ITTO20070455A1 - Procedimento di determinazione e di separazione di isoforme di gamma-glutamiltransferasi (ggt) sierica in un campione di fluido biologico e isoforme enzimatiche cosi' ottenute - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento di determinazione e di separazione di isoforme di gamma-glutamiltransferasì (GGT) sierica in un campione di fluido biologico e isoforme enzimatiche così ottenute"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un procedimento di determinazione e di separazione di isoforme dell'enzima gamma-glutamiltransferasi sierica (sGGT) presenti in un campione di fluido biologico quale ad esempio siero o plasma, nonché le isoforme enzimatiche ottenute con il procedimento dell'invenzione.

La gamma-glutamiltransferasi (EC 2.3.2.2, anche indicata come gamma-glutami1 transpeptidasi) è un enzima presente nel sangue (5), nella maggior parte dei fluidi biologici e sulla membrana piasmatica della maggior parte dei tipi cellulari. Alcuni tessuti, come la corticale del rene, i plessi corioidei del cervello, le strutture biliari, la ghiandola mammaria in lattazione, sono particolarmente ricchi di GGT (6). Inoltre, particolarmente ricchi di GGT sono la maggior parte dei tumori solidi (7), così come le cellule leucemiche mieloidi e linfoìdi della serie T (8).

La GGT è l'unico enzima in grado di catalizzare l'idrolisi del glutatione (GSH), il più importante antiossidante delle cellule dei mammiferi (9). Il fatto che la GGT sia localizzata sulla superficie esterna della membrana cellulare lascia supporre che il suo substrato sia principalmente il GSH extracellulare, e risultati sperimentali ottenuti dai presenti inventori ne hanno fornito una prova. L'idrolisi del glutatione, che nelle cellule tùbulari renali e negli altri tessuti contenenti normalmente GGT ha una funzione fisiologica di recupero del GSH, ha però conseguenze dannose nei tessuti patologici, con produzione di specie reattive dell'ossigeno, di radicali liberi e l'innesco di eventi ossidativi a carico delle strutture cellulari (10). Inoltre, nelle cellule tumorali l'espressione di elevate attività di GGT conferisce resistenza nei confronti degli agenti chemioterapici antitumorali, in virtù della particolare reattività dei prodotti dell'idrolisi extracellulare del GSH, che sono in grado dì interagire con i farmaci ed inattivarli (11).

Le funzioni fisiologiche della GGT presente nel circolo sanguigno, ossia la GGT sierica (sGGT), non sono finora ben definite, ma è noto che l'attività di sGGT si modifica secondo l'età, il sesso, lo stato fisiologico ed in conseguenza di patologie tra le quali quelle epato-biliari e l'alcolismo. Per questo motivo la determinazione dell'attività di sGGT è un test comunemente utilizzato in chimica clinica, dal momento che i livelli di sGGT vengono considerati un marcatore di patologie epatobiliari e di consumo di alcool.

Valori elevati (patologici) di sGGT vengono riscontrati in molti pazienti, ma solo in una percentuale minima di casi viene effettivamente diagnosticata una malattia epatica o viene confermato l'abuso di alcool. Molti pazienti vengono sottoposti ad un lungo e costoso iter diagnostico (come ad es. esami di laboratorio, ecografie, biopsia epatica, etc.) senza che ciò conduca, in ultima analisi, alla diagnosi di alcuna patologia in corso.

Negli anni recenti è inoltre emerso che la sGGT, indipendentemente dalla presenza di una patologia epatica, è uno dei più potenti predittori di morbilità e di mortalità precoce. Lavori pubblicati nell'ultimo decennio hanno infatti dimostrato che livelli di sGGT finora considerati non patologici, ma che comunque si situano nella parte alta (sGGT > 25 U/L) della fascia di riferimento (sGGT 5-50 U/L), si accompagnano ad aumentata mortalità cardiovascolare ed al rischio di diabete (1, 2, 3). Ancora più recentemente è emerso che il livello di sGGT determinato al ricovero è il più potente indicatore di evoluzione sfavorevole di numerose patologie, non solo cardiovascolari ma anche neoplastiche, degenerative ed altre (4). E' evidente che un indicatore di mortalità e morbilità così potente potrebbe essere di grande utilità clinica, ma il fatto che il suo valore predittivo sia di così ampio spettro non permette di predire, con la sola determinazione della sGGT, la patologia da cui il paziente sarà colpito né tanto meno il suo esito, né di orientare il successivo iter diagnostico-terapeutico. Per questo motivo la determinazione dell'attività di GGT sierica è considerato un test di laboratorio sensibile e accurato, ma purtroppo poco specifico.

In effetti, per quanto i determinanti dei livelli di sGGT siano noti, poco si sa sull'origine, la natura, le funzioni ed il destino di questo enzima. Tra i determinanti positivi vi sono ad esempio il consumo di alcool, l'assunzione di farmaci - tra cui gli anticoncezionali orali - l'età, malattie quali il diabete, 1'ipertensione arteriosa, 1'ipercolesterolernia, mentre tra i determinanti negativi vi sono l'attività fisica, il consumo di caffè, la capacità ventilatoria polmonare (1).

Numerose indagini si sono rivolte allo studio dei differenti isoenzimi della GGT (12), nel tentativo di stabilire ima correlazione con specifiche patologie e/o diversi tessuti di origine.

In realtà, dal momento che nell'essere umano è stato identificato un solo gene capace di codificare la GGT attiva (13), non è completamente corretto utilizzare il termine "isoenzima" per riferirsi alle diverse forme di GGT rilevabili, bensì appare più corretto utilizzare il termine generico di isoforme*E'noto da tempo che, con l'uso di varie metodiche, è possibile distinguere tra le GGT originate da tessuti diversi, nonché tra le diverse forme di GGT sierica, così come è possibile dimostrare la comparsa di diverse forme di GGT nel corso di malattie, o perlomeno la variazione del pattern delle diverse forme di GGT.

Per rivelare e separare le isoforme dì GGT sono state utilizzate diverse tecniche, che tuttavia sono gravate da due importanti problemi. Il primo consìste nella scarsa sensibilità della determinazione, mentre il secondo origina dalla estrema lipofilia della proteina che obbliga in molti casi alla digestione proteolitica della GGT allo scopo di ottenere il distacco della porzione terminale lipofila così da consentire l'analisi della proteina in sistemi liquidi.

Attraverso le tecniche di gel filtrazione, elettroforesi in gel d'agarosio, isoelectrofocusing, affinità con lectine, cromatografia per scambio anionico (ossia procedure che prevedono la digestione proteolitica dell'enzima e che sono utilizzabili sia su estratti tissutali che su plasma) è stato possibile dimostrare che tessuti diversi producono la stessa proteina enzimatica ma con diversa glìcosilazione e quindi con diversa carica elettrostatica superficiale (14).

Quanto alla GGT sierica, essa appare omogenea con alcune tecniche (ad esempio lo scambio anìonico) ma eterogenea con altre (ad esempio l'elettroforesi in gel d'agarosio o su acetato di cellulosa). Grazie agli studi di Huseby (5, 15) tale apparente incongruenza è stata chiarita: nel circolo sanguigno è presente la sola GGT di origine epatica, per cui l'enzima rilevabile in un fluido biologico quale piasma, siero o urina appare omogeneo quando sì utilizzano tecniche che implicano proteolisi e che separano secondo la carica elettrostatica, mentre quando si utilizzano tecniche che non implicano proteolisi l'identificazione di diverse isoforme dipende, almeno in parte, dalla capacità della GGT di associarsi alle diverse lipoproteine piasmatiche (16).

Sfortunatamente la scarsa sensibilità di queste tecniche ha permesso di studiare il problema delle eterogeneità solo in pazienti con valori di GGT elevati (come ad esempio i soggetti affetti da colestasi), per cui i meccanismi, i determinanti e la precisa correlazione fisiopatologica dell'associazione della GGT sierica con le diverse lipoproteine non sono stati ancora chiariti, né è veramente certo se anche ai livelli normali di attività enzimatica nel siero sia presente solamente la GGT epatica.

Al momento attuale la determinazione chimicoclinica della GGT viene effettuata con un saggio cinetico enzimatico (17) basato sulla decomposizione di un substrato cromogenico (gamma-glutamil-4-nitroanilide o gamma-glutamil-3-carbossi-4-nitroanilide), con liberazione di un prodotto colorato (4-nitroanilina) in quantità proporzionale all'attività di GGT presente nel campione.

La determinazione delle isoforme della GGT è stata proposta commercialmente con un'apparecchiatura (Beckman Paragon) che sostanzialmente comporta l'elettroforesi delle proteine sieriche su un supporto di acetato di cellulosa (in analogia con la normale elettroforesi delle proteine sieriche) e la rivelazione della presenza di bande di GGT co-migrate con le proteine sieriche tramite l'ausilio di un substrato che produce un prodotto colorato in proporzione alla quantità di GGT presente nella banda (18). In tal modo si ottiene un tracciato nel quale sono evidenziabili diverse bande di GGT, ed in particolare viene evidenziata una banda di GGT che co-migra con l'albumina, nonché diverse altre bande che co-migrano in corrispondenza di lipoproteìne sieriche. Con tale procedura non è possibile determinare se la GGT sia fisicamente associata all'albumina ed alle 1ipoproteine o se semplicemente essa produca bande che migrano con la stessa velocità sul supporto.

La questione della natura delle diverse isoforme di GGT ha ricevuto un interesse marginale negli ultimi anni, giacché non è stato possibile identificare alcuna correlazione patologica tra la presenza/assenza o l'intensità, assoluta o relativa, delle diverse isoforme della GGT e le malattie studiate (ad eccezione che nel caso dell'epatocarcinoma; 19, 20). Questo fallimento è stato principalmente causato dal fatto che, finora, la GGT è stata erroneamente considerata solamente come un marcatore di danno epatobiliare o di abuso di alcool- Per questi motivi tale tecnica non ha mai approdato ad alcun impiego clinico.

Recentemente, grazie a studi effettuati dai presenti inventori, è stato dimostrato che:

1) la GGT è un fattore di rischio cardiaco (21);

2) la GGT è presente all'interno della placca aterosclerotica {responsabile di patologie quali infarto cardiaco ed ictus) in lesioni sia cerebrali sia carotidee e cardiache (10, 22, 23);

3) all'interno della placca aterosclerotica la GGT si trova associata ai depositi di lipoproteine ossidate (22);

4) la GGT stessa è capace dì causare l'ossidazione delle lipoproteine LDL (24), un evento considerato cruciale sia per la formazione della placca aterosclerotica sia per la sua destabilizzazione, che causa le conseguenze terminali della malattia aterosclerotica, ossia l'infarto cardiaco e l'ictus.

Per questi motivi studiare in dettaglio l'associazione della GGT sia con le lipoproteine che causano l'aterosclerosi (ad esempio LDL ed Lipoproteina(a)) sia con quelle che la prevengono (ad es. HDL), così come tutte le isoforme tissutali e sieriche della GGT, potrebbe portare ad avanzamenti sostanziali nella prevenzione delle malattie cardiovascolari, nello sviluppo di farmaci metabolici e cardio-vascolari, così come nella diagnosi e diagnosi differenziale delle patologie in cui possono giocare un ruolo importante l'incremento dei livelli di GGT o la modificazione delle sue isoforme.

Tuttavia, tali studi non possono essere effettuati con le tecniche di determinazione di GGT attualmente disponibili, in quanto tutte le procedure che implicano proteolisi (isoelctrofocusing, cromatografia a scambio anionico e per affinità, etc.) causano il distacco della GGT dai diversi vettori plasmatici.

La migrazione differenziale delle proteine nelle procedure di tipo elettroforetico è dovuta alla combinazione di svariati fattori (tra i quali la carica, la massa, il volume, ecc.) per cui con queste tecniche non è possibile determinare la precisa natura di ciascuna banda, dal momento che la formazione di ciascuna singola banda è determinata dall'azione concomitante di più fattori.

Le procedure nelle quali le lìpoproteine vengono separate per precipitazione con policationi potrebbero essere utilizzate (ad esempio precipitando una singola classe di lipoproteine e determinando quanta GGT è precipitata con essa), ma queste tecniche non offrono una sufficiente specificità, in quanto la precipitazione delle diverse lipoproteine non è sufficientemente selettiva ed è eccessivamente influenzata dalle condizioni di temperatura e di pH.

La separazione delle lipoproteine potrebbe essere conseguita con tecniche di ultracentrìfugazione su gradiente di densità, nelle quali le diverse classi di lipoproteine vengono separate in virtù della loro diversa densità centrifugando campioni di siero o plasma su gradienti continui o discontinui. Tali procedure, tuttavia, implicano l'uso di apparecchiature (ultracentrifughe) poco cornimi nei laboratori di analisi biologiche e soprattutto necessitano di tempi di centrifugazione molto lunghi {nell'ordine delle decine di ore) che possono comportare il deterioramento dei campioni.

Vi è dunque la necessità di un procedimento per la determinazione di isoforme di GGT sierica che sia sufficientemente sensibile da permettere la rivelazione dell'enzima anche nella fascia dei valori considerati non patologici (sGGT 5-50 U/L).

Un siffatto saggio permetterebbe di distinguere e quantificare le diverse isoforme di GGT sierica, o i diversi pattern di isoforme dì GGT sierica, consentendo di studiare la correlazione fra ciascuna isoforma o pattern di isoforme e specifiche patologie. Ciò porterebbe ad un miglioramento della capacità diagnostica nonché a considerevoli risparmi in termini di costi sia umani sia economici.

È quindi uno scopo della presente invenzione fornire un procedimento per la determinazione di isoforme di gamma-glutamiltransferasi sierica (sGGT) in un campione di un fluido biologico, che sia piu sensibile, accurato, semplice ed economicamente vantaggioso rispetto ai procedimenti divulgati nella tecnica anteriore.

È un altro scopo della presente invenzione fornire un procedimento per la determinazione di isoforme sGGT in un campione di un fluido biologico, che permetta l'identificazione e quantificazione delle varie isoforme di sGGT presenti nel campione.

E' un ulteriore scopo della presente invenzione fornire un procedimento per la determinazione di isoforme di sGGT in un campione di un fluido biologico, che permetta l'identificazione delle isoforme secondo un solo parametro chimico-fisico, ossìa il peso molecolare, così da rendere possibile la quantificazione della GGT associata fisicamente a ciascuna classe di 1ipoproteine.

Questi ed altri scopi sono raggiunti tramite un procedimento per la determinazione di ìsoforme di gamma-glutamiltransferasi sierica (sGGT) in un campione di fluido biologico, comprendente i passaggi di:

(a) separazione delle proteine sieriche presenti nel campione mediante cromatografia lìquida ad alte prestazioni (HPLC) con 1'ausilio dì una colonna HPLC per Gel Filtrazione atta a separare le proteine sieriche in funzione del peso molecolare, così da conseguire la separazione delle proteine sieriche in diverse frazioni e la conseguente separazione delle diverse isoforme di sGGT rispettivamente associate a ciascuna frazione;

(b) reazione post-colonna di ciascuna frazione proteica ottenuta nel passaggio precedente con un substrato per la gamma-glutamiltransferasi (GGT) atto a formare un prodotto rivelabile in presenza di GGT in tale frazione proteica;

(c) determinazione della presenza od assenza di prodotto rivelabile in ciascuna frazione proteica, la presenza dì prodotto rivelabile in una data frazione proteica essendo indicativa della presenza in detta frazione proteica della associata isoforma di GGT.

La determinazione delle isoforme di sGGT secondo il procedimento dell'invenzione può essere effettuata su un campione di qualsiasi fluido biologico contenente GGT, quale ad esempio plasma, siero, urina, od anche sovranatante di coltura cellulare e coltura batterica.

La descrizione dettagliata che segue, effettuata a titolo di esempio non limitativo, fa riferimento ai disegni annessi, in cui:

- la figura 1 è una rappresentazione schematica del procedimento dell'invenzione e della strumentazione che può essere utilizzata per attuarlo;

- la figura 2 mostra la curva di calibrazione dello standard di GGT ottenuta iniettando GGT nella colonna HPLC a diverse concentrazioni;

- la figura 3 mostra due cromatogrammi ottenuti da un campione di plasma iniettato nel sistema di figura 1. Linea continua: cromatogramma di fluorescenza ottenuto on-line utilizzando γ-Glu-AMC come substrato della reazione della GGT (λ∞= 380 nm e Xen,=440 nm); linea tratteggiata: cromatogramma a λ= 405 nm ottenuto atline utilizzando y-Glu-4-NA come substrato;

la figura 4 mostra profili di distribuzione dell'attività di GGT ottenuti iniettando nel sistema di figura 1, nelle condizioni riportate in Tabella I, dei campioni di plasma ottenuti da soggetti controllo (donatori di sangue); e

- la figura 5 mostra l'attività di GGT nel plasma e nelle rispettive frazioni lipoproteiche ottenute mediante ultracentrifugazione a diverse densità.

Facendo riferimento alla figura 1, il procedimento dell'invenzione può essere attuato facendo uso di una strumentazione per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), che presenta il vantaggio di essere presente sostanzialmente in tutti i laboratori di analisi. Il procedimento inoltre prevede una reazione on-line post-colonna dell'enzima GGT con un substrato di GGT atto a produrre un prodotto rivelabile, preferibilmente un composto colorato (cromoforo) o fluorescente (rivelabili rispettivamente mediante spettrofotometro e fluorimetro). Il cromatografo liquido è vantaggiosamente uno strumento di largo uso, automatizzabile, adatto all'analisi di routine, di costo contenuto, e può essere utilizzato anche da personale non specializzato. Il cromatografo liquido permette la separazione dei singoli componenti costituenti una miscela.

Nella parte A di figura 1 è rappresentata la separazione cromatografica del campione di fluido biologico da analizzare mediante l'ausìlio di un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) dotato di pompa, valvola di iniezione e colonna separativa. Il campione iniettato viene fatto passare attraverso la colonna separativa, cioè una colonna HPLC atta a separare le isoforme di GGT in base al loro peso molecolare, così da ottenere l'eluizione dalla colonna di diverse frazioni proteiche contraddistinte da uno specifico peso molecolare.

Nella parte B di figura 1 è rappresentata la miscelazione delle frazioni eluite dalla colonna con un substrato per la GGT atto a produrre un prodotto rivelabile, in particolare un composto colorato (ad esempio y-glutamil-4-nitroanilide) o fluorescente (ad esempio Y-glutamil-7-amido-4-metilcumarina), in presenza di una adatta concentrazione dì un accettore della reazione di transpeptidazione catalizzata dalla GGT. La miscelazione delle varie frazioni eluite dalla colonna con il substrato di GGT avviene in una spira di reazione (mixing coil) posta in un bagno termostatico ad una temperatura adatta ad accelerare la reazione enzimatica on-line post-colonna, ad esempio una temperatura di 37°C. La soluzione contenente il substrato per la reazione enzimatica on-line postcolonna è erogata da una pompa a siringa (ad esempio un comune perfusore per uso clinico dotato di una riserva o serbatoio). Infine, il prodotto colorato o fluorescente viene rivelato tramite registrazione dell'assorbanza o della fluorescenza del flusso in uscita dalla spira di reazione (effluente).

L'attività (quantità) di GGT presente in ciascuna frazione eluita e la dimensione molecolare della relativa isoforma enzimatica vengono determinati in base all'area del picco (quantità) e al tempo di ritenzione in colonna (peso molecolare).

Gli esempi che seguono sono forniti esclusivamente a scopo illustrativo e non vanno intesi in senso limitativo della portata dell'invenzioni come definita dalle annesse rivendicazioni.

Principi

Separazione delle iso forme

Le tecniche cromatografiche e, in particolare, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), consentono di separare due o più componenti di una miscela sfruttando l'equilibrio di affinità tra una fase stazionaria posta all'interno di una colonna cromatografica ed una fase mobile che fluisce attraverso la colonna stessa. Il principio alla base di questa tecnica è che una sostanza più affine alla fase stazionaria che alla fase mobile impiega un tempo maggiore per percorrere la colonna cromatografica rispetto ad una sostanza con bassa affinità per la fase stazionaria ed alta affinità per la fase mobile. Il campione da analizzare viene iniettato alla estremità iniziale della colonna cromatografica e, nella tecnica HPLC, esso viene sospinto attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile mediante l'applicazione di una pressione elevata. Per ottenere una separazione estremamente efficiente, caratteristica dell'HPLC, è necessario che le dimensioni delle particelle del riempimento siano molto ridotte. Per mantenere una ragionevole velocità di flusso dell'eluente, e quindi un tempo di analisi adeguato, è indispensabile applicare un'elevata pressione. All'estremità terminale della colonna sono presenti un rivelatore (detector), ad esempio un fluorimetro, uno spettrofotometro o un dispositivo elettrochimico, e un computer per identificare e/o quantificare le sostanze presenti nelle frazioni che man mano eluiscono dalla colonna.

La cromatografia HPLC consente l'identificazione e la quantificazione delle varie isoforme piasmatiche di GGT. Nel caso specìfico, le ìsoforme di GGT, avendo dimensioni molecolari significativamente diverse, sono trattenute in colonna con affinità diversa e presentano di conseguenza volumi di ritenzione (vR) diversi.

L'uso di una colonna per gel-filtrazione permette di separare molecole di dimensioni diverse in virtù del fatto che il materiale microporoso della fase stazionaria contiene anfratti (pori) di dimensioni variabili, in modo tale che molecole di dimensioni maggiori abbiano a disposizione uno spazio proporzionalmente più limitato per spostarsi nella fase stazionaria. In tal modo, l'iniezione a velocità costante di una soluzione tampone nella colonna fa muovere a velocità proporzionalmente maggiore le molecole più grandi, che possono usufruire di un volume più limitato per spostarsi. Le molecole più piccole, invece, potendo entrare sia nei pori di dimensioni maggiori sia in quelli di dimensioni minori, ai quali le molecole più grandi non possono accedere, avanzano lungo la colonna più lentamente. Utilizzando colonne per gel-filtrazione, e scegliendo opportunamente la porosità del materiale, è possibile separare le lipoproteine piasmatiche, come ad esempio descritto da Usui et al . (25) e da Okazaki et al. (26).

Infine, l'iniezione a velocità costante, a valle della colonna, di un reagente in grado di produrre una reazione rivelabile in presenza di GGT consente di determinare la quantità di GGT presente in ciascuna frazione di 1ipoproteine, ciascuna frazione essen do caratterizzata da un diverso peso molecolare e quindi da un diverso tempo di ritenzione in colonna.

Rivelazione delle isoforme

La reazione complessiva catalizzata dalla GGT può essere sinteticamente rappresentata nel modo che segue:

γ-Glu-Substrato+Accettare—<GGT>>Prodotto+γ-Glu-Accettore Questa reazione notoriamente procede secondo il seguente meccanismo a ping-pong modificato {27, 28): Passaggio (1): l'enzima lega il substrato donatore di gruppi gamma-glutamile e rilascia il primo prodotto della reazione:

γ-Glu-Substrato GGT - > γ-Glu-GGT Prodotto Passaggio (2): il risultante gamma-glutamil acilenzima (γ-Glu-GGT) può reagire con acqua (idrolisi) o con un substrato accettore (tipicamente un aminoacido o un dipeptide, quale ad esempio la glicìlglicina) a dare, nel secondo passaggio della reazione (deacilazione), rispettivamente il glutammato o un prodotto transpepidato:

γ-Glu-GGT GliciJglicina - > γ-Glu-gUcUglicina GGT

Un ulteriore aspetto innovativo della presente invenzione, oltre a quello di separare le isoforme sulla base di un unico parametro chimico-fisico, consiste nella realizzazione di un sistema di rivelazione sensibile e selettivo delle isoforme di GGT basato sulla reazione enzimatica on-line post-colonna in cui la reazione sopra descritta tra GGT e substrato viene fatta avvenire in una spira di reazione a valle della separazione cromatografica.

Per la rivelazione dell'attività di GGT è necessario utilizzare un substrato donatore di gruppi gamma-glutamìle atto a produrre un prodotto di reazione avente caratteristiche chimico-fisiche diverse e quindi rivelabili tramite un adatto dispositivo rivelatore. I substrati sintetici per la determinazione della GGT (quali Y-glutamil-7-amido-4-metilcumarina, Y-glutajmil-4-metossi-naftilammide, y-glutamil-4-nitroanilide, gamma-glutamil-3-carbossi-4-nìtroanilide y-glutamil-3,5-dibromo-4-idrossianilide) soddisfano tali requisiti.

Nell'esempio specifico di realizzazione dell'invenzione fornito qui di seguito è stato utilizzato il substrato Y-glutamil-7-amido-4-metilcumarina (γ-Glu-AMC), una molecola fluorescente che in seguito alla reazione della GGT, produce il prodotto 7-amino-4-metilcumarìna (AMC), secondo la seguente reazione di transpeptidazione:

γ-Glu-AMC GlicilGlicina<GGT>> γ-Glu-GlicilGlicina AMC Il prodotto AMC presenta uno spettro di eccitazione/emissione in fluorescenza diverso da quello del substrato di partenza y-Glu-AMC (29) e può essere rivelato utilizzando un fluorimetro operante a lunghezza d'onda di eccitazione di 380 nm (λεχ=380 nm) e a lunghezza d'onda di emissione di 440 nm (λβπι=440 nm). La rivelazione fluorimetrica presenta il vantaggio di essere sensibile, presentando un limite di rivelazione { detection limit) dell'enzima GGT di 0,1 mU.

Tuttavia, l'attività di GGT associata con le diverse frazioni proteiche eluite dalla colonna cromatografica può essere determinata utilizzando altri dispositivi rivelatori commercialmente disponibili (spettrofotometro UV-visibìle, rivelatore elettrochimico), in funzione del tipo di substrato prescelto.

Nell'esempio specifico di realizzazione qui descritto, la miscela contenente il substrato donatore γ-Glu-AMC proveniente dal perfusore (figura 1, parte B) viene miscelata in flusso continuo con l'eluato proveniente dalla colonna cromatografica (figura 1, parte A). Il substrato donatore reagisce con l'eluato proveniente dalla colonna cromatografica. Poiché il prodotto fluorescente AMC si forma specificatamente solo in presenza dell'enzima GGT, il segnale di fluorescenza si osserva solo con l'eluizione delle isoforme di GGT.

Questa procedura consente di visualizzare il volume di ritenzione (vR), e quindi il peso molecolare, di isoforme piasmatiche della GGT.

La miscela di reazione utilizzata per la reazione enzimatica on-line post-colonna secondo questa forma di realizzazione contiene preferibilmente i seguenti componenti nelle seguenti quantità:

- Tampone TRIS 0,25 M, pH 8,3;

- γ-Glu-AMC 180 μΜ;

La fase eluente cromatografica contenuta nella riserva della pompa HPLC contiene preferibilmente i seguenti componenti nelle seguenti quantità:

- Tampone fosfato 0,1M, pH 7,4 contenente WaCl 0,2 M ed EDTA 0,1 mM;

Glicil-glicina (GG, accettore di gruppi gammaglutamilici) 5,4 mM.

Nella Tabella I sottostante sono riportate le condizioni operative ottimali per la determinazione delle isoforme di GGT mediante cromatografia lìquida accoppiata a derivatizzazione on-line post-colonna con substrato γ-Glu-AMC e rivelazione spettrofluorimetrica (Xex= 380 nm e λε„ι=440 nm):

Tabella I

La figura 2 mostra la curva di calibrazione dello standard di GGT (preparazione commerciale di GGT di rene bovino sciolta in tampone fosfato 0,1 M pH 7.4) ottenuta iniettando GGT a diverse concentrazioni. La calibrazione riportata in figura 2 è stata realizzata nelle condizioni operative riportate in Tabella I con tecnica FIA { Flow Injection Analysis) , ovvero con il sistema di figura 1 ma in assenza di colonna cromatografica. Questa tecnica consente di ottenere risposte analoghe (area del picco) a quelle ottenute in presenza della colonna separativa, ma in un tempo minore (circa 4 minuti contro circa 50 minuti) e può vantaggiosamente essere impiegata con uno standard commerciale per la calibrazione del sistema. I punti sperimentali ottenuti sono lineari nell'intervallo di tre ordini di grandezza, con range dinamico lineare di 0,5 - 150 mU/ml (corrispondente all'intervallo di 0,05 - 15 mU), con un fattore di sensibilità di 3,806 ± 0,116 area-ml/mU (R<2>=0,952, N=8 punti) e un limite di rivelazione di 0.5 mU/ml ( detection limit, LODc=0,167 mU/ml). La deviazione standard si riferisce a N = 7 repliche dello stesso punto sperimentale.

Esempio sperimentale

Determinazione delle iso forme di GGT in plasma umano (1) Preparazione di un campione standard di plasma Un campione standard di plasma è stato ottenuto miscelando in parti uguali il plasma ottenuto da 10 soggetti. Il pool così ottenuto è stato suddiviso in aliquote da 150 μΐ, che sono state conservate a -20<o>C fino al momento dell'uso.

(2) HPLC

E' stata utilizzata una colonna cromatografica con le seguenti caratteristiche: colonna a filtrazione molecolare Superose-6 10/300 GL (GE Healthcare) con particelle del diametro di 13 μΜ, lunghezza 30 cm, diametro 1 cm. Come eluente è stato utilizzato tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4 contenente NaCl 0,2 M, EDTA 0,1 mM e glicilglicina 5,4 mM. E' stato utilizzato un loop dì iniezione da 100 pL (volume di iniezione). Sono state utilizzate condizioni di eluizione isocratica con flusso di 0,5 mL/min.

(3) Miscela per la reazione di derivatizzazione postcolonna

La soluzione madre del substrato, γ-Glu-AMC 3,6 mM, è stata preparata in NaOH 0,005 N e conservata a 4°C. La miscela per la reazione di derivatizzazione post-colonna, γ-Glu-AMC 180 μΜ, è stata preparata giornalmente in tampone TRIS 0,25 M, pH 8,3.

(4) Preparazione del campione

Il sangue intero periferico (3 mL) del soggetto da analizzare è stato campionato in provetta Vacutest in presenza di EDTA come anticoagulante. Il sangue è stato centrifugato a 1500 x g per 10 minuti a 4°C per rimuovere la parte corpuscolata e ottenere il plasma. Il plasma così ottenuto è stato iniettato nel sistema di figura 1 diluito 1:2 con la fase eluente.

(5) Procedura di analisi

Il sistema è stato calibrato iniettando giornalmente il plasma standard diluito 1:2 con la fase eluente. Il campione di plasma diluito è stato iniettato nel loop del sistema descritto in figura 1.

La figura 3 mostra, sovrapposti, i tipici tracciati cromatografici ottenuti usando il substrato fluorescente γ-Glu-AMC ed il substrato cromoforo γglutamil-4-nitroanilide (y-Glu-4-NA). In entrambi i casi la cromatografia è stata realizzata nelle se guenti condizioni: colonna Superose-6 10/300 GL (GE Healthcare); loop di iniezione = 100/iL; eluizione ìsocratica 0,5 ml/min in 0,1 M tampone fosfato pH 7,4, contenente NaCl 0,2 M, EDTA 0,1 mM e glicilglicina 5,4 mM come accettore. Flusso derivatizzante del substrato fluorescente = 0,1 mL/min.

Nel primo caso il profilo di eluizione della GGT è stato determinato utilizzando il sistema di figura 1 ed il substrato fluorescente y-Glu-AMC. Nel secondo caso l'eluato della colonna cromatografica del sistema di figura 1 è stato raccolto in frazioni di 0,5 mi e l'attività di ognuna di esse è stata determinata con il saggio cinetico enzimatico (30) basato sulla decomposizione del substrato cromoforo y-Glu-4-NA con liberazione di un prodotto colorato (λ= 405 nm) proporzionale all'attività di GGT presente nella frazione.

Nella figura 4 sono riportati a titolo dì esempio i tracciati cromatografici ottenuti iniettando campioni di plasma di diversi soggetti di controllo ed utilizzando γ-Glu-AMC come substrato per la rivelazione dell'attività di GGT. Si osserva la presenza di quattro picchi di attività corrispondenti alle diverse isoforme di GGT a vR= 11,6; 14,8; 18,9; 21,7 mi, corrispondenti a frazioni caratterizzate da un peso molecolare rispettivamente di circa 2000, 940, 140 e 70 KDa.

La concentrazione di GGT associata a ciascun picco è determinata in base dell'area del picco e in base della cur<a>va di calibrazione. In alternativa può essere preso come riferimento il rapporto tra l'area sottesa a tutto il cromatogramma e l'attività enzimatica totale di GGT dosata sul campione di plasma (tenuto conto del fattore di diluizione).

Poiché ì pesi molecolari associati a ciascuno dei picchi di attività di GGT corrispondono a quelli delle classi di lipoproteine presenti nel plasma, dei campioni di plasma sono stati sottoposti ad ultracentrifugazione su gradiente di densità per separare le principali classi di lipoproteine (VLDL, LDL, HDL). Le frazioni lipoproteiche così ottenute sono state quindi iniettate nel sistema schematizzato in figura 1 per valutare il contenuto in GGT.

Come è possibile osservare in figura 5, mentre il tracciato del plasma totale (a) presenta frazioni di attività nelle regioni indicate con i numeri 1-4, l'iniezione di sole VLDL purificate (b) non presenta picchi, mentre il plasma arricchito di LDL (c) ed HDL (d) presenta aumento dei picchi nelle regioni, rispettivamente 1 e 2 (c) e 3 (d). Infine, il plasma impoverito di lipoproteine presenta una diminuzione di tutte le bande, tranne che della banda 4.

Pertanto 1'ultracentrifugazione del plasma a densità differenti ha permesso di separare tre isoforme di sGGT: le forme 1 e 2 (di peso molecolare pari a 2000 e 940 KDa, rispettivamente) flottano a

d = 1,063; la forma 3 di peso molecolare 140 KDa flotta a d = 1,21. Queste densità corrispondono rispettivamente alle LDL ed alle HDL, il che dunque conferma che la GGT circolante si associa a queste frazioni lipoproteiche. D'altro canto, la forma 4 di sGGT {70 KDa) non è presente in alcuna frazione lipoproteica, e potrebbe pertanto corrispondere all'enzima solubile nel plasma, come suggerito anche dal peso molecolare.

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Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento di determinazione di isoforme di gamma-giutamiltransferasi sierica (sGGT) in un campione di un fluido biologico, comprendente i passaggi di: (a) separazione delle proteine sieriche presenti nel campione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con l'ausilio di una colonna HPLC atta a separare le proteine sieriche in funzione del peso molecolare, così da conseguire la separazione delle proteine sieriche in diverse frazioni e la conseguente separazione delle diverse isoforme di gammaglutamiltransferasì (GGT) sierica rispettivamente associate a ciascuna frazione; (b) reazione post-colonna di ciascuna frazione proteica ottenuta nel passaggio precedente con un substrato per la gamma-giutamiltransferasi (GGT) atto a formare un prodotto rivelabile in presenza di GGT in tale frazione proteica; (c) determinazione della presenza od assenza di prodotto rivelabile in ciascuna frazione proteica, la presenza di prodotto rivelabile in una data frazione proteica essendo indicativa della presenza in detta frazione proteica della associata isoforma di GGT.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il passaggio di separazione è realizzato con una co lonna HPLC per gel-filtrazione.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il prodotto rivelabile che sì forma in presenza di GGT nella reazione del passaggio (b) è un cromoforo o un composto fluorescente.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui la reazione del passaggio (b) è effettuata in presenza di un accettore di gruppi yglutamile.
5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui 1'accettore di gruppi γ-glutamile è glicilglicina.
6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui il substrato di GGT atto a formare un prodotto rivelabile in presenza di GGT è scelto dal gruppo che consiste di y-glutamìl-7-amido-4-metìlcumarina, y-glutamil-4-metossi-naftilammide, γglutamil-4-nìtroanilide, 7-glutamil-3-carbossi-4-nitroanilide, y-glutamil-3,5-dibromo-4-idrossianilide.
7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui il substrato di GGT atto a formare un prodotto rivelabile in presenza di GGT è y-glutamil-7-amido-4-metilcumarina ed il prodotto rivelabile è 7-amino-4-metilcumarina.
8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, in cui il passaggio (c) di determinazione include la determinazione della presenza di GGT in ciascuna frazione proteica e la quantificazione dell'attività di GGT.
9. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, comprendente i passaggi di: (a) separazione delle proteine sieriche presenti nel campione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni {HPLC) con l'ausilio di una colonna HPLC atta a separare le proteine sieriche in funzione del peso molecolare (o delle dimensioni molecolari), così da conseguire la separazione delle proteine sieriche in diverse frazioni e la conseguente separazione delle diverse isoforme di gamma-glutamiltransferasi sierica (sGGT) rispettivamente associate a ciascuna frazione; (b) reazione post-colonna di ciascuna frazione proteica ottenuta nel passaggio precedente con il substrato γ-glutamil-7-amido-4-metileumarina atto a formare il prodotto fluorescente 7-amido-4-metilcumarina in presenza di GGT in tale frazione proteica; (c) determinazione e quantificazione del prodotto 7-amido-4-metileumarina in ciascuna frazione proteica mediante fluorimetria, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 380 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 440 nm.
10. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9, in cui il fluido biologico è scelto nel gruppo che consiste di plasma, siero, urina, sovranatante di coltura cellulare e coltura batterica.
11. 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10, comprendente inoltre la fase (d) di separare le isoforme di gamma-giutamiltransferasi sierica {sGGT) determinate nella fase {c).
12. 12. isoforma enzimatica avente attività di gammaglutamiltransferasi (GGT) ed avente un peso molecolare di circa 2000 KDa.
13. 13. Isoforma enzimatica avente attività di gammaglutamiltransferasi (GGT) ed avente un peso molecolare di circa 940 KDa.
14. 14. Isoforma enzimatica avente attività di gammaglutamiltransferasi (GGT) ed avente un peso molecolare di circa 140 KDa.
15. 15. Isoforma enzimatica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 12 a 14, ottenibile mediante il procedimento secondo la rivendicazione 11.