JPS63207384A - 耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は６０℃において１０分間加温処理をしても９５
％以上のペルオキシダーゼ活性を仔している耐熱性ペル
オキシダーゼ及びその酵素の製造法およびその酵素を用
いる分析用試薬に関する。

従来よりペルオキシダーゼは過酸化水素の存在下で槌々
の化合物を酸化する酵素であり、近年２床診断用として
グルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸の定量
に種々のオキシダーゼと共に使用されており、又、酵素
免疫試験法における標識酵素としても使用されている。

（従来の技術） ここで言うペルオキシダーゼとは酵素番号ＥＣ１、Ｉｌ
、１７であり、系統名Ｄｏｎｏｒ：ｈｙｄｒｏｇｅｎ−
ｐｅｒｏｘｆｄｅｏｘｌｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅのこと
である。

ペルオキシダーゼの供給源としては西洋ワサビ、大根等
の植物が広く知られている。しかしながら、これらの植
物由来のペルオキシダーゼには性質が僅かずつ異なるア
イソザイムが含まれるため、診断試薬に用いる純粋な酵
素を得るにはアイソザイムを分離する必要があり、非常
に手間を要するという問題がある。

微生物起源のペルオキシダーゼも各種知られており、オ
イデイオデンドロン（０１ｄｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）属（
特開昭５９−１７９０７５号）、アルスロマイセス属（
特開昭６１−４３９８７号）、ヒトヨタケ（特開昭６１
−１２８８８７号）に存在することが報告されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来から知られている上記ペルオキシダ
ーゼは熱安定性が不充分であり、臨床診断用試薬及び酵
素免疫試験法における標識酵素として用いる場合、問題
がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは熱安定性の優れたペルオキシダーゼを広く
検索したところ、バチルス・ステアロサーモフィラス（
Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）の産生ずるペルオキシダーゼが６０℃において１
０分間加温処理をしても９５％以上のペルオキシダーゼ
残存活性を有していることを見い出した。

また該耐熱性ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの存
在下、過酸化水素と作用すると発色螢光又は発光を生ず
る色原体及び緩衝剤により過酸化水素または種々のオキ
シダーゼから生成した過酸化水素をより熱安定性の優れ
た状態で分析することが出来ることを見い出し、本発明
の完成に至った。

すなわち本発明は６０℃において１０分間加温処理をし
ても９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有している耐
熱性ペルオキシダーゼ、バチルス属に属する耐熱性ペル
オキシダーゼ生産菌を培養し、培養物から耐熱性ペルオ
キシダーゼを採取することを特徴とする耐熱性ペルオキ
シダーゼの製造法および過酸化水素または過酸化水素を
遊離する系を何してなる試料中の過酸化水素を分析する
試薬において、６０℃において１０分間加温処理をして
も９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有している耐熱
性ペルオキシダーゼおよび該酵素の存在下、過酸化水素
を作用すると発色、螢光又は発光を生ずる色原体群を含
有することを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼを用い
る分析用試薬である。

本発明の酵素の内の１種、バチルス・ステアロサーモフ
ィラスＩＡＭＩ１００Ｉから産生する耐熱性ペルオキシ
ダーゼの理化学的性質を示す。

（１）　　作用特異性； 本酵素は過酸化水素の存在下で種々の化合物の酸化を触
媒する。その作用機構は次式に示す通りである。

［但し式中ＡＨ，は水素供与体を、又、Ａは酸化された
水素供与体を示す］２．４−ジクｏｏフェノール（２＋
４−Ｄｌｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）と４−アミノアン
チピリン（４−ｘｍｔｎｏａｎｔ＋ｐｙｒ＋ｎｅ）は良
好な基質である。

以下余白 第１表 ■　至適ｐＨ；　ｐＨＥ３付近にある。

■　至適温度；５０℃付近にある。

（４温度安定性； ６０℃において１０分間の加温処理後の残存活性は９６
％であり、３０℃において５日間は充分に安定である。

■　分子量； 約１６４，０００　（ゲル濾過法による）であり、８２
．０００　（Ｓ　Ｄ　Ｓ電気泳動による）のサブユニッ
トの２ｆｆｉ体である。

（６）　　アミノ酸組成； 下記第２表に示す。

第２表 本発明の耐熱性ペルオキシダーゼを産生ずる微生物とし
てはバチルス属、例えばバチルス・ステアロサーモフィ
ラスなどが挙げられる。バチルス・ステアロサーモフィ
ラスはパーシース・マニュアル・オブ曇ディタミネイテ
ィブバクテリオロジ−（第８版）（１９７４）によると
、６５℃で生育する好熱性桿菌であり、０．６〜１×２
〜３．５の大きさを持ち、運動性を有する。

本発明に用いるバチルス属の微生物としては、例えばバ
チルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭ１１００１株な
どがある。

本発明に使用される菌株を培養するためには、その菌株
の胞子菌糸あるいは予め培養して得られた前培養液を液
体培地に接種し培養する。液体培地の炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、
マルトース、可溶性テンフン、糖蜜、クリセリン、マン
ニトール等の一般的に使用されるものがいずれも使用で
きる。

窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉
エキス、カザミノ酸、コーンステイープリカー等の天然
窒素源の他に尿素等の有機窒素源ならびに硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることがで
きる。この他必要に応じてリン酸塩、硫酸マグネシウム
、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養
源として使用できる。これらの培地成分は微生物の生育
を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に
炭素源は０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％
、窒素源は０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜２
重４２Ｌ％の濃度とするのが良い。又、培養温度は３０
〜７５℃、好ましくは４０〜６０℃とし、培地のｐＨは
４〜１０．好ましくは６〜９として、通気攪拌培養、振
盪培養もしくは静置培養を行なう。培養は通常８時間〜
３日間で行なわれる。

ふすま、もみがら、米ぬか等を用いる固形培地も利用で
きるが、大量培養のためには液体培地を使用することが
好ましい。

この様に培養して培養物中にペルオキシダーゼが生成蓄
積する。ここで培養物とは液体培養においては培養後の
菌体及び培養上澄液又は培！Ｉ鑓液を意味し、固形培養
においてはΔ体及び菌体の生育した培地を意味する。

液体培地を使用した場合には培養液中からペルオキシダ
ーゼの採取は次のごとく行なう。

培養終了後、培養液より遠心分離及び旙過なとの固液分
離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得る。

この様にして得られた粗酵素液から、例えば有機溶媒分
別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法及びカラムクロ
マトグラフィー等通常の酵素精製法を単独にあるいは組
合せて用いることにより精製されたペルオキシダーゼを
得ることが出来る。

本発明のペルオキシダーゼ活性測定は水素供与体として
、例えば４−アミノアンチピリン−フェノール系を使用
して次のように行なう。

即ち ４絹４−アミノアンチピリン　　　　　０．５ｍ１２４
．６ｍＭ　２．４−ジクロロフェノール　０．５ｍに８
．８ｍＭ　Ｈａ　Ｏｔ　　　　　　　　　　　　１ｄ１
００■阿リン酸緩衝液ｐＨ８，ｏ　　　　　１社を混合
し、約５分間５０℃で予備加温後酵素液１０μｔを添加
し、５００ｎｌにおける吸光度の増加を測定した。分子
吸光係数は１．３８　Ｘｌ　０’　Ｍ−’　ｃ＋ｓ−’
を用いた。

本発明の分析用試薬は過酸化水素または過酸化水素を遊
離する系を有してなる試料中の過酸化水素を分析する試
薬であり、上記耐熱性ペルオキシダーゼおよび該酵素の
存在下、過酸化水素と作用すると発色、螢光又は発光を
生ずる色原体群を含有する。

本発明に用いる過酸化水素を遊離する系とは、例えば体
液試料中の基質となる各成分、例えばグルコース、尿酸
、コレステロール、ポリアミン等に各醇化酵素を作用さ
せて過酸化水素を遊離する系を含む。

ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と作用すると発
色を生ずる色原体とは、例えば次の様な試薬をいう。

（Ｉ）４−アミノアンチピリンとフェノール及びフェノ
ール化合物 ■　４−アミノアンチピリンとＮ、Ｎ−ジメチルアニリ
ン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン等のアニリン化合物 （３）４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
（ＥＨ９ＰＴ）等のトルイジン化合物（４メチルベンゾ
チアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とＮ−エチル−Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＥＳＰ
ＡＳ）等のアニンジン化合物などがあり、ペルオキシダ
ーゼの存在下過酸化水素と作用すると発色を生ずる色原
体であれば、上述の試薬に限定されるものではない。

又、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素と作用すると
螢光を生じる色原体とは、例えば次の様な試薬をいう。

例えば、ホモバニリン酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸
などがあり、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素と作
用すると螢光を生ずる色原体であれば、上述の試薬に限
定されるものではない。

さらにペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と作用す
ると発光を生じる色原体とは、例えば次の様な試薬をい
う。

例えば、ルミノール、ロイコ−２’、７’−ジクロロフ
ルオレラセンとビス（２，４，６−）リクロロフェニル
）オキザレートなどがあり、ペルオキシダーゼの存在下
、過酸化水素と作用すると発光を生じる色原体であれば
、上述の試薬に限定されるものではない。

本発明の分析用試薬は必要により緩衝液、各種安定剤な
どを含む。

本発明の分析用試薬とは上記耐熱性酵素と該酵素の存在
下、過酸化水素と作用すると発色、螢光又は発光を生ず
る色原体群を含有する。したがって、過酸化水素と該分
析用試薬を作用させることにより゛、発色、螢光又は発
光が生じ、通常の方法に従い、発色、螢光又は発光の量
を測定することにより、過酸化水素の量を知ることがで
きる。

本発明の耐熱性酵素は凍結乾燥して、又は液状にて使用
できる。又、固定化酵素として過酸化水素電極を利用し
た電極法、含浸性基材に吸収させた分析用キット、標識
酵素として免疫反応を利用した酵素免疫測定法などに利
用できる。

本発明の分析用試薬は過酸化水素の分析のみならず、各
種体液成分（基質又は酵素）の測定が可能である。

（実施例） 以下、本発明を実施例により説明する。

実施例　１ Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｌ（ＬＨ）−ブロス寒天培地
（１ｔあたりペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩１
０ｇ、寒天１６　ｇ、ｐＨ７，０）の斜面培地で５５℃
、１日間培養したバチルス・ステアロサーモフィラスＩ
ＡＭ１１００１株を１２０℃、１５分間オートクレーブ
殺菌したＬＢ培地（ＩＱあたりペプトン１０ｇ。酵母エ
キス５ｇ１食塩１０　ｇ１ｐＨ７，０）１００ｍｆに一
白金耳植菌した。５５℃、１２時間振盪培養を行い、種
菌とした。

１２０℃、１５分間オートクレーブ殺菌したＬ−ブロス
培地３ｔに上記種菌を３０ｍｇ植菌した。

通気、撹拌しながら、５５℃、１８時間培養を行った結
果、その培養物中にペルオキシダーゼ活性０．１４ｕ／
ｍｆｆ１を見出した。

遠心分離機で菌体を集めたのち、２０ｍＭ！Ｊン酸緩街
液、ｐＨ７、ｏ、１００ｍ１！で懸濁し、超音波破砕Ｃ
２０ＫＨｚ１２０分間）を行った。遠心分離し、その上
清９０ｍｆｆ１　（８，１５ｕ／ｍｆｆ１、比活性０．
２２ｕ　／ｍｇ蛋白）を得た。上清を硫安分画（３５％
飽和〜５５％飽和）シ、活性画分１８ｍｅ　、１１．１
ｕ／ｍｆｆ１．比活性０．３５ｕ／ｍｇを得た。１００
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０に対して透析し脱塩した。

さらに２０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液ｐ■７．０で緩衝化した
ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（ファルマシア社）
に吸着させた。２０ａ＋Ｍ！Ｊン酸緩衝液ｐｉ（７，０
で洗浄後、Ｏ〜０．５Ｎ　ＮａＣｅを含む２０ｍＭリン
酸緩衝液ｐＨ７，０で溶出し、活性画分を集め、１５５
＋ａＱ（１，１５ｕ／ｍｌ！１比活性０．７４ｕ　／ｍ
ｇ蛋白）を得た。

再度、脱塩後、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セファデックスＡ５０
クロマトグラフィーを行ない、１００＋ｌＦ　（１，６
６ｕ／ｍＱ、比活性１．８８ｕ／Ｂ蛋白）を得た。

さらに、２０　＋ｇＭ　’Ｊン酸緩衝液ｐ■７．０で緩
衝化したトヨバール）ＩＷ５５（東洋曹達）で分子篩を
行い、活性画分３０ｍ紀（５，１ｕ／■ｉ１比活性２．
７３ｕ／Ｂ蛋白）を得た。

ＴＳＫ−ＤＥＡＥ−３８Ｗ　（東洋曹達）高速液体クロ
マトグラフィーで吸着、溶出し、高純度品８４ｍＱ（１
，８４ｕ／ｍｆｆ１．比活性９．７６ｕ／Ｂ蛋白）を得
た。

得られた酵素の理化学的性質は前述の通りである。

実施例　２ 実施例で１得られた耐熱性ペルオキシダーゼと従来より
市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼの熱安定性
を比較した。

０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，ｏ　　１　ｒａＱにペル
オキシダーゼ０．１ｕ／ｍｆｆ１になる様に調製し、各
温度での安定性を調べた。各温度での処理時間は１０分
間とした。ペルオキシダーゼ活性の残存率で示した。

第３表 実施例　３ 実施例１で得られた耐熱性ペルオキシダーゼと従来より
市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた過
酸化水素測定用試薬溶液を調製し、その溶液中でのペル
オキシダーゼの安定性を調べた。過酸化水素測定用試薬
としては次の様な組成を用いた。

４．１ｍＭ２．４−ジクロロフェノール、０．６７ｍＭ
　４−アミノアンチピリン、３３＋＊Ｍリン酸緩衝液ｐ
Ｈ８，０、ペルオキシダーゼ（５ｕ／ｍｆｆ１）とした
。

上記過酸化水素測定用試薬ＩＱｍＱを３０℃で保存し、
経口変化をペルオキシダーゼ活性の残存率で示した。

本発明の耐熱性ペルオキシダーゼは過酸化水素測定用試
薬としても安定性が優れていることが判明した。

（効果） 本発明では６０℃において１０分間加熱処理をシテも９
５％以上のペルオキシダーゼ活性を育している新規な耐
熱性ペルオキシダーゼが得られ、該酵素を使用すること
により、−従来の熱的性質の弱かったペルオキシ、ダー
ゼでは測定が熱的に困難であった過酸化水素の測定が可
能となった。例えば該耐熱性ペルオキシダーゼを固定化
してバイオリアクターとして又は該耐熱性ペルオキシダ
ーゼを標識とする酵素免疫測定に有効に利用することが
できる。また該耐熱性ペルオキシダーゼは基材に含浸さ
せた診断用キット又は液状酵素として利用しても充分に
熱的に安定である。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応ｐＨと本発明のペルオキシダーゼの相対活
性との関係を示すグラフである。 第２図は反応温度と本発明のペルオキシダーゼの相対活
性との関係を示すグラフである。 第３図は温度安定性を示すグラフである。 界ｌ　図 ｐＨ 早゛２　図 ｈｊＬｃｏｃ＞

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）６０℃において１０分間加温処理をしても９５％
   以上のペルオキシダーゼ活性を有している耐熱性ペルオ
   キシダーゼ。
2. （２）バチルス属に属する耐熱性ペルオキシダーゼ生産
   菌を培養し、培養物から耐熱性ペルオキシダーゼを採取
   することを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製造法
   。
3. （３）過酸化水素または過酸化水素を遊離する系を有し
   てなる試料中の過酸化水素を分析する試薬において、６
   ０℃において１０分間加温処理をしても９５％以上のペ
   ルオキシダーゼ活性を有している耐熱性ペルオキシダー
   ゼおよび該酵素の存在下、過酸化水素と作用すると発色
   、螢光又は発光を生ずる色原体群を含有することを特徴
   とする耐熱性ペルオキシダーゼを用いる分析用試薬。