JP2002000264A

JP2002000264A - 新規なヒスタミンオキシダーゼを産生するアースロバクター・クリスタロポイーテス及び固定化ヒスタミンオキシダーゼ

Info

Publication number: JP2002000264A
Application number: JP2000191614A
Authority: JP
Inventors: Kunio Matsumoto; 邦男松本
Original assignee: Able Corp
Current assignee: Able Corp
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2000-06-26
Publication date: 2002-01-08

Abstract

(57)【要約】【課題】熱安定性を有し、優れた固定化率を有するヒ
スタミンオキシダーゼ及びその産生菌、並びに食品中等
のヒスタミンを測定する場合等に使用するのに好適な固
定化ヒスタミンオキシダーゼ及びこれを用いたヒスタミ
ン測定装置を提供すること。【解決手段】熱安定性を有するヒスタミンオキシダー
ゼを産生するアースロバクター・クリスタロポイーテス
である。ヒスタミンオキシダーゼは、アースロバクター
・クリスタロポイーテスから産生され、７０℃以下で熱
的に安定である。このようなヒスタミンオキシダーゼを
担体に固定化して成る固定化ヒスタミンオキシダーゼで
ある。ヒスタミン測定装置は、この固定化ヒスタミンオ
キシダーゼと、酸素センサー、アンモニアセンサー及び
過酸化水素センサー等を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なヒスタミン
オキシダーゼを産生するアースロバクター・クリスタロ
ポイーテス及び固定化ヒスタミンオキシダーゼに係り、
更に詳細には、食品等、特に水産食品や食肉製品の食品
衛生管理において、ヒスタミン量を簡便に測定するのに
有用なヒスタミンオキシダーゼ、固定化ヒスタミンオキ
シダーゼ及びこれを用いたヒスタミン測定装置に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、食品衛生管理においてヒスタ
ミンが測定されている。このヒスタミンは、新鮮な魚
肉、食用肉中には殆ど存在しない成分であるが、温度管
理の不手際等により、微生物、特にヒスチジン脱炭酸酵
素活性の強いモルガン菌などが増殖すると、肉組織中の
遊離ヒスチジンが脱炭酸されて生成する不揮発性アミン
である。一方、タンパク質の分解により生成したヒスチ
ジンも同様の反応を行う。

【０００３】また、ヒスタミンを多量（約５００ｐｐ
ｍ）に含有する食品を摂取するとアレルギー性食中毒を
発症するおそれがあることから、欧米諸国ではその量を
法的に規制している。米国では、要注意レベル（ＤＡ
Ｌ）が５０ｐｐｍ、健康上有害とし行政処分をするレベ
ル（ＡＬ）が５００ｐｐｍ（Ｆｅｄｅｒａｌｒｅｇｉ
ｓｔｅｒ［ＤｏｃｋｅｔＮｏ．９５Ｄ−０１５７］Ｄ
ｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄＨｉｓｔａｍｉｎ
ｅ，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ１９４，３９７５４−３９７５
６（１９９５））とされている。

【０００４】更に、国際的な食品の品質管理法として重
視されるＨＡＣＣＰにおいて、特に水産品については、
漁獲工程から、加工、流通、摂食の最終段階に至る全工
程におけるヒスタミン量のモニターリングが要求され、
規制値を超えたものは廃棄することが要求されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、水産食
品のヒスタミン定量には、ＡＯＡＣの公定分析法となっ
ている蛍光分析法又はＨＰＬＣ法などが従来用いられて
きた。何れも研究室用の分析法で、操作が複雑で数時間
を要し、ＨＡＣＣＰで要求される迅速なフィールド測定
には使用困難なものであるという課題がある。

【０００６】そのため、最近海外では動物由来のジアミ
ンオキシダーゼ（ＤｉａｍｉｎｅＯｘｉｄａｓｅ）を用
いた酵素法（例えば、Ｌｅｐｅｚ−ｓａｂａｔｅｒ，Ｆ
ｏｏｄＡｄｄＣｏｎｔ．Ｖｏｌ．１０，５９３−６
０２（１９９３））、又は酵素免疫キット（ＳＦＳＡＮ
ＨＡＣＣＰ（ｓｅａｆｏｏｄ）Ｃｈａｐｔｅｒ２７，
６〜８（２０００））等による水産食品のヒスタミン簡
易定量法が提案されているが、ＨＡＣＣＰの実行に真に
好適な分析法は未だ見出されていない。酵素免疫法は１
〜２時間を要し、キットが高価な難点がある。寿命も６
ヶ月程度である。また、上記ジアミンオキシダーゼを用
いた酵素法には、約２時間を要し、目的成分のヒスタミ
ンがモノアミンであるため、選択性が合致しないという
基本的な課題がある。

【０００７】我が国では、山田（Ｙａｍａｄａ）らの研
究による微生物由来のモノアミンオキシダーゼ（Ｍｏｎ
ｏａｍｉｎｅＯｘｉｄａｓｅ）（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２９，６４９−６５４（１９
６５））をコラーゲン膜に固定化したバイオセンサーに
よるヒスタミン定量法が、軽部（Ｋａｒｕｂｅ）らによ
り報告されている（ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２，１１７〜１２０
（１９８０））。但し、この方法では、固定化により酵
素が変性し固定化率が３％に満たないものであった。そ
の後、ＩｖｏＦｒｅｂｏｒｔらが、山田らの酵素を更
に精製したものを固定化してフォトダイオード（ｐｈｏ
ｔｏｄｉｏｄｅ）つきＨＰＬＣによるヒスタミン定量を
再試したが、１〜２日の寿命しか得られなかったと述べ
ている（山口大学博士論文、Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒＡＫ
Ｕ３３０２由来の銅／トパキノンアミン酸化酵素の局在
性と活性部位の構造，ｐａｇｅ１２，ｌｉｎｅ１〜２
（１９９７））。

【０００８】ところが、かかる酵素はフリーエンザイム
の状態では極めて安定で、大橋（Ｏｈａｓｈｉ）らは、
酸素電極法によるヒスタミンの簡易迅速測定を実用化し
ている（Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．５
９，５１９−５２２（１９９４）Ｕ．Ｓ．Ｐ．，Ｐａ
ｔ．Ｎｏ．５５６５，３２９．Ｏｃｔ．１５，（１９９
６）；特開平９−２７１７７４５号公報（１９９７），
特開平１０−１７４５９９号公報、平成１０年６月３０
日）。しかし、このようなフリーエンザイム法によるヒ
スタミン測定は、高価な酵素試薬を多量に消費するた
め、分析のランニングコストが嵩むという経済的弱点が
あり、産業用として未熟な方法であるという課題があ
る。

【０００９】本発明は、このような従来技術の有する課
題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところ
は、熱安定性を有し、優れた固定化率を有するヒスタミ
ンオキシダーゼ及びその産生菌、並びに食品中等のヒス
タミンを測定する場合等に使用するのに好適な固定化ヒ
スタミンオキシダーゼ及びこれを用いたヒスタミン測定
装置を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行い、京都府中郡大宮町近郊の
ほうれん草畑の土壌の中から、ヒスタミンを唯一の栄養
源とする集積培養法を用いてヒスタミン資化菌を採取
し、この菌株を種々研究したところ、所定の特性を有し
ヒスタミンの定量に好適であり、熱安定性を有する新規
な酵素ヒスタミンオキシダーゼが産生されることなどを
見出し、本発明を完成するに至った。

【００１１】即ち、本発明のアースロバクター・クリス
タロポイーテスは、熱安定性を有するヒスタミンオキシ
ダーゼを産生することを特徴とする。

【００１２】また、本発明のヒスタミンオキシダーゼ
は、上述の如きアースロバクター・クリスタロポイーテ
スから産生され、７０℃以下で熱的に安定であることを
特徴とする。

【００１３】更に、本発明のヒスタミンオキシダーゼの
好適形態は、タンパク質量を基準とした担体への固定化
率が３０〜９５％であることを特徴とする。更にまた、
本発明のヒスタミンオキシダーゼの他の好適形態は、上
記固定化の際の活性発現率が５０〜９５％であることを
特徴とする。

【００１４】また、本発明の固定化ヒスタミンオキシダ
ーゼは、上述の如きヒスタミンオキシダーゼを担体に固
定化して成ることを特徴とする。

【００１５】更に、本発明の固定化ヒスタミンオキシダ
ーゼの好適形態は、ｐＨ６．７〜８．５で良好な活性を
示すことを特徴とする。更にまた、本発明の固定化ヒス
タミンオキシダーゼの他の好適形態は、上記担体が、多
孔性アルキルアミノ化ガラス、多孔性アミノ化ポリアク
リロニトリル及び多孔性アルキルアミノ化セラミックス
から成る群より選ばれた少なくとも１種のものであるこ
とを特徴とする。

【００１６】また、本発明のヒスタミン測定装置は、上
述の如き固定化ヒスタミンオキシダーゼと、酸素センサ
ー、アンモニアセンサー及び過酸化水素センサーから成
る群より選ばれた少なくとも１つのセンサーを備えるこ
とを特徴とする。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。なお、本明細書において、「％」は特記しない限
り、質量百分率を示す。本発明のアースロバクター・ク
リスタロポイーテス（Ａｒｔｈｌｏｂａｃｔｅｒｃｒ
ｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）は、上述の如く、京都
府中郡大宮町近郊のほうれん草畑の土壌から採取・分離
されたものである。なお、アースロバクター・クリスタ
ロポイーテスは、ＦＥＲＭＰ−１７９１５として平成
１２年６月２２日付けで工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託してある。

【００１８】アースロバクター属は、既知のヒスタミン
オキシダーゼ産生菌である。上記アースロバクター属の
ヒスタミンオキシダーゼ産生菌としては、寄藤らの「新
規ヒスタミンオキシダーゼとその製造方法」（特開平５
−２３６９５２号公報）に開示されている発明に用いら
れている酵素産生菌が知られているが、この酵素産生菌
は、表１（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳ
ｙｓｔｅｍＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，ｐ
ａｇｅ１２９４のＴａｂｌｅ１５・１１（１９８
６）から転載）及び上記明細書の記載から明らかなよう
に、アースロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）である。これ
に対して、本発明のアースロバクターは、種がクリスタ
ロポイーテスであり、寄藤らの用いているヒスタミンオ
キシダーゼ産生菌とは別種のものである。

【００１９】

【表１】

【００２０】また、上記アースロバクター・クリスタロ
ポイーテスと上記アースロバクター・グロビホルミスと
は、ペプチドグリカンタイプ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｒｙｃ
ａｎｔｙｐｅＧｒｏｕｐ３、即ちＬｙｇ−Ａｌａ１
−４）における相同性の指数（ｉｎｄｅｘ）がクリスタ
ロポイーテス１００に対し、グロビホルミスは１９であ
り、両株の相同性は極めて低く、クリスタロポイーテス
のＤＮＡについては、指数１０〜１９％で、相同性はほ
とんどない（ＡｒｃｈｅｉｖｅｓｏｆＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２０，ｐａｇｅ２８９〜２
９５（特にＴａｂｌｅ２及びｐａｇｅ２９の右欄、
Ｇｒｏｕｐ３の記載）（１９７９））。更に、上記表
１に示したように、グロビホルミスはデンプン加水分解
能を有するのに対し、クリスタロポイーテスはデンプン
加水分解能がなく、生理学的特性の異なるものである。

【００２１】また、本発明のアースロバクターは、１６
ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の解析によってもクリスタロ
ポイーテスであることが確認されている。以下の表２及
び表３に、本発明のアースロバクター・クリスタロポイ
ーテスの菌学的性質を示す。なお、上記寄藤らの公開公
報には、アースロバクターをヒスタミンの定量に固定化
して使用できることの具体的記載はない。

【００２２】

【表２】

【００２３】

【表３】

【００２４】上述した本発明のアースロバクター・クリ
スタロポイーテスは、従来公知のヒスタミンオキシダー
ゼと異なる、熱安定性などの優れた特性を有するヒスタ
ミンオキシダーゼを産生する。かかる本発明のヒスタミ
ンオキシダーゼは、以下に記載するように、優れた基質
特異性や熱安定性の他にも固定化率などが良好であり、
また固定化の際の失活が少ないなどの優れた特性を有す
る。

【００２５】まず、本発明のヒスタミンオキシダーゼ
（フリーエンザイム）の理化学的特性について説明す
る。上記グロビホルミスが産生するヒスタミンオキシダ
ーゼは、至適ｐＨ８．０、熱安定性６０℃以下、分子量
７３０００、基質特異性はカダベリン（Ｃａｄａｖｅｒ
ｉｎｅ）及びプトレッシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）で
５．９％であるのに対し、上記クリスタルポイーテスが
産生する本ヒスタミンオキシダーゼは、表４及び図１に
示したように、至適ｐＨ９、熱安定性７０℃以下、至適
温度４５℃、分子量７００００〜８００００、基質特異
性はカダベリン及びプトレッシンで０％であり、これら
の腐敗性アミンには全く応答せず、本発明に係るヒスタ
ミン測定に適合する差異が認められた。

【００２６】

【表４】

【００２７】即ち、本発明のヒスタミンオキシダーゼ
は、腐敗性アミンのプトレッシン、カダベリンには全く
応答せず、後述する本ヒスタミン測定に適合する差異性
を有している。なお、チラミン（Ｔｙｒａｍｉｎｅ）に
対する応答性は実用上の問題にはならないものである。

【００２８】また、本発明のヒスタミンオキシダーゼ
は、熱安定性、即ち耐熱性が高い。この性質は、実用上
特に重視すべき特性である。図２に示したように、寄藤
らの用いたグロビホルミスＩＦＯ１２１３７株は、
６０℃以上の加熱処理（１０分）により失活するのに対
し、本発明のヒスタミンオキシダーゼを産生するクリス
タロポイーテスＫＡＩＴ−Ｂ−００７株では、７０℃
を超える温度付近で初めて活性低下を示し、極めて耐熱
性の高い菌株であることが明らかである。よって、この
特性を活用すれば耐熱性の高いバイオセンサーを得るこ
とができる。この高い耐熱性は、現在、輸出指向の水産
加工業が最も活発化しているタイなどの暑い国、アセア
ン地域などでの利用上特に有効である。

【００２９】更に、本発明のヒスタミンオキシダーゼ
は、担体への固定化率が高く、特にタンパク質を基準と
した固定化率は、３０〜９５％程度である。ヒスタミン
オキシダーゼをヒスタミン測定などに利用するときに
は、酵素の触媒的性質を利用した反復使用を可能にすべ
く、担体に固定化して用いることが好ましいが、例え
ば、従来のヒスタミン測定に用いられているモノアミン
オキシダーゼを固定化しようとすると、この酵素が変性
してしまい、固定化率が数％程度になってしまう。ま
た、公知のヒスタミンオキシダーゼに関しては、固定化
に関する具体例は全くない。これに対し、本発明のヒス
タミンオキシダーゼは、例えばグルタルアルデヒド架橋
法によって担体に固定化した場合、固定化率が９０％以
上と極めて高い。

【００３０】また、かかる固定化の際の失活が少なく、
活性発現率が高いことも、本発明のヒスタミンオキシダ
ーゼの利点であり、具体的には、上記固定化の際の活性
発現率は５０〜９５％程度である。よって、従来のヒス
タミン測定に用いられているモノアミンオキシダーゼの
場合の活性発現率３〜１０％に比べて極めて失活率が小
さく、ほとんど失活することなく担体に固定化できる。

【００３１】次に、本ヒスタミンオキシダーゼを担体に
固定した、本発明の固定化ヒスタミンオキシダーゼにつ
き説明する。かかる固定化ヒスタミンオキシダーゼの製
法としては、通常の固定化酵素の製法である担体結合
法、架橋法や包括法等が挙げられるが、固定化ヒスタミ
ンオキシダーゼの使用目的・使用形態により、最適な方
法を採用すればよく、特に限定されるものではない。例
えば、ヒスタミンの測定に固定化ヒスタミンオキシダー
ゼを利用するには、固定化ヒスタミンオキシダーゼをカ
ラムに詰めて使用することなどが考えられ、この場合、
カラムに詰めるビーズ状担体にヒスタミンオキシダーゼ
を固定化すればよい。

【００３２】また、本発明のヒスタミンオキシダーゼを
固定化すれば、従来のアミンオキシターゼのような固定
化による失活を起こす欠点がないだけではなく、かかる
固定化により、ヒスタミン測定装置の一例であるバイオ
センサーやフローアンペロメトリー等への利用において
好都合なｐＨ特性や耐久性に改質され、利用し易く何度
も使用できるものが得られる。なお、上記担体として
は、各種多孔性材料、即ち多孔性樹脂や多孔性セラミッ
クス、具体的には、多孔性アルキルアミノ化ガラス、多
孔性アミノ化ポリアクリロニトリル又は多孔性アルキル
アミノ化セラミックス及びこれらの組合せを利用した担
体を挙げることができる。また、担体形状としては、布
状や粒状などが挙げられるが、特にこれらに限定される
ことなく、通常の固定化担体に用いられるもののいずれ
でもかまわない。

【００３３】次に、本発明のヒスタミン測定装置につい
て説明する。上述した本発明のヒスタミンオキシダー
ゼ、特に固定化ヒスタミンオキシダーゼを用いれば、反
復乃至は連続使用に耐えるヒスタミン測定装置を作製す
ることができる。即ち、ヒスタミンオキシダーゼは、ヒ
スタミンが水と酸素と反応してイミダゾールアセトアル
デヒドになり、アンモニアと過酸化水素を発生する反応
を促進する。よって、この反応系で生成又は消費される
物質、例えば過酸化水素（生成）、アンモニア（生成）
及び酸素（消費）などを検出できるセンサーと、本発明
の固定化ヒスタミンオキシダーゼを組み合わせれば、ヒ
スタミン測定装置が得られるのである。

【００３４】具体的には、固定化ヒスタミンオキシダー
ゼを充填したカラムと過酸化水素電極を用いたヒスタミ
ン測定装置などが挙げられる。本発明のヒスタミン測定
装置は、上述の固定化ヒスタミンオキシダーゼを利用し
ていることにより、従来のヒスタミン測定法に比較し
て、食品中のヒスタミンの定量を極めて迅速且つ容易に
行うことができ、しかも感度や再現性も上述した法規制
に対して十分なものを得ることができる。

【００３５】また、装置構造、特に試料の供給形式など
には限定されるものではなく、フローインジェクション
方式も採用でき、これにより、回分式で使われるリアク
ター洗浄の手間と時間が省略され、迅速且つ経済的な酵
素の分析が可能になる。更に、本発明の固定化ヒスタミ
ンオキシダーゼは極めて長寿命であるため、ランニング
コストも低く産業的利用に適しており、従来実施されて
いないヒスタミンのフィールド検索を可能にするもので
あり、ＳｅａｆｏｏｄＨＡＣＣＰの実行を容易にする
ことができる。なお、上述した大橋らの酵素分析法は回
分リアクターを用いるため、測定の度毎にリアクターを
丁寧に洗浄して、酵素のキャリーオーバーをなくす必要
があり、これに１０数分を要することを余儀なくされた
が、フローインジェクション方式を採用した本発明のヒ
スタミン測定装置によれば、洗浄に要する時間と手間を
削減することができる。

【００３６】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００３７】（クリスタロポイーテスの分離・培養及び
ヒスタミンオキシダーゼの産生）本発明に係るクリスタ
ロポイーテスは、０．１％ヒスタミン二塩酸塩を含む寒
天平板（寒天２％，ｐＨ７．０）を用いる集積培養法に
より、京都府中郡大宮町近郊のほうれん草畑の土壌から
分離された。また、本発明に係るヒスタミンオキシダー
ゼは、上記菌を下記の組成を有する培地のもとでロータ
リーシェーカー（回転速度２００ｒｐｍ）を用いて培養
して得られた。

【００３８】［培地組成］成分配合量（ｗｔ／ｖｏｌ％） ────────────────────── ヒスタミン０．１酵母エキス０．０５ペプトン０．０３ＫＨ_２ＰＯ_４０．１Ｋ_２ＨＰＯ_４０．２ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．０００５ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ＮａＣｌ０．２ ────────────────────── 初発ｐＨ７．０培養温度３０℃ 培養時間１７〜２１時間

【００３９】（酵素活性の測定方法）ヒスタミンをヒス
タミンオキシダーゼで酸化させ、酸化反応で生じる過酸
化水素を、４−アミノアンチピリン及びＤＡＯＳ（Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
３，５−ジメトキシアニリン）の存在下でペルオキシダ
ーゼと共役させて、青色キノン色素（６００ｎｍ）に導
く比色法を用いた。具体的には、ペルオキシダーゼ（５
Ｕ）、４−アミノアンチピリン（１．５ｍＭ）、ＤＡＯ
Ｓ（１ｍＭ）、トリトンＸ−１００（０．０５％）及び
ヒスタミン（１ｍＭ）を含む容量１．０ｍｌの溶液を３
７℃で５分間予備加熱した後、ヒスタミンオキシダーゼ
（０．１ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させた。し
かる後、０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
を２．０ｍｌ添加し、６００ｎｍの比色法で測定した。
なお、酵素活性の計算式は、以下の通りである。酵素活性（Ｕ）＝（ＡΔ_６００／５）／１６．８×
（３．１／０．１）

【００４０】（酵素の採取方法）液体培養した後、４℃
及び１３００ｒｐｍで遠心分離を行って菌体を得、これ
を２０ｋＨｚで３０秒間超音波処理して細胞を破砕し、
粗酵素液を抽出した。その後、３０〜７５％の硫酸アン
モニウムで塩析を行い、上清と沈殿を分離した。次い
で、上述のようにして得られた沈殿をセロファンチュー
ブで透析し、リン酸塩緩衝液を用いてＤＥＡＥ−イオン
交換セファロースカラムでグラジエント溶出して、０．
１５ｍＭ〜０．３ｍＭの画分を得、この画分をマイクロ
コンチューブで濃縮した。しかる後、この濃縮物をリン
酸塩緩衝液及び塩化ナトリウム溶液を用いてＤＥＡＥ−
イオン交換セファロースカラムで溶出し、更にマイクロ
コンチューブで濃縮し、目的とするヒスタミンオキシダ
ーゼを得た。

【００４１】（至適緩衝液の検討）上述のようにして得
られた本発明のヒスタミンオキシダーゼの至適緩衝液に
ついて検討した。ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒ、
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨＢｕｆｆｅｒ、Ｂｉｃｉｎｅ−
ＮａＯＨＢｕｆｆｅｒ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＢｕｆｆ
ｅｒの４つについて、サンプル量１０μｌ、反応温度３
７℃、反応ｐＨ７．５の条件下で検討したところ、図３
に示したように、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ピペラジン−
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））を用いたと
きに、最大活性が示された。但し、安価なＰｈｏｓｐｈ
ａｔｅＢｕｆｆｅｒ（リン酸塩緩衝液）であっても十
分使用できることも明らかであり、こちらの方が実用的
である。

【００４２】（固定化ヒスタミンオキシダーゼの作製）
次に、カラムに入れて用いる粒子状の固定化ヒスタミン
オキシダーゼの作製例を示す。本ヒスタミンオキシダー
ゼ溶液（０．１Ｕ／ｍｌ）を調製し、固定化担体（各種
アルキルアミノ化ユニポートＣ（王子計測機器製）粒子
径３０〜６０メッシュ、細孔径５μｍ以下、表面積４ｍ
^２／ｇ）にグルタルアルデヒド架橋法により固定化し
た。この際、本ヒスタミンオキシダーゼの固定化率をタ
ンパク量から求めたところ、９１％であり、Ｋａｒｕｂ
ｅらによる固定化モノアミンオキシダーゼの固定化率
２．４％と比べて、顕著な差があった。

【００４３】（固定化ヒスタミンオキシダーゼの特性）＜至適ｐＨ＞固定化する前の本ヒスタミンオキシダーゼ
溶液は、図４に示したように、ｐＨ９付近の甚だ狭い領
域で最大活性を示しただけであるのに対し、固定化ヒス
タミンオキシダーゼでは、活性が中性域にシフトし、ｐ
Ｈ６．７〜８．５の広い領域で安定な最大活性を示し
た。従って、本ヒスタミンオキシダーゼを固定化するこ
とにより、実用に好適なｐＨ特性を実現することができ
る。

【００４４】＜基質特異性＞本発明のヒスタミンオキシ
ダーゼ（フリーエンザイム）は、上述のように、基質特
異性についてカダベリン及びプトレッシンは０％であ
り、また、図５に示したように、固定化後のヒスタミン
オキシダーゼであってもフリーエンザイムの有する上記
基質特異性は変化せず、カダベリンとプトレッシンのい
ずれも０％であった。従来法では、カダベリン、プトレ
ッシンやトリプタミン等の腐敗性アミンを除去していた
が、本発明のヒスタミンオキシダーゼを用いれば、この
操作をすることなく、腐敗性アミンの共存する試料液で
あってもヒスタミンの選択的定量が可能となる。

【００４５】＜固定化ヒスタミンオキシダーゼの耐久性
＞０．１ｍＭ（１１．１ｍｇ／Ｌ）のヒスタミン溶液を
モデル試料とし、直径４ｍｍ、長さ３０ｍｍ、容積０．
４ｍｌの固定化ヒスタミンオキシダーゼカラムに対し、
０．３ｍｌ／ｍｉｎのキャリアー流速の下、３７℃の温
度におけるヒスタミン測定を反覆し、夜間は４℃の冷蔵
庫に保存しながら、約１ヶ月に亘る固定化ヒスタミンオ
キシダーゼカラムの連続使用を行った。酵素活性は極め
て安定に保たれ再現性も優れ、測定値の相対変動係数
（Ｒ．Ｓ．Ｄ）は、ｎ＝５０の条件で０．５％という低
い値であった。従って、従来の固定化酵素に比べ、耐久
性が非常に優れており、実用に適しているといえる。な
お、上述のように、アースロバクター・クリスタロポイ
ーテスから産生されるヒスタミンオキシダーゼは耐熱性
が高いことから、固定化ヒスタミンオキシダーゼの耐熱
性も高いといえる。

【００４６】（ヒスタミンの測定方法）市販のフローイ
ンジェクション分析計（王子計測機器製、ＢＦ−４型）
を用いて、図６に示すようなヒスタミン測定装置を作製
した。図６において、符号１はキャリヤー液、２はポン
プ、３はインジェクター、４は流管、５はカラム、６は
過酸化水素電極、７は加電圧・出力電流増幅装置、８は
レコーダ又はコンピュータを示している。

【００４７】好適温度（例えば３７℃）に保持したキャ
リアー液１（例えば０．１Ｍリン酸塩緩衝液）をポンプ
２を用いて定流速（０．１〜０．３ｍｌ／ｍｉｎ）で流
管４に流しつつ、試料液をインジェクター３から（例え
ば１０μｌ）注入した。試料中のヒスタミンは、上述の
方法で調製した固定化ヒスタミンオキシダーゼを充填し
たカラム５（φ＝４ｍｍ、Ｌ＝３０ｍｍ、Ｖ＝０．４ｍ
ｌ）で、固定化ヒスタミンと接触することにより、次式
（１）

【００４８】

【化１】

【００４９】で表される反応を起こし、ヒスタミンと等
モルの過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）が生成される。このよう
にして生成されたＨ_２Ｏ_２は、加電圧・出力電流増幅装
置７で（＋）６００ｍＶに加電圧された過酸化水素電極
６に対して、次式（２）Ｈ_２Ｏ_２→（過酸化水素電極）→Ｈ_２ ^２＋＋２ｅ⁻＋Ｏ_２…（２）で表される反応により、酸化電流を発生する。

【００５０】電流は加電圧・出力電流増幅装置７で増幅
後、レコーダ又はコンピュータ８（例えばｗｉｎｄｏｗ
ｓの分析用解析ソフトウエア付き）によりヒスタミン濃
度に演算デジタル表示記録される。なお、上記カラム５
及び過酸化水素電極６を有する電極部はキャリヤーによ
り自動洗浄されるので、直ちに次の試料液を注入して約
２．５ｍｉｎのインターバルで分析することができる。

【００５１】図７に示したように、ヒスタミン濃度と電
流値の間に原点を通る直線関係（電流による定量）が得
られるので、ヒスタミンのアンペロメトリーができる。
その測定範囲は０．１〜３．０ｍＭ（約１０〜３００ｍ
ｇ／Ｌ）で、例えば魚肉ヒスタミンのモニターリングに
好適である。

【００５２】（測定例）ヒスタミンを生成し易い赤身魚
のサバ、マグロについて、ヒスタミン含有の測定を実施
した。試料は３８℃で２〜６日保存してヒスタミン量を
増やしたものを用いた。まず、魚肉５ｇを秤取し、図８
に示したように、０．１Ｍリン酸塩緩衝液を加え、破砕
後、加熱処理し、遠沈、ろ過して抽出液を調製した。各
抽出液について上記要領でヒスタミンのアンペロメトリ
ーを行うと共に、ＨＰＬＣ法を同時に行なった。表５に
示したように、両法の結果は極めてよく一致した。

【００５３】

【表５】

【００５４】なお、念のため３７℃に６日保存した試料
の抽出液にヒスタミンを添加して測定したところ、表６
に示したように、９７〜１００％の高い回収率が得られ
た。

【００５５】

【表６】

【００５６】また、上記測定は、サンプリング時間も含
め２．５ｍｉｎの短時間に行うことができ、固定化酵素
カラムは夜間は４℃で冷蔵保存して１ヶ月間使用でき
た。

【００５７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
特定菌株から所定の特性を有しヒスタミンの定量に好適
であり、熱安定性を有する新規なヒスタミンオキシダー
ゼを産生させることなどとしたため、熱安定性を有し、
優れた固定化率を有するヒスタミンオキシダーゼ及びそ
の産生菌、並びに食品中等のヒスタミンを測定する場合
等に使用するのに好適な固定化ヒスタミンオキシダーゼ
及びこれを用いたヒスタミン測定装置を提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】基質特異性を比較したグラフである。

【図２】熱安定性を示すグラフである。

【図３】至適緩衝液に対する相対活性を示すグラフであ
る。

【図４】ｐＨに対する相対活性を示すグラフである。

【図５】基質特異性を示すグラフである。

【図６】ヒスタミン測定装置の概要図である。

【図７】ヒスタミン濃度と電流値の関係を示すグラフで
ある。

【図８】試料の調製法を示すフローチャートである。

【符号の説明】

１キャリヤー液２ポンプ３インジェクター４流管５カラム６過酸化水素電極７加電圧・出力電流増幅装置８レコーダ又はコンピュータ

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06）Ｃ１２Ｒ 1:06）Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA21 BB16 CC03 CC10 CC13 FA12 4B033 NA01 NA23 NB13 NB25 NB27 NB36 NB62 NB68 NC05 ND05 ND08 ND09 NE02 NF04 NF05 4B050 CC01 DD02 EE02 FF04E FF05E FF11E GG10 LL03 LL05 4B063 QA01 QQ16 QQ61 QR03 QR83 QS36 QS39 QX05 4B065 AA13X AC12 AC14 AC16 BA23 BB03 BB12 BB24 BB29 BC02 BC03 BC26 BD01 BD15 BD16 BD17 BD50 CA28 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】熱安定性を有するヒスタミンオキシダー
ゼを産生することを特徴とするアースロバクター・クリ
スタロポイーテス。
【請求項２】請求項１記載のアースロバクター・クリ
スタロポイーテスから産生され、７０℃以下で熱的に安
定であることを特徴とするヒスタミンオキシダーゼ。
【請求項３】タンパク質量を基準とした担体への固定
化率が３０〜９５％であることを特徴とする請求項２記
載のヒスタミンオキシダーゼ。
【請求項４】上記固定化の際の活性発現率が５０〜９
５％であることを特徴とする請求項２又は３記載のヒス
タミンオキシダーゼ。
【請求項５】請求項２〜４のいずれか１つの項に記載
のヒスタミンオキシダーゼを担体に固定化して成ること
を特徴とする固定化ヒスタミンオキシダーゼ。
【請求項６】ｐＨ６．７〜８．５で良好な活性を示す
ことを特徴とする請求項５記載の固定化ヒスタミンオキ
シダーゼ。
【請求項７】上記担体が、多孔性アルキルアミノ化ガ
ラス、多孔性アミノ化ポリアクリロニトリル及び多孔性
アルキルアミノ化セラミックスから成る群より選ばれた
少なくとも１種のものであることを特徴とする請求項６
記載の固定化ヒスタミンオキシダーゼ。
【請求項８】請求項５〜７のいずれか１つの項に記載
の固定化ヒスタミンオキシダーゼと、酸素センサー、ア
ンモニアセンサー及び過酸化水素センサーから成る群よ
り選ばれた少なくとも１つのセンサーを備えることを特
徴とするヒスタミン測定装置。