JPS589698A - γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ活性測定用基質、およびそれを用いる活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 采発明は、ｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ｒ　
　ｇｌｕｔａｍいｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ　；　
Ｅ、Ｃ，２，３，２・１１Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　：　Ｄ
−ｇｌｕｔａｍｙｌ　ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ。

以下・　ｒｒ−Ｇ［ｐＪと略す〕活性ｍ１１１定用基質
、およびそれを用いるγ−ＧＴＰ活性測定用に関するＯ ｒ　−ＧＴ　Ｐは、ｒ−グルタミルペプチドのｒ−グル
タミル基を加水分解し、さらにこの基を他のアミノ酸や
ペプチド−（例えばグリシルグリシン）１こ転移せしめ
る反応を触媒する酵素である〔日常検査の基礎知識シリ
ーズ　／、％Ｆ素検査第λ版、第６２頁〕０この１−Ｇ
ＴＰが臨床的に注目されたのは、ｌりＡＯ’ｉＥ初頭の
Ｏｒｌｏｗｓｋｉら、Ｇｏｌｄｂａｒｇらによる合成基
質を用いる測定法が開発され、肝胆道疾患における血清
ｆ−ＧＴ　Ｐの臨床的意義１こ注目されてからでおった
０血清中のγ−ＧＴＰは、慢性肝炎の非活性型では低値
を示すが、活性型では高値を示し、また胆汁うつ滞性肝
炎、閉塞性原 黄痘、実見性または転移性肝癌では高値をとるといわれ
ている。血中のｒ−ＧＴＰ活性の測定は、従来°の酵素
学診断法とは異なり、慢性肝疾患をこ特異的であり、か
かる疾病の診断、病態把握の手段として有用なものであ
る。

ｙ−ｃ’ｒｐ活性測定のための合成基質、およびそれを
用いる活性測定法としては、ｒ−グルタミルーア＝Ｑン
誘導体（特開昭≠７−５ｇ９ｇ号公報、特開昭３３−１
１１７９３号公報、特開昭ｊｊ−／ｌ／−７０３１Ａ号
公報等）を合成基質とする測定系やγ−グルタミルーナ
フチルアミン誘導体（特開昭５０−［３り３号公報等）
を合成基質とする測定系が挙らＫ、ま几現在一般に用い
られている合成基質としては、ｒ−グルタミル−ｐ−二
）ロアニリド、ｒ−グルタミル−α−ナフチルアχドや
ｒ−グルタミル−β−ナフチルアミドが挙られる。

このｒ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを用いるｒ−
ＧＴＰ活性測定法としては、ｒ−グルタミ／Ｌ’−ｐ−
ニトロアニリドよりｒ−Ｇ’ｒｐの酵素遊離しｆｃｐ−
ニトロアニリンの基質ヲｑｌＯｒ１ｒｒ＋で光学的吸光
度測定することにより求めているものである。しかし≠
１０ｎｍにおけるｐ−ニトロアニリンの吸光度測定は、
その測定波長が生体試料中の他の成分、特ｔこビリルビ
ン系色素の吸収波長帯であるため１こ、測定値への著し
い影響を受けるものであった。また遊離するｐ−ニトロ
アニリンをｐ−ジメチルベンズアルデしドなどのアルデ
ヒド系化合物と縮合せしめて発色させ、その極大吸収波
長での光学的吸光度から測定する方法もあるが、との−
比色定量法は反応過程が複雑で、かつ厳密な操作等条件
を必要とするために、検査法としては、なお、不便なも
のであった〇 またｒ−グルタミル−α−ナフチルアミドやｒ−グルタ
ミル−β−す７チルアミドを用いるｒ−ＧＴＰ活性測定
法としては、これらの合成基質にｒ−ＧＴＰを作用せし
めてα−ナフチルアミンまたはβ−ナフチルアミンを遊
離せしめ、次いでこの遊離するアミン化合物をジアゾニ
ウム塩となして比色定量するか、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾンと酸化剤とで発色させて定ψ
する方法が挙られる。しかしこれらの定量法は、反応過
程が複雑で、かつ厳密な操作を必要とするためｔこ、な
お不便なものであった。さらｔこ用いられるα−ナフチ
ルアミンやβ−ナフチルアミンは、毒性も著しく、特に
近住膀胱の腫瘍や癌を発生する毒性が明らかとなり、特
にその使用において注意を要するものであった。

本発明者らは　かかる欠点を有する従来のｒ　−ＧＴＰ
活性測定用基質およびその活性法にっ諭て改善すべく鋭
意研究した結果、全く意外にも、血清中に存在しないベ
ンジルアミン、チラミン、その他ブチルアミンやエタノ
ールアミンなどの置換メチルアミン化合物を、Ｌ−グル
タミン酸のｒ−カルボキシル基に結合せしめて得られる
合成基質は、ｆ　−ＧＴ　Ｐの作用により置換メチルア
ミン化合物を遊離せしめ得るもの′であることを知った
。

さらｔこ、この合成基質ｔこｒ−ＧＴＰを作せしめ°て
遊離される置換メチルアミン化合物は、対応するその酸
化酵素を作用せしめることケこより、その遊離される置
換メチルアミｙ化合物の量に対応して酸素を消費し１、
また過酸化水素およびアンモニアの各成分を生成するも
ので、この消費される酸素の量または生成される過酸化
水素またはアンモニアの量を測定すること１こよりｒ−
ＧＴＰ活性の測定を簡便、かつ正確ｔこ測定し得ること
を知った。

さらにその測定において、特ｔこ酸素電極、過酸化水素
電極やアンモニア電極、またはそれらの電極面をこその
酸化酵素の固定化酵素を具備せしめた酵素電極などの電
気的計測手段を用いることにより血清中の有色物質など
ｔこよる影響を受けず、かつ蝮時間ｔこ良好ｔこ測定し
得るものであつ几。

本発明は、上記の知見に基いて完成されたもので、下記
一般式ＣＩ） （九だし式中、Ｒは有機基、を意味する）で表わされる
γのＧＴＰ活性測定用基質、またはその塩、および一般
式（１）で表わされるｒ−ＧＴＰ活性測定用基質または
その塩に、１−ＧＴＰ活性測定用試料を作用せしめて、
反応生成物たる置換メチルアミン化合物に対応する酸化
酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費される酸素
ま几は生成される過酸化水素ま友はアンモニアの量を測
定することを特徴とする活性測定法であり、従来のγ−
グルタミルーアニリン誘導体やγ−グルタミルるもので
、本発明の目的はｒ−ＧＴＰ活性測定における良好な基
質、およびその活性測定法を提供するものである。

まず本発明に用いられるｒ−ＧＴＰ活性測定用基質とし
ては、Ｌ−グルタミン酸のｒ−カルボキシル基１こ置換
メチルアミン化合物を結合せしめて得られる下記一般式
〔Ｉ） Ｎｎｔ （ｆｃ、だし式中、Ｒは前記と同じ意味を示す）で表わ
される化合物ｃ以下、１−ＧＴＰ基質ＣＩ〕と略す丸で
ある。このｒ−ＧＴＰ基質ＣＩ）を得るに用いられる置
換メチルアミン化合物としては、一般式（Ｉｔ） Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ２（ｎ） （ただし式中、Ｒは前記と同じ意味を示す）にて表わさ
れる化合物であればよく、例えばベンジルアミン、ｐ−
ヒドロキシフェニルエチルアミン（チラミン）　、３．
≠−ジヒドロキシフェニルエチルアミン、ヒスタミン、
トリプタミンや、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、
ｎ−ブチルアミン、１ｓｏ−ブチルアミン、ｎ−アミル
アミン、ｉｓｏ　−アミルアミンやｎ−ヘキシルアミン
などのアルキサアミン化合物やエタノールアミンやアミ
ノプロピルアルコールナトのヒドロキシアルキルアミン
が挙られる。これらの置換メチルアミン化合物は、Ｌ−
グルタミン、酸やピログルタミン酸またはその保護誘導
体と反応せしめるととｔこよって得られる。一般１こそ
の保護誘導体となすをこ当っては、公ルタミン酸を用い
る場合には、そのな−アミノ基をｔ−ブトキシカル−ボ
ニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、ベンジルオキシカ
ルボニルなどの通常の保護基ｔこて保護せしめ、また瘉
−カルボキシル基ヲエチルｌステル、ベンジルエステル
、ｐ−ニトロベンジルエステル、ｐ−メ）キシベンジル
エステル、ｔ−ブチルエステルとして保護せしめればよ
く、さら１こ市販のベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グ
ルタミン酸−α−ベンジルエステルであるし一グルタミ
ン酸の保護誘導体を用いることが簡便である。次いでそ
のｒ−カルボキシル基を、例えば酸アジド、酸無水物、
酸イミダゾリドや活性エステル、例えばシアンメチルエ
ステル、ｐ−二トロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルなどに変換することｔこよって
、あるいはジシクロへキシルカルボジイミド、カルた化
合物と置換メチルアミン化合物と反応せしめるもので、
好ましい反応手段としてはカルボジイミド法、アジド法
、活性エステル法や酸無水物法である。また反応ｅこ当
っては、不活性媒体、例えばジメチルホルムアミド、ジ
メチルアセトアミド、ジメチルスルホキサイ・ド、テト
ラヒドロフライ、ベンゼン、キシレン、トルエン、ジエ
チルエーテルなどの溶媒中に両者＃１は等モル量を加え
、約−３０℃〜室温ｔこて攪拌下反応せしめればよい。

一般をこ反応は１〜３０時間で完了するもので、反応後
α−アミノ基やα−カルボキシル基の保護基を脱離せし
めればよい。脱離に当って、保護アミン基の場合では例
えば保護基がｔ−ブトキシカルボニル基ではトリフルオ
ロ酢酸を用いればよく、またベンジルオキシカルボニル
基ではパラジウム−炭素を用いる接触還元の手段を用い
て行なえばよく、保護カルボキシル基の場合では、例え
ばベンジルニスルチルの場合にはパラジウム−炭素を用
いる接触還元の手段を用いて行なうことが好ましい。さ
らにピログルタミン酸を用いる場合には、例えばピログ
ルタミン酸のＮ−４護誘導体であるベンジルオキシカル
ボニル−ピログルタミン酸となして、これに置換メチル
アミン化合物を用いて反応せしめればよい。また反応に
当っては、置換メチルアミン化合物が液状の際にはこれ
を反応媒体として兼甲してもよく、またはベンゼンやト
ルエンなどの媒体を用いてもよく、さらに反応温度とし
ては５ｏ−ｔｏｏ℃程度でよく、２０分〜５時間程度反
応せしめればよい。反応後、その保護基を脱離せしめれ
ばよく、これらは、必要に応じて精製する。

このようｔこして得元れｆｃｌ−ＧＴＰ基質〔１〕ｔこ
ついて述べれば、第゛１表ｔこ示す通りである０第　　
ｌ　　表 ＣＲｆ値；ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：ｌ：ｌの溶
媒を用いるシリカゲルプレートによる薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣ）） さらにこれらのｒ−ＧＴＰ基質〔Ｉ〕は、適宜、塩酸塩
、リン酸塩、酢酸塩などの可溶性塩として使用してもよ
い。

さらにこれらの合成基質を用いてｆ−ＧＴＰ作用により
遊離される成分としては、１−ＧＴＰ基質ＩＩＩ）で表
わされるｒ−グルタミル−置換メチルアミド化合物の置
換メチルアミン化合物である。

またこの遊離される置換メチルアミン化合物に対応する
酸化酵素しては、置換メチルアミン化合物、例えばベン
ジルアミンやチラミン、ブチルアミンなどのアルキルア
ミン化合物やエタノールアミンなどのヒドロキシアルキ
ルアミン化合物を基質とし、反応において少なくとも酸
素を消費し、過酸化水素、アンモニアを生成する酵素で
あればよい。例えば、モノアミンオキシダーゼ、ジアミ
ンオキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼやエタノール
アミンオキシダーゼなどのアミンオキシダーゼ系酵素が
、その置換メチルアミン化合物に応じて使用される。ま
たベンジルアミンやアルキルアミン化合物を基質とする
アミンオキシダーゼ系酵素としては、例えば豚や牛與清
、またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ″ｒｇｉｌ
ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ｔこ属する菌などより得られた
酵素、チラミンを基質とするチラミンオキシダーゼとし
ては、例えばサルシナ・ルテアーＩＡＭＢＩタタ菌（５
ａｒｃｉｎａ　１ｕｔｅａ　Ｉ　Ａ　Ｍｌρタタ）より
得られた酵素（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、　’Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ　、、２７　、３３０　（／り６
７）、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ）ｒ　
ｌ　ｄ、　７２２　　（／　９７　／）〕、ヒドロキシ
アルキルアミン化合物を基質トーｌエタノールアミンオ
キシダーゼとしては、例えばアースロバフタ−（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属ｔこ属する菌より得られ７′
ｃｋ？素（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　＊　ｃｈｅｍ、、Ｌｌｌｓ
（力２１ざり〜２１りＪ、（／り６≠）〕が挙られ、さ
らに市販の酸化酵素であってもよい。さらにり５０マイ
セス・フラパスΦバリエタス・７２７７．Ｍｌｌ／７５
菌（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｌａｖｕａ　Ｗａｒｓ
ｆｌａｖｕｓＭ！　／　７　ｊ　：　ＦＥＲＭ　−ＰＮ
２　ｆ　Ａ　４）、ペトロミセス・アリア±ウス・Ｍ≠
６ψｇ菌（ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ　　ａｌｌｉａｃｅｕ
ｓ特ｔＴｈｊｉＩｌ糖や鯖Ｎ晴１−１Ｍ≠６≠に：ＦＥ
ＲＭ−ＰＡｊＪ’Ａ７）、ネオサルトルヤ・フイツエリ
−Ｍ４４６りＯｅＭ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ　ｆｉｓ
ｃｈｅｒｉ　　Ｍ　４’　６り０：　Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　
ＰＮ３　ｆ　６−１）　、ユーロチウム優チェバリエリ
　−ｈ／１１１−ｇ０！；菌　（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ　ｃ
ｈｅｖｅｌｉｅｒｉＭψｆ０３　：ＦＥＲＭ　　ＰＡｊ
Ｊ’６９）、ニーペニシリウム・パルパム−Ｍ２Ｏ５／
菌（Ｅｕｐｅｎｉｃｉ　−１１ｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ　
Ｍ　ｊ　ＯＳ　／菌：ＦＥＲＭ−ＰＡ５１７０＞　（な
お、これらの各菌株の菌学的性質輸ついては、特願昭５
６−２≠２３／号明細書参照）１こよる基質特異性の広
いアミンオキシダーゼ系酵素を用いてもよい。このよう
なアミンオキシダーゼ系酵素生産菌を用いて目的とする
酵素を得るに当っては、該酵素生産菌を、酵素を生産す
る通常の方法で培養すればよく、通常液体培養で行な通 うが、工業的には深部凰気榎拌培養を行なうのが有利で
ある。また用いられる培地の栄養源としては、微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源
としては同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグ
ルコース、シュクロース、ラクトース、マルトース、糖
蜜、スターチなどがμいられる。まｆｃ窒素源としては
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、コーン−
スチープ・リカーなどが使用される。その他、リン酸塩
、マグネシウム、カルシウム、カリウ、ム、ナトリウム
、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要１こ応じて用い
られる。培養温度は菌が発育し、アミンオキシダーゼ系
酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、特に好まし
くは２ｊ〜３７℃程度である。培養時間は、条件によっ
て多少異なるが、アミンオキシダーゼ系酵素が最高収量
に達する時期を見計って適当な時期ｅこ培養を終了すれ
ばよく、通常はｌＯ〜２ｊ時間程度である。次いで、こ
の様にして得られた培養物からアミンオキ系 シダーゼ濡酵素を採取するのであるが、本酵素を採取す
るｔこ例示すれば、まず得られた培養物を洲過または遠
心分離などの手段により、その菌体を採取し、次いでこ
の菌体を種々の機械的または細胞壁溶解酵素などの酵素
的方法にて破壊してアミンオキシダーゼ系酵素を可溶化
して水溶液として分離、採取する。このよう１こして得
几アミンオキシダーゼ系酵素を含有する溶液は、さらに
濃縮するか、または濃縮することなく可溶性塩類例えば
硫安、食塩などを用いて塩析せしめるが、さらに親水性
有機溶媒例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
を添加することにより沈澱せしめればよい。さらにこの
沈澱物は、水に溶解し、半透膜をごて透析せしめて、よ
り低分子量の不純物を除去することができる。また吸着
剤あるいはゲル沖過剤など１こよる吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィーあるいはゲル濾過
などの手段を甲いてアミンオキシダーゼの溶液中の不純
物を有効ｅこ除去し、これらの手段により得られる酵素
溶液は、減圧濃怖、凍結乾燥などの処理ｔこて固形のア
ミンオキシダーゼ系酵素を得る。さらをここのアミンオ
キシダーゼ系酵素をさらに精製するに当っては、蛋白質
、酵素などの精製に通常用いられる手段、例えば吸着ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過などを用いて精製すればよい。次に、そのアミン
オキシダーゼ系酵素の理化学的性質なこつぃて述べる。

なお、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ　ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉＭ　４
’　Ｉ　０５より生産されたアミンオキシダーゼ系酵素
１こついては、単にＭ４１’１０　Ｓ　、　Ｎｅｏａａ
ｒｔｏｒｙａ　ｆｉｓｃｈｅｒｉＭ　’Ａ　６り０より
生産されたアミンオキシダーゼ系酵素１こついてはＭ４
（６り０　、　Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｉａｃｅ
ｕｓ　Ｍ　１１６’Ｉ　Ｉ　ｔこより生産されたアミン
オキシダーゼ系酵素についてはＭ　１１８１１　　Ｆ　
　、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　　ｐａｒｖｕｍ　　
Ｍ　ｊ　０　５　　／　　ｔこより生産されたアミンオ
キシダーゼ系酵素ｔこついてはＭ　５０５　／　、　Ｔ
ａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｆｌａｖｕｓ　　ｖａｒ、　
ｆｌａｖｕｓＭ４’　／　７５ｔこより生産されたアミ
ンオキシダーゼ系酵素１こついてはＭ弘／７ｊと略称す
る。

（１）作用 モノアミン、酸養、水からアルデヒド、アンモニア、過
酸化水素を生じる反応を触媒する。

（２）　　至適ＰＨ Ｍｉｔｇｏｓ％Ｍ≠６り０、Ｍ≠６≠ｆ、ＭＳＯ５ｌお
よびＭｌｌ／７３について、ｎ−ブチルアミンを基質と
して、その至適ｐＨを求めた。測定においては酸凛電極
を用いた電舎法を使用し、緩衝液としてｐＨ６〜ｇはリ
ン酸緩衝液を、又、ｐＨ９〜ＩＯはトリス−塩酸緩衝液
を使用した。各ｐＨにおけるアミンオキシダーゼ活性は
第１−５−５図をこ示す通りで、（第１図はＭ≠ｒ０５
％第２図はＭｖ６９０、第３図はＭｇ６＜ｚざ、第ｖ図
１！　Ｍ　Ｓ　Ｏ５ｔ、第ｓ図はＭψ／７５のアミンオ
キシダーゼ系酵素を示す）又、これらのアミンオキシダ
ーゼ系 〜酵素の至適ｐＨは次の通りである。

ＭｕｌＯ５ｐＨ７，５〜Ｉｓ　　　（第１図）Ｍ≠６り
ＯｐＨ７，５〜Ｉｓ（第２図）ＭＩＩ６’ＡＩ　　ｐＨ
７，！；−４，５＜第３図）ＭＳＯ５／　　ｐＨ７，３
＝ｌ！；　　　（第ｑ図）Ｍ≠７７５　　ｐ　Ｈ７５〜
ｇ、ｓ＜第５図）（３）　　熱安定性 各５種の菌より得７’ｃ＃素液Ｑ、　／　ｍｅに０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）　０．９　ｖｒｌを加
え、０，３０゜３７、ψｏ、ｓｏ、ｂｏおよび７０℃で
ＩＱ分間加熱し象後、力価測定法ｔこ準じて、各酵素の
活性を測定しｆｃｏその結果は、第６図〜ｌＯ図ｔこ示
す通りで、（第６図はＭ≠１０３、第７図はＭψ６り０
１第ｇ図はＭψ６μｇ１第６図はＭＳＯ５／−１Ｗｊｌ
Ｏ図はＭ≠１７５の各酵素の熱安定性を示す）いずれの
酵素゛も約≠θ℃まで安定でＡ（７℃以上でははぼ完全
ｔこ失活する。

（４）ｐＨ安定性。

各酵素溶液０．　／　ｍｌに０．　／　Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨｊ〜６）、゛θ、１Ｍリン酸緩衝液ｔｐｎ６〜ｇ）
および０．７　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨざ〜ｉｏ
＞をＯｌりｔｎｌ加え、３７℃で３時間保持した。この
加温した酵素の酵素活性を、酵素液１００μｌ　を用い
、力価測定法に準じて測定した。その結界は第１／−１
５図Ｉｎ示す通すテ、（第１／図はＭＩＩＩ０５、第１
２図はＭ≠６りθ、第１３図はＭ弘６≠ざ、第７４ｊ図
はＭ３０ＳＩ、第１３図はＭＩＡ／７Ｓの酵素を示す）
各酵素はｐＨ５〜７で安定であつ７’Ｃ。

（５）　　基質特異性 各酵素液１００μｌを用いて、力価測定法に準じて、下
記モノアミン類の各基質に対する作用を測定した。その
相対活性（ｎ−ブチルアミン１こ対して）は次の通りで
ある。

また、各酵素はジアミン化合物に対しても弱い酵素活性
を示す。

（６）　　分子量 酵素の分子量を、セファデックスＧ−１００（ファルマ
シア社製）を□用いたゲルー過法で測定した結果は次の
通りである。

〔力価測定法〕

スミ／オキシダーゼ系酵素の力価測定法は次の通りであ
る。

０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ１，０）　　　０
．７　ｍ１７　　　　　　０２チフエノール　　　　　
　　　　　　　０．０３　ｍ１０．３％ｕ−ｙミｉｔｙ
チビ７ｙ　　　　　　　　Ｑ、ＱＳｍｌｏ、ｏ、ｓｓペ
ルオキシダーゼ（シグマＴｙｐｅＩ）　　０．０５ｍ１
Ｏ，／Ｍｎ−ブチルアミン（ｐＨ７，（１７）　　　　
　Ｑ、ｔｍｌ蒸留水　　　　　　　　　　　　　０．　
Ｏｓ　ａｔ上記の組成の反応液Ｏ９≠−を試験管をこ分
取し、３７℃、３分間予備加温した後、酵素液Ｉθθμ
ｌを加えて３７℃、Ｓ分間反応を行う０反応後、２゜≠ ５ｍｌのエタノールを加えて反応を停止し＼ｌｆＱ１１
１Ｍ＋の波長會こて比色定量する。１分間會こ１μｍｏ
ｌｅの過酸化水素を生じる活性をｌ単位（Ｕ）とした。

またこれらの酸化酵素壷よ固定化酵素として使用しても
よい。この場合には、自動分析装置に組み込んで測定を
行なうことが可能となり、酸素電極、過酸化水素電極や
アンモニアガス膜電極やアンな 用かつ高価な酵素の使用を著しく少量ならしめるため會
こ、特１こ有用である。さら會こ固定化酵素を上側 記電気的計画装置である電極の検知部に着装せしめてな
る酵素電極として用いることにより、迅速ｔこ、しかも
種々の試薬も必要とせず、さらに繰り返し測定をこ利用
でき、さらにまた有色物質を含むγ−ＧＴＰ活性測定用
試料１こも適用できる几めに極めて有効なものである。

また固定化靜＾すｔこ当っては、公知の種々の固定化手
段が使用できるもので、好ましくは、ポリアクリルアミ
ドで包括固定化する方法、アルブミンなどの蛋白質とと
もに混合し、さらｔここれを架橋して固定化する方法、
ナイロン系ポリマーなどの種々の合成高分子化合物を用
いて固定化する方法、光硬化性樹脂を用いて包括固定化
する方法、多孔性アミノ化ガラスなどの多孔性無機担体
ｔこ吸着または共有結合にて固定化する方法などの種々
の固定化手段が甲いられ、またその固定化酵素の形状と
しては、酵素電極用として使用に好ましい膜状、繊維状
、粒状、ま几はチューブ状となせばよい０ 次いでｒ−ＧＴＰ活性測定を行なうに当って例示すれば
まずγ−ＧＴＰ基質ＣＩ）の一定濃度の溶液を調整し、
これと、γ−ＧＴＰ活性測定用試料、例えば血清、グリ
シルグリシン、緩衝液、必要に応じて塩化マグネシウム
を加えて反応せしめる。反応に当っては、通常３７℃近
辺ｔこて行なえばよく、反応時間としては、ｒ−ＧＴＰ
により用いたγ−ＧＴ’Ｐ基質ＣＩ）から置換メチルア
ミン化合物が遊離される時間であればよく、特に限定さ
れるものではない。次いで反応後、γ−ＧＴＰｔこより
生じり置換メチルアミン化合物を、対応する酸化酵素ｅ
こより酸化せしめるものであるが、その際、反応終了液
中ｔこ生成した置換メチルアミン化合物を対応する酸化
酵素の作用ｅこよって、反応系中の酸素を消費し、ま友
過酸化水素、アンモニアの成分を生成せしめてなるもの
であって、通常対応する酸化酵素の溶液、を添加して反
応せしめるが、対応する酸化酵素の固定化酵素に接触せ
しめて反応せしめればよく、通常３７℃近辺にて行なわ
れる０反応後、反応１こよって消費される酸素、または
生成される過酸化水素やアンモニアの各成分の量を測定
すればよく、好ましくは酸素電極、過酸化水素電極、ア
ンモニア電極を用いて電気的計測手段により測定する。

またアンモニアの竜を測定するに当っては、アンモニウ
ムイオンとなし、これをアンモ斤つムイオン選択電極な
こて測定してもよい０さらｔこ、前記固定化酵素とこれ
らの電極とを組み合せてなる酵素電極として使用するこ
とｔこより、著しく簡便に行なわれる。これらの電気的
計測手段ｔこよって測定され几値は、さらｔこ電気的変
化にて、必要ｔこ応じて記録するか、デジタル表示し、
γ−ＧＴＰ活性値として換算すればよい。

また過酸化水素の量の測定に当っては、フェノール、≠
−アｉツアンチピリ／、ペルオキシダーゼ、７ を含有する試薬、フェノール、ψ−アミノＸエナソー、
ン、ペルオキシダーゼを含有する試薬、Ｎ５「−ジエチ
ル−ｍ−トルイジン、ψ−アミノアンチピリン、ペルオ
キシダーゼを含有する試薬などの呈色試薬を用いて生成
される過酸化水素と反応せしめ、その反応をこよる呈色
の強さを吸光度測定してもよい。さらｅこ２・６−ジク
ールフエノールインドフエノールとペルオキシダーゼと
の組合せによる過酸化水素の定量、グアヤク脂とベルオ
キシダーゼノの組み合せｔこよる過酸化水素の定量、ホ
モパニ１ノン酸とペルオキシダーゼとの組み合せｔこよ
る過酸化水素の定量、ルミノールを用いる過酸化水素の
定量など、種々の過酸化水素の呈色試薬、螢光試薬、発
光試薬ｔこより定量してもよい。

質ＣＩ）の浴液、グリシルグリシンなどの受与体、反応
媒体たる緩衝液を注入口より注入し、ｆ−ＧＴＰ基質〔
Ｉ〕から置換メチルアミン化合物を生成せしめる几めの
ｒ−ＧＴＰ反応槽１こ導き、この反応槽にて置換メチル
アミン化合物を生成せしめ、さらにこの反応によって遊
離した置換メチルアミン化合物に対応する酸化５酵二素
を作用せしめ、反応によって消費される酸素の竜、生成
される過酸化水素の量、アンモニアの・量を検出してな
る反応検出槽を有する測定系を設ければよく、また好ま
しくは、その反応検出槽において対応する酸化酵素の固
定化酵素の反応カラム部と検出のための電極を備えた電
気約言＋測部とをこ分離してもよく、または電気的計測
部である電極の検知部ｔこ固定化酵素を具備した酵素電
極として一体化せしめたものであってもよい。さらｔこ
、ｒ、−ＧＴＰ反応槽と反応検出槽とは対の糸量こ限定
されるものではなく、例えば複数のγ−ＧＴＰ反応槽よ
りサンプリング装置ｔこで順次反応槽中槽ｔこ注入し、
順次検出、洗浄を繰り返してなる２以上のｒ−ＧＴＰ反
応槽と反応検出槽を有する測定系であってもよいＯさら
にまたこの電気的計測ｔこよるγ−ＧＴＰ測定は、生体
内の種々の検査項目１こおいて多項目同時測定のための
−項目として行なってもよい。さらをここの電気的計測
部の代りに、過酸化水素の定量用試薬を用いて、反応カ
ラム部の後ｔこ試薬注入口を設けて、反応ｔこよって生
成した過酸化水素と反応せしめればよく、次いでこれを
特定の波長域にて測定すればよい。さら（こ、これらの
試薬を合成樹脂フィルムや一紙などの膜状物をこ積層せ
しめた積層一体型として用いてもよい。

なお、後述各実施例をこおいては、酸素電極による測定
系を例示するものであるが、その酸素電極の代りをこ過
酸化水素電極を用いて過酸化水素を定量してもよく、ま
たアンモニア電極を用いてアンモニアまたはアンモニウ
ムイオンを定量しても同様に良好ｔなし得るものであり
、さらに過酸、化水素の定量用試薬を用いて定量しても
なし得るものである。

このよう１こ、本発明のｒ−ＧＴＰ基質（ＩＩ）はｒ−
ＧＴＰ活性測定１こおいて有用であり、かつ不発（こ、
さらｔこ再現性も良好な測定２％１Ｎ診Ｎ玉上極めて有
用なものである。

次に本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれらｔこよって伺んら限定されるもの
ではない。

実施例１ （Ｌ−グルタルミン酸−γ−ベンジルアミドの合成〕 ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログルタミン酸〔市
販品：（（’：］雷＝−、２’ＺＩＯ（Ｃ＝／、Ｏｔ、
メタノール）、融点１３≠−／３３℃〕２．６１（ｌＯ
ｍＭ）ｔこベンジルアミンｌＱｍｌを加えて、ｇＯ℃で
１時間攪拌しながら加熱した。反応後、これにジエチル
エーテルを加えて析出した沈澱物を回収し、さらにジエ
チルエーテルにて洗浄した。次いでこれを、酢酸エチル
と１０％クエン酸で溶解し、分液ロートに入れ、振盪し
、酢酸エチル層を回収し、水洗後、無水硫酸ナトリウム
で乾燥した。乾燥剤を除去し、酢酸エチルを留去し、仁
の残渣にジエチルエーテルを加えて沈澱物を得た。さら
にこの沈澱物を酢酸エチルで再結晶を行ない、得た結晶
を５０％エタノール２ＱＱｍｌｋこ懸濁し、ｊチパラジ
ウム炭素５００■を加え几後水素ガスを３時間通じた。

反応終了後、濾過にてパラジウム炭素を除去し、炉液を
濃縮乾固し、さらに水−エタノールで再結晶してＬ−グ
ルタミル−ｒ−ベンジルアミドを得た。

収ｔ　：　／、２１．　ｆ　＜！’３３　ｍＭ）収率：
５３．３係 融点：２／２−２／≠℃ ＴＬＣ：Ｒｆ　　＝０．３３ 元素分析： 実測値　Ｃ＝ＡＯざ≠係、Ｈ＝４．９／％、Ｎ　＝　／
　２．　／　６チ 計算値（Ｃ１２Ｈ１ｂ　０ｓＮ２として）Ｃ＝　６／、
　ＯＯ係、Ｈ＝６ｇ３％ Ｎ＝Ｉ／ざ６チ 大ｍａｘ＝＝、２’５Ｊ’μｍ　（Ｃ−’　ｓ水）ＩＲ
：第１６図ｔこ示す通り 実施例λ （Ｌ−グｋｌミン酸−γ−ベンジルアミドの合成〕１ベ
ンジルオキシカルボニル−し−グルタミン酸−α−ベン
ジルエステル〔市販品：〔α）　２５　＝　−２３、ざ
０（Ｃ＝／、２３、メタノール）、融点９７〜９１’Ｃ
〕７．３７Ｐ　　Ｌ２７７ｍＭ）　　とＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド２．３？　　（，２０ｍＭ）　　を溶解
した１００ｍ１ジメチルホルムアミド溶液を一１ｏｃに
冷却し、攪拌下、シンクロへキシルカルボジイミドｔＡ
１３９　　（，１４（：）ｍＭ）の２０ｍ１ジメチルホ
ルムアミド溶液を５分で滴下した。反応液を冷却下、コ
時間攪拌後、さらに室温で７５時間摂押した。析出した
沈澱物を枦去した後、ろ液を減圧濃縮し、残渣ｅこヘキ
サンを加えて、粘性のある沈澱物をデカ／チージョンに
て得た。次いでこれを３Ｑｍｌジメチルホルムアミドに
溶解し、これにベンジルアミン２１ψｔ’ｃ２０ｍＭ）
を加えて室温で２０時！む 魔擾拌した。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られ
た残渣ｔこクロロホルムとｊチ炭酸水素ナトリウム水溶
液を加えて振僧した。クロロホルム層を回収し、これを
５チ炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、／Ｎ−塩酸で２
回、食塩水で２回、さらｔこ水で１回、順次洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥後、乾燥剤を除き、
クロロホルムを留去し、酢酸エチル−ぺ／ゼンでコ回再
結晶して、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン
酸−（ｒ−ベンジルアミド）　−α−ベンジルエステル
を得た。

収量二ｌｌ−，０６ｆ　　（ｆｆｌｉ’、、２ｍＭ）収
率ニゲ！ＯＸ係 融点：ｌ≠５−／≠７℃ Ｔ　ＬＣ：　Ｒｆ　＝０．７３　　（クロロホルム：メ
タノール：酢酸＝ｔｙｓｓｓ：３、シリカゲルプレート
）元素分析： 実測値　Ｃ＝　７０．７７　＊、Ｈ＝４．／ｆ％Ｎ＝４
．７６％ 計算値（Ｃ２７Ｈ２Ｓ　０５Ｎ２として）Ｃ＝７０≠２
チ、Ｈ＝　４．７３　％ Ｎ　＝　Ａ、　０ざチ さら１こ、ｊ％パラジウム炭素ｊＯＯ■を少量の水で浸
し、これＶこ２０ｙａｌメタノールとｔＯｍ！酢酸と５
ｍ／！の水で、上記のベンジルオキ７カルポニルα−ベ
ンジルエステル３．ｇ　ｔ−ｆ　　（ｇ、４（ｍＭ）を
溶解して加えた。室温で攪拌しながら３時間水素ガスを
通じた。次いでパラジウム炭素を炉去し、Ｐ液を濃縮し
て沈澱物を得た。この沈澱物を７Ｍ酢酸水で溶解し、セ
ファデックスＬＨ−，２０のカラム　（径３．０ｔｙｎ
　Ｘ　／　／　Ｑ　ｃｔｎ）　ｔこチャージしたｃ、／
Ｘ酢酸水を流し、９．６ＩＩＩｌづつ分画し、ＴＬＣで
確認して、フラクションＡ７９〜９ｊを回収し、凍結乾
燥してＬ−グルタミン酸−ｒ−ベンジルアミド（収量ｔ
ｏｉ３ｍｙ、≠２９ｍ　Ｍ　１　を得た。

実施例３ （Ｌ−グルタミン酸−γ−（ｐ−ヒドロキシフェニル−
２−エチル）アミドの合成〕 ｔ−ブトキシカルボニル−し一グルタミン酸−α−ベン
ジルエステル／、７ｆ（５ｍＭ）とＮ−メチルモルホリ
ン０．５　？　　（５ｍＭ）をテトラヒドロフラン３０
１Ｒ１＆こ溶解し、−２ｏ′Ｃｒこ冷却した。これｔこ
クロル炭酸エチルＯ１≠７１１１／（ｊｍＭ）を加え、
−ｉｓ℃で２分間攪拌後、チラミン０．７１（ｊｍＭ）
の’７０ｍ１ジメチルホルムアミド溶液を加えを酢酸エ
チルと１０％クエン酸水で抽出洗浄して酢酸エチル層を
回収した０次いで、これを、５チ炭酸水素ナトリウム水
溶液で２回、水で３回順次洗浄し、硫酸す［リウムで乾
燥した。乾燥剤を除去した後、酢酸エチルを留去し、得
られた残漬をジエチルエーテル−ヘキサンで再結晶し友
。これに〇℃にてトリフルオロ酢酸、５ｍ、ｌを加えて
室温ｔこて３０分間攪拌し’ｆｔｏその後、直ち１こ減
圧下で濃縮乾固した。これを５ＯｔＲ１の水ｔこ溶解し
、ｊチノくラジウム炭素３００ｑを加え、室温で攪拌し
ながら炭 水素ガスを２時間通じ良。その後、）（ラジウム素素を
炉去し、得られたｆ液を減圧濃縮して沈澱物を得、さら
ｔここれを水−エタノールｔこで再結晶してＬ−グルタ
ミン酸−ｒ−（ｐ−ヒドロキシフェニル−２−エチル）
アミドを得た。

収量：　０．７９　　（２，ｂ　３　ｍＭ）収率：５２
６チ 融点＝２２り〜２３／℃ ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．≠０ 元素分析： 実測値　Ｃ＝　５　ｆ、７４％、Ｈ＝　７．θψチＮ＝
ＩＯ，２９係 計算値（Ｃ１５）（１Ｂ　０４Ｎ２として）Ｃ＝　５　
ｇ、　６３％、■−乙、ｇ／％Ｎ　＝　’ｔ　ｏ、　ｓ
　、ｚチ λｍａｘ＝２７←５（Ｃ＝’＋水） ＩＲ：第１７図ｔこ示す通り、 実施例≠ 実施例３のチラミンの代りｅこ、３．≠−ジヒドロキシ
フェニルー２−エチルアミン、トリプタミン、エチルア
ミン、ｎ−プロピルアミン、ｎ−フ゛チルアミン、１ｓ
ｏ−ブチルアミ／、ｎ−アミルアミン−エタノールアミ
ン、ｒ−アミノプロピルアルコールを用いて以下実施例
３と同様ｔこして、各アミド化合物を得π０ （λｍａＸ測定においては、ｃ　＝　’　＋水を用い、
Ｒｆ値は、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：ｌ：ｌの溶
媒を用いｆｃＴＬＣである） 実施例５ 〔Ｌ−グルタミン酸−γ−ベンジルアミドを用いるｆ−
ＧＴＰ活性測定〕 ３０ｍＭのＬ−クルタミン酸−ｒ−ベンジルアミド含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）　　／　ｍ／お
よび０．５　ＭグリシルグリシンＱ、　５　ｍｌ　ｆ有
する媒体を、酸素電極を具備した反応槽に加えた。次い
でこれに、各濃度のｆ−ＧＴＰ　（シグマ社製）含有−
試料ｊＯμｅを加え、攪拌下、３７℃、３ｏ分間反応せ
しめた。反応稜、Ｅｕｒｏｔ＋ｕｍ　ｃｈｅｖａｌｉｅ
ｒｉ　Ｍ　４１１θ〕菌株より得られたアミンオキシダ
ーゼ系酵素Ｃ２／　Ｕ／Ｉｌｌ／）　３０μｍを加え、
３７℃・ｔコで／　分間反応せしめ、ｒ−ＧＴＰより遊
離されたベンジルアミンを酸化させ、反応によって消費
される酸素の減少景を、具備したＰ紫電ｆｉｔこて電流
変化値として測定した。その結果、第ｉｆ図ｔこ示す通
りで、得られた電流変化値とｆ−ＧＴＰ活性値との間ｅ
こ比例関係が成立するもので、かつ簡便ｔこ測定し得た
ものであった。

実施例６ （Ｌ−グルタミン酸−γ−（ｐ−ヒドロキシフェニル−
２−エチル）アミドと用いるｒ−ＧＴ　Ｐ活性測定〕 実施例ｊのＬ−夛ルタミン酸−γ−ベンジルアミンの代
りに、５０ｍＭＬ−グルタミン酸＝ｒ−（ｐ−ヒドロキ
シフェニル−２−エチル）アミドを用い、以下実施例ｊ
と同様ｔこ行なって、γ−ＧＴＰ活性測定を行なった。

その結果、第１り図１こ示す通りで、良好１こｒ−ＧＴ
Ｐ活性測定をなし得たものであった。

実施例７ まず、γ−ＧＴＰ活性測定のためのフローダイヤグラム
を誉れは第２０図の通りである（第２０図中、ｌはγ−
ＧＴＰ活性測定用試料の注入口、コは１−ＧＴＰ基質（
Ｉ）含有溶液槽、３は１−ａＴＰ反応槽、ψは定量ポン
プ、ｊはアミンオキシダーゼ系酵素の固定化酵素含有カ
ラム、６は緩衝液槽、７は定量ポンプ、ｒは電極、りは
フローセル、ｌＯは恒温槽、ｉｔは増巾器、１２は記録
計、１３はデジタルメーター、ｌψはデジタル記録計を
示す）。即ち、γ−ＧＴＰ活性測定用試料を注入口ｌよ
り注入し、また１−ＧＴ　Ｐ基質ＣＩ）含有浴液槽２よ
り定量ポンプ≠にてγ−ＧＴＰ反応槽３に導入する。そ
の際、γ−ＧＴＰ活性測定用試料は、マイクロピペット
やオートサンプラーなどにて注入すればよい。ｒ−ＧＴ
Ｐ反応槽をごて一定時間反応後、反応液は固定化酵素含
有カラム５ｔこ送られ、その際緩衝液槽６より定量ポン
プ７により媒体が送られる。さらをこ固定化酵素含有カ
ラムＳを通過した液は、酵素反応ｔこよって消費された
酸素、生成された過酸化水素、アンモニアの量を測定す
るための、酸素電極、過酸化水素電極またはアンモニア
電極などの電極ｇを具備する７０−セルタに導く。また
これらの系は恒温槽／Ｑｌこて一定温度をこ保持せしめ
る。次いで電極とによって測定された電気的変化を増巾
器１／を介して記録計７２１こて記録せしめるか、デジ
タルメーター１３、デジタル記録計７４４を具備せしめ
て記録する０ グ このフローダイヤ嶌ラム１こおいて、その１−ａＴＰ基
質ＣＩ）含有溶液槽２に、その基質溶液として５０ｍＭ
のし一グルタミン酸−γ−ベンジルアミドおよび２５０
ｍＭクリシルグリシンを含有する０、　７　Ｍ　’）ン
酸緩衝液’（ｐＨ７θ〕　を用い、また固定化酵素含有
カラムｊとしてはＥｕｒｏｔｉｕｍｃｈｅｖａｌｉｅｒ
ｉ　Ｍ　ＩＡ　ｇ　０５菌株より得られたアミンオキ／
ダーゼ系酵素を多孔性アミノ化ガラスピーズ（多孔性ガ
ラスピーズをＴ−アミノプロピルトリエトキンシラン処
′理したもの）ｔこグルタルアルデヒドにて共有結合せ
しめてなる固定化酵素（アミンオキシダーゼ活性乙≠Ｕ
／ｆ担体）　１３０〜含有のカラム（径３ｍｍ×３０間
）を用い、さら１こ緩衝液槽６ｔこ媒体としての０．７
　Ｍ　’）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い、また内容
積Ｑ、　／の７０−セルタ１こ電極ｇとしての酸素電極
を具備せしめた。

まず基質溶液を定量ポンプにて６μｅを送り、またγ−
ＧＴＰ含有試料ｑμ４を注入口より注入して３７℃にて
３０分間反応せしめた。また緩衝液槽より０．７　Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７０）を流速ｌＩＩ＋７！／分の条件
ｔこて定量ポンプで固定化酵素含有カラムｔこ送り、そ
の後、フローセル内の酸素電極をこよ液 る溶存酸素値が安定した後、上記の反応終了後をこの固
定化酵素含有カラム１こ注入した。ｆ−ＧＴＰ（こよっ
て遊離したベンジルアミンは、固定化酵素含有カラムｔ
こおける酵素作用（こより酸化され、また溶存酸素を消
費するもので、この酸素の量を電流変化値として酸素電
極１こて測定し、増巾器を記 介してその電流変化値を駄録計１こて記録しｆｃｃその
結果、第２１図をこ示す通り、良好に測定し得たもので
、また自動化のために極めて良好なものであった。

実施例ｇ 実施例７のＬ−グルタミン酸−ｒ−ベンジルアミンの代
りに、Ｌ−グルタミン酸−ｒ−（ｐ−ヒドロキシフェニ
ル−２−エチル）アミド、および実施例ｔで得られた種
々のアミド化合物を」いて、同様１こ行なった結果、良
好？こｒ−ＧＴＰ活性測定をなし得るものであった。

参考例１ グルコース２％、ボテＦ抽出ｉ５（７ｍｇ（ポテト３０
０ｆを水／ｌで抽出した液）、リン酸−カリウ°ム０５
％、硫酸マグネシウム０．２！％及びｎ−ブチルアミン
ｏ、ｉｓを含有する培地（ｐＨ６０）ｓ　ｏ　ｏ　ｍ７
！を５θＯＩＩ＋７！容三角フラスコ（こ５本ｔこ各ｌ
Ｑ　Ｑ　ｍｌ宛分注し、１２０℃、２０分間加熱殺菌し
た後、Ｅｕｒｏｔｉｕｍ　　ｃｈｓｖａｌｉｅｒｉ　　
Ｍ　４’　Ｉ　ＯＳ　。

Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ　　ｆｉｓｃｈｅｒｉ　Ｍ　１
１６りθ、Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓａｌｌｉａｃｅｕｓ　
　Ｍ　ＩＩ　６’Ａ　Ｉ　、　Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ　　ｐａｒｖｕｍＭ　５０　ｊ　／　％’　Ｔａｌ
ａｒｏｍｙｃｅａ　　ｆｌａｖｕａ　　ｖａｒ、　　ｆ
ｌａｖｕｓＭ≠１７５の各々の菌株を夫々接種し、各々
３０℃、２’１時間、３００　ｒ、ｐ、ｍで振盪培養し
た。培養物を濾過して菌体を回収し、蒸留水をこて洗浄
後、再び濾過して菌体を回収した。次いで、得られｆｃ
′菌体を約２倍量の海砂（半片化学薬品社製）で摩砕し
たのち、菌体の約２倍量の０．７　Ｍ−リン酸緩衝液（
ｐ　Ｈ７，０）で抽出して遠心分離を行い、アミンオキ
シダーゼ系酵素を含有する上清液を得た。この上清液中
の酵素活性は、各々次ｔこ示す通りであった。

菌　株　　　　酵素活性（Ｕ／ｍｌ・培養液）Ｍψｇθ
ｓ　　　　　　　Ｏ，ｏｓｔ Ｍ　ｔＩ−６９０ｏ、　ｏ　３ｇ Ｍψ６≠ｇ　　　　　　　ｏ、ｏｂθ Ｍ　５０５　／　　　　　　　０．θｊ２Ｍ≠ｔ７！；
　　　　　　　、０．０≠６参考例２ 参考例１と同一の組成を有する培地２０ｇを、３０１２
容ジヤーやファーメンタ−１こ加えて加熱減菌した後、
これｔこ、参考例１と同様の方法ｔこて予備培養したＥ
ｕｒｏｔｉｕｍ　ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ　　Ｍ　１１　
ｆ　ＯＳの培養液２００ｍ１を移植し、３０℃にて２０
時間培養した。培養後、培養物を渥過して菌体（約ｔＳ
Ｏ２）を回収した。

グルコース３チ、リン酸−カリウム０．７　％、硫０）
２０１を、３０１容ジヤー・ファーメンタ−に加えて加
熱殺菌した後、得られた菌体を加え、３０℃、１０時間
、２６０ｒ、１ｂｍにて、培養しｆＣ，。

培養後、培養物を一過して菌体を回収して、蒸留水ｔこ
て洗浄後、再び濾過して菌体を回収した。（約１５０ｆ
）。次いで、得られた菌体の約２倍量の海砂（約３００
９＞で摩砕しんのち、θ／Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７ｂ
）で抽出し、後、遠心分離を行い、アミンオキシダーゼ
系酵素を含有する上／＃液を得た（約３　／　０ｒｌＩ
ｌ；　０．５１Ｊ／１Ｂ７！＞。

次で、この上清液を、０．７　Ｍ　−ＩＪン酸緩衝液（
ｐ　Ｈ７，０）に″溶解したカーボワックス２ｏｏｏ。

（和丸純薬社製）の３０％溶液を用いて濃縮し、（約５
倍）、後、０．７　Ｍ−リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７゜０）
に対して透析した。透析液（約６ｓｒｒｔ）を、セファ
デックスＧ−１００のカラム（３Ｘ　ｇ　Ｏｒｍ）ｆこ
チャージして、アミンオキシダーゼ系酵素画分を回収、
併合し、アミンオキシダーゼ系酵素溶液的２ＩＯＩ＋＋
７！を得た（／３２Ｕ）。此のアミンオキシダーゼ系酵
素溶液を、０．７　Ｍ　−’）ン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，
０）　　に溶解したカーボワックス２０００の３０係溶
液を用いて濃縮し、（約１０倍）、後、０．００５Ｍ−
リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０＞に対して、充分透析した
（ψｒ待時間。透析液（約２５ｍ１）を、あらかじめ０
．００３　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７０）で緩衝化しｆｃ
ＤＥＡＥ−セルロース（生化学工業社製）カラム（／、
　Ｓ　Ｘ　２０ｃｍ）　ｋこチャージして、アミンオキ
シダーゼ系酵素を吸着させる。カラム（こカラムの約２
　倍量）０．００５　Ｍ、　０．０／Ｍ、０．０２５Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７０）を流して、アミンオキシダ
ーゼ系酵素を溶出し、溶出液を併合し、アミンオキシダ
ーゼ系酵素溶液的／’３５ｒｎｌを得た。（ｌ！ｉ′５
Ｕ）。此のアミンオキシダーゼ系酵素溶液を、０．７　
Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐｌ（７０）に溶解したカーボワ
ックス２００００の３０係溶液を用いて濃縮、透析（約
１２倍）し、アミンオキシダーゼ系酵素溶液（’？、　
Ｓｍｌ　；　ｇ、２１Ｊ／ｍｌ　；活性回収率ｊＯ１３
％）を得、次で、これを凍結乾燥してアミンオキシダー
ゼ系酵素粉末ｔｇ、ｓ■を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第ｊ図はアミンオキシダーゼ系酵素の至適ＰＨ
凸曲線第６図〜第ｉｏ図はアミンオキシダーゼ系酵素の
熱安定性曲線、第ｉｔ図〜第１５図はアミンオキシダー
ゼ系酵素のｐＨ安定性曲線、Ｅ／６図はＬ−グルタミン
酸−γ−ベンジルアミドのＩＲチャート、第１７図はＬ
−グルタミン酸−γ−（ｐ−ヒドロキンフェニル−，２
−工ｆ　ｋ）アミドのＩＲチャート、第１ｆ図はＬ−グ
ルメミン酸−ｒ−ベンジルアミドを用いるｆ−ＧＴＰ活
性測定曲線、第１９図はＬ−グルタミン酸−ｒ−’（ｐ
−ヒドロキシフェニル−２−エチル）アミドを甲いるｒ
−ＧＴＰ活性測定曲線、第２０図はｒ−ＧＴＰ活性測定
用のフローダイアグラム、第２１図はＬ−グルタミン酸
−ｒ−ベンジルアミドを用いるｒ−ＧＴＰ活性測定曲線
を示す〇−１′ 特許出願人　東洋醸造株式会社 代表者伊東富士馬 第１図 ６７１３９’ｌＯ 第２図 ６　　　　７　　　　８　　　　９　　　　１０第　　
３　図 ６　　　　７　　　　８　　　　９　　　１０第４図 ６　７　８　９１０ 第５図 ６’７８９１０ 第６図 １ ３０　４０　５０　６０　７０ ！Ａ 第７図 ３０　４０　５０　６０　７０ 第８図 ３０　　　　４０　　　　　５０　　　　　６０　　　
　　７０湯４ 第９図 ｉＬ＋’！、 第１ｏ　ｆｉｌ ３０　　　　４０　　　　５０　　　　６０　　　　７
０逼４ 第１１１１１ ３　　　　’４　　　５　　　　（３７８Ｄ　　　１０
第１２図 ３　　　４　　　５　　　６　　　７　　　８　　　０
　　　　１０篤゛１３図 ３　　　４　　　　５　　　　　Ｇ　　　　　７　　　
　８　　　　　Ｆｌ　　　　１０第１４図 ３４　５　６　７　　Ｑ　　Ｄ　１０ 第１５図 ３　４　５　６　７　　Ｂ　　！’ｌ　１００　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１第１８図 ５０　　　　１００　　　１５０　　　２００　　　２
５０ｙ−ＧＴＰ　　　　（ｍＵ／ｍｌ） 第１９図 Ａ ５０　　　　　１００　　　　１５０　　　　２００　
　　　２５０ｙ−ＧＴｐ（ｍＵ／ｍｌ） 第２１図 ５０　１００　１５０　２００　２５０ｙ−ＧＴＰ　（
ｍＵ／ｍｌ） 昭和５７年Ｓ月ｄ６日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 ／、　事件の表示 昭和５６年特許願第１Ｏざ５９３号 ２８　　発明の名称 ｌ−グルタミルトフンスペブチダーゼ活性測定用基質、
およびそれを用いる活性測定法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ６発 同第２５頁第６行の「アミノアンチピリン」ヲ「アミノ
アンチピリン」と訂正する。 同第３ざ頁第１Ｓ行〜１６行の「ｎ−アミフレアミン−
エタノールアミン、」をｒ−−アミルと訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （り下記一般式〔Ｉ〕 （ただし式中、Ｒは有機基を意味する）で表わさレルγ
   −グルタミルトランスペプチダーゼ活性１１１１’１定
   用基質、またはその塩。　パ （２）Ｒが、フェニル基で示される一般式ＣＤで表わさ
   れるｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用基
   質である特許請求の範囲第１項記載のｒ＝グルタミル゛
   トランスペプチダーゼ活性測定用基質、またはその塩。 ′ （３）　Ｒ７５ｆ、ヒドロキシベンジル基で示される一
   般式ＣＩ）で表わされるｒ−グルタミルトランスペプチ
   ダーゼ活性測定用基質である特許請求の範囲第１項記載
   のｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用基質
   、まキはその塩。 （４）　Ｒが、アルキル基またはヒドロキシアルキル基
   で示される一般式ＣＩ）で弄わさ鬼るγ−グルタ、ミル
   トランスペプチダーゼ活性測定用基質である特許請求の
   範囲第１項記載のｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ
   活性測定用基質４、またはその欅。 （５）下記一般式ＣＩ） （ただし式中、Ｒは有機基を意味する）で表わされるｒ
   −グルタミルトラくスペプチダーゼ活性測定用基質、ま
   た（よその塩【こ、γ−グルタミルトランスペプチダー
   ゼ活性測秤世試料を作用せ、しめて、反応生球物たる置
   換メチルアミン化合物ｅこ対応する酸化酵素を作用せし
   め、次い、で反応ｔこよって消、費される酸素ま７′ｃ
   畔乍成される過酸化水素またはアンモニアの量を測定す
   ることを特徴とする活性測定法、 （６）Ｒカ、フェニル−基またはヒドロキシベンジル基
   ヤ示される一般式ＣＩ）で表わされるγ−グルタミルト
   ランスペプチダーゼ活性測定用基質である特許請求の範
   囲第５項記載の活性測定法Ｃ（７）　、Ｒカ、アルキル
   基またはヒドロキシアルキル基で示される一般式ＣＩ）
   　＊表わされるｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ活
   性測定用基質である法 特許請求の範囲第５項記載の活性測定用。 （８）反応生成物たる置換メチルアミン化合物が、ベン
   ジルアミンである特許請求の範囲第５項記載の活性測定
   法。 （９）反応生成物たる置換メチルアミン化合物が、チラ
   ミンである特許請求の範囲第５項記載の活性測定法。 （１０）反応生成物たる置換メチルアミン化合物が、ア
   ルキルアミン化合物ま几はヒドロキシアルキルアミン化
   合物である特許請求の範囲第５項記載の活性測定法。 （１１）アルキルアミン化合物が、プロピルアミンまた
   はブチルアミンである特許請求の範囲第１Ｑ項記載の活
   性測定法。 （＋２）ヒドロキシアルキルアミン化合物がエタノール
   アミンである特許請求の範囲第１Ｏ項記載の活性測定法
   。 （６）酸化酵素が、アミンオキシダーゼ系酵素である特
   許請求の範囲第５項記載の活性測定法。 （１４）酸化酵素が、固定化酵素である特許請求の範素
   電極ま７’（ゆその酵素電極を用いてなる測定である特
   許請求の範囲第５項ないし第１≠項のいずれかの項の記
   載の活性測定法。 （１６）生成される過酸化水素の量を測定するに当って
   、過酸化水素電極ま友はその酵素電極を用いてなる測定
   である特許請求の範囲第５項ないし第１≠項のいずれか
   の項記載の活性測定法。 （１７）生成される過酸化水素の量を測定するに当って
   、呈色試薬、発光試薬または螢光試薬を用いてなる測定
   である特許請求の範囲第５項ないし第１Ｖ項のいずれか
   の項記載の活性測定法。 る測定である特許請求の範囲第５ＸＪｑいし第１≠項の
   いずれかの項記載の活性測定法。