分間反応せしめた。
試料１０μｌを加えて３７℃で１５分間反応せしめた。
また緩衝液槽より０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
を流速１ｍｌ／分の条件にて定量ポンプにて固定化酵素
カラムに送り、その後フローセル内の酸素電極による溶
存酸素値が安定した後、上記反応終了液の１０μｌを固
定化酵素カラムに注入した。
を流速１ｍｌ／分の条件にて定量ポンプにて固定化酵素
カラムに送り、その後フローセル内の酸素電極による溶
存酸素値が安定した後、上記反応終了液の１０μｌを固
定化酵素カラムに注入した。
ＬＡＰによって生じたｎ−ブチルアミンは、固定化酵素
カラムにおける酵素により酸化され、酵素反応ζこ使用
された溶存酸素量を電流変化値としてフローセルに具備
した酸素電極にて測定し、これを増巾器を介してその電
流変化値を記録計にて記録した。
カラムにおける酵素により酸化され、酵素反応ζこ使用
された溶存酸素量を電流変化値としてフローセルに具備
した酸素電極にて測定し、これを増巾器を介してその電
流変化値を記録計にて記録した。
その結果、第５図に示す通りで、前記のフローダイヤグ
ラムに応じても良好に−Ｍｌｆｆｌし得るものであるこ
とが明らかであり、自動化のために極めて良好なもので
あった。
ラムに応じても良好に−Ｍｌｆｆｌし得るものであるこ
とが明らかであり、自動化のために極めて良好なもので
あった。
実施例 ５
（Ｌ−ロイシル−Ｄ−メチオニン、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼを用いるＬＡＰ活性測定〕５０ｍＭＬ−ロイシル
−Ｄ−メチオニンの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
） ５０μ４に、各種濃度のＬＡＰ含有試料（５０Ｕ／
ｍｌ、 １００ Ｕ／ｍ１１１５０Ｕ／１ｒＬｌ、 ２
００Ｕ／ｍｌ、 ２５０Ｕ／ＴＬｌ）１０μｌを加え、
３７℃、１５分間反応せしめた。
ダーゼを用いるＬＡＰ活性測定〕５０ｍＭＬ−ロイシル
−Ｄ−メチオニンの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
） ５０μ４に、各種濃度のＬＡＰ含有試料（５０Ｕ／
ｍｌ、 １００ Ｕ／ｍ１１１５０Ｕ／１ｒＬｌ、 ２
００Ｕ／ｍｌ、 ２５０Ｕ／ＴＬｌ）１０μｌを加え、
３７℃、１５分間反応せしめた。
次いで反応後、第６図に示す装置を用いてＬＡＰ活性の
測定を行なった。
測定を行なった。
即ち、第６図において、その１５は上記ＬＡＰ反応終了
後の注入口を示し、その１６は０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液槽を示し、１７は緩衝液を流速ＩＴＬｌ／分の条件
にて送る定量ポンプを示し、１８はフローセルを示す。
後の注入口を示し、その１６は０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液槽を示し、１７は緩衝液を流速ＩＴＬｌ／分の条件
にて送る定量ポンプを示し、１８はフローセルを示す。
またこのフローセルには、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ固
定化酵素膜（アミン基含有ポリアクリロニトリル膜を担
体とし、架橋剤としてグルクルアルデヒドを使用；英国
特許第２１５００１号参照）（３０Ｕ／ｇ担体、径５ｍ
ｙｔｔ、ｏ、ｓｙｙ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性２
．４ｍＵ）１９を備えた酸素電極２０からなる酵素電極
が具備されてなる反応−検知槽を構成せしめ、さらに酸
素電極による電気的変化は増巾器２１を介して記録計２
２にて記録され、その２３は排出口を示すものである。
定化酵素膜（アミン基含有ポリアクリロニトリル膜を担
体とし、架橋剤としてグルクルアルデヒドを使用；英国
特許第２１５００１号参照）（３０Ｕ／ｇ担体、径５ｍ
ｙｔｔ、ｏ、ｓｙｙ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性２
．４ｍＵ）１９を備えた酸素電極２０からなる酵素電極
が具備されてなる反応−検知槽を構成せしめ、さらに酸
素電極による電気的変化は増巾器２１を介して記録計２
２にて記録され、その２３は排出口を示すものである。
上記の装置を用いて、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）を流速１ｒｒＬｌ／分の条件にて送り、その
溶存酸素値が安定した後、上記のＬＡＰ反応終了液１０
μ４をその注入口より注入した。
Ｈ７，０）を流速１ｒｒＬｌ／分の条件にて送り、その
溶存酸素値が安定した後、上記のＬＡＰ反応終了液１０
μ４をその注入口より注入した。
注入後、ＬＡＰによって生成されたＤ−メチオニンはそ
の固定化酵素膜の酵素反応により酸化され、溶存酸素の
減少を生じ、これをその酸素電極にて電流変化値となし
、記録した。
の固定化酵素膜の酵素反応により酸化され、溶存酸素の
減少を生じ、これをその酸素電極にて電流変化値となし
、記録した。
その結果、第７図に示す通りで、良好にＬＡＰ活性を測
定し得たもので、このような自動化においても良好にな
し得ることが明らかであった。
定し得たもので、このような自動化においても良好にな
し得ることが明らかであった。
さらζこ、ＬＡＰ活性測定用試料（１００Ｕ／ＴｒＬｌ
。
。
２００Ｕ／ｒｒＬｌ）の各試料を用いて、各々１００回
連続して、上記と同様に行なった結果、測定後その溶存
酸素値はすみやかに（測定終了後約１分間後）安定な元
の値を示し、かつ各々１００回すべてに同様の良好な測
定値を示したもので、啄めて再現性の良好なものであっ
た。
連続して、上記と同様に行なった結果、測定後その溶存
酸素値はすみやかに（測定終了後約１分間後）安定な元
の値を示し、かつ各々１００回すべてに同様の良好な測
定値を示したもので、啄めて再現性の良好なものであっ
た。
参考例 １
〔各種合成基質に対するＬＡＰおよびアミノペプチダー
ゼの作用の相違〕 各種合成基質としてＬ−ロイシナミド（５０ｍＭ）、Ｌ
−ロイシル−ｐ−二トロアニリド（５０ｍＭ）、Ｌ−ロ
イシル−β−ナフチルアミド（飽和溶液）、Ｌ−ロイシ
ル−ｎ−ブチルアミド（５０ｍＭ）、Ｌ−ロイシル−チ
ラミン（５０ｍＭ）を用い、その各０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）５０μｌに、各々３００Ｕ／ＴＬｌの
ＬＡＰ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０μ
ｌを加え、３７°Ｃ１１５分間反応せしめた。
ゼの作用の相違〕 各種合成基質としてＬ−ロイシナミド（５０ｍＭ）、Ｌ
−ロイシル−ｐ−二トロアニリド（５０ｍＭ）、Ｌ−ロ
イシル−β−ナフチルアミド（飽和溶液）、Ｌ−ロイシ
ル−ｎ−ブチルアミド（５０ｍＭ）、Ｌ−ロイシル−チ
ラミン（５０ｍＭ）を用い、その各０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）５０μｌに、各々３００Ｕ／ＴＬｌの
ＬＡＰ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０μ
ｌを加え、３７°Ｃ１１５分間反応せしめた。
また別に、上記と同一の各種合成基質を用い、これに２
０Ｕ／ｒｕｌのアミノペプチダーゼ（ベーリンガー社製
）１０μｌを加えて３７°Ｃ１１５分間反応せしめた。
０Ｕ／ｒｕｌのアミノペプチダーゼ（ベーリンガー社製
）１０μｌを加えて３７°Ｃ１１５分間反応せしめた。
これらの反応終了液ｌと関し、各々ＬＡＰ、アミノペプ
チダーゼによって生成されるＬ−ロイシンを、実施例４
の第４図に示すフローダイヤグラムに基く装置（ただし
、実施例４のアミンオキシダーゼの代りに、Ｌ−アミノ
酸オキシダーゼを用いたものである）（こより測定した
。
チダーゼによって生成されるＬ−ロイシンを、実施例４
の第４図に示すフローダイヤグラムに基く装置（ただし
、実施例４のアミンオキシダーゼの代りに、Ｌ−アミノ
酸オキシダーゼを用いたものである）（こより測定した
。
即ち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を流速ＩＴ
ＬｌＺ分の条件にて定量ポンプにて送り、固定化酵素カ
ラムを介するフローセル内の溶存酸素値が安定ζこなっ
た後、その固定化酵素カラムに、上記各反応終了後Ｉ
Ｍを注入した。
ＬｌＺ分の条件にて定量ポンプにて送り、固定化酵素カ
ラムを介するフローセル内の溶存酸素値が安定ζこなっ
た後、その固定化酵素カラムに、上記各反応終了後Ｉ
Ｍを注入した。
この固定化酵素カラムとしては、Ｌ−アミノ酸オキシダ
ーゼ固定化酵素繊維（２８Ｕ／ｇ担体、１０ ｏｍｐ）
含有のカラム（２，８Ｘ ３０ｍｍ）を用いた。
ーゼ固定化酵素繊維（２８Ｕ／ｇ担体、１０ ｏｍｐ）
含有のカラム（２，８Ｘ ３０ｍｍ）を用いた。
注入後、フローセルに具備した酵素電極により、各々の
し一ロイシン生成量に基＜Ｌ−アミノ酸オキシダーゼに
よる酸素の減少量を測定し、これを増巾器により電気的
変化として測定し、各々各基質に対するＬＡＰおよびア
ミノペプチダーゼの作用の強弱の相違を求めた。
し一ロイシン生成量に基＜Ｌ−アミノ酸オキシダーゼに
よる酸素の減少量を測定し、これを増巾器により電気的
変化として測定し、各々各基質に対するＬＡＰおよびア
ミノペプチダーゼの作用の強弱の相違を求めた。
その結果、第１表に示す通りであった。
この第１表に示す通り、公知のし一ロイシナミド、Ｌ−
ロイシル−ｐ−ニトロアミド、Ｌ−ロイシル−β−ナフ
チルアミドＧｔ、ＬＡＰのみでなくアミノペプチダーゼ
にも同程度以上作用するものであり、従ってＬＡＰ活性
測定用試料としｕＡＰおよびアミノペプチダーゼの両者
を含有する血清を対象となす場合には著しく不適当なＬ
ＡＰ活性値として求められているものであり、これに対
し本発明で用いるし一ロイシルーｎ−ブチルアミンやＬ
−ロイシル−チラミンではＬＡＰにより極めて良好に作
用を受け、アミノペプチダーゼによる作用が著しく弱い
ものであるこ吉から、血清を対象とする場合に特に好ま
しいものである。
ロイシル−ｐ−ニトロアミド、Ｌ−ロイシル−β−ナフ
チルアミドＧｔ、ＬＡＰのみでなくアミノペプチダーゼ
にも同程度以上作用するものであり、従ってＬＡＰ活性
測定用試料としｕＡＰおよびアミノペプチダーゼの両者
を含有する血清を対象となす場合には著しく不適当なＬ
ＡＰ活性値として求められているものであり、これに対
し本発明で用いるし一ロイシルーｎ−ブチルアミンやＬ
−ロイシル−チラミンではＬＡＰにより極めて良好に作
用を受け、アミノペプチダーゼによる作用が著しく弱い
ものであるこ吉から、血清を対象とする場合に特に好ま
しいものである。
さらに、本件ではＬ−アミノ酸オキシダーゼを用いて測
定を行なったもので、本来薄情を対象とすれば血清中の
Ｌ−アミノ酸の存在のために誤差を生ずる不適当な方法
であるが、本件ではＬ−アミノ酸を含まない標準系であ
るためにあえて採用したもので、かつＬ−ロイシナミド
、Ｌ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドやＬ−ロイシル−
β−ナフチルアミドより生成されるアンモニア、ｐ−ニ
トロアニリンやβ〜ナフチルアミンに作用する酸化酵素
が存在しなかったために、簡便な測定として使用したも
のである。
定を行なったもので、本来薄情を対象とすれば血清中の
Ｌ−アミノ酸の存在のために誤差を生ずる不適当な方法
であるが、本件ではＬ−アミノ酸を含まない標準系であ
るためにあえて採用したもので、かつＬ−ロイシナミド
、Ｌ−ロイシル−ｐ−ニトロアニリドやＬ−ロイシル−
β−ナフチルアミドより生成されるアンモニア、ｐ−ニ
トロアニリンやβ〜ナフチルアミンに作用する酸化酵素
が存在しなかったために、簡便な測定として使用したも
のである。
参考例 ２
〔基質の合成例〕
（１） Ｌ Ｌｅｕ ＮＨＣＨ２−ＣａＨ５（Ｌ
−ロイシル−ベンジルアミド）の合成例 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＳｕ ３．２８１ （１０ｍ ｍ
ｏｌｅ）およびベンジルアミン１．０９ ｇ（１０ｍｍ
ｏｌｅ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌに
溶゛解し、０℃、冷却下、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭ
Ｍ）でｐＨ７に調整後、室温で一夜攪拌した。
−ロイシル−ベンジルアミド）の合成例 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＳｕ ３．２８１ （１０ｍ ｍ
ｏｌｅ）およびベンジルアミン１．０９ ｇ（１０ｍｍ
ｏｌｅ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌに
溶゛解し、０℃、冷却下、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭ
Ｍ）でｐＨ７に調整後、室温で一夜攪拌した。
その後、ＤＭＦを留去し、その残渣を酢酸エチル５０罰
に溶解し、５チ炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、ＩＮ
塩酸で２回、水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムにて乾燥
し、次いで酢酸エチルを留去し、その残渣をシリカゲル
のカラム（１０ｏｇ）にチャージし、ベンゼン：酢酸エ
チル（１：１）の溶媒で溶出して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｎ
Ｈ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５１，３ｇを得た。
に溶解し、５チ炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、ＩＮ
塩酸で２回、水で２回洗浄後、硫酸ナトリウムにて乾燥
し、次いで酢酸エチルを留去し、その残渣をシリカゲル
のカラム（１０ｏｇ）にチャージし、ベンゼン：酢酸エ
チル（１：１）の溶媒で溶出して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｎ
Ｈ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５１，３ｇを得た。
次いでこの１．２ｇを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）
３ｒｒＬｌに溶解し、３０分間攪拌した後、ＴＦＡ留
去後残渣を０．ＩＮ酢酸に溶解し、これをセファデック
スＬＨ−２０のカラム（９７，ＯＸ３．０儒）にチャー
ジし、１フラクシヨン６．３ＴＩＬｌにて分画し、フラ
クション４２８〜３６を回収し、これを凍結乾燥してＬ
−ロイシル−ベンジルアミドの酢酸塩９００ｍｇを得た
。
３ｒｒＬｌに溶解し、３０分間攪拌した後、ＴＦＡ留
去後残渣を０．ＩＮ酢酸に溶解し、これをセファデック
スＬＨ−２０のカラム（９７，ＯＸ３．０儒）にチャー
ジし、１フラクシヨン６．３ＴＩＬｌにて分画し、フラ
クション４２８〜３６を回収し、これを凍結乾燥してＬ
−ロイシル−ベンジルアミドの酢酸塩９００ｍｇを得た
。
収率：３２．１％（酢酸塩）
分子式：Ｃ１３Ｈ２ｏＮ２０−ＣＨ３ＣＯＯＨ元素分析
： 計算値 Ｃ二６４．２６係、Ｈ二８．６３％Ｎ＝９．９
９％ 実測値 Ｃ＝６４．２２係、Ｈ二８．６８％Ｎ＝１０．
０１係 Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３
：１：１）Ｒｆ＝０．８０ ＩＲ（ヌジョール）：１６９０，１６２０ＣｒｒＬ（−
ＣＯ−ＮＨ−） ’、２） Ｌ−Ｌｅｕ−（）−Ｍｅｔ−ＯＨ−（Ｌ−
ロイシル−Ｄ−メチオニン）の合成例 １）ｎｅｔ−（）Ｈ１，４９Ｅｌ （１０ｍ ｍｏｌｅ
）、炭酸水素ナトリウム１．６８ｇ（２０ｍｍｏｌｅ
）を水１５ｍ１． ＤＭＦ５ｒＩｌｌの混合溶媒に加え
、これにＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ８ｕ ３．２８ ＆ （１
０ｍ ｍｏｌｅ）含有ＤＭＦ３０１ｒＬｌを加えて一夜
、室温で攪拌した。
： 計算値 Ｃ二６４．２６係、Ｈ二８．６３％Ｎ＝９．９
９％ 実測値 Ｃ＝６４．２２係、Ｈ二８．６８％Ｎ＝１０．
０１係 Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３
：１：１）Ｒｆ＝０．８０ ＩＲ（ヌジョール）：１６９０，１６２０ＣｒｒＬ（−
ＣＯ−ＮＨ−） ’、２） Ｌ−Ｌｅｕ−（）−Ｍｅｔ−ＯＨ−（Ｌ−
ロイシル−Ｄ−メチオニン）の合成例 １）ｎｅｔ−（）Ｈ１，４９Ｅｌ （１０ｍ ｍｏｌｅ
）、炭酸水素ナトリウム１．６８ｇ（２０ｍｍｏｌｅ
）を水１５ｍ１． ＤＭＦ５ｒＩｌｌの混合溶媒に加え
、これにＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ８ｕ ３．２８ ＆ （１
０ｍ ｍｏｌｅ）含有ＤＭＦ３０１ｒＬｌを加えて一夜
、室温で攪拌した。
次いで０℃に冷却後、ＩＮ塩酸でｐ Ｈ６、５に調整し
た後減圧濃縮した。
た後減圧濃縮した。
残渣を、酢酸エチル−ＩＮ塩酸（５０ＴＬｌ−５０罰）
に溶解し、その酢酸エチル層を水洗後、硫酸ナトＩＪウ
ムにて乾燥し、酢酸エチルを留去した。
に溶解し、その酢酸エチル層を水洗後、硫酸ナトＩＪウ
ムにて乾燥し、酢酸エチルを留去した。
残渣をシリカゲルのカラム（１０１）（こチャージし、
ベンゼン：酢酸エチル（１：１）の溶媒で溶出して、Ｂ
ｏｃ Ｌｅｕ Ｄ −Ｍｅｔ ＯＨ１，６９を
得た。
ベンゼン：酢酸エチル（１：１）の溶媒で溶出して、Ｂ
ｏｃ Ｌｅｕ Ｄ −Ｍｅｔ ＯＨ１，６９を
得た。
次いでこの１．５９をＴＦＡ４ｙｄに溶解し、室温で３
０分間攪拌した後、ＴＦＡを留去し、その残渣を０．Ｉ
Ｎ酢酸に溶解し、セファデックスＬＨ−２０のカラム（
９７、ＯＸ ３．Ｏｃ＊）にチャージして１フラクシヨ
ン６．３ｙｄづつ分画し、フラクション／ｉ６．２８〜
３６を回収し、凍結乾燥して、Ｌ−ロイシル−Ｄ−メチ
オニンの酢酸塩１．３ｇを得た。
０分間攪拌した後、ＴＦＡを留去し、その残渣を０．Ｉ
Ｎ酢酸に溶解し、セファデックスＬＨ−２０のカラム（
９７、ＯＸ ３．Ｏｃ＊）にチャージして１フラクシヨ
ン６．３ｙｄづつ分画し、フラクション／ｉ６．２８〜
３６を回収し、凍結乾燥して、Ｌ−ロイシル−Ｄ−メチ
オニンの酢酸塩１．３ｇを得た。
収率：４０．４係
分子式二Ｃ１１Ｈ２□Ｎ２ＳＯ３・ＣＦ２ＣＯＯＨ元素
分析 計算値 Ｃ二４８．４３係、Ｈ＝８．１３係Ｎ＝８．６
９係、Ｓ＝９．９４係 実測値 Ｃ＝４８．４０％、Ｈ＝８．１５係Ｎ＝８．６
５係、Ｓ＝９．９５係 Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水工３
：１：１）Ｒｆ＝０．５０ Ｉ ＩＲ（ヌジョール） ：１６８７．１６．２０ｃｒｌＬ
（−ＣＯ−ＮＨ−） （３）Ｌ−Ｌｅｕ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−
ＯＨ（Ｌ−ロイシル−チラミン）の合成例 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ８ｕ ３．２８ ＆ （１０ｍ ｍ
ｏｌｅ）、チラミン１．３７ ｇ（１０ｍ ｍｏｌｅ
）をＤＭＦ３０ＴＬｌに溶解し、０℃に冷却下、ＮＭ
ＭでｐＨ７に調整後室温で一夜攪拌した。
分析 計算値 Ｃ二４８．４３係、Ｈ＝８．１３係Ｎ＝８．６
９係、Ｓ＝９．９４係 実測値 Ｃ＝４８．４０％、Ｈ＝８．１５係Ｎ＝８．６
５係、Ｓ＝９．９５係 Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水工３
：１：１）Ｒｆ＝０．５０ Ｉ ＩＲ（ヌジョール） ：１６８７．１６．２０ｃｒｌＬ
（−ＣＯ−ＮＨ−） （３）Ｌ−Ｌｅｕ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−
ＯＨ（Ｌ−ロイシル−チラミン）の合成例 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ８ｕ ３．２８ ＆ （１０ｍ ｍ
ｏｌｅ）、チラミン１．３７ ｇ（１０ｍ ｍｏｌｅ
）をＤＭＦ３０ＴＬｌに溶解し、０℃に冷却下、ＮＭ
ＭでｐＨ７に調整後室温で一夜攪拌した。
次いで、ＤＭＦを留去後、その残渣を酢酸エチル５０ｍ
１に溶解し、５％炭酸水素すＩ−ＩＪウム水溶液で３回
、ＩＮ−塩酸で２回、水で２回洗浄し、硫酸ナトリウム
で乾燥した。
１に溶解し、５％炭酸水素すＩ−ＩＪウム水溶液で３回
、ＩＮ−塩酸で２回、水で２回洗浄し、硫酸ナトリウム
で乾燥した。
その後、酢酸エチルを留去し、その残渣をシリカゲルの
カラム（ＩｏＯｇ）にチャージし、ベンゼン：酢酸エチ
ル−１：１の溶媒で溶出し、Ｂ ｏｃ−Ｌ ｅｕ −Ｎ
Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−０Ｈ１，５８＆を得た
。
カラム（ＩｏＯｇ）にチャージし、ベンゼン：酢酸エチ
ル−１：１の溶媒で溶出し、Ｂ ｏｃ−Ｌ ｅｕ −Ｎ
Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−０Ｈ１，５８＆を得た
。
次いで、その１．４ｇを、ＴＦＡ ５ＴＬｌに溶解し、
室温で３０分間攪拌した後、ＴＦＡを留去し、その残渣
を０． Ｉ Ｎ酢酸に溶解し、セファデックスＬＨ−２
０のカラム（９７，ＯＸ３．０ＣｒｒＬ）にチャージし
、■フラクション６．３ｄづつ分画して、フラクション
Ａ３０〜３８を回収し、凍結乾燥して、Ｌ−ロイシル−
チラミンの酢酸塩１，２５ｇを得た。
室温で３０分間攪拌した後、ＴＦＡを留去し、その残渣
を０． Ｉ Ｎ酢酸に溶解し、セファデックスＬＨ−２
０のカラム（９７，ＯＸ３．０ＣｒｒＬ）にチャージし
、■フラクション６．３ｄづつ分画して、フラクション
Ａ３０〜３８を回収し、凍結乾燥して、Ｌ−ロイシル−
チラミンの酢酸塩１，２５ｇを得た。
収率：４０．３係（酢酸塩）
分子式：Ｃ１４Ｈ２２Ｎ２０２．ＣＦ２ＣＯＯＨ元素分
析： 計算値 Ｃ＝６１．９２係、Ｈ＝８．４４係Ｎ＝９．０
３係 実測値 Ｃ二６１．９０チ、Ｈ＝８．４５％Ｎ＝９．０
２％ Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３
：１：１） Ｒｆ＝０．７５ＩＲ（ヌジョール）：１
６８５，１６１５−１（−Ｃｏ−ＮＨ−） （４） Ｌ Ｌｅｕ Ｉ’ＪＨ（ＣＨ２）３
ＣＨ３（Ｌ−ロイシル−ｎ−ブチルアミド）の合成例 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＫ ２．５ ｇ（１０ｍ ｍｏｌ
ｅ ）、ｎ−ブチルアミ７１１ｒＬｌ（１０ｍ ｍｏｌ
ｅ ）および１−ヒドロキシベンズトリアゾール２．７
ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ＴＬｌに溶解し
、アイスバス中で冷却した。
析： 計算値 Ｃ＝６１．９２係、Ｈ＝８．４４係Ｎ＝９．０
３係 実測値 Ｃ二６１．９０チ、Ｈ＝８．４５％Ｎ＝９．０
２％ Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３
：１：１） Ｒｆ＝０．７５ＩＲ（ヌジョール）：１
６８５，１６１５−１（−Ｃｏ−ＮＨ−） （４） Ｌ Ｌｅｕ Ｉ’ＪＨ（ＣＨ２）３
ＣＨ３（Ｌ−ロイシル−ｎ−ブチルアミド）の合成例 Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＫ ２．５ ｇ（１０ｍ ｍｏｌ
ｅ ）、ｎ−ブチルアミ７１１ｒＬｌ（１０ｍ ｍｏｌ
ｅ ）および１−ヒドロキシベンズトリアゾール２．７
ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ＴＬｌに溶解し
、アイスバス中で冷却した。
その後、水溶性カルボジイミド１．ｓ ３ｍ（１０ｍ
ｍｏｌｅ ）を加え、一夜攪拌した。
ｍｏｌｅ ）を加え、一夜攪拌した。
次いでＴＨＦを留去後、その残渣を酢酸エチル５０ＴＬ
ｌに溶解し、５チ炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、Ｉ
Ｎ塩酸で２回、水で２回洗浄後硫酸ナトリウムで乾燥し
、次いで酢酸エチルを留去した。
ｌに溶解し、５チ炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、Ｉ
Ｎ塩酸で２回、水で２回洗浄後硫酸ナトリウムで乾燥し
、次いで酢酸エチルを留去した。
その残渣をシリカゲルのカラム（１００ｇ）にチャージ
し、ベンゼン酢酸エチル１：１の溶媒で溶出して、ＢＯ
Ｃ−Ｌｅｕ −ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ ＣＨｓ １．４
ｇを得た。
し、ベンゼン酢酸エチル１：１の溶媒で溶出して、ＢＯ
Ｃ−Ｌｅｕ −ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ ＣＨｓ １．４
ｇを得た。
次いで、この１．２ｇをＴＦＡ３１ｒＬｌに溶解し、室
温で３０分間攪拌した後ＴＦＡを留去した。
温で３０分間攪拌した後ＴＦＡを留去した。
得られた残渣を、０．ＩＮ酢酸に溶解し、セファデック
スＬＨ−２０のカラム（９７、’ ＯＸ ３． Ｏｃｍ
）にチャージし、１フラクシヨン６．３ｍｌづつ分画し
て、フラクション４３０〜３５を回収し、凍結乾燥して
、Ｌ−ロイシル−ｎ−ブチルアミンの酢酸塩８００１ｎ
Ｉ？を得た。
スＬＨ−２０のカラム（９７、’ ＯＸ ３． Ｏｃｍ
）にチャージし、１フラクシヨン６．３ｍｌづつ分画し
て、フラクション４３０〜３５を回収し、凍結乾燥して
、Ｌ−ロイシル−ｎ−ブチルアミンの酢酸塩８００１ｎ
Ｉ？を得た。
収率：３２．５％（酢酸塩）
分子式：Ｃ１ｏＨ２□Ｎ２Ｏ−ＣＦ５ＣＯＯＨ元素分析
： 計算値 Ｃ＝５８．５係、Ｈ＝１０．６％、Ｎ−１１
，４係 実測値 Ｃ＝５８．４係、Ｈ＝１０．５８係、Ｎ＝１
１．４係 Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３
：１：１） Ｒｆ二０．５２Ｉ ＩＲ（ヌジョール）：１６９０，１６２０ｃｒｒＬ（−
ＣＯ−ＮＨ−） なお、上記合成剤における略記号は以下の通りである。
： 計算値 Ｃ＝５８．５係、Ｈ＝１０．６％、Ｎ−１１
，４係 実測値 Ｃ＝５８．４係、Ｈ＝１０．５８係、Ｎ＝１
１．４係 Ｒｆ値ニジリカゲル板（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３
：１：１） Ｒｆ二０．５２Ｉ ＩＲ（ヌジョール）：１６９０，１６２０ｃｒｒＬ（−
ＣＯ−ＮＨ−） なお、上記合成剤における略記号は以下の通りである。
Ｂｏｃ：ｔ−ｊチルオキシカルボニル
Ｏ８ｕ ： Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル
テル
第１図はＬ−ロイシル−ベンジルアミド、アミンオキシ
ダーゼを用いて、酸素電極によるＬＡＰ活性測定の結果
を示し、第２図はＬ−ロイシル−チラミン、チラミンオ
キシタヒゼ゛を用いて、酸素電極によるＬＡＰ活性測定
の結果を示し、第３図はＬ−ロイシル−Ｄ−メチオニン
、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いて、酸素電極による
ＬＡＰ活性測定の結果を示し、第４図はＬＡＰ活性測定
系のためのフローダイヤグラムを示し、その１はＬＡＰ
活性測定用試料の注入口、２は基質溶液、３はＬＡＰ反
応槽、４は定量ポンプ、５は固定化酵素カラム、６は緩
衝液槽、７は定量ポンプ、８は型側、９はフローセル、
１０は恒温槽、１１は増巾器、１２は記録計、１３はデ
ジタルメーター、１４はデジタル記録計を示し、第５図
はＬ−ロイシル−ｎ−ブチルアミド、アミンオキシダー
ゼを用いて、第４図に示されるフローダイヤグラムに基
く酸素電極によるＬＡＰ活性測定の結果を示し、第６図
はＬＡＰ活性測定用装置を示し、その１５はＬＡＰ反応
終了液の注入口、１６は緩衝液槽、１７は定量ポンプ、
１８はフローセル、１９は固定化酵素膜、２０は酸素電
極、２１は増巾器、２２は記録計、２３は排出口を示し
、第７図はＬ−ロイシル−Ｄ−メチオニン、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼを用いて、固定化酵素を備えた酸素電極
からなる酵素電極によるＬＡＰ活性測定の結果を示すも
のである。
ダーゼを用いて、酸素電極によるＬＡＰ活性測定の結果
を示し、第２図はＬ−ロイシル−チラミン、チラミンオ
キシタヒゼ゛を用いて、酸素電極によるＬＡＰ活性測定
の結果を示し、第３図はＬ−ロイシル−Ｄ−メチオニン
、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いて、酸素電極による
ＬＡＰ活性測定の結果を示し、第４図はＬＡＰ活性測定
系のためのフローダイヤグラムを示し、その１はＬＡＰ
活性測定用試料の注入口、２は基質溶液、３はＬＡＰ反
応槽、４は定量ポンプ、５は固定化酵素カラム、６は緩
衝液槽、７は定量ポンプ、８は型側、９はフローセル、
１０は恒温槽、１１は増巾器、１２は記録計、１３はデ
ジタルメーター、１４はデジタル記録計を示し、第５図
はＬ−ロイシル−ｎ−ブチルアミド、アミンオキシダー
ゼを用いて、第４図に示されるフローダイヤグラムに基
く酸素電極によるＬＡＰ活性測定の結果を示し、第６図
はＬＡＰ活性測定用装置を示し、その１５はＬＡＰ反応
終了液の注入口、１６は緩衝液槽、１７は定量ポンプ、
１８はフローセル、１９は固定化酵素膜、２０は酸素電
極、２１は増巾器、２２は記録計、２３は排出口を示し
、第７図はＬ−ロイシル−Ｄ−メチオニン、Ｄ−アミノ
酸オキシダーゼを用いて、固定化酵素を備えた酸素電極
からなる酵素電極によるＬＡＰ活性測定の結果を示すも
のである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式（ｎ） −”−ｊ＼ （ただし、式中 ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＯ−は／ ＣＨ３１ ＮＨ２ Ｈ１ Ｌ−ロイシル基、−ＮＨ−ＣＨ′ は置換メチル＼ ２ アミン基またはＤ−アミノ酸残基を示し、置換メチルア
ミン基の場合にはＲ１またはＲ２のいずれか一方は水素
原子を示し、他は有機残基を示し、Ｄ−アミノ酸残基の
場合にはＲ１またはＲ２のいずれか一方はカルボキシル
基を示し、他方は有機残基を示し、ＣはＤ型不整炭素を
示す。 ）で表わされるＬ−ロイシル−アミド化合物またはその
可溶性塩を基質とし、これにロイシンアミノペプチダー
ゼ活性測定用試料を作用せしめた後、反応生成物たる置
換メチルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物に対応
する酸化酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費さ
れる酸素または生成される過酸化水素の量を測定するこ
とを特徴とするロイシンアミノペプチクーゼ活性測定法
。 ２ Ｌ−ロイシル−アミド化合物が、Ｌ−ロイシル−ベ
ンジルアミド、Ｌ−ロイシルチラミンまたはＬ−ロイシ
ル−ｎ−ブチルアミドである特許請求の範囲第１項記載
の測定法。 ３ Ｌ−ロイシル−アミド化合物が、Ｌ−ロイシル−Ｄ
−メチオニンまたはＬ−ロイシル−Ｄ−ロイシンである
特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ４ 酸化酵素が、固定化酵素である特許請求の範囲第１
項、第２項または第３項記載の測定法。 ５ 測定に当って、酸素電極または過酸化水素電極、ま
たはそれらの酵素電極を用いてなる測定である特許請求
の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の測定
法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4608580A JPS592278B2 (ja) | 1980-04-07 | 1980-04-07 | ロイシンアミノペプチダ−ゼ活性の測定法 |
| IT8120946A IT1211017B (it) | 1980-04-07 | 1981-04-06 | Composto ammidico e procedimento per la sua utilizzazione nel saggio per leucina amminopeptidasi |
| CA000374692A CA1197165A (en) | 1980-04-07 | 1981-04-06 | Synthetic substrate and assay method of enzyme activity |
| FR8106863A FR2479817B1 (fr) | 1980-04-07 | 1981-04-06 | Nouveau substrat synthetique contenant un amide et procede de determination de l'activite enzymatique de la leucine aminopeptidase |
| BE0/204385A BE888296A (fr) | 1980-04-07 | 1981-04-06 | Nouveau substrat synthetique pour le titrage d'une activite enzymatique |
| DK154881A DK154881A (da) | 1980-04-07 | 1981-04-06 | Fremgangsmaade til analyse for leucinaminopeptidase |
| GB8110858A GB2075969B (en) | 1980-04-07 | 1981-04-07 | Compounds for use as substrates in determining leucine aminopeptidase |
| US06/251,784 US4384041A (en) | 1980-04-07 | 1981-04-07 | Assay method of enzyme activity |
| CH2331/81A CH648291A5 (it) | 1980-04-07 | 1981-04-07 | Composto ammidico e procedimento per la sua utilizzazione nel saggio per leucina amminopeptidasi. |
| DE19813114065 DE3114065A1 (de) | 1980-04-07 | 1981-04-07 | Neues synthetisches substrat und analyseverfahren zur bestimmung der enzymaktivitaet |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4608580A JPS592278B2 (ja) | 1980-04-07 | 1980-04-07 | ロイシンアミノペプチダ−ゼ活性の測定法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13825081A Division JPS5774096A (en) | 1981-09-01 | 1981-09-01 | Measurement of enzyme activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56144097A JPS56144097A (en) | 1981-11-10 |
| JPS592278B2 true JPS592278B2 (ja) | 1984-01-18 |
Family
ID=12737143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4608580A Expired JPS592278B2 (ja) | 1980-04-07 | 1980-04-07 | ロイシンアミノペプチダ−ゼ活性の測定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS592278B2 (ja) |
| BE (1) | BE888296A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6019499A (ja) * | 1983-07-11 | 1985-01-31 | Yamasa Shoyu Co Ltd | ペプチダ−ゼ活性の測定法 |
| DE102009002044A1 (de) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | Evonik Degussa Gmbh | Dipeptide als Futtermitteladditive |
-
1980
- 1980-04-07 JP JP4608580A patent/JPS592278B2/ja not_active Expired
-
1981
- 1981-04-06 BE BE0/204385A patent/BE888296A/fr not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BE888296A (fr) | 1981-07-31 |
| JPS56144097A (en) | 1981-11-10 |
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